PRIMER REGISTRO DE MOSCA BLANCA DEL BIOTIPO B DE Bemisia tabaci (GENNADIUS) (HEMIPTERA: ALEYRODIDAE) EN BOLIVIA Bolivia: 1 Angel Fernando Copa Bazán & 2 Tito Anzoategui L. Colombia: 3 Francisco Morales, 4 Ana Karine Martínez, 5 Mauricio Castaño, 6 Ana Cecilia Velasco y 7 Maria del Pilar Hernández.

RESUMEN

Incidencia de la mosca blanca

Este es el primer registro de Bemisia tabaci (Gennadius) en Bolivia, realizado mediante estudios de carácter bioquímico, molecular y etiológico. La identificación bioquímica consistió en la determinación de patrones de bandas de esterasas no específicas. Se encontró polímorfismo entre las muestras colectadas en todo el departamento de Santa Cruz como biotipo B, en comparación al biotipo A, usado como testigo y procedente de una colonia de cría mantenida en el laboratorio del CIAT en Colombia por más de 10 años. B. tabaci es absolutamente predominante en las llanuras orientales, encontrándose en cultivos de fréjol, soya y otros cultivos totalizando 43 especies de plantas entre cultivos y malezas. Se reporta también la presencia de otras especies como Trialeurodes vaporariorum en la zona de los valles mesotermicos y Aleurothrixus floccosus (Maskell) en cultivos frutales en las llanuras y plantas forestales.

Estos insectos erróneamente llamados como mosca blanca (Gallo, et al.), pertenecen al orden Hemiptera, familia Aleyrodidae, con más de 1.156 especies registradas en el mundo (www.ceniap.gov.ve, 1999). Son insectos pequeños de 1 mm de tamaño, cuatro alas membranosas recubiertas por polvillo blanco, los huevos son colocados en el envés de las hojas en números variados, después de 3 a 4 días eclosionan pequeñas ninfas móviles,; a las pocas horas fijan su estilete para quedarse definitivamente en la hojas hospederas hasta completar los 3 instares,; posteriormente pasan a pupa y finalmente eclosionan los adultos., completando entre 15 a 17 días su ciclo. Las hembras viven aproximadamente 18 días colocando aproximadamente 300 huevos (Gallos, et al.). Algunas especies de este género adquieren fácilmente resistencia a los plaguicidas, y se hospedan en diferentes especies de plantas cultivadas y malezas. El problema radica en que la mosca blanca, aparte de succionar y alimentarse de la savia de las plantas, transmite enfermedades virales que ocasionan la pérdida total del cultivo, en el menor de los casos facilita la aparición de hongos que perjudican el desarrollo normal de la planta.

Palabras claves: primer registro, Bemisia tabaci; biotipo A y B, bioquímico, molecular y etiológico, Trialeurodes vaporariorum, Aleurothrixus floccosus 1. Jefe del departamento de Entomología Agrícola del Instituto de Investigaciones Agrícolas “El Vallecito” IIAV: [email protected], [email protected] Tel. celular 71619940 2. Fitomejorador de frejol del IIAV 3. Jefe de la Unidad de Virología , CIAT, Colombia 4. Asistente de Investigación, Unidad de Virología, CIAT, Colombia 5. Asociado de Investigación, Unidad de Virología, CIAT, Colombia 6. Asistente de Investigación, Unidad de Virología, CIAT, Colombia 7. Entomóloga taxónoma del Departamento de Entomología del CIAT, Colombia

La mosca blanca pudo haber ingresado a Bolivia en plantines de frutilla o varetas de durazno, provenientes de los países vecinos como: Perú, Argentina, Brasil y Chile. En el departamento de Santa Cruz, desde 1997 se registró una alta incidencia de mosca blanca en los valles mesotérmicos (San Isidro, provincia Manuel María Caballero) y con baja infestación en los llanos orientales (CIAT & ANAPO, 2005). Entre las especies de mosca blanca registradas durante el año 2000-2001, se encuentra la especie Trialeurodes vaporariorum Westwood, en la zona de los valles mesotérmicos y a Bemisia tabaci Gennadius como biotipo A, infestando plantas cultivadas en la llanura oriental como: tomate y frejol, (IIA “El Vallecito” 2001; CIAT 2005). De acuerdo al registro de www.tropicalwhiteflyipmproject.cgiar.org las moscas blancas se agrupan en 21 géneros distribuidos en 41 especies y transmiten más de 112 tipos de virus. Otras de las causas posibles para la propagación de la mosca blanca es el monocultivo, así como la implantación de cultivos hospederos potenciales como papa, tomate, repollo, fréjol, las cucurbitaceas y soya;,

INTRODUCCIÓN 1

en los valles mesotérmicos y en algunas localidades del norte integrado de Santa Cruz. En la campaña de verano 2004/05 se registró alta incidencia la mosca blanca en el cultivo de la soya, afectando una superficie cultivada de 10.000 hectáreas, en la localidad de Limoncito, distante a 190 km al norte de Santa Cruz (ANAPO & DEBER, marzo, 2005). También fue registrada en las localidades de Monte Verde y en los campos de San Pedro. Los agricultores indican que el ataque de esta plaga reduce hasta una tonelada del rendimiento total por hectárea del cultivo de soya. Al alimentarse la mosca blanca chupa la savia, y deposita sobre las hojas su excremento azucarado en el cual se desarrolla un hongo de color negro llamado fumagina (Capnodium sp.). Los factores que influyen para la propagación rápida de la plaga son: alta capacidad reproductiva, condiciones climáticas favorables, como también la capacidad de alimentarse. Para disminuir estos problemas es necesario implementar diferentes alternativas de control enmarcados en lo que se conoce como Manejo Integrado de Plagas (M.I.P.) (www.ceniap.gov.ve, 1999). Las pérdidas ocasionadas por la mosca blanca son alrededor del 50 % en las hortalizas en los valles mesotémicos, con aplicaciones de insecticidas desde 4 en frejol, hasta 18 en el cultivo del tomate (InformeTaller: Prefectura, SEDAG, SENASAG, ASHOFURT, 2005). Para el control de la mosca blanca se emplean insecticidas: Profenofos, Clorpirifos, Imidacloprid, Endosulfan y otros. En los valles mesotérmicos se está realizando en hortalizas ensayos con productos específicos y que sean selectivos para los controladores biológico y también con trampas amarillas (CIAT, 2005); sin embargo T. vaporariorum y B. tabaci posee una gran capacidad de adaptarse y desarrollar resistencia a los insecticidas de los grupos Piretroides, Organofosforados y Carbamatos. La presencia de la mosca blanca en los valles mesotérmicos en su etapa inicial sin duda ha causado daños considerables, y su posterior aparición en las llanuras de manera sorpresiva atacando miles de hectáreas de soya en verano y fréjol en invierno, además de otros cultivos, causó la maduración no uniforme de los frutos en la soya y los síntomas de mosaico dorado en el fréjol. Esta situación ha despertado la preocupación en todos los sectores como: Asociación Nacional de Productores de Oleaginosas (ANAPO), Agricultores pequeños, casas comerciales de agroquímicos, Universidades, Servicio Nacional de Seguridad Agroalimentaria y Ganaderia SENASAG y otras Organizaciones no Gubernamentales, con los que se ha creado un comité de lucha contra la mosca blanca.

Nuestra institución el Instituto de Investigación Agrícolas “El Vallecito” dependiente de la UAGRM, realizó trabajos de monitoreo de la mosca blanca en las diferentes comunidades recolectando especimenes (ninfas y adultos) y plantas hospederas (cultivos y malezas). Afortunadamente se ha establecido contacto con el Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT de Cali - Colombia, para realizar trabajos conjuntos de identificación, sabiendo que PROIMPA desarrolla actividades del manejo de la MB en la zona de Comarapa, Saipina y los valles altos de Cochabamba específicamente con el cultivo de la papa. Gracias a una invitación del Dr. Morales, se llevaron las muestras al CIAT de Colombia, para la identificación taxonómica y conocer las metodologías del proceso de identificación y determinar los biotipos de Bemisia tabaci mediante la amplificación de fragmentos de ADN (RAPDs) y paralelamente realizando pruebas de ELISA para determinar los tipos de virus presentes en las muestras de fréjol. MATERIALES Y MÉTODOS Los muestreos de especímenes de la mosca blanca, se realizaron en los cultivos de fréjol, soya, solanaceas, cucurbitaceas y hortalizas, en las localidades de Limoncito, Chané, Monte Verde, San Pedro y San Julian, ubicados en la provincia Obispo Santiestevan, 190 km al norte de Santa Cruz; y en fréjol, solanaceas, hortalizas y cucurbitaceas, en las localidades de San Isidro y San Juan del Potrero, provincia Manuel María Caballero; al igual de Los Negros, Yerba Buena y Mairana provincia Florida, del departamento de Santa Cruz. El Torno a 32 km y el Instituto de Investigaciones Agrícolas “El Vallecito” ubicado a 9 km de la ciudad de Santa Cruz (Figura 1 y Cuadro 1), con el fin recolectar especimenes de las moscas blancas. Los muestreos de moscas blancas (adultos y “pupas”) se realizaron en cultivos y posteriormente de malezas (Cuadro 2), entre las campañas de verano 2004/05 y 2005/06. Las condiciones medio ambientales de las mencionadas localidades se encuentran entre las temperaturas desde 18 a 25°C, humedad relativa de 50 a 90%, las lluvias caídas durante estas épocas fueron de 650 a 1500mm año. Las muestras se introdujeron en frascos con alcohol al 70%, posteriormente llevados al Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT –Colombia, Los especimenes se identificaron inicialmente en el Laboratorio de Entomología del CIAT; para diferenciar entre Bemisia tabaci y otras especies. Una vez determinadas, se separaron individualmente con el objetivo de identificar a través de PCR-SCAR el biotipo de B. tabaci, siguiendo la metodología descrita a continuación. PCR-SCAR para identificación de biotipos de Bemisia tabaci. 2

Las muestras de especimenes de mosca blanca se llevaron al CIAT de Colombia, donde se realizó la siguiente metodologia:

SANTA CRUZ, ZONAS DE Area con presencia de la mosca blanca

Extracción de ADN Para cada muestra analizada se tomaron cinco pupas y adultos de Bemisia tabaci que se colocaron individualmente en tubos eppendorf de 1.5 ml. La extracción de ADN se hizo siguiendo el protocolo de De Barro & Driver (1997), con algunas modificaciones. Cada una de las pupas fue macerada con un pistilo de vidrio previamente humedecido con buffer de lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris- HCl pH 8.4, 0.45% Tween 20, 0.45% NP-40, 500 µg/ml proteinasa K). Cuando los insectos estuvieron totalmente desintegrados se agregaron 20 µl del buffer. Este macerado se transfirió a tubos de PCR de 0.2 ml y se incubo en un termociclador PTC-100TM (MJ Research, Inc.) por 20 min. a 65 ºC y 10 min. a 94 ºC para inactivar la proteinasa K. Pasado este tiempo se agregan 25 µl de agua estéril y el ADN es guardado a –20ºC hasta su posterior utilización.

BOLIVIA

Figura 1. Zonas de muestreo de mosca blanca realizado en las zonas de mayor producción de fréjol y soya en el departamento de Santa Cruz.

SCARs Para la amplificación del ADN se utilizaron los primers F24 (5’TTTCATCACACCGACCAT3’), R265 (5’GACATTACGGCATTGAACTT3’), para la detección de biotipo A y los primers H9BB1F (5’TGGTTTTTCATGAATGGGAGA3’), H9BB1R (5’AAAAAGCCGGAAGAACCATT3’), para la detección de biotipo B, diseñados en la Unidad de Virología del CIAT. La reacción se hizo en un volumen final de 25 µl a las siguientes concentraciones finales: Buffer 1X, MgCl2 2.0 mM, dNTPs 0,2 mM, Primers 0,2 µM cada uno, 1 U de Taq polimerasa (PROMEGA) y 2 µl de ADN. El programa de amplificación consistió de un primer ciclo de 94 ºC por 5 min, 62 ºC por 2 min, 72 ºC por 3 min y 39 ciclos de 94ºC por 1 min, 62 ºC por 1:30 min y 72 ºC por 2 min, y una extensión final de 10 min a 72 ºC. Los productos de amplificación, junto con el marcador de peso 1 Kb (Invitrogen) y los controles positivos para el biotipo A y biotipo B (Colonias del CIAT), fueron corridos en TBE 1X en geles de agarosa al 1.2 % preparados en el mismo buffer (Figura 2A). Las bandas fueron visualizadas por tinción con bromuro de etidio y observación con luz ultravioleta. Cada gel se fotografió en el equipo Gel Doc 2000 (BIORAD) (Figura 2 B).

A

B Figura 2. A- Equipo de electroforésis para la corrida de geles de agarosa. B- Equipo Gel Doc 2000 para fotografia de geles.

3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN La Esterasas no específicas y las isoenzimas han mostrado ser útiles como marcadores genéticos en la evaluación de la variabilidad de las moscas blancas a nivel de género y especie. Más recientemente, el análisis de esterasasespecíficas ha permitido confirmar la identidad de poblaciones de Bemisia tabaci biotipo B en Bolivia Luego de procesar las muestras colectadas, se observaron diferencias en la actividad de las esterasas entre las moscas blancas y la B. tabaci tradicional. Así, biotipo A, tomado de la colonia de cría presentó un patrón único correspondiente a cuatro bandas mientras que el biotipo B presentó hasta seis patrones de esterasas diferentes conformados por bandas no comparables en su migración en el gel con las de B. tabaci biotipo A (Fig. l). También se encontraron diferencias respectivas de la degradación del substrato, es decir, el biotipo B presentó bandas rojas las cuales corresponden a la hidrólisis del (x-naftil acetato), a diferencia del biotipo A, el cual sólo presentó bandas negras (degradación de a-naf acetato). Luego del análisis de las muestras disponibles, se identificó una banda B para todos los individuos del biotipo B, la cual se utilizó como marcador bioquímico. Otros resultados son el registro de 44 especies entre cultivos y malezas como hospederos de la mosca blanca,; entre los cultivos más perjudicados están las solanáceas, frejol y la soya, además de las brasicas.

Cuadro 1. Localidades de Santa Cruz muestreadas para la recolección de mosca blanca Provincia y loc

Latitud

CABALLERO Sn Juan del Potrero 64º17’16’’ Saipina 64°34’66’’ Comarapa 64°32’19’’ FLORIDA 64º11’66’’ Los Negros Yerba Buena64°02’71’’ 63°96’42’’ Militar Mairana SANTIESTEVAN -Limoncito, 63°23’97’’ Chané 62°53’32’’ Monte Verde 63º48’72’’ San Pedro 62°61’25’’ San Julian ANDRES IBAÑEZ 63º36’88’’ El Torno IIA “El Vallecito” 63°02’71’’ 63°30’67’’ Porongo ICHILO Buena Vista 63°39’34’’ Guaytu 63°44’43’’

Longitud Altitud T msnm ºC

17º91’86’’ 1540 18°05’43’’ 1500 17º54’58’’ 1850

18 21

18º06’68’’ 1550 17°95’85’’ 1450 18º12’07’’ 1450

19 a 21

-16°98’63’’ 16º95’98’’ 16º81’0’’ 16°87’50’’

400 400 400 400 350

23 a 25

17º97’39’’ 600 17°95’85’’ 400 17º84’26’’ 450

23 a 24

17°27’30’’ 400 17°32’20’’ 380

24 a 25

Fuente, MHNNKM Área de Geografía 2005

La zona de mayor infestación por las moscas blancas son dos: los valles que comprende San Isidro, Comarapa, Saipina, y San Juan del Potrero,; la especie predominate es T. vaporariorum,; sin embargo se ha encontrado B. tabaci biotipo B a 1500msnm con poca incidencia,; por otro lado, la presencia de síntomas de virosis del mosaico dorado en las plantas de frejolsometidas a las pruebas serologicas de ELISA, dieron positivos a mosaico Dorado, lo que también confirma la presencia de B. tabaci Los especímenes de mosca blanca, sometidos a la pruebas de PCR-SCAR, dieron como resultado la no existencia de Bemisia tabaci biotipo A. (Figura 7) Los especímenes colectados de mosca blanca de las llanuras de las localidades: El Torno, IIA El Vallecito, Porongo, Buena Vista, Guaytu, Limoncito, Chane, Monte Verde, San Pedro y San Julian de las 42 especies botánicas evaluadas (cultivos y malezas) (Cuadro 1 y 2) de Santa Cruz y analizados con las pruebas de PCR, todas confirmaron ser Bemisia tabaci biotipo B (Figura 6).

4

Malvaceae Mirthaceae Moraceae Passifloraceae Pedaliaceae Portulaccaceae Rosaceae Rosaceae Rubiaceae Rutaceae Solanaceae Solanaceae Solanaceae Solanaceae Solanaceae Vitaceae

*= solamente Aleurothrixus floccosu

P o rc e n ta je

Nombre vernacular Chiori Chiori Chirimoya Girasol Repollo Brocoli Papaya Camotillo Camote Pepinillo Pepinillo Pepino Zapallo Achojcha Yuca Golondrina Macororó Fréjol Caupi Palta Soya Maní Pedro II Malva Algodón Algodón Gossypium barbadense L. arboreo Guayaba Psidium guajava * Ficus spp. Pingo de oro Maracuya Passiflora edulis Sesamo Sesamun orientale Portulaca sp. Verdolago Rosa sp. Rosa Fragaria Frutilla Coffea arabica L.* Café Citrus spp. * Citricos Lycopersicum sculentum Tomate M. Papa Solanum tuberosum Capsicum annuum L. Paprika Capsicum sp. Aji Solanum melongena L. Berengena Uva Vitis vinifera Género y especie Amaranthus deflectus Amaranthus sp. Annona cherimolla Helianthus annuus L. Brassica oleraceae Brassica oleraceae Carica papaya Ipomoea purpurea Ipomea batata Lam. Cucurbita sp. Cucumis sp. Cucumis sativus Cucurbita moschata (D.) Cyclantera pedata Manihot sculenta Crantz Euphorbia hirta Recinus comunis L. Phaseolus vulgaris Vignia unguiculata (L.) Persea americana Mill. Glycine max Arachis hypogea L. Ibiscus sp. Sida rhombifolia Gossypium hirsutum L.

100

90

100 80

60

60

40

30

40

25

14

20 0 Recurren a técnicos

Uso de QMC

Control MB Abandono

Pérdida Cosec.

Nuevos cultivos

Prom. aplicación

Problemas de la MB

Figura 3. Problemas que ocasiona la mosca blanca en la zona de los valles mesotérmicos de Santa Cruz, datos de 1996 IIA “El Vallecito”, Trialeurodes vaporariorum se presenta en su mayor porcentaje Ninfas

35

Adultos

30 P r o m . de e s pe c im e n e s d e M B /ho ja

Familia Amaranthaceae Amaranthaceae Annonaceae Asteraceae Brassicaea Brassicaea Caricaeae Convolvulaceae Convolvulaceae Cucurbitaceae Cucurbitaceae Cucurbitaceae Cucurbitaceae Cucurbitaceae Euphorbiaceae Euphorbiaceae Euphorbiaceae Fabaceae Fabaceae Lauraceae Leguminosae Leguminosae Malvaceae Malvaceae Malvaceae

120

25 20 15 10 5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Evaluciones

Figura 4. Evaluación de MB en las comunidades del norte de Santa Cruz, promedio de especimenes de adultos y ninfas por hoja del cultivo de soya.

12

Prom . de MB/hoja en frejol

Cuadro 2. Familia, género y especies botánicas de hospederos de la mosca blanca en Santa Cruz Bolivia, 2005

10 8 6 4 2 0 Soya

Fréjol Evaluaciones

Adultos

Nifas

Figura 5. Evaluación de ninfas y adultos de MB a los 55 días de la germinación entre los cultivos de soya y fréjol en invierno 2005, localidad de San Pedro.

5

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10 11 12 13 144 15 16 17

CAR para deteección de biootipo B de B. Figurra 6. PCR-SC tabaci. 1 y 17- Marrcador de pesso molecular 1Kb, 2--11 muestras colectadas enn cultivos de frejol, soya, malezaas y otros, en diferentes localidaades de Santaa Cruz, Boliv via. 12 y 13Controles positivos de B. tabaci biotipo A, 14 y 151 Controless positivos de d B. tabaci biotipo biotipo B, 16 6- Control de reacción.

Figurra 9. Pupa de Trialeurodess vaporarioruum de tercer instar

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 15 16 17

Figurra 7. PCR-SC CAR para deteección de bio otipo A de B. tabacci. 1 y 17- Marcador M de peeso moleculaar 1Kb, 2-11 muestras colectadaas en cultivoss de frejol, sooya, malezas y otrros, en difeerentes localidades de Santa S Cruz, Boliv via. 12 y 133- Controles positivos dee B. tabaci biotippo A, 14 y 151 Controles positivos de d B. tabaci biotippo biotipo B, 16- Control dee reacción.

d mosca blannca tomadas Figurra 10. Oceloss de adultos de en eel CIAT Co olombia a trravés de la micrroscopia elecctrónica A. Trialeurodes T vapoorariorum, B Bemisia tabbaci de los espeecimenes de Santa S Cruz, Bolivia.

Figurra 8. Pupa de d Bemisia ta abaci biotipo B de tercer instarr.

6.. A nivel de ninfas y/o puupas es fácil identificar i o diferenciarr entre Trialeeurodes vapoorariorum y Bemisia taabaci. 7.. Se tiene rregistrado la presencia deel virus del Mosaico D Dorado en el cultivo c de frejjol y aun no se observaa problemas virales v en el cultivo c de la soya. LIOGRAFÍA A . BIBL

Figurra 11. Moscaa blanca adullta tomada enn el IIA “El Vallecito”

Figurra 12. Síntom mas del mosaaico dorado enn plantas de fréjol CON NCLUSIONE ES 1. Se identificaron espeecies de mo osca blanca Trialeuroddes vaporariorum, Bemissia tabaci y Aleurothriixus floccosuss 2. De los especímenes de mosca blannca Bemisia tabaci colectados e ideentificados, toodas son del biotipo B realizadoss con los marcadores molecularees y comparrados con unna población de B. tabaaci biotipo A criados en el CIAT de Colombia.. 3. Trialeuroddes vaporarriorum es la especie predominaante en los valles mesottérmicos de Santa Cruuz y el conntrol se realliza con la aplicación n de insecticid das. 4. En las 9 evaluacionees realizadass de mosca blanca en n el cultivo de d lasota, la presencia p de ninfas es mayor m que loss adultos. e cultivo de 5. La presenccia de ninfas y adultos en el la soya es relativamente simillar por la superficie extensa del cultivo, c no asi en el frejol donde los adultos tiend den a migrar a hospederos alternos.

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