P o s t, biochenx.

PO L S K A A K A D E M I A N A U K POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

POSTĘPY BIOCHEMII KWARTALNIK

TOM VIII PAŃSTWOWE

1962

ZESZYT 4

W Y D A W N I CT W O N A U K O W E WARSZAWA

http://rcin.org.pl

WYKAZ SYMBOLI AMP, ADP, A TP

BAL CoA (CoASH), AcCoA DN, RN, S-R N

(Ac-SCoA)

DNP EDTA FAD, FA D H 2 FMN, FM N H 2 GSSG, GSH Hb, H b 0 2, HbCO, M Hb

NAD (NAD+), NADH 2 (NADH -f- H+) NADP, N A DPH 2

P, P P PA LP, PA M P T PP UDPG, U D PG al

5 -fosforany adenozyny: m ono-, dw u-, tró jfo sfo ra n ; analogicznie: 5'-fosfora~ ny innych nukleozydów 2,3-dw um erkap to p ro p an o l koenzym A, acetylokoenzym A kw as dezoksyrybonukleinow y, k w as r y ­ bonukleinow y, rozpuszczalny kw as r y ­ bonukleinow y dw unitro fen o l etylenodw uam inoczterooctan dw unukleotyd flaw in o -ad en in o w y : fo r­ m a utleniona, fo rm a zred u k o w an a m ononukleotyd flaw inow y: fo rm a u tle ­ niona, form a zred u k o w an a g lu tatio n : fo rm a utleniona, fo rm a z re ­ dukow ana hem oglobina, oksyhem oglobina, h em o­ globina tlenkow ęglow a, hem iglobina (m ethem oglobina) dw unukleotyd nikoty n am id o -ad en in o w y : fo rm a utleniona, fo rm a zred u k o w an a fosforan d w u n u k leo ty d u n ik o ty n am id o adeninow ego: fo rm a u tleniona, fo rm a zredukow ana ortofosforan, piro fo sfo ran fosforan piryd o k salu , fo sfo ran p iry d o ks am iny p irofosforan tiam in y u rydynodw ufosfo ran glikozy, u ry d y n o dw ufosforan galaktozy

U zupełniający w ykaz sym boli oraz zasady ich stosow ania p o d ają Post. B lochem . 8, 411 (1962).

http://rcin.org.pl

P O L S K A

A K A D E M I A

N A U K

POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

POSTĘPY BIOCHEMII

K w artalnik

TOM VIII

1962

ZESZYT 4

P A Ń S T W O W E W Y D A W N I C T W O NAUKOWE

http://rcin.org.pl

K OM ITET RED A K CY JN Y R eda kto r — Ire n a C hm ielew ska S ek re ta rz — W itold B rzeski RA D A R E D A K C Y JN A P rzew o d n iczą cy — Jó zef H eller C złonkow ie — W łodzim ierz M ozołowski, Ja n in a O p ień sk a-B lau th , B olesław S k arży ń sk i

ADRES KATEDRA

REDAKCJI BIOCHEMII

UW

W arszaw a 22, Al. Ż w irk i i W igury 6/8 tel. 22-22-91, w ew n. 46

PAŃSTWOWE WYDAWNICTWO NAUKOWE — WARSZAWA 1962 Nakład 1080 (947+133)

Oddano do składania 20. VII.62 r.

Ark. wyd. 14. Ark. druk. 7,1

Podpisano do druku w li stop. 1962 r.

Papier druk. sat. kl. v. 70x100

Druk ukończono w listop ad zie 1962 r.

Cena zł 20.—

Zam. nr 1225/62

DRUKARNIA IM. REWOLUCJI PAŹDZIERNIKOWEJ. WARSZAWA

http://rcin.org.pl

H-41

O D R E D A K C JI

T e m a ty k a niniejszego ze szy tu różni się nieco od te m a ty k i pierw szych trzech zeszytów to m u VIII. Obok k ilk u a rty k u łó w monograficznych zeszyt zawiera m ateriały II Krajowego S y m ­ pozjum Polskiego Tow arzystw a Biochemicznego na tem a t bio­ chemii k rw in ki czerwonej (Poznań 1962). W yodrębnienie ze­ szytu poświęconego w całości tem a tyce sy m pozjalnej nie było m ożliw e ze w zględów technicznych. W części obejm ującej treść obrad S y m p o z ju m znalazły m ie j­ sce następujące materiały dostarczone przez K om itet Orga­ nizacyjny: cztery referaty (zamieszczone jako oddzielne a r ty ­ kuły) oraz 39 doniesień (zamieszczonych łącznie). W celu za­ chowania dokumentalnego charakteru całości w y d ru k o w a n y c h materiałów S y m p o z ju m , podano t y t u ł y i autorów doniesień nie nadesłanych do redakcji.

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

P

O

S

TOM VIII

T

Ę

P

Y

B

I

O

C

H

1962

E

M

I

I

ZESZYT 4

T A D E U SZ K Ł O P O T O W SK I*

Nowe osiągnięcia genetyki biochemicznej Recent Progress in Biochemical Genetics T he rec en t progress in biochem ical genetics has been review ed. The article covers th e papers published up to the D ecem ber 1961 and especially le ctu res and com m unications of th e V th In te rn a tio n a l Congress of B iochem istry in Moscow.

Ja k w iele innych n auk biologicznych, tak i genetyka użyła dla swych celów m etod biochem icznych. W ciągu k ilk u n astu lat stosow ania osiągnę­ ła ona stopień rozw oju, um ożliw iający sprecyzow anie zasadniczych jej założeń w term inach m olekularnych. Gen, jednostka determ in u jąca daną cechę, m oże już być rozpatryw ana jako fun k cy jn y frag m en t kw asu n u kle­ inowego. Z drugiej strony, biochem ia nie m a w łasnych m etod badania sw oistości i fun k cji kw asów nukleinow ych, a naw et, jak to podkreślił C r i c k w podsum ow aniu dyskusji III sym pozjum K ongresu Bioche­ m icznego w M oskwie, m etod badania sekw encji nukleotydów . W tej sy ­ tu ac ji m etody genetyczne są w łaściw ie jedynym środkiem badań nad fu n k cjam i kw asów nukleinow ych. Ponadto, zastosow anie * m utantów przyczyniło się do poznania szeregu łańcuchów biosyntetycznych oraz u łatw iło badania nad heterogennością enzymów. Ta sym bioza m a jeszcze trzeciego p a rtn e ra — m ikrobiologię. W pro­ w adzenie m etod m ikrobiologicznych i w irologicznych um ożliw iło szybki rozw ój w iedzy zarów no o stru k tu rz e i funkcji genów, m echanizm ach ich rekom binacji, jak i o funkcjach kw asów DN. W ty m udziale m ikrobio­ logii szczególnie doniosłe znaczenie m iało odkrycie m u tan tó w auksotroficznych. W przeciw ieństw ie do w yjściow ych, prototroficznych szczepów dzikich, w ym agają one dodatkow ych czynników w zrostow ych, jak w ita­ m iny, zasady purynow e, zasady pirym idynow e lub am inokw asy. Do­ św iadczenia z m u tan tam i tego rodzaju cechuje swoistość i czułość; za po­ mocą selektyw nych podłóż m ożna w ykryć jed n ą zm utow aną kom órkę o określonych cechach w śród m iliarda innych tej cechy nie posiadają­ cych. Z drugiej stro n y w zględnie łatw o jest odnaleźć u tych m u tan tó w enzym atyczny skutek m utacji. Łatw ość w yw oływ ania m u tacji u drob­ * D r, ad iu n k t Z ak ład u Biochem ii In s ty tu tu M atki i D ziecka w W arszaw ie.

http://rcin.org.pl

422

[2]

noustrojów za pomocą fizycznych lub chem icznych czynników m u tag en ­ nych pow oduje, że są one dziś najlepszym m ateriałem do badań nad funkcjam i s tru k tu r genetycznych. I chociaż nie w szystkie w yniki uzy­ skane na m ateriale m ikrobiologicznym m ożna ekstrapolow ać do zjaw isk genetycznych organizm ów wyższych, to jednak prostota s tru k tu r gene­ tycznych b akterii i w irusów pozwala na poznanie najb ard ziej ogólnych zasad dziedziczenia cech, jak i stosunków m iędzy genom em a cytoplazm ą. I. Metody badania materiału genetycznego Gen jest najm niejszą jednostką funkcji m ate ria łu genetycznego. S ta ­ now i on frag m en t (praw dopodobnie nie w ydzielony przestrzennie) k w a­ su nukleinow ego, będącego siedzibą inform acji dziedzicznej u danego organizm u. W większości przypadków inform acja ta jest zaw arta w DN, a je d y n ie u niektórych w irusów w RN. Rola genów polega na przekazy­ w aniu tej inform acji z jednej strony do kom órek potom nych, z drugiej zaś do centrów biosyntezy białka poprzez sw oisty inform acyjny RN. G eny stru k tu ry d e te rm in u ją budow ę odpow iadających im cząsteczek białka, natom iast geny nadrzędne d eterm in u ją ekspresję genów s tru k ­ tu ry w zależności od przem ian chem icznych zachodzących w kom órce. 1. Rekombinacja wzajem na i niew zajem na

Podstaw ow ą m etodą badania lokalizacji, s tru k tu ry i funkcji genów jest obserw acja cech fenotypow ych genów „znakow anych” przez m u ­ tacje. Dzięki tem u m ożna geny lokalizować w poszczególnych chrom oso­ m ach, k tórym odpow iadają w term inach genetycznych grupy sprzęże­ nia. Są to zbiory genów przekazyw ane kom órkom potom nym łącznie, co odkrył już M o r g a n , uzupełniając zasadę M endla niezależnego dzie­ dziczenia cech, w ażną oczywiście wciąż dla każdej p a ry cech, których geny mieszczą się w różnych chrom osom ach. Z czasem okazało się, że w pew nym m ałym odsetku geny należące do tej sam ej grupy sprzężenia dziedziczą się niezależnie. Na podstaw ie da­ nych uzyskanych z badań cytologicznych nad procesam i podziału jąd ra kom órkow ego pow stała koncepcja tzw. crossing-over. Zgodnie z tą kon­ cepcją, w czasie podziału chrom osom ów zachodzi niekiedy ich pękanie i w ym iana hom ologicznych końcówek, w skutek czego jedna z pochod­ nych kom órek m a chrom osom złożony, np. z większego odcinka chrom o­ som u ojca i m niejszego — m atki, druga zaś — odw rotnie, z większego odcinka chrom osom u m atki — i m niejszego — ojca. Z procesu tego w y­ nika rekom binacja w zajem na (ang. reciprocal recombination). Z akłada­ jąc, że praw dopodobieństw o przerw ania ciągłości chrom osom u jest iden­ tyczne w każdym jego m iejscu, m ożna wyw nioskow ać, że częstość re ­

http://rcin.org.pl

GENETYKA BIOCHEMICZNA

[3]

423

kom binacji danej pary genów jest ty m większa, im większa jest odległość m iędzy nimi. Dzięki tem u m ożna ustalać w zajem ne odległości m iędzy genam i, a następnie konstruow ać m apy chrom osom ów nanosząc na od­ cinku prostej odpow iednie p u n k ty reprezentujące poszczególne geny. Stw ierdzona addytyw ność odległości m iędzygenow ych (w yrażonych w procentach rekom binacji) jest jednym z dowodów linearności s tru k tu r genetycznych. Zasada rekom binacji w zajem nej ma sw oje w yjątki, k tórych klasyfi­ kacja, uogólnianie i in te rp re ta c ja stanow ią jeden z zasadniczych pro­ blem ów współczesnej genetyki. Otóż w w yniku badań nad bardzo blisko siebie położonym i m iejscam i m u tacji okazało się, że rekom binacja odby­ wa się często inaczej, niż w ynikałoby to ze w zajem nej w ym iany odcin­ ków hom ologicznych chrom osomów. W przypadku rekom binacji w za­ jem nej proporcje m iędzy hom ologicznym i genam i potom stw a są takie sam e jak w kom órkach m acierzystych. N atom iast w tych ,»wyjątkow ych” rekom binacjach proporcje hom ologicznych genów m ają się do siebie jak 3:1. A więc z tego rodzaju rekom binacji, zw anej nie w zajem ną lub kon­ w e rsją genową (68), uzyskuje się potom stw o o w iększym odsetku jednej cechy rodzicielskiej niż drugiej. Ilu stru je to przykład przedstaw iony w schem acie 1. Jedna z gam et rodzicielskich zaw iera trzy zm utow ane geny a, b i c, zaś druga ich n a tu ra ln e „dzikie” homologi A, B i C W przypadku crossing-over, polegającym np. na w zajem nej w ym ianie fragm entów c i C lub b i B, proporcje m iędzy hom ologicznym i genam i są te sam e jak u rodziców. N atom iast gam ety pow stałe w w yniku kon­ w ersji genowej np. B lub b zaw ierają trzy k ro tn ie więcej osobników z ce­ chą B niż b, lub trzy k ro tn ie w ięcej z cechą b niż B. Dla w yjaśnienia tego rodzaju rekom binacji niew zajem nej L e d e r b e r g (64) p rzyjm uje, że osobniki nietypow e, w naszym przykładzie aBc lub AbC, pow stają w skutek tego, że replikujący się DN jednego G am ety rodzicielskie

A B C

I G am ety potom ne pow stałe w w y n ik u rekom binacji w zajem n ej (kolum ny I i II) oraz niew zajem nej (III i IV)

S to su n ek genów dom inujących (duże litery) do genów recesyw nych (małe litery) w te tr a dach

III

II

IV

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

c

A

b

C

A

B

a a

b b

C

a a

B b

c c

a

B

C c

a

b

c

2

2

2

2

2

2

2

3

2

2

1

2

2

2

2

2

2

2

1

2

2

3

c

S chem at 1. R ekom binacja w zajem n a i n iew zajem na

http://rcin.org.pl

A A a a

B

C

b b

C c

b

c

2 2

424

[4]

chrom osom u na pew nym , zawsze m ałym , odcinku jest odtw arzany w e­ dług m atry cy drugiego chrom osom u (copying-choice). In te rp re ta c ja ta w ydaje się praw dopodobna; istnieje n aw et tendencja by rekom binację w zajem ną, p rzynajm niej u najniższych organizm ów , tłum aczyć m echa­ nizm em copying-choice. Jednakże, w dośw iadczeniach z bakteriofagam i znakow anym i fosforem 32P okazało się, że n aw et u tak p ry m ity w n eg o organizm u zachodzi pękanie i w ym iana końców ek s tru k tu r genetycz­ nych (76). W ydaje się, że rekom binacja niew zajem na i w zajem na są zja­ w iskam i o różnych m echanizm ach (77, 88, 98). 2. Transdukcja, koniugacja i transform acja

B adania lokalizacji, stru k tu ry i funkcji genów są ogrom nie ułatw io­ ne przy posługiw aniu się drobnoustrojam i. Można wówczas, w k rótkim czasie uzyskiw ać ogrom ne ilości kom órek potom nych, a ty m sam ym w ie­ le rekom binantów , co jest niezbędne dla statystycznej oceny w yników . M apy grup sprzężenia dostarczyły cennych danych o w zajem nych re ­ lacjach m iędzy genam i. Badania przeprow adzone n a Escherichia coli i Salmonella ty p h im u r iu m pozw oliły na odkrycie t r a n s d u k c j i przez Z i n d e r a i L e d e r b e r g a (128) oraz k o n i u g a c j i przez L e d e r b e r g a i T a t u m a (cyt. wg 46). T ransdukcja jest procesem przenoszenia m ate ria łu genetycznego b akterii przez bakteriofagi. N iew iru le n tn e fagi, nam nożone przez indukcję w kom órkach szczepu—dawcy, zaw ierają po około 1/100 ich m ate ria łu genetycznego. Fagi po w niknię­ ciu do kom órek szczepu-biorcy w budow ują się w ich m ate ria ł genetycz­ ny lub tylko w cytoplazm ę, w przypadku tran sd u k cji poronnej. Przez swą obecność n ad ają one kom órkom cechy odpow iadające genom za­ w a rty m w przeniesionych fragm entach DN. Jeżeli dany fra g m en t DN zaw iera niezm utow ane geny, hom ologiczne (czyli alleliczne) w stosunku do zm utow anych genów biorcy, to fenotyp tego szczepu nie w ykazuje cech m u tacji. N atom iast jeżeli fagi uzyskane od m u ta n ta —daw cy nie d a ją po­ tom stw a biorcy bez cech m utacji, to oba szczepy są zm utow ane w obrębie tego sam ego genu. T ransdukcja jest cenną m etodą przy sporządzaniu m ap genow ych, przede w szystkim dla genów blisko siebie położonych. Jeżeli fagi na­ m nożone w kom órkach szczepu dzikiego po w budow aniu w m ate ria ł ge­ netyczny biorcy pow odują u części potom stw a zniknięcie dw u cech m u ­ tacji genów A i B, to geny te są położone blisko siebie w obrębie odcinka około 1/100 długości s tru k tu ry genetycznej. Im w ięcej jest potom stw a bez obu cech m u tacji w stosunku do sum y potom stw a bez jed n ej tylko z tych cech, tym bliżej geny A i B są w zględem siebie położone. K oniugacja jest procesem , w trakcie którego n a stę p u je bezpośrednie przekazyw anie m ateriału genetycznego m iędzy kom órkam i b ak tery jn y m i.

http://rcin.org.pl

[5]

GENETYKA BIOCHEMICZNA

425

Zdolność oddaw ania swego DN m ają b ak terie o charak terze płciow ym F +, biorcam i zaś są zawsze kom órki F~. Zjaw isko to zostało szczegółowo zbadane u E. coli (46, 51). Szczególnie n a d a ją się do tego rodzaju badań szczepy zaw ierające tzw. czynnik Hfr, przekazujące DN z wysoką czę­ stotliw ością. P rzeryw ając proces koniugacji w określonych odstępach czasu przez gw ałtow ne m ieszanie w hom ogenizatorze, rozryw a się chro­ m osom y przechodzące powoli do kom órek F ~ . Dzięki tem u kom órki F ~ zaw ierają obok swego chrom osom u rów nież i odcinek chrom osom u daw cy, o długości proporcjonalnej do czasu trw an ia procesu koniugacji. W badaniach tych okazało się, że czynnik Hf r m a stałą u danego szczepu lokalizację. Dzięki tem u m ożna było ustalić położenie genów na całej długości s tru k tu ry genetycznej E. coli. Ich w zajem ne odległości są w y­ rażane w m inutach trw an ia procesu. P rzeniesienie około 1/4 chrom oso­ m u trw a w przybliżeniu 30 m inut. C ałkow ita długość chrom osom u E. coli odpowiada więc 2 godzinom. M apy w yznaczone tą m etodą p okry­ w ają się z m apam i uzyskanym i przy pom ocy tra n sd u k c ji (119). Jed n ak przez koniugację uzyskuje się przeniesienie dużo w iększych odcinków stru k tu ry genetycznej szczepów zaw ierających czynnik Hfr. Dzięki tem u, przy pomocy kilku takich szczepów m ożna było sporządzić m apę gene­ tyczną dla całej długości jedynego chrom osom u E. coli i ustalić, że m a on k ształt zam kniętej obręczy, pękającej w m iejscu zajm ow anym przez czynnik Hfr. W czasie koniugacji czynnik ten przechodzi do kom órki biorcy jako pierw szy i um iejscaw ia się tak, że geny penetrującego chro­ mosomu układają się naprzeciw ko allelicznych genów biorcy (119). Transformacja czyli przenoszenie cech jednego szczepu na drugi za pomocą izolowanego DN om ówiona ostatnio przez E p h r u s s i -Taylor (23) ma m niejsze znaczenie w badaniu s tru k tu r genetycz­ nych. T ransdukcja, transform acja i koniugacja um ożliw iają w prow adzenie m ateriału genetycznego jednego szczepu (dawcy) do kom órek drugiego szczepu (biorcy). M ateriał ten ulega w budow aniu przez crossing-over lub copying-choice, w rezultacie czego kom órki biorcy, w m iejsce zm u­ towanego genu, mogą uzyskać gen norm alny, potocznie zw any „dzikim ” . Łatwo można je w ykryć za pomocą odpow iednich podłóż selekcyjnych. Jednakże stosow alność tran sd u k cji, koniugacji i transform acji jest ogra­ niczona fizjologicznym i w łasnościam i danego g atu n k u bakterii. W ba­ daniach genetycznych u drożdży m ożna stosow ać proces diploidyzacjidwie haploidalne kom órki o przeciw nych znakach płciow ych tw orzą ko­ m órkę diploidalną, analogicznie do procesu zapłodnienia u zw ierząt. U Neurospora crassa — organizm u często używ anego w badaniach za­ leżności m iędzy genom em a cytoplazm ą, przez łączenie kom órek jed nojądrow ych uzyskuje się heterokariony, to jest kom órki d w ujądrow e.

http://rcin.org.pl

T. KŁOPOTOWSKI

426

[6]

U bakteriofagów badania genetyczne um ożliw ia rekom binacja za­ chodząca w w yniku łącznej infekcji b ak terii dw om a szczepam i fagów. Technika ta pozwoliła B e n z e r o w i (7, 8) na sporządzenie szczegóło­ wej m apy genetycznej, obejm ującej locus r II faga T4 E. coli. U zyskane w yniki nie tylko zw iększyły pewność, że s tru k tu ry genetyczne są lin ear­ ne (8), lecz rów nież um ożliw iły Benzerow i zdefiniow anie kilk u now ych pojęć genetycznych, z k tórych najszerzej przyjęło się pojęcie cistronu (7). Cistron jest odcinkiem s tru k tu ry genetycznej, którego w y m iary ok reś­ la test kom plem entacji, zw any też testem cis-trans. G dy m iędzy haploidalnym i m utan tam i zachodzi kom plem entacja i diploid nie w ykazuje Cecha mutacji

Wzajemne poło­ żenie m iejsc zmutowanych

nie ma

trans

Krzyżówka 1 x 3

nie ma

trans

Krzyżówka 1 x 4

jest

cis

nie ma

trans

Krzyżówka 2 x 4

nie ma

trans

Krzyżówka 3 x 4

nie ma

trans

Krzyżówka 1

X

2

-x-

Krzyżówka 2 x 3 X

S chem at 2. P rzebieg k la sy fik ac ji gru p y m u ta n tó w o te j sam ej cesze m u ta cji za pom ocą te stu kom p lem en tacji (testu cis-tra n s). M u ta n ty oznaczono cy fram i od 1 do 4. O dcinki poziom e p rze d staw ia ją frag m en ty chrom osom u. L inie pionow e słu ­ żą do oddzielania cistronów m iędzy sobą. K rzyżyki re p re z e n tu ją m iejsca m u tacji. W ynik dośw iadczenia: szczepy 1 i 4 są allelam i. Ich m iejsca m u ta c ji z n a jd u ją się w obrębie tego sam ego cistronu. M iejsca m u ta cji szczepów 2 i 3 są położone w obrębie innych cistronów . P rzy pom ocy analizy rek o m b in acji będzie m ożna w y ­ kazać położenie m iejsc m u ta cji tych szczepów w zględem siebie oraz w zględem m iejsc m u ta cji innych cistronów , w cześniej zb ad an y ch i n an iesionych n a m apę genetyczną tego organizm u.

http://rcin.org.pl

[7]

GENETYKA BIOCHEMICZNA

427

cechy m utacji, wówczas szczepy badane są zm utow ane w dw u różnych cistronach (schem at 2). N atom iast dw a haploidalne m u ta n ty są zm utow a­ ne w obrębie tego samego cistronu, jeżeli tw orzą diploid z cechą m utacji. Jakkolw iek pojęcie cistronu w ynikało z założeń m etodycznych, coraz liczniejsze dane w skazują, że je st on istotnie jednostką funkcji genom u, co będzie om ówione dalej. W tym sensie cistron byłby synonim em genu, jednakże nazwę cistron m ożna używ ać tylko dla -tych genów, których w ew nętrzna s tru k tu ra i rozm iary zostały opracow ane za pomocą testu cis-trans. Genam i natom iast m ożna nazwać tylko te cistrony, któ re dzię­ ki badaniom enzym atycznym okazały się niepodzielnym i jednostkam i fu n k cji genomu. Nazwę gen stosuje się rów nież tam , gdzie nie jest roz­ strzygnięte lub nieistotne, czy czjm nik genetyczny d e term in u jący daną cechę jest pojedynczym cistronem , czy też składa się z kilku cistronów . II. Struktura materiału genetycznego 1. Model

Watsona

i

Cricka

Na podstaw ie danych rentgenograficznych uzyskanych w pracow ni W i l k i n s a w K in g ’s College ( 116), W a t s o n i C r i c k podali m odel cząsteczki DN (111, 112). Dwa spiralne łańcuchy polinukleotydow e splecione są regularnie m ię­ dzy sobą. Ich w zajem ną łączność u trzym ują w iązania wodorow e m iędzy należącym i do zasad atom am i azotu i tlenu lub dwom a atom am i azotu. A denina i tym ina tw orzą parę dw uw iązaniow ą, zaś guanina i cytozyna, jak to później uzupełnili P a u l i n g i C o r e y (87) — parę trójw iązaniową. Zasady znajdują się w ew nątrz cząsteczki, a ich płaszczyzny są prosto­ padłe do jej osi. G rupy fosforanow e znajdują się na zew nątrz. Skok każdej ze spirali ma 34 A, a zatem cząsteczka o masie 106 posiada 150 splotów. Model cząsteczki DN, zaproponow any w 1953 roku w bardzo hipote­ tycznej form ie znalazł potw ierdzenie zarówno w badaniach ren tg en o g ra­ ficznych, jak i w badaniach nad częściowymi hydrolizatam i DN (89, 104). Jednakże stru k tu ra taka nie jest uniw ersalna: okazało się, że bakteriofag w

^^ m id

a

własności enzymów

pod wpływem

m u ta cji

H O *co o tí co cd

U >> G 2

g

£ w

U

u

£

£ w

§ Pi u

t/f < +

J H

J H

o


tí co CO

cu

CO tí co CO £ cd

N

cd -♦-> Q) +-> tí >> CO

Xi l-l

Ph

£ CO CO co

tí >> o tí

CO O

'c

xi

CU

Q

i LO 1 O tí

tí co CO £

X CO N CO

3 TS eu

tí

i

cd

£

O T3 >> N CD

o

tí tí CO «M -)-> ft >>

tí cd 3 CO cd £ cd

cu

cd 0)

c

>> C/3

cd N cd

cd N cd

cd N cd

u

tí

ÍH

CO

Eh

cu

ï>*

g cd ÍH 4->

tí

cd co cd

CU

ÍH

o CO O «Q +H

*+H

s

cd

N

cd 4-> 0) tí

>> co

http://rcin.org.pl

i 1

cd

N (H

cd

co

cd

N U

C5

Id

CO

6-fosfogIikoza----> kwas 6-fosfoglikono wy

I

6-fosfofruktoza ATP

5-fosforyboza

t

1,6-d wuf osf of ruktoza ________ l _

/

/

V

fosfodwuhydroksyaceton

aldehyd 3-fosfoglicerynowy ADP—. ATP kwas m lekowy

-2,3-DPG

S chem at 1. P rz em ian a glikozy w erytrocycie w g G a b r i o

i w sp. ( 8)

-D-ksylulozę, z drugiej strony wydaje się mieć związek z syntezą kwasu L-askorbinowego. Istnieje więc szereg możliwości m etabolizow ania glikozy w ery tro cy ­ tach. G łów ną drogę stanow i niew ątpliw ie proces glikolizy, z któ ry m w spółdziała w m niejszym czy w iększym stopniu cykl pentozow y. Udział cyklu pentozow ego w przem ianach zależy od w arunków , np. można tak dobrać w arunki dośw iadczalne, że będzie on dom inującym procesem m e­ tabolicznym . Istn ieje rów nież możliwość przem iany glikozy poprzez cykl kw asów uronow ych. W rezultacie tych przem ian nagrom adza się w erytrocycie pew na ilość energii, zm agazynow ana głów nie w postaci ATP. Oprócz A T P w erytrocy­ tach w ystępuje szereg innych nukleotydów , k tó re zostały ostatnio ziden­ tyfikow ane przez B i s h o p a i in. (5) przy zastosow aniu rozdziału na w ym ieniaczach jonow ych. Badacze ci znaleźli w e ry tro cy tach świeżej k rw i ludzkiej następujące nukleotydy: ATP, ADP, AMP, N A D P i NAD oraz GTP, pochodną cytozyny (przypuszczalnie CD P-cholina), pochodną u ra ­ cylu (przypuszczalnie UD P-glikoza) i niezindetyfikow aną pochodną adeni­ ny (AXP). Nie znaleziono natom iast nukleozydów ani w olnych zasad p u rynow ych i pirym idynow ych, poza kw asem m oczow ym i bardzo niew iel­ kim i ilościam i hipoksantyny. Bishop przeprow adził rów nież szczegółową analizę osocza i stw ierdził obecność tylko dw óch w ierzchołków , które od­ pow iadają kwasowi m oczow em u oraz składnikow i nie posiadającem u b u ­ dowy purynow ej czy pirym idynow ej. Rozdział nu k lety d ó w przedstaw iony jest na ry su n k u 2, a ilościow e w yniki Bishopa w tab licy 1. J a k w ynika z tablicy 1 całkow ita zaw artość ad en in y (ze w szystkich nukleotydów ) w pełnej krw i wynosi około 0,4— 0,7 mM/1, co w przelicze­ niu na stężenie w ery tro cy tach (w artość h e m a to k ry tu 47% ) wynosi około 0,9— 1,5 mM (dla 18 osób). D ane te zgodne są z w ynikam i otrzym anym i przez innych badaczy zupełnie odm iennym i m etodam i. Z estaw ię je z w y -

http://rcin.org.pl

515

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

[5]

Rys. 2. Rozdział na w ym ieniaczach jonow ych nukleo ty d ó w lu d zk iej k rw i p ra w id ło ­ w ej wg B i s h o p a i wsp. (6); a) krew , b) osocze

Tablica

1

Z aw artość nukleotydów w e k rw i p raw idłow ej w g B i s h o p a i wsp. (5) Stężenie w m ikrom olach sk ład n ik a w litrze pełnej 'krwi NAD

K w as moczowy

AM P

NADP

ADP

A TP

GTP

M ężczyźni K obiety

29,8 32,4

140,9 135,1

6,2 5,1

11,6 11,2

47,8 46,6

433,2 424,8

24,5 26,4

W artości graniczne

2 2 -4 0

94 -1 7 3

2 -1 4

2 -1 5

3 2 -7 3

287-587

1 3 -3 6

nikami R o 11 i n o (17), otrzymanymi metodą enzymatyczną K a l e k a r a, oraz z naszymi badaniami (13) przy zastosowaniu wytrącania puryn solami srebra a następnie oznaczeniu ich metodą spektrofotometryczną i polarograficzną (tabl. 2). Należałoby tu podkreślić fakt, że nukleotydy adenino we zawarte są jedynie w erytrocytach, natomiast brak ich jest zu­ pełnie w osoczu krwi. W szystkie zmiany zawartości tych związków od7*

http://rcin.org.pl

W. LEYKO

[6]

zw ierciadlają więc pew ne procesy odbyw ające się w ew nątrz erytrocytów , a nie w ym ianę związków adeninow ych m iędzy krw ią a tkankam i, z k tó ­ rym i krew się styka. Tablica

2

C ałkow ita zaw artość nukleotydów w ery tro cy tach Badacze Rottino i wsp. Bishop i wsp. Leyko i wsp.

Metoda enzym at. spektrof. wym. jonowe, spektrof. Ag20 spektrof. polar.

Rok publ. 1952 1959 1959

mM adeniny/l

Ilość przy p .

0 , 6 - 1,6

21

0 ,9 -1 ,5 0 ,9 - 1 ,6

22

18

Zw iązki te m ają podstaw ow e znaczenie dla praw idłow ego funkcjono­ w ania erytrocytów . U w idoczniły to badania dotyczące krw i konserw ow a­ nej, zainicjow ane przez G a b r i o (8), a kontynuow ane przez szereg badaczy, np. przez w spom nianych już uprzednio B a r t l e t t a i B a r n e t a (2); badali oni skład krw i w czasie 0, 8, 15, 22, 34, 44, 62 dni przecho­ w yw ania, określając oprócz nukleotydów rów nież estry fosforowe cukrów . P rzedm iotem ich badań były zm iany ilościowe w składzie 7 zasadniczych składników , tj. fosforanu nieorganicznego, m onofosforanów (MP), heksozodwufosfioranów (HDP), 2,3-DPG, ADP, A TP i AX P. W yniki oznaczeń B a rtle tta i B arneta przeprow adzane we krw i przechow yw anej 0, 15 i 62 dni przedstaw ione są na ry su n k u la, b i c. Po okresie 15 dni przechow yw a­ nia zaobserwow ano gw ałtow ny spadek 2,3-DPG i nieznaczne zm niejszenie się zaw artości ATP, natom iast po 62 dniach ponad 90% fosforanów orga­ nicznych rozpuszczalnych w kw asach znikało z erytrocytów . N ależałoby tu podkreślić, że przy przechow yw aniu krw i ludzkiej dopiero po w yczer­ paniu 2,3-DPG n astęp u je gw ałtow ny rozpad ATP. Jeżeli rozkład nukleotydów adeninow ych nie pójdzie zbyt daleko, to m ożliwa jest ich regeneracja, k tórej tow arzyszy rów nież regeneracja czyli tzw. „odm łodzenie” erytrocytów . ,,O dm łodzony” ery tro cy t w prow a­ dzony do aktyw nego krążenia zdolny jest do „przeżycia” po transfuzji. R egenerację erytrocytów m ożna przeprow adzić na drodze inkubacji z m itochondriam i w ątroby. Podobne efekty dają różne nukleozydy, np. adenozyna, inozyna, guanozyna i ksantozyna. Są one przypuszczalnie m e­ tabolizow ane przy udziale fosforylazy nukleozydow ej, dając adeninę i 2-fosforybozę, k tó ra poprzez 5-fosforybozę włącza się do cyklu pen to ­ zowego erytrocytów (schem at 1). Zgodnie z tym schem atem ak tyw nym składnikiem dodanego nukleozydu jest cząsteczka rybozy, a nie pu ry n y . Tę drogę przem iany potw ierdziły badania B a r t l e t t a (2). B a rtle tt określał zaw artość 2,3-DPG, ADP, ATP, IM P (kwas inzynowy), fosfo­ ra n u nieorganicznego, S-7-P (7-fosfosedoheptuloza) we krw i królika kon-

http://rcin.org.pl

\

IX KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE'

517

serw ow anej w ACD (roztw ór cytrynian-glikoza) i w ACDI (ACD z do­ d atk iem inozyny). O trzym ane w yniki przedstaw ione są na ry su n k u 3. N ajbardziej uderzającym efektem działania inozyny w dośw iadczeniach B a rtle tta było nagrom adzenie 7-fosfosedoheptulozy, zw iązku biorącego bezpośredni udział w pentozow ej przem ianie węglowodanów.

20 15

\\ \\

P nieorg.

DPQ

\\ \ \ \v \ \ V h \\ N. *

10 5

1/ 0

i

.

I=»>4 ~ c.

\ \ \\

‘ 2 £ a

\ V '

/

/

/

/

l ----- O IMP

0,4

/ ^

0

/

/

ADP

f /

0,2 0

S - 7-P

ATP

/

/

3

0 6

0

3

6

Tygodnie przechowywania ----- ►

Rys. 3. Z m iany zaw artości składników fosforanow ych ery tro cy tó w k ró lik a wg B a r t l e t t a i S h a f e r a (3); przechow yw anie w ACD (linia ciągła) i w ACDI (linia p rzeryw ana) w tem p. 4°

Przytoczone badania w yjaśniły niezm iernie w ażny fakt, a m ianowicie, że związki adenino we konieczne są dla właściwego funkcjonow ania, więcej naw et — dla istnienia erytrocytów . We w nętrzu ery tro cy tu zn ajd u je się szereg układów enzym atycznych, zw iązanych przede w szystkim z m eta­ bolizm em węglowodanów, których celem jest utrzym anie ATP na odpo­ w iednim poziomie. Jeśli ATP, a w łaściw ie nagrom adzona w nim energia, jest czynnikiem tak istotnym , decydującym do pewnego stopnia o zdolności istnienia erytrocytu, to właściw ie do jakich celów ta energia jest w yzyski­ wana?

http://rcin.org.pl

518

W. LEYKO

[8 ]

Przy odpowiedzi na to py tan ie p rzy jm u je się jako ustalone cały szereg m echanizm ów i pojęć, które jednak nie są udow odnione i często m ogą być m ylne, jak w ykażę to np. w przypadku tra n sp o rtu jonów fosforanow ych.

II. Procesy przebiegające kosztem energii nagromadzonej w erytrocytach Ja k już w spom niałam na początku, ery tro cy t tak jak i inne kom órki potrzebuje energii dla zachow ania integralności sw ej s tru k tu ry . S tru k tu ra ta jest wysoce zorganizow ana, składa się głów nie z lipidów i białek i jest w niej inkorporow anych szereg enzymów. Stw ierdzono np., że ATP-aza, fosfataza, D PN -aza, fosforylaza nukleotydow a i szereg proteinaz są ściśle związane ze strom ą ery tro cy tó w (9). P rzy rozw ażaniu s tru k tu ry e ry tro ­ cytów należałoby w spom nieć o hipotezie P r a n k e r d a , A l t m a n n a i Y o u n g a (15), sugerującej, że dla u trzym ania k sz ta łtu (biconcave) e ry ­ tro c y tu potrzebna jest w ystarczająca ilość w iązań bogatych w energię, a więc w ystarczające tem po regeneracji ATP. Może to być związane z działaniem pew nych kurczliw ych elem entów w strom ie kom órkow ej, przypom inających m iozyn, któ re tak jak m iozyn mogą m ieć aktyw ność ATP-azy. A utorom tym nie udało się jed n ak w ykazać bezpośredniego związku m iędzy zaw artością A T P a kształtem e ry tro c y tu i pew nym i scho­ rzeniam i hem olitycznym i. W niektórych pow ażnych zaburzeniach, np. dziedzicznej sferocytozie, nie zaobserw ow ali oni w yraźnych zm ian w stę­ żeniu ATP i 2,3-DPG. (W norm ie zaw artość A TP w yrażona w i-ig P /m l ubitych krw inek w ynosiła 43,2 ± 5,4 dla 8 przypadków , przy sferocytozie 38,2 ± 6,6 dla 14 przypadków ). Z drugiej stro n y dla osobników norm al­ nych, nie w ykazujących żadnych zaburzeń hem olitycznych, zaw artość tych związków w aha się w szerokich granicach. C ałkow ita zaw artość ade­ niny w edług R o t t i n o (17) leży w granicach 4— 10 mg°/o (21 osób), a w edług naszych danych (13) w granicach 5— 10 mg%> (22 osoby). Cho­ ciaż więc nie ulega w ątpliw ości, że w utrzy m an iu s tru k tu ry e ry tro cy tu w spółdziałają związki bogate w energię, nie jest to jednakże ich jedyną rolą. Z ostatnio przeprow adzonych badań w ynika, że tra n sp o rt szeregu jo­ nów odbywać się może tylko dzięki energii nagrom adzonej w ery trocytach. Chciałabym omówić dw a takie przykłady, tj. tra n sp o rt jonów N a+ i K + oraz jonów fosforanow ych. Błona erytrocytów jest w ybiórcza w stosunku do jonów sodu i potasu, chociaż te jony m ają podobne rozm iary i ładunki. W e ry tro cy tach stęże­ nie potasu jest około 150 mM, podczas gdy w osoczu 4,5 mM, natom iast stężenie sodu w ery tro cy tach jest około 10 mM a w osoczu 145 mM. Róż­ nicę w zachow aniu się błony w stosunku do N a+ i K J tłum aczy się istnie­ niem nośników (carriers) z różnym pow inow actw em do tych dw óch jonów.

http://rcin.org.pl

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

[9]

519

P rzy to czę tu hipotezę S h a w a (1954 r.), któ ra przedstaw iona jest sche­ m aty czn ie na ry su n k u 4 (12). W olny nośnik K + nie może poruszać się przez błonę (rysunek 4-1), zan im nie utw orzy zw iązku z K + (rysunek 4-2). W tedy przechodzi z ze­ w n ę trz n e j stro n y błony do w ew nętrznej stro n y (rysunek 4-3) i pobiera e n e rg ię z w n ętrza kom órki. E nergia ta zam ienia go w nośnik N a+ (rysu­ n e k 4-4), k tó ry znow u nie może przechodzić przez błonę zanim nie połą­ czy się z N a + (rysunek 4-5). W tedy przenika znow u do zew nętrznej strony Z e w n ę tr zn a

s tr o n a

kom órki

Wnętrze komorki

O Nośnik sodu o Sod

9 Nośnik potasu • Potas

^

Energia

Rys. 4. T ra n sp o rt jonów N a+ i K + w g S h a w a

(12); o b jaśn ien ia w tekście.

błony i oddaje N a+ (rysunek 4-6). O ddaje rów nież energię, przypuszczal­ nie za pośrednictw em enzym u i staje się na nowo nośnikiem K + (rysunek 4-1). Je st to tzw. „ak ty w n y tra n s p o rt”, poniew aż kom órka dostarcza energii do uruchom ienia pew nego u k ład u przeciw ko dużym gradientom stężenia N a+ zew nątrz i K + w ew nątrz kom órki. G radienty te pow odują w olne „przeciekanie” N a + do środka a K+ na zew nątrz ery tro cy tu . O zw iązku m iędzy dostarczaniem energii i aktyw nym tran sp o rtem nie wiadomo nic poza tym , że energia w ydaje się być dostarczana przez ATP i pobierana jest z procesu glikolizy. Przypuszczalnie w szystkie ssaki po­ kry w ają to zapotrzebow anie energetyczne z układów glikolizy, podczas gdy e ry tro cy ty jąd rzaste czerpią energię potrzebną do tra n sp o rtu jonów z procesów oddechowych.

http://rcin.org.pl

520

W.

LEyK O

[10]

W przypadku tra n sp o rtu fosforanów należałoby natom iast zrew idow ać ogólnie p rzy jęte pojęcia. M ianowicie uw aża się powszechnie, że tra n sp o rt nieorganicznych fosforanów do w nętrza e ry tro cy tu jest ściśle zw iązany z glikolizą. G o u r 1 e y (10) doszedł do w niosku, że fosforany dostają się do w n ę­ trza ery tro cy tu poprzez tw orzenie ATP na pow ierzchni kom órki. P r a n k e r d i A l t m a n (14) oraz B a r t l e t t (1) podali, że P nieorganiczny jest przenoszony do w nętrza ery tro cy tu przez inkorporację do kw asu 1,3-dwufosfoglicerynow ego. N atom iast badania przeprow adzone w 1961 ro­ ku przez Z i p u r s k y ’e g o i I s r a e l s a (19) sugerują, że tra n sp o rt P nieorganicznego jest niezależny od glikolizy. Badacze ci przeprow adzili inkubację krw i z :i2P w obecności: a) glikozy, b) glikozy i kw asu jodooctowego (całkow ite zaham ow anie produkcji kw asu mlekowego) i c) gli­ kozy, kw asu jodooctowego i adenozyny. N astępnie badali radioaktyw ność trzech frakcji: pierw sza frakcja (0,1 N N H 4C1) zaw ierała dw ufosforany

Rys. 5. T ra n sp o rt fosforu nieorganicznego w g Z i p u r s k y ’ e g o i I s r a e l s a (19) w obecności: a) glikozy, b) glikozy i k w asu jodooctow ego i c) glikozy, k w asu jo d o ­ octow ego i adenozyny.

heksoz, głów nie 2,6-dw ufosfofruktozę, druga frak cja zaw ierała 2,3-DPG, trzecia frak cja ATP. O trzym ane w yniki przedstaw ione są na ry su n k u 5. W obecności glukozy 32P znaleziono przede w szystkim w 2,3-DPG i ATP, natom iast zaham ow anie glikolizy zapobiegało inkorporacji 32P do tych estrów . Jeśli przy zaham ow anej glikolizie dodano adonozyny, pow staw ały heksozodw ufosforany, głów nie 2,6-dw ufosfofruktoza. W przypadku a) i c) nieorganiczny fosforan przenikał do erytrocytów z tą sam ą szybkością, jednak m usiał przechodzić dw ie różne drogi m etaboliczne. Zdaniem Z ip u rsk y ’ego i Israelsa w obecności sam ej glikozy ortofosforan jest w ykorzy­ sta n y w reakcji katalizow anej przez dehydrogenazę ald eh y d u 3-fosfoglicerynow ego; tw orzy się wówczas kw as 2,3-dw ufosfoglicerynow y. W przypadku zaham ow ania glikolizy w obecności adenozyny fosforan włącza się przypuszczalnie poprzez i-fosforybozę przy udziale fosforylazy nukleozydow ej. Ten m ateriał może być dalej m etabolizow any i pow oduje nagrom adzenie się 2,6-dw ufosfofruktozy. Podobne zjaw iska zaobserw o­

http://rcin.org.pl

[11]

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

521

w ano uprzednio na cieniach erytrocytów , k tó re nie m ogą m etabolizow ać glikozy. Pobieranie fosforanów przez cienie jest wzmożone w obecności adenozyny i tow arzyszy m u fosforoliza adenozyny i m etabolizm rybozy. Poniew aż w norm alnych w arunkach w osoczu nie ma rybozydów , w ydaje się niepraw dopodobne, żeby fosforoliza była norm alnie zw iązana z pobie­ ran ie m fosforanów przez ery tro cy ty . Z drugiej strony ta sam a szybkość tran sp o rtu fosforanów w przypadku glikolizy aktyw nej i zaham ow anej sugeruje, że proces ten jest jednakow y w obu przypadkach i niezależny od glikolizy. M echanizm pobierania jonów fosforanow ych jest więc ciągle jeszcze niew yjaśniony i, jak należałoby sądzić z badań Z ip u rsk y ’ego i Israelsa, nie odbyw a się on kosztem energii w ytw arzanej w procesie glikolizy. Energia grom adzona w ery tro cy tach w yzyskiw ana jest również nie­ w ątpliw ie w procesach zw iązanych z m etabolizm em białek i tłuszczów. W iadom ości na ten tem at są ciągle jeszcze bardzo nieliczne. Przytoczę tu doniesienie S t o l z m a n n a (18) dotyczące tra n sp o rtu i czynnego zagęsz­ czania w olnych am inokw asów przez krw inki jak rów nież zaobserw ow any przez H i e r o w s k i e g o (11) proces ak tyw acji niektórych am inokw asów w e ry tro cy tach człowieka. Ponadto B e r n s t e i n (4) stw ierdził, że w e ry ­ tro cy tach przebiega synteza g lutationu z poszczególnych am inokw asów , w chodzących w jego skład. Jed n y m z zadań erytrocytów jest utrzym anie hem oglobiny w stanie zredukow anym . D w uw artościow e żelazo w hem oglobinie ery tro cy tó w we krw i krążącej podlega stale działaniu czynników utleniających. W procesie red u k cji tw orzącej się m ethem oglobiny (MHb) (w norm ie około 0,7%) w spółdziałają zarów no układ beztlenow ej glikolizy jak i cykl pentozow y krw inek. G a b r i o (8) badając reakcję utlenienia 6’-fosfoglikozy do kw asu 6-fosfoglikonowego stw ierdził, że pierw szym koenzym em biorącym udział w tej reakcji jest NADP i że reakcja stym ulow ana jest przez błękit m ety ­ lenow y. N astępnie wyizolow ał enzym — reduktazę MHb, k tó ra katalizu je reakcję: N A DPH 2 zw iązana lub e hem atyna NADH 2 > ,410”

e

czynnik rozp. O* „400” e lub >lub błęk it m etyl. > MHb

Podobnie jak w innych układach elektrony przerzucane tu są przez szereg nośników, w ydaje się więc praw dopodobne, że procesowi tem u to ­ w arzyszą rów nież jakieś przekształcenia energetyczne, w których m oże brać udział ATP. N ależałoby podkreślić, że ery tro cy ty ssaków m ają specjalne funkcje do spełnienia jako kom órki. W szystkie te skom plikow ane procesy, o k tó ­ rych pokrótce tu w spom niałam , składają się na w spólną całość, um ożli­ w iającą ostatecznie spełnienie zasadniczej roli erytrocytów , jaką jest tra n s­ p o rt tle n u w organizm ie. Proces ten m usi więc być rów nież m niej czy więcej pośrednio zw iązany z ogólnym m etabolizm em ery tro cy tó w i z na­

http://rcin.org.pl

522

W . LEYKO

[1 2 ]

grom adzoną w nim energią. Podkreślą może jeszcze raz, że jeśli w trakcie przechow yw ania krw i, poziom A TP spadnie poniżej pew nego granicznego stężenia, to ery tro cy t nie jest zdolny do „przeżycia” po tra n sfu z ji i zostaje usunięty z krążenia. W ciągu ostatnich lat zm ieniły się bardzo poglądy dotyczące s tru k tu ry i m etabolizm u erytrocytów . E ry tro cy t uw ażany pierw otnie za rodzaj cien­ kościennego balonika napełnionego płynną hem oglobiną, za jak b y zhem oglobinizow ane widm o kom órki, stał się obecnie przedm iotem badań doty­ czących szeregu skom plikow anych procesów enzym atycznych. Zarzucono ostatecznie pogląd sprzed 1930 roku, że ery tro cy t jest zapieczętow anym układem ze stałą zaw artością jonów. S tan jonow y uw aża się obecnie za tycznych um ożliw iło zrozum ienie podstaw ow ych procesów m etabolicz­ nych, przebiegających we w n ętrzu erytrocytów , chociaż w iele etapów pozostaje jeszcze niew yjaśnionych. Na zakończenie przytoczę jeszcze zdanie w ypow iedziane w 1948 roku rez u lta t dynam icznej rów now agi, a w prow adzenie now ych m etod analiprzez P o n d e r a (9), jednego z w ybitnych badaczy m etabolizm u ery ­ trocytów : „Pow iedziano mi, że m am skłonność do m ów ienia o erytrocycie tak, jak gdyby to był m ikrokosm os i jakby zrozum ienie jego n a tu ry i własności było praw ie jednoznaczne ze zrozum ieniem w szystkich innych procesów w świecie kom órek. W pew nym sensie jest to praw dziw e.” L ITER A TU R A 1. 2. 3. 4. 5.

B a r t l e t t G. R., A nn. N. Y . Acad. Sci. 75, 110 (1958). B a r t l e t t G. R., B a r n e t H. N., J. Clin. In ve st. 39, 56 (1960). B a r t l e t t G. R., S h a f e r A. W., J. Clin. In ve st. 39, 62 (1960). B e r n s t e i n R. E., Kom. IV. Międz. K ongr. C hem ii K lin., E d y n b u rg 1960. B i s h o p Ch., R a n k i n e D. M., T a l b o t t J. H., J. Biol. C hem . 234, 1233 , (1959). 6. B r i n M., Y o n e m o t o R. H., J. Biol. C hem . 230, 307 (1958). 7. C h m i e l J., Post. B iochem . 7. 264 (1961). 8. G a b r i o B. W., F i n ic h C. A., H u e n n e k e n s F. M., Blood 11, 10 (1956). 9. G l y n J. M., Progr. B iophys. Biol. C h e m istry 8, 241 (1957). 10. G o u r l e y D. R. H., A rch. Biochem . B iophys. 40, 1 (1952). 11. H i e r o w s k i M., N ature 191 (1961). 12. H o l t e r H., Sci. A m . 205, 168 (1961). 13. L e y k o W., Z w iązki adeninow e k rw i ludzkiej, Łódzkie Tow. N auk., Wydz. III, Nr. 61 (1959). 14. P r a n k e r d T. A. J., A l t m a n K. J., B iochem . J. 58, 622 (1954). 15. P r a n k e r d T. A. J., A l t m a n K. J., Y o u n g L. E., J. Clin. In ve st. 34, 1268 (1955). 16. R a p o p o r t S., L u e b e r i n g J., J. Biol. C hem . 183, 507 (1950). 17. R o t t i n o A., H o f m a n G. T., A l b a u m H., Blood 7, 836 (1952). 18. S t o l z m a n n Z., W a l i g ó r a Z., Kom. IV Międz. K ongr. Chem ii Klin., E d y n b u rg 1960. 19. Z i p u r s k y A., I s r a e l s L. G., N ature 189, 1013 (1961).

http://rcin.org.pl

P

O

S

TOM VIII

T

Ę

P

Y

B

I

O

C

H

1962

E

M

I

I

ZESZYT 4

J E R Z Y K R A W C Z Y Ń S K I*

Transport jonów i drobin przez błonę krwinki czerwonej Transport of Ions and Molecules through the Erythrocyte Membrane The hypothetical m echanism s of inorganic ions, su g ars and am ino acids tra n sp o rt th ro u g h e ry th ro cy te m em b ran e are review ed.

T ran sp o rt jonów i drobin przez błonę kom órkow ą jest jednym z n a j­ w ażniejszych. procesów biologicznych. Proces ten w a ru n k u je bowiem u trzy m an ie określonego składu kom órki i zachow anie integralności jej s tr u k tu ry (7). Ż yw y organizm różni się sw ym składem od otaczającego go środow iska, a żyw a kom órka posiada inny skład, niż otaczający ją płyn pozakom órkowy. Ta odrębność składu kom órki u trzym yw ana przeciw gradientow i stę­ żeń i przeciw spadkow i p otencjału elektrochem icznego jest w ynikiem sw oistych własności błony kom órkow ej, w k tórej zlokalizow ane są m e­ chanizm y tran sp o rtu jące jony i cząsteczki do kom órki i z kom órki na ze­ w nątrz. W ynika stąd więc, że błona kom órkow a um ożliw iająca osiągnięcie rów ­ now agi biologicznej m iędzy kom órką i jej otoczeniem m usi być wysoce skom plikow anym układem biologicznym , w pływ ającym czynnie i na skład środow iska w ew nętrznego kom órki i na skład środow iska pozakom órkowego. T ransport przez błonę kom órkow ą może być zarów no procesem czyn­ nym jak i biernym . T ransport czynny cząsteczki lub jonu przez błonę ko­ m órkow ą zw iązany jest z zużyciem energii nagrom adzonej w procesach przem iany pośredniej i odbyw a się w k ieru n k u w zrostu potencjału elek ­ trochem icznego układu: kom órka—płyn pozakom órkow y i przeciw spad­ kowi stężenia substancji przenoszonej. T ransport bierny cząsteczek lub jonów odbyw a się zgodnie ze spadkiem potencjału elektrochem icznego rozpatryw anego układu, zgodnie ze spad­ kiem stężeń i nie w ym aga dopływ u energii z zew nątrz. * Doc. dr, k ierow nik Z akładu A n ality k i In s ty tu tu D oskonalenia i S p ecjalizacji K ad r L ek a rsk ich w W arszaw ie.

http://rcin.org.pl

J. K R A W C ZY Ń SK I

[21

W ostatnich latach prow adzone są intensyw ne badania m ające na celu m ożliw ie najdokładniejsze poznanie m echanizm ów przechodzenia różnych związków przez błonę krw inki czerw onej. Szczególnie interesującym i okazały się badania dotyczące m echanizm ów przechodzenia m ałych jonów, zwłaszcza sodu i potasu, zw iązanych ściśle z procesam i regulacji osmotycznej ustroju. Nie m niejsze zainteresow anie w zbudziły także procesy tra n sp o rtu przez błonę k rw inki i innych substancji drobnocząsteczkow ych, takich jak cukrow ce i am inokw asy.

I. Transport jonów Skład elektrolitow y krw inki czerw onej odpow iada składow i płynu w śródkom órkow ego, a więc cechuje się wysoką zaw artością potasu i fosfo­ ranu. Jedyną cechą odróżniającą krw in k ę czerw oną od innych kom órek jest stosunkow o duża ilość znajdującego się w niej anionu chlorkow ego, pow szechnie uw ażanego za jon w yłącznie pozakom órkow y. Jakościow e i ilościowe rozm ieszczenie poszczególnych elek tro litó w w krw ince czer­ w onej jest różne u różnych gatunków zw ierząt a naw et u różnych ras tego sam ego gatu n k u (20). 1. Transport sodu

Błona krw inki czerw onej jest przepuszczalna dla sodu w obydw u kie­ runkach. W ykazano to w dośw iadczeniach z radioaktyw nym sodem (30). Tym niem niej p e n e trac ja *4Na z osocza do ery tro cy tó w jest bardzo w olna (nie przekracza 9°/o w ciągu 4 godzin). Stosunek stężeń sodu w osoczu i w erytrocycie k sz ta łtu je się jak 8,5 do 1. U trzym anie tak wysokiej róż­ nicy stężeń sodu po obu stronach błony krw inki zw iązane jest z istnieniem w błonie skom plikow anego m echanizm u regulującego przenoszenie sodu z krw inki do osocza i nazyw anego „pom pą sodow ą” . W najprostszym ujęciu działanie „pom py sodow ej” w yrzucającej sód na zew nątrz kom órki przedstaw ia się w edług F lorkina (24) następująco (schem at 1). N aładow any ujem nie w ew nątrzkom órkow y nośnik (Ti) unosi znajdujący się we w n ętrzu kom órki jon sodowy na brzeg błony kom órko­ w ej i tam przekazuje go w raz z ujem nym ładunkiem elektrycznym w cho­ dzącem u w skład s tru k tu ry błony kom órkow ej nośnikow i — Tm. Nośnik Ti, teraz już elektrycznie obojętny, odryw a się od w ew nętrznej pow ierzch­ ni błony i w raca do w n ętrza kom órki. K om pleks Tm. e—. N a + przesuw a się do zew nętrznej pow ierzchni błony i tam ulega rozpadow i na jon Na ; , k tó ry opuszcza kom órkę, i na ujem nie naładow any kom pleks Tm. e~. E lektron z nośnika Tm przenoszony jest z kolei na obojętną elektrycznie cząsteczkę nośnika Ti, k tó ra ponow nie sta je się e lek tro u jem n a i przygoto­ w ana w ten sjposób do w iązania nowego jonu sodowego.

http://rcin.org.pl

r3]

II K R A JO W E SY M PO Z JU M

B IO C H E M IC Z N E

525

S c h e m a t 1. M echanizm aktyw nego tra n sp o rtu jonu sodowego przez błonę k o m ó r­ kow ą w g F 1 o r k i n a (24)

Pow yższa koncepcja działania pom py sodowej doczekała się później w ie lu uzupełnień, które pozwoliły na ściślejsze określenie elem entów skła­ dow ych pom py sodowej. M ałżonkowie H o k i n (34) w ysunęli przypusz­ czenie, że fosfatydy, a głów nie kw as fosfatydow y odgryw ają rolę prze­ nośników sodu przez błonę kom órkow ą i podali n astępujący schem at ilu­ s tr u ją c y działanie pom py sodowej (schem at 2).

w ą wg H o k i n a

i Hokin

(34)

W edług tego schem atu pierw szym etapem w procesie przenoszenia so­ du jest w ytw orzenie kw asu fosfatydow ego z dw uglicerydu i ATP pod dzia­ łaniem enzym u dw uglicerydokinazy zlokalizow anego na w ew nętrznej

http://rcin.org.pl

526

J. K R A W C ZY Ń SK I

[4]

pow ierzchni błony. Z najdujący się w ew nątrz kom órki jon sodowy łączy się z kw asem fosfatydow ym , stanow iącym elem en t s tru k tu ra ln y błony kom órkow ej i w ten sposób sam wchodzi w obręb błony. Na zew nętrznej strorlie błony pod w pływ em fosfatazy kw asów fosfatydow ych n astęp u je rozpad soli sodowej kw asu fosfatydow ego. U w olniony sód odryw a się od błony kom órkow ej i przechodzi do środow iska pozakom órkow ego; jon fo­ sforanow y (który nie może przejść na zew nątrz kom órki) przechodzi z po­ w rotem do jej w nętrza, dw ugliceryd zaś cofa się do w ew nętrznej po­ w ierzchni błony kom órkow ej, gdzie ponow nie ulega ufosforylow aniu na kw as fosfatydow y w iążący nowe jony sodowe. O pisany w yżej m echanizm czynnego w ydalania sodu z kom órki stym ulow any je st przez acetylocho­ linę, która 15-krotnie zwiększa w łączanie 32P w kw asy fosfatydow e. A kty­ w u je ona jednak tylko pew ną ilość cząsteczek kw asu fosfatydow ego, co pow oduje, że określonem u stężeniu acetylocholiny odpow iada określony stały poziom radioaktyw ności w e frak cji kw asów fosfatydow ych. W ynika stąd, że pew na frak cja kw asów fosfatydow ych osiągnęła w tedy określony stan rów now agi z A T P i że odnaw ia się już bez udziału innych kw asów fosfatydow ych (H o k i n, H o k i n) (34). Tego ro d zaju schodkow a a k ty ­ w acja kw asów fosfatydow ych przez acetylocholinę w skazyw ać może na obecność w błonie kom órkow ej określonych m iejsc, w k tórych znajdują się fra k c je kw asów fosfatydow ych (jako kom pleksy lipoproteidow e) o nie­ jednakow ym progu w rażliw ości na ten związek. W błonie krw inek czerwonych, blisko ich pow ierzchni znaleziono w sto­ sunkow o dużych ilościach esterazę cholinową (45). Fizjologiczna rola tego enzym u w krw inkach czerw onych nie jest jeszcze ostatecznie w yjaśniona. N iektórzy autorzy (27) uw ażają, że odgryw a on w tych kom órkach taką sam ą rolę jak w kom órce nerw ow ej przy przechodzeniu bodźców nerw o­ wych, co jak wiadomo związane jest z periodycznym i zm ianam i przepusz­ czalności błony kom órkow ej. W pew nej sprzeczności z powyższym znaj­ dują się jednak obserw acje B a r r o n a (5), k tó ry w krw inkach niektórych zw ierząt, np. kotów nie stw ierdzał w ogóle obecności esterazy cholinow ej. T ransport jonów sodowych ham ow any jest przez oubainę, któ ra jednak zwiększa ilość znakow anych kw asów fosfatydow ych w błonie kom órkow ej. M echanizm działania oubainy polega praw dopodobnie na ham ow aniu dzia­ łania fosfatazy kw asów fosfatydow ych. A ktyw ny tra n sp o rt sodu jest stym ulow any przez aldosteron in vivo i in vitro (14). Jego działanie poprzedzone jest trw ają cy m około 1 godz. okresem indukcji. Przypuszcza się, że w okresie indukcji następuje wzm o­ żona synteza przenośników sodu. S tym ulacja tra n sp o rtu jonu sodowego przez aldosteron jest niezależna od procesów przechodzenia przez błonę kom órkow ą innych kationów , takich jak jon potasow y czy też jon w odoro­ wy. Przechodzenie jonu sodowego przez błonę kom órkow ą sty m u lu je też w azopressyna.

http://rcin.org.pl

[5]

527

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

2. Transport potasu

Błona krw inki czerw onej jest przepuszczalna dla potasu w obu k ieru n ­ kach. W ym iana potasu m iędzy krw inkam i a osoczem w ynosi 4°/o/l godz. (44). Mimo tego, zm iany stężeń potasu w krw in k ach i w osoczu są od siebie niezależne. S praw a sprzężenia czy też niezależności aktyw nego tra n sp o rtu jonu potasow ego i sodowego nie została ostatecznie rozstrzygnięta. Je d n i badacze (3) p rzy jm u ją istnienie swoistego nośnika dla potasu, n ato m iast inni (29) uw ażają, że może istnieć w spólny nośnik dla obydw u jonów . S h a w (56) staw ia hipotezę, że na zew nętrznej stronie błony e ry ­ tro c y tu nośnik sodowy ulega przem ianie w nośnik potasow y i że przem ia­ na ta zw iązana jest z w ydatkow aniem energii. O dw rotna przem iana byłaby w ięc zw iązana z w yzw oleniem energii. S tosując term inologię używ aną p rz y opisie zjaw isk jonow ym iany m ożna powiedzieć, że nośnik ten prze­ chodzi odw racalnie z cyklu K w cykl Na i z pow rotem .

BtOM KOMÓRKOWA

D H a* - Rki* (V» tUa+

K* E

J

S ch em at 3. M echanizm d ziałan ia sprzężonej „pom py so d o w o -p o taso w ej” w g v i e s a i K e y n e s a (17)

http://rcin.org.pl

D a-

528

J. K RAW CZYŃSK I

[6]

Gdy zaw artość potasu w środow isku zwiększa się, jego w chodzenie do krw inki ustala się na now ym , w yższym poziomie. Z tego fa k tu m ożna w y­ ciągnąć wniosek, że przy określonym poziomie potasu w środow isku, prze­ nikanie jego do w nętrza kom órki odbywa się przez ograniczoną ilość m iejsc w błonie kom órkow ej. P rzy niskich stężeniach K w środow isku spa­ da intensyw ność wchodzenia K do krw inki. W tedy spada też i w ychodze­ nie jonu sodowego z krw inki. A ktyw ny tran sp o rt potasu jest zależny od praw idłow ego przebiegu procesów glikolizy w krw ince, ściślej od ilości znajdującego się w krw ince ATP (63). D a v i e s i K e y n e s (17) podają hipotezę tzw. „sprzężonej pom py sodow o-potasow ej”, o działaniu skoordynow anym z działaniem „pom py w odorow o-hydroksylow ej”. A utorzy ci zakładają, że w błonie kom órko­ wej znajduje się sztyw na s tru k tu ra lipoproteidow a wrzecionow atego k ształtu (schem at 3). W rzeciono to łączy się z zew nętrzną i w ew nętrzną stroną błony kom órkow ej przez kanały o ujem nie naładow anych ściankach, przez któ re może przechodzić albo w yłącznie jon sodowy, albo tylko jon potasow y. W rzeciono obracając się w w yniku ruchów B row na wzdłuż osi I-J może zam ykać lub otw ierać to zew nętrzny, to w ew nętrzny otw ór każdego z kanałów . N aprzeciw ko kanałów znajdują się w e w rzecionie pa­ rzyste m iejsca, w k tórych zlokalizow ane są substancje X i Y, m ogące tw o­ rzyć sole z N a+ lub K +, 'względnie w ystępow ać jako w olne kw asy. Energia potrzebna do przeniesienia jonów przeciw ko gradientow i elektrochem icz­ nem u m a pochodzić bezpośrednio z reakcji przenoszących elektrony na tle n atm osferyczny. Jon sodowy dy fu n d u je z cytoplazm y do odpowiedniego kan ału i przez kanał dochodzi do w rzeciona lipoproteidow ego, a następnie przy odpow ied­ nim ustaw ieniu się w rzeciona przechodzi do jego w nętrza, gdzie napotyka nośnik X w form ie anionu X ~ — pow staje sól NaX. W ędrujący z zew nątrz jon potasow y tw orzy szybko sól KY. Jednak pod działaniem „pom py w odorow o-hydroksylow ej” K + zostaje uw olniony z połączenia z nośnikiem i przez w ylotow ą część swojego kan ału dostaje się do cytoplazm y. P rzy następnym obrocie w rzeciona nośnik HY i sól N aX dostają się do początkowego odcinka swoich kanałów , tzn. sól NaX do odcinka wylotow ego skierow anego na zew nątrz błony kom órkow ej a nośnik HY do odcinka wlotowego dla jonu K +, m ającego swój początek rów nież na zew nętrznej pow ierzchni błony kom órkow ej. Pow staje ponow ­ nie sól KY, ale już z now ym jonem potasow ym , k tó ry w tym czasie w szedł do kanału. Równocześnie jon sodowy zostaje uw olniony z połączenia z noś­ nikiem X i wychodzi swoim kanałem na zew nątrz kom órki, a nośnik X reaguje z now ym jonem N a+, po kolejnym obrocie wrzeciona. Ilość sprzężonych „pomp sodow o-potasow ych” w błonie kom órkow ej zależy od natężenia i ch a ra k te ru tran sp o rtu jonowego. Pom py te mogą być sprzężo­ ne ze sobą przestrzennie stru k tu ra m i m etabolicznym i, dostarczającym i od­ pow iednie ilości jonów w odorow ych i w odorotlenow ych. Kiedy „pom py

http://rcin.org.pl

[7]

II K R A JO W E SY M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

529

w odorow o-hydroksylow e” nie pracują, opisane w yżej kanały m ogą być w ykorzystyw ane do dyfuizji w ym iennej. M odel sprzężonej „pom py sodow o-potasow ej” w yjaśnia bardzo wiele fak tó w dośw iadczalnych, zaobserw ow anych przy w ahaniach stężeń N a n' i K + z zew nątrz i w ew nątrz kom órki, jak rów nież fakt, że tra n sp o rt sodu i potasu jest niezależny od w łasnego potencjału błony kom órkow ej. 3 . T ran sp ort jonu chlorkowego

Uw aża się na ogół, że przechodzenie przez błonę kom órkow ą anionów jedno atom ow ych jest procesem biernym (22). Przechodzenie chloru przez błonę krw inki jest procesem niezależnym od jej aktyw ności m etabolicznej i od jakościowego rozm ieszczenia kationów . Jest ono bardzo szybkie, od 600— 1300 razy szybsze niż przechodzenie jonów N a + i K + (41), co pozwala przypuszczać, że anion Cl- rozm ieszcza się po obu stronach błony kom ór­ kow ej zgodnie z praw am i rów now agi Donnana. Badania W y s o c k i e g o (69) nad rozm ieszczeniem jonu chlorkow ego w ykazały, że stosunek jego stężenia w „w olnej w odzie” k rw inki czerwonej do stężenia w osoczu w y­ nosi około 0,5. Zm iany zaw artości chloru w krw inkach są ściśle związane ze zm ianam i jego zaw artości w osoczu. Je st to w ynikiem szybkiej jego w y­ m iany m iędzy krw inką a osoczem. 4 . T ran sp ort jonu fosforanow ego

Jo n fosforanow y p e n e tru je przez błonę krw inki stosunkow o wolno. W ciągu 95 m in. tylko 30°/o znakow anego fosforu dodanego do krw i prze­ chodzi do krw inek. Przechodzenie jonu fosforanow ego z krw inki do osocza jest jeszcze w olniejsze. Nie rozstrzygnięto ostatecznie, czy przechodzenie jonu fosforanow ego przez błonę krw inki czerw onej jest procesem czynnym czy też biernym . W iększość autorów uważa, że jest to proces czynny, zależ­ ny od praw idłow ego przebiegu glikolizy i przyjm uje, że fosforan może wchodzić do krw inki w łączając się na jej pow ierzchni w ATP (26), w zględ­ nie w kw as 2,3-dw ufosfoglicerynow y (6). Jednakże w edług Z i p u r s k ye g o i I z r a e l s a (70) proces przechodzenia fosforanu przez błonę krw inki czerwonej jest niezależny od glikolizy i przebiega z tą sam ą in ten ­ sywnością, gdy glikoliza jest zaham ow ana kw asem m onojodooctow ym . B rak wapnia w środow isku otaczającym kom órki pow oduje zw ięk­ szone w ychodzenie z kom órki fosforu nieorganicznego, ATP i fosfokreaty n y (1). 5.

T ran sp o rt innych jonów

Wapń. Błona ery trocytów jest nieprzepuszczalna dla w apnia, stanow i on jednak jej in tegralny elem ent stru k tu ra ln y . Obecność C a++ uszczelnia błonę erytrocytów . W jego nieobecności bierne przechodzenie sodu do krw inki w zrasta 20-krotnie. 8 P ostęp y B iochem ii

http://rcin.org.pl

530

J. K R A W C ZY Ń SK I

[8]

Magnez. Z najdujący się w niew ielkich ilościach w krw in ce m agnez przechodzi przez błonę kom órkow ą i podobnie ja k N a+ i K ! a k ty w u je A TP-azę m em branow ą (49, 58). W skazuje to, że jego tra n sp o rt może być w pew ien sposób zw iązany z tran sp o rtem sodu i potasu i z działaniem „pom py sodow o-potasow ej”. Żelazo. Błona e ry tro cy tu dojrzałego jest nieprzepuszczalna dla żelaza. Przechodzenie żelaza z osocza do rekikulocytów zw iązane jest z obecnością białkow ych nośników, któ re pośredniczą m iędzy tra n sfe rry n ą a w n ętrzem krw inki (21, 46). Jed n e z tych nośników m ają znajdow ać się w osoczu, drugie natom iast w cieniach krw inkow ych. Nie jest w ykluczone, że w cza­ sie dojrzew ania krw inki ilość nośnika białkowego w błonie zm niejsza się stopniow o w zględnie zm niejsza się jego pow inow actw o do żelaza i w zw ią­ zku z tym krw inka traci zdolność pobierania żelaza z otoczenia. Miedź. Miedź w ystępująca w ery tro cy tach w form ie zw iązanej z b iał­ kam i przechodzi przez błonę kom órkow ą. W k rw inkach w y stęp u je jeszcze inne białko zaw ierające miedź, o nieokreślonych bliżej jeszcze w łasnościach i nazw ane białkiem ,,S”. R adioaktyw na m iedź — 64Cu z otoczenia w p ierw ­ szym rzędzie włącza się do tzw. białka „S ”, k tó re praw dopodobnie stanow i część składow ą błony e ry tro cy tu i odgryw a w ażną rolę w transporcie m ie­ dzi do w nętrza krw inki. Cynk. Badania z 65Zn w ykazały, że cynk szybko p e n e tru je do w nętrza krw inki (25). Stężenie cynku w krw inkach jest praw ie 5-krotnie w iększa niż w osoczu. Tak wysoki grad ien t stężeń cynku m iędzy k rw in k ą i osoczem i duża szybkość jego przenikania do w nętrza krw inki, a więc przeciw gradientow i stężenia pozw alają przypuszczać, że proces przechodzenia Z n ++ przez błonę ery tro cy tu jest procesem czynnym . • Siarka. Badania z radioaktyw nym siarczanem w ykazały, że jon ten przechodzi biernie przez błonę krw inki i podobnie jak jon chlorkow y rozmieszcza się po obu stronach błony krw inkow ej zgodnie z rów now a­ gą D onnana (64). Szeroko stosow any w diagnostyce lab o rato ry jn ej tio ­ siarczan rozmieszcza się rów nom iernie w osoczu i w krw inkach (40). Jony m etali ciężkich. Jony Pb, Hg, Sn, Co, Cr, Cd, Ni i inne ad sorbują się łatw o na pow ierzchni krw inki, a następnie tw orzą kom pleksy z b ia ł­ kam i błony kom órkow ej, niszcząc jej s tru k tu rę i zm ieniając jej po ten cjał pow ierzchniow y. Po w ejściu do krw inki jony te ham u ją niesw oiście z n a j­ dujące się tam układy enzym atyczne doprow adzając w efekcie do znisz­ czenia krw inki. W m niejszych stężeniach zw iększają przepuszczalność błony erytrocytów , co doprow adza do zm niejszenia zaw artości potasu w krw ince i zw iększenia zaw artości sodu. 6.

Z m iany przepuszczalności błony krwinkowej dla jonów w różnych stan ach patologicznych

Zm iany zaw artości poszczególnych jonów w krw ince czerw onej spo­ tykane w różnych stanach patologicznych m uszą być zw iązane z zabu­ rzeniam i procesów ich tra n sp o rtu przez błonę kom órkow ą. Przypuszczenie

http://rcin.org.pl

[9]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

I.

531

tego rodzaju ma mocne uzasadnienie w fakcie, że zm iany te w odniesie­ niu do większości jonów w krw ince nie są skorelow ane ze zm ianam i poziom u tychże jonów w osoczu. M echanizm zaburzeń tra n sp o rtu przez błonę k rw inki nie jest praw ie zupełnie znany, a patologia tra n sp o rtu przez błony kom órkow e bardzo pow oli sta je się przedm iotem zainteresow ań biochem ików klinicznych. Sód. W edług K e s s l e r a i w spółpracow ników (39) zaw artość sodu w krw inkach jest obniżona podczas pow staw ania obrzęków (niew ydol­ ność krążenia, m arskość w ątroby, schorzenia nerek). W czasie diurezy zw iązanej z zanikaniem obrzęków zaw artość sodu w krw ince w zrasta. N atom iast w edług R i e c k e r a i B u b n o f f a (52) w stanach obrzę­ kow ych m a m iejsce nie obniżenie, a statystycznie znam ienne podwyższe­ nie zaw artości sodu w krw inkach i obniżenie zaw artości potasu, tak że w skaźnik N a/K w zrasta od 0,20 do 0,29. Tego rodzaju rozbieżność jest tru d n a do w yjaśnienia. O bniżenie zaw artości sodu w ery tro cy tach obserw ow ano w kw asicy cukrzycow ej i w okresow ym porażeniu rodzinnym (paralysis familiaris periodica) (15, 16). W zrost zaw artości sodu w krw ince jest charak­ tery sty czn y dla stanów pooperacyjnych (18). Potas. Zaw artość potasu w krw ince w zrasta w stanach, kiedy krąży we krw i zwiększona ilość horm onów kory nadnerczy, a zwłaszcza aldosteronu. Ma to m iędzy innym i m iejsce w stanach niew ydolności krążenia i w innych stanach chorobow ych, podczas pow staw ania obrzęków . P o­ danie glikozydów nasercow ych zm niejsza zaw artość potasu w krw ince. C l i f f o r d i B e a u t y m a n (13) uw ażają, że badanie zaw artości po­ tasu w krw ince u chorych z niew ydolnością krążenia leczonych glikozy­ dam i nasercow ym i, może być uw ażane za m iernik prow adzonego lecze­ nia, przy czym zm niejszenie zaw artości potasu w krw ince oznacza popra­ wę w arunków hem odynam icznych w ustro ju . Z aw artość potasu w krw inkach spada w początkow ych fazach ostrego zapalenia w ątroby (10), a także cięższych przypadkach niew yrów nanej m arskości w ątroby (51), w kw asicy cukrzycow ej (15, 16, 35), biegunkach u dzieci (28), okre­ sowym porażeniu rodzinnym , stanach pooperacyjnych (18) i przew lek­ łych schorzeniach nerek. W stw ard n ien iu nerek poziom potasu w k rw in ­ kach podnosi się rów nolegle z poziom em potasu w surow icy (35). Niski poziom potasu obserw uje się w m ik ro cy tarn y ch niedokrw istościach nie­ dobarw liw ych, w sierpow atości krw inek, a wysoki w niedokrw istościach m akrocytarnych (68) i we w rodzonej żółtaczce hem olitycznej (19). Chlor. Zm iany w zaw artości chloru w krw ince odpow iadają na ogół zm ianom zaw artości tego jonu w osoczu. Fosfor. Zm iany zaw artości fosforu nieorganicznego w krw inkach prze­ biegają rów nolegle do zm ian w osoczu. Podw yższony poziom fosforu nie­ organicznego stanow i zw ykle zjaw isko kom pensujące u tra tę hem oglobiny, um ożliwia bowiem związanie pow stałego nad m iaru zasad i utrzym anie

http://rcin.org.pl

532

J. K R A W C Z Y Ń S K I

[10]

rów now agi kw asow o-zasadow ej w krw ince (42). O bniżenie poziomu fosforu nieorganicznego obserw uje się natom iast w kw asicy cukrzycow ej, w rodzonej niedokrw istości hem olitycznej i krzyw icy.

II. Transport cząsteczek niezjonizowanych 1. Transport cukrowców

C ukrow ce w roztw orach w odnych nie są naładow ane elektrycznie i dlatego w łasny potencjał błony e ry tro cy tu nie w yw iera w pływ u na ich przechodzenie przez błonę. Dzięki dużej zaw artości grup hydroksylow ych w cząsteczce posiadają one w ybitnie zaznaczone w łasności hydrofilne. Te w łasności w zestaw ieniu z lipoidową stru k tu rą błony ery tro cy tó w stano­ wią zasadniczą przeszkodę w przechodzeniu cukrow ców do w n ętrza k rw in ­ ki. W ynika stąd, że w tym procesie m uszą brać udział określone związki odgryw ające rolę nośników i zw iększające pow inow actw o cukrow ców do lipoidow ych składników błony e ry tro cy tu . T ran sp o rt cukrow ców przez błony kom órkow e odbyw a się w zasadzie zgodnie z gradientem stężeń, a więc w edług definicji P a r k a (48) jest tra n sp o rte m biernym . Odpo­ w iedni g rad ien t stężenia w aru n k u jący wchodzenie cukrow ca do krw inki zależny jest zwłaszcza w przypadku cukrow ców m etabolizow anych (glikoza) od szybkości ich zużyw ania przez krw inkę w procesach przem iany pośredniej. P rzechodzenie cukrow ców przez błony kom órkow e cechuje się (12, 38): a) swoistością przestrzenną, w ynikającą praw dopodobnie z udziału w tym procesie enzym ów o dość wysokiej wybiórczości wobec substratu, b) m niej lub więcej zaznaczoną swoistością gatunkow ą, uw arunkow a­ ną czynnikam i genetycznym i, c) bliżej nieokreśloną jeszcze zależnością od tra n sp o rtu jonów nieorga­ nicznych. Już przed kilku laty L e v i n e zwrócił uwagę, że cu kry przechodzą­ ce przez błonę krw inki czerw onej posiadają identyczną konfigurację p rze­ strzenną p rzy 0-1, 0 -2 i 0-3 (D-glikoza, D-galaktoza, D-ksyloza i L-arabinoza). W yjątk iem od tej reg u ły jest m annoza. D la innych cukrów błona krw inki nie jest przepuszczalna. Przechodzenie cukrów przez błonę od­ byw a się na zasadzie ,,w ym iany przeciw prądow ej” (counterflow m ec h a ­ nism), polegającej na tym , że w yjście z krw in k i drobiny określonego cukru jest zw iązane z w ejściem do jej w nętrza drobiny innego cukru. Z badań term odynam icznych i badań nad k inetyką procesów przecho­ dzenia cukrów do krw inki w ynika, że w ym iana przeciw prądow a zw iąza­ na jest z istnieniem system u nośnikow ego nie będącego statycznym e le ­ m entem s tru k tu ra ln y m błony kom órkow ej e ry tro c y tu (19). W procesie

http://rcin.org.pl

[U ]

II K R A JO W E SY M PO Z JU M B IO C H E M IC Z N E '

533

w iązania się cukrów z nośnikiem nie m ają istotnego znaczenia g rupy hy ­ droksylow e przy C-2 i C- 6 . R ozpatrzm y proces przenoszenia np. galaktozy przez błonę kom órko­ w ą z udziałem odpowiedniego nośnika. Z najdująca się na zew nątrz ko­ m órki galaktoza (Gegz) reag u je z aktyw ow anym nośnikiem RT w ze­ w n ętrzn ej części błony kom órkow ej dając kom pleks GT Gegz + R T

—

>

GT + R

K om pleks ten szybko przechodzi na w ew nętrzną stronę błony kom órko­ w ej i odszczepia galaktozę ( G j n) do w nętrza kom órki. G T — > G in + T

W olny nośnik T jest ponow nie aktyw ow any w reakcji z udziałem ATP dając RT zdolny do reakcji z następną cząsteczką galaktozy ATP

R + T — >R T

N ośnik w form ie aktyw nej nie może reagow ać z G ;n a tylko z G egz, nato­ m iast w olny nośnik T może reagow ać z G in, tj. z galaktozą w ew nątrzko­ m órkow ą i ta reakcja może być pierw szym etapem w procesie w ycho­ dzenia drobin cu kru z krw inki. P rz y jm u je się, że w procesie aktyw acji nośnika bierze udział swoista perm eaza (transportaza). W ty m ujęciu po­ jęcie perm eazy zbliża się do pojęcia reg u lato ra R a n d 1 e ’ a (50), k tórym ma być jakiś m etabolit kom órkow y łączący się odw racalnie z nośnikiem i zm ieniający w jednym lub drugim k ieru n k u jego pow inow actw o do substra tu . K ierunek działania regulatora byłby zależny od ak tualnego prze­ biegu procesów m etabolicznych w komórce. T ransport glikozy i innych cukrów do krw in k i jest ham ow any przez różnego rodzaju inhibitory. Spośród nich należy w ym ienić florydzynę i jej aglukon — floretynę, następnie związki blokujące grupy — SH jak p-chlorortęciobenzoesan, dw unitrofluorobenzen, niektóre nark o ty k i itp. Nieza­ leżnie od tego poszczególne cukry k o n k u ru ją ze sobą o cząsteczki noś­ nika (55). Poglądy różnych autorów co do zależności tra n sp o rtu cukrowcówT od m etabolizm u energetycznego w ykazują w iele sprzeczności. D ziałanie p e r­ m eazy w ym aga raczej dopływ u energii w postaci ATP. Z d ru g iej strony wiele danych w skazuje, że procesy tra n sp o rtu cukrów przez błonę ko­ Wilbrandta m órkow ą nie są reakcjam i endoergicznym i. W edług (67) reakcja z nośnikiem ułatw iająca cząsteczce cukrow ca sforsow anie bariery lipoidowej ma być więc reakcją przebiegającą bez dopływ u energii z zew nątrz. Proces przechodzenia cukrow ców przez błonę k rw in k i czer­ wonej należy więc uważać za proces dyfuzji ułatw ionej. Hipoteza postulująca przechodzenie cukrow ców przez błonę k rw inki w w yniku dyfuzji ułatw ionej z udziałem sw oistych nośników została po­

http://rcin.org.pl

534

J. K R A W C ZY Ń SK I

[12]

ważnie podważona przez opublikow ane niedaw no w yniki badań S t e i n a (60, 61). Jak już wspom niano, zadaniem nośnika będącego częścią skła­ dową błony kom órkow ej m iało być w ytw orzenie a lte rn a ty w n y c h wiązań w odorow ych z cukrow cem po rozerw aniu w iązań tego ty p u m iędzy gru­ pam i hydroksylow ym i cukrow ca a cząsteczkam i wody. W ten sposób na­ stępow ałoby zwiększenie własności lipotropow ych cząsteczki cukrowca, ułatw iające jej przejście przez lipoidową błonę kom órkow ą. Podobny w pływ może m ieć w ytw orzenie dim eru z dw u cząsteczek cukrowca. W tym przypadku jedna z nich służy jako nośnik dla drugiej. Tw orzenie się dim erów zaobserw ow ał S tein w procesie przechodzenia glicerolu, a później także w procesie przechodzenia cukrów przez błonę ery tro cy ­ tów. Proces dim eryzacji jest zw iązany z bardzo niew ielkim w ydatkiem energii. W m yśl koncepcji dim erów w błonie kom órkow ej zn ajd u ją się m iejsca, k tó re wiążą przechodzące cząsteczki w pary. W m iejscach tych znajduje się praw dopodobnie enzym katalizujący proces dim eryzacji, k tó ry został nazw any dim erazą (62). Swoistość tego enzym u odnośnie su b strató w jest raczej niew ielka, co pozw alałoby na pow staw anie m ieszanych kom plek­ sów ty p u AEB, gdzie sym bole A i B oznaczają różne cukrow ce, a sym bole E — enzym dim erazę. W edług Steina ham ujące przechodzenie glikozy działanie floryzyny polega na zaham ow aniu aktyw ności dim erazy. Przepuszczalność błony krw inkow ej dla cukrow ców jest różna u róż­ nych gatunków . I tak np. krw inki człow ieka i m ałp człekokształtnych ce­ ch u ją się w ysoką przepuszczalnością dla glikozy, k rw inki królika — znacz­ nie m niejszą. K rw inki psa odw rotnie niż krw in k i człow ieka w ykazują wyższą przepuszczalność dla ketoz niż dla aldoz. Te różnice gatunkow e w ynikają być może i z różnic w stru k tu rz e koloidów w ew nątrzkom órko­ w ych w iążących cukry i w ten sposób elim inujących je ze środow iska w ew nątrzkom órkow ego jako cząstki osm otycznie czynne. Zaw artość glikozy w krw ince jest nieco m niejsza niż w osoczu: stosu­ nek jej ilości zaw artej w ery tro cy tach do ilości zaw artej w osoczu E /P wynosi 0,77 (7). S tosunek ten zostaje w zasadzie zachow any i przy zm ia­ nach poziom u glikozy we krw i. Jed n ak zm iany zaw artości glikozy w krw inkach po obciążeniu u stro ju glikozą, czy też hiperglikem ii po­ karm ow ej w zględnie w yw ołanej podaniem epinefryny, jak rów nież w cu­ krzycy zachodzą w olniej niż w osoczu i dlatego też w skaźnik rozm ieszcze­ nia glikozy E /P może być okresow o obniżony. I na odw rót w stanach hipoglikem icznych w skaźnik te n może być okresow o w yższy od norm y. Glikoza zaw arta w krw inkach może być więc uw ażana za swojego rodza­ ju rezerw ę, k tó ra w pew nym stopniu kom pensuje groźne dla u stro ju skutki w yw ołane ostrym spadkiem jej zaw artości w osoczu.

http://rcin.org.pl

[13]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

535

2 . T ran sp ort am inokw asów

K rw inka czerw ona w ykazuje duże pow inow actw o do am inokw asów . W y jątek stanow i tryptofan, k tó ry w y stęp u je w w iększej ilości w osoczu niż w krw inkach (w spółczynnik d y stry b u cji 0 , 2 ), oraz kw as glutam inow y i glutam ina — w ystępujące tylko w osoczu. Istn ieją znaczne różnice ga­ tunkow e w zaw artości poszczególnych am inokw asów w krw ince. Różnice te zdają się w skazyw ać na możliwość bezpośredniego udziału k rw inek w procesach red u k cji składu ogólnej p uli am inokw asów u stroju. Rola k rw in ek czerw onych jako nosicieli am inokw asów jest od daw na znana. U w olnione w czasie traw ienia białek am inokw asy po przejściu przez ścianę jelita wiążą się z krw inkam i (62, 69) i w ten sposób, być może, są tran sp o rto w an e do tkanek. M ożna przyjąć, że am inokw asy znajdujące się w krw inkach stanow ią część am inokw asow ej puli u stro ju i to raczej puli w ew nętrznej (internal pool), w któ rej praw dopodobnie ulegają a k ty ­ w acji (31). P rocesy przechodzenia am inokw asów przez błony kom órkow e prze­ biegają podobnie w różnych tkankach (ery tro cy ty , n erki, nabłonki jelita), co pozw ala na przeprow adzenie odpow iednich analogii w oparciu o w y ­ niki uzyskane na różnym m ateriale dośw iadczalnym . Proces przechodzenia am inokw asów przez błonę k rw in k i czerw onej zachodzi w większości przypadków przeciw gradientow i ich stężenia, a więc jest procesem endoergicznym , w ym agającym sprzężenia z sam o­ rzu tn ie przebiegającą reak cją egzoergiczną. Proces przechodzenia am i­ nokw asów do krw inki jest więc zależny od natężenia procesów m etabo­ licznych w kom órce i w ym aga obecności sw oistych nośników . Podobnie jak w procesie przenoszenia cukrow ców p rzy jm u je się możliwość istnie­ nia nośników w spólnych dla kilk u am inokw asów . W badaniach nad m echanizm em przechodzenia am inokw asów przez błony kom órkow e nieocenione usługi oddały a-N -m etyloam inokw asy (11) i kw as a-am inoizom asłow y (43), p e n e tru ją c e do kom órek jak n a tu ra ln e am inokw asy, a nie w chodzące w kom órce w ciąg procesów m etabolicz­ nych. O dnośnie niem ożności przechodzenia przez błonę kom órkow ą am ino­ kw asów dw ukarboksylow ych zostały ostatnio podniesione pow ażne za­ strzeżenia (47). Zw rócono m ianow icie uw agę na to, że am inokw asy te są stałym i p artn eram i w reakcjach tran sam in acji i zaraz po przejściu błony kom órkow ej mogą przechodzić w odpow iednie ketokw asy. Za słusznoś­ cią tego p u n k tu w idzenia przem aw iają następ u jące fakty: a) stosunkow o duża zaw artość transam inaz w krw ince czerw onej oraz b) łatw ość prze­ chodzenia transam m az przez błony kom órkow e. P rzy przechodzeniu am inokw asów przez błonę kom órkow ą obserw uje się zjaw isko kom petycji. Na przykład m etionina i histydyna h am u ją przechodzenie przez błonę kom órkow ą pro lin y i glicyny.

http://rcin.org.pl

536

J. K R A W C Z Y Ń S K I

[14]

Do w yjaśnienia c h a ra k te ru nośnika zaangażow anego w transporcie am inokw asów przyczyniły się w pew nym stopniu badania B a r n a b e l a i F e r r a r i (4). A utorzy ci, p erfu d u jąc izolow aną w ątrobę płynem za­ w ierającym znakow ane am inokw asy stw ierdzili, że radioaktyw ność szybko włącza się do frak cji fosfatydopeptydow ej. Proces ten jest ham ow any przez cyjanki i zachodzi w olniej w w arunkach beztlenow ych. Być może, że tzw. lipopeptydy odgryw ają w ażną rolę w trasporcie am inokw asów przez błonę kom órkow ą. W edług m ałżonków H o k i n (34) nośnikam i dla am inokw asów m ogą być kw asy fosfatydow e, odgryw ające jak już w spom niano rolę nośników w aktyw nym transporcie sodu. Spraw a przechodzenia peptydów i białek przez błonę kom órkow ą nie jest do chwili obecnej rozstrzygnięta. P rz y jm u je się, że białka w nie­ w ielkich ilościach mogą przechodzić przez błonę kom órkow ą nie ulegając rozkładow i do am inokw asów . W ydaje się, że d w upeptydy m ogą przecho­ dzić przez błonę kom órkow ą w ten sam sposób jak am inokw asy, szybko jednak ulegają hydrolizie po drugiej stronie błony, ta k że nie m ożna stw ierdzić ich nagrom adzania się w kom órce. W ynika stąd, że glu tatio n m usi być syntetyzow any w ew nątrz krw inki czerw onej. Zaw artość am inokw asów w krw inkach w zrasta w takich schorzeniach jak: ostre zapalenie w ątroby, chroniczne zapalenie kłębuszków nerko­ wych, k retynizm itp. W zrost ilości am inokw asów w k rw inkach jest w ted y znacznie w iększy niż w osoczu.

III. Powiązania procesów transportu przez błony komórkowe z metabolizmem komórkowym W ielokrotnie w spom niano już o zależności procesów tran sp o rtu od obecności w kom órce odpow iedniej ilości ATP. P ozostaje jeszcze do omó­ wienia bezpośredni sposób przenoszenia energii uzyskanej z procesów m etabolicznych na m echanizm y tra n sp o rtu jąc e oraz w pływ samego tra n ­ sportu na m etabolizm kom órki. Ilość energii zużyw anej w procesach ak­ tyw nego tra n sp o rtu w ynosi w edług Maizelsa 1 2 % , zaś w edług W h i 11 a m a 40% całkow itej energii w yprodukow anej w procesach gli­ kolizy czy też oksydatyw nej fosforylacji ( 6 6 ). D ane M aizelsa dotyczą krw inki czerw onej, a dane W hittam a kom órek kory m ózgowej. Z da­ nych tych w ynika, że aktyw ność biologiczna k rw in ek czerw onych w m niejszym stopniu zw iązana jest z a k ty w n y m tra n sp o rte m jonów i in­ nych drobin niż aktyw ność biologiczna kom órek nerw ow ych. Podczas aktyw nego przenoszenia jonu czy cząsteczki niezjonizow anej energia zużyw ana jest na pokonanie różnego ro d zaju oporów przeciw ­ staw iających się tem u przenoszeniu, a m ianow icie na zerw anie w iązań w odorow ych z wodą przy przechodzeniu z fazy w odnej do fazy lipido­ wej, na aktyw ację nośnika i wreszcie przeniesienie utw orzonego kom ­

http://rcin.org.pl

[15]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

537

p le k su na drugą stronę błony. Obliczono, że tra n sp o rt 3—4 rów now ażni­ ków jonu sodowego jest zw iązany z zużyciem 1 m ola A T P czyli, innym i słow y, tran sp o rt 1 rów now ażnika jonu sodow ego zużyw a ilość energii ró w n ą 2 0 0 0 kal. Zależność m iędzy natężeniem procesów m etabolicznych w kom órce a zjaw iskam i tra n sp o rtu przez błony kom órkow e jest obustronna i p raw ­ dopodobnie oparta na zasadzie „sprzężenia zw rotnego” . Za tego rodzaju ujęciem w zajem nej współzależności m iędzy procesam i tra n sp o rtu a m e­ tabolizm em przem aw ia szereg faktów . W iększość z nich (o k tórych w spo­ m inano uprzednio) ilu stru je raczej zależność tra n sp o rtu od m etabolizm u. N atom iast stosunkow o niew iele faktów dośw iadczalnych nagrom adzono dla uziasadnienia odw rotnej współzależności. Od w ielu lat znany jest fakt, że zw iększenie zaw artości potasu i zm niejszenie zaw artości w apnia prow adzi do zaburzeń m etabolizm u energetycznego w kom órce (3). Z aburzenia te przejaw iają się spadkiem w łączania fosforanów w fosfoproteidy (23), obniżeniem poziom u fosfok re a ty n y i ATP (36) i zm niejszeniem syntezy glikogenu. Z adziałanie na błonę kom órkow ą fosfolipazą A, pow odującą uszkodzenie jej stru k tu ry , prow adzi do szybkiego spadku w spółczynnika P/O i zaburzeń tra n sp o rtu kom órkow ego. Dodanie do zaw iesinny kom órek sw oistej surow icy odpor­ nościow ej znosi całkowicie aktyw ny tra n sp o rt glicyny przez błonę kom ór­ kow ą już w tedy, kiedy nie można jeszcze zaobserw ow ać żadnych zm ian m orfologicznych w kom órce (8 ). W zajem ne powiązania m etabolizm u kom órkow ego z tran sp o rtem jo­ now ym oparte na zasadzie „sprzężenia zw rotnego” rozw ażym y na przy ­ kładzie tra n sp o rtu jonu potasowego. W pierw szym etapie jon potasow y a k ty w n ie grom adzi się we w n ętrzu kom órki. W procesie ty m zużyw ana jest pew na ilość cząsteczek ATP. Z m niejszenie zaw artości A TP prow adzi do zw iększenia ilości ADP i P, co zwiększa intensyw ność procesów m eta­ bolicznych a tym samym i oksydatyw nej fosforylacji. W drugim etapie stężenie jonu potasowego w kom órce osiągnęło m aksym alny kry ty czn y poziom, a dalsze jego grom adzenie m ogłoby już naruszyć rów now agę jo­ nową kom órki i grozić zniszczeniem jej stru k tu ry . T ran sp o rt potasu zostaje w ięc w strzym any przez zaham ow anie produkcji ATP i tym sa­ m ym przerw anie działania „pom py sodow o-potasow ej”. W trzecim etapie zaw artość jonu potasowego w kom órce zaczyna się zm niejszać i osiąga m inim alny kry ty czn y poziom. Rozpoczyna się znów pro d u k cja ATP, na­ stęp u je w łączenie „pom py sodow o-potasow ej” i cały cykl rozpoczyna się na nowo. W w arunkach norm alnych w ahania m iędzy obydwom a p u n k ta ­ mi krytycznym i są tak m ałe, że cały proces robi w rażenie procesu cią­ głego. O pisany wyżej hipotetyczny schem at „sprzężenia zw rotnego” jest praw dopodobnie tylko jednym z licznych ogniw bardzo skom plikow anego układu „sprzężeń zw rotnych”.

http://rcin.org.pl

538

J. K R A W C ZY Ń SK I

[16]

K onserw ow ana kr'w inka traci stopniowo w łasności aktyw nego tra n s­ p ortu jonów, co jest zw iązane z obniżeniem poziom u połączeń fosforano­ wych zaw ierających w iązania fosforanow e bogate w energię, ja k ATP i kw as 2,3-dw ufosfoglicerynow y (57). Dodanie inozyny lub adenozyny przyw raca krw inkom konserw ow anym zdolność aktyw nego tra n sp o rtu jonów, praw dopodobnie przez zw iększenie zasobów A T P (9). Cienie krw inek w zględnie krw inki regenerow ane w procesach odw ra­ calnej hem olizy (krw inki bez hem oglobiny) zachow ują w łasności tra n s ­ p o rtu jonów, jeżeli tylko zaw ierają dostateczną ilość A T P (33, 6 6 ). F akt ten jest w edług S o l o m o n a (59) jednym z arg u m e n tó w przeciw ko teorii sorbcji. K rw inka regenerow ana w zględnie cień krw in k o w y jest ko­ m órką, któ ra utraciła przew ażającą większość sw ojego białka protoplazm atycznego, a jednak mim o to zachow ała w pełni w łasność aktyw nego tran sp o rtu jonów. W ydaje się jednak, że sprzeczność tego fa k tu z teorią sorbcji jest tylko pozorna. K rw inka czerw ona bow iem je st kom órką 0 w ysokim stopniu w yspecjalizow ania w ypełniającą ściśle określone za­ dania. M iędzy innym i jest ona przenośnikiem hem oglobiny, któ ra chyba tylko w pew nym stopniu może być uw ażana za in te g raln ą jej część skła­ dową. Być może, niezbyt daleko od praw dy byłab y analogia p rzep ro w a­ dzona m iędzy k rw in k ą zaw ierającą hem oglobinę a kom órką tkanki tłu sz ­ czowej zaw ierającą w sw ym w n ętrzu kropelkę tłuszczu. W ty m ujęciu w łaściw ą krw inką byłby sam ,,cień” składający się z błony krw inkow ej, pokrytej w ew nątrz cienką w arstw ą protoplazm y. W protoplazm ie tej 1 w zrębie krw inki byłyby zlokalizow ane w szystkie procesy m etaboliczne, w tym także procesy dostarczające energię.

LITER A TU RA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

A b o o t L., K o h e t s n K., K o y a m a I., N a tu re 191, 395 (1961). A s h f o r d A., D i x o n K., B iochem . J. 29, 157 (1935). A r m s t r o n g Mc. J., N ature 192, 65 (1961). B a r n a b e l D., F e r r a r i R., A rch. B iochem . B io p h ys. 94, 79 (1961). B a r r o n E., A d v. E nzym ol. 3, 149 (1943). B a r t l e t t G., A n n . N Y Acad. Sci. 75, 110 (1958). Behrendt H., C hem istry of E rythrocytes, Ch. C. T hom as P u b lish e r, S p ringfield — Illinois 1957. B i c k i s J., Q u a s t e l J., V a s S., C ancer Res. 14, 602 (1959). B l o n s t e i n R., R u b i n s t e i n D., D e n s t e l t O., Cand. J. B iochem . Physiol. 39, 1897 (1961). C a s e y T., S u m m e r s h i l l W., O r v i s A., J. L ab. C lin. M ed. 58, 805 (1961). C h r i s t e n s e n H., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 470. C i r i 11 e V., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K o­ tyk, P ra h a 1961, str. 343. C l i f f o r d Th., B e a u t y m a n W., Clin. C hem . 311 (1958). G r a b b e J., J. C lin. In ve st. 40, 2103 (1961).

http://rcin.org.pl

[1 7 ]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

539

15. D a n o w s k i T., E l k i n s t o n J., B u r r o w s R., W i n k l e r A., J. Clin. In v e st. 27, 65 (1948). 16. D a n o w s k i T., H a l d P., P e t e r s J., Am,. J. P hysiol. 149, 667 (1947). 17. D a v i e s R., K e y n e s R., M em brane tra n s p o rt and m etabolism , red. A. K leinzeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 336. 18. E k i e l L., P e a r s o n O., R a w s o n R., N ew E ngland J. M ed. 243, 471 (1950). 19. E r e c k s o n B., W i l l i a m s H., H u m m e l F., L e e P., M a c y I., J. Biol. C hem . 118, 569 (1937). 20. E v a n s J., N ature 192, 567 (1961). 21. F a b e r M., J o r d a l R., N ature 192, 181 (1961). 22. F e n c l Z., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K o­ ty k , P ra h a 1961, str. 296. 23. F i n d l e y M., M a g e e W., R o s s i t e r R., B iochem . J. 58, 236, (1944). 24. F l o r k i n M., In tro d u ctio n biochim ique ä la m edicine, P a ris 1959, str. 204. 25. G i b s o n J., Blood cells and plasm a p ro tein s, N ew Y ork 1953. 26. G o u r 1 e y D., A rch. B iochem . B iophys. 40, 1 (1952). 27. G r e i g M., H o l l a n d W., A m . J. P hysiol. 164, 423 (1951). 28. H a l l m a n N., K a u h t i o J., A cta Ped. 39, 347 (1950). 29. H a r r i s E., M a i z e l s M., J. P hysiol. (London) 118, 40 (1952). 30. H a v e s y G., R adioactive indicators, New Y ork 1948. 31. H i e r o w s k i M., N ature 191, (1961). 32. H i l l m a n R., A s h m o r e J., Fed. Proc. 17, 243 (1958). 33. H o f f m a n J., B iophysical Society A bstract, P h ila d e lp h ia 1960. 34. H o k i n L., H o k i n M., M em brane tra n s p o rt an d m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P rah a, 1961, str. 204. 35. H u l t M., A m . J. Med. Sci. 223, 176 (1952). 36. I I w a i n Me. H., W o o d m a n J., C u m m i n s J., B iochem . J. 81, 79 (1961). 37. J a r n e f e l t J., N ature 190, 694 M (1961). 38. K e p e s A., Biochem . B iophys. A cta 40, 70 (1960). 39. K e s s l e r E., L e v y R., A 11 e n R., J. Lab. Clin. M ed. 57, 32 (1961). 40. K o w a l s k i H., T u t s t e i n D., J. Clin. In v e st. 35, 607 (1956). 41. L o v e W., B u r c h G., Proc. Soc. E xp tl. B iol. M ed. 82, 131 (1953). 42. M a n e r y F., M ineral m etabolism , red. C. C om ar i F. B ro n n er, vol. I P a r t B, N ew Y ork 1961, str. 551. 43. M a t h e w N„ "A 11 e n W., J .Biol. C hem . 236, 2987 (1961). 44. M u l l i n s L., F e n n W., N o o n a n T., H a e g e L., A m . J. P hysiol. 135, 93, (1961). 45. N a c h m a n s o n D., W i l s o n I., A d v. E nzym o l. 12, 259 (1951). 46. N a j e a n V., A r d a i 11 o u R., B e r b a r d J., R ev. Franc. E tud. Clin. Biol. 5, 783 (1960). 47. N e a m e K., W i s e m a n G., J. P hysiol. (London) 135, 442 (1957); 140, 148 (1958). 48. P a r k C., M em brane tra n s p o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 19. 49. P o s t R., A l b r i g h t C., M em brane tra n s p o rt an d m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P raha, 1961, str. 204. 50. P a n d 1 e P., M em brane tra n s p o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K o­ ty k , P ra h a 1961, str. 431. 51. R e m e n c h i l i A., P a s l o P., W i l o u g h b y E., J. Lab., Clin. M ed. 58, 952 (19(Tl). 52. R i e c k e r G., B u b n o f f M., K lin. W ochenschr. 36, 556 (1958). 53. R o s e n b e r g Th., W i l b r a n d t W., J. G en. P hysiol. 41, 239 (1957).

http://rcin.org.pl

540

54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66 . 67.

68 . 69. 70.

J.

K RAW CZYŃSKI

Schubert G., R i e z l e r W., K lin. W ochenschr. 27, 304 (1947). S c h a r f f T., A rch. B iochem . B iophys. 95, 319 (1961). S h a w T., J. P hysiol. (London) 129, 464 (1955). S h a f e r W., B a r l e t t G., J. Clin. In ve st. 40, 1178 i 1185 (1961). S k o u J., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 228. Solomon A., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 106. S t e i n W., N ature 191, 352 (1961). S t e i n W., N ature 191, 1277 (1961). S t o l z m a n n Z., W a l i g ó r a Z., Proc. IV In tern a tl. Congr. Clin. C h em . 137, 1960. S t r a u b F., A cta P hysiol. H ung. 4, 235 (1953). S w a n R., F e i n s t e i n H., M a d i s s o H., J. Clin. In v e st. 35, 607 (1956). W a l t n e r K., C s e r n o v s z k y M., Clin. C him . A cta 5, 230 (1960). W h i t t a m R., B iochem . J. 82, 205 (1962). W i l b r a n d t W., M em brane tra n sp o rt and m etabolism , red. A. K lein zeller i A. K otyk, P ra h a 1961, str. 388. W i l l i a m s H., E r i c k s o n B., B e r n s t e i n S., H u m e l F., M a c y I.» J. Biol. Chem . 118, 599 (1937). W y s o c k i K., R ozpr. W ydz. L ek. P A N 7, (1954). Z i p u r s k y A., I s r a e l s L., N ature 189, 1013 (1961).

http://rcin.org.pl

P

O

S

T

Ę

P

Y

B

TOM VIII

I

O

C

H

E

1962

M

I

I

ZESZYT 4

J A R O S L A V H O R E JSl*

Rola glutationu w krwince czerwonej The Role of Glutathione in the Red Blood Celi A sh o rt re p o rt is given on in vesigations c a rrie d on in the In stitu te of H em atology and Blood T ra n sfu sio n (Prague, C zèchoslovakia) concerning th e oxygen binding capacity of hem oglobin and some factors in flu en cin g th is process. .

F u n k cja krw i w układzie oddechow ym w iąże się głów nie ze zdol­ nością hem oglobiny do w iązania tlenu. R eakcja ta zależy przede w szyst­ kim od ciśnienia cząstkowego tlenu. Poza ty m na reak cję tę w pływ a jeszcze w iele innych dobrze poznanych czynników , opisanych przez B a r c r o f t a , B o h r a , K r o g h a , H a s s e l b a c h a i innych. Za­ leżność m iędzy ilością tle n u związanego przez hem oglobinę a w artością ciśnień cząstkow ych tlen u i d w u tlen k u w ęgla wyriaża tzw . krzyw a dysocjacji. Zależność m iędzy ilością tle n u związanego a jego ciśnienieniem czą­ stkow ym nie m a c h a ra k te ru liniowego. W roztw orach czystej, krystalicz­ nej hem oglobiny — jak to w ykazał H u f f n e r — krzyw a ma kształt zbliżony do hiperboli. N atom iast we krw i i w roztw orach zaw ierających e lek tro lity krzyw a dysocjacji m a kształt litery S. W edług A d a i r a jest to następstw em sukcesywnego w iązania tle n u przez poszczególne cząstki hem u w hem oglobinie. O statnio B e n e s c h i R a n n e y podali, że k ształt krzyw ej dysocjacji jest zależny od liczby grup —SH w łań cu ­ chach peptydow ych hem oglobiny. Istn ieje na p rzykład w yraźna różnica m iędzy krzyw ym i dysocjacji hem oglobiny A i H. K rzyw a dysocjacji hem oglobiny H jest hiperboliczna i nie z n a jd u je się tam efek tu Bohra, n atom iast krzyw a dysocjacji hem oglobiny A ma k sz ta łt lite ry S, a efekt Bohra jest w yraźnie zaznaczony. Hem oglobina H zaw iera cztery (3-A łań ­ cuchy poiipeptydow e z dw iem a reak ty w n y m i grupam i —SH, a hem oglo­ bina A — tylko jedną tego rodzaju grupę w łańcuchu p. Esow aty k sz ta łt krzyw ej dysocjacji m ożna w yrazić rów naniem : y

k x 2'5

100

I-I- k x 2'5

* P rof. dr, U stav H em atologie a K re v n i i P rzetaczan ia K rw i), P ra h a, C zechosłow acja.

T ra n sfu se

http://rcin.org.pl

(In sty tu t

H em atologii

542

J . H O ftE J S l

[2 ]

W rów naniu tym y oznacza procent oksyhem oglobiny utw orzonej p rzy podainym ciśnieniu cząstkow ym tle n u x; 2,5 oznacza liczbę cząsteczek hem oglobiny tw orzących agregaty. Liczba ta w aha się od 1 do 4 przy średniej w artości 2,5. R ów nanie to pozw ala na obliczenie stałej k, k tó ra w yznacza k sz ta łt krzyw ej — jest to tzw. stała Hilla. N orm alne w artości tej stałej w ynoszą od 1 , 8 *1 0 ~ 4 do 3,9*1 0 4. W artości wyższe odpow iadają przesunięciu k rz y ­ w ej w lewo, niższe — przesunięciu w praw o. J a k już w spom niałem , wiele różnych czynników w yw iera w pływ na ilość tlen u wiązanego przez hem oglobinę i d e te rm in u je krzyw ą jej dysocj&cji. Czynnikam i tym i, opisanym i przez B ohra, są: 1 ) stężenie i skład elektrolitów w roztw orach hem oglobiny; 2 ) tem p e ra tu ra — jej podniesienie pow oduje przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o i vice versa; 3) ciśnienie cząstkow e d w u tlen k u węgla, przy czym w yrazem jego w pływ u jest efekt B ohra — przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o przy wzroście ciśnienia cząstkowego d w utlenku w ęgla; 4) rodzaj składnika globinowego: krzyw a dysocjacji hem oglobiny, któ rej składnik globinow y został zdenaturow any, m a k sz ta łt hiperboliczny; w edług ostatnich badań na k sz ta łt krzyw ej dysocjacji w yw iera rów ­ nież duży w pływ w spółdziałanie pom iędzy łańcucham i a i (3 globiny. Z podanych faktów m ożna by w yciągnąć wniosek, że kształt i u m iej­ scowienie krzyw ej dysocjacji zależy głów nie od czynników fizykoche­ m icznych. Na podstaw ie naszych dośw iadczeń udało się w ykazać, że przypuszczenie to nie jest słuszne i że oprócz dobrze znanych czynników fizykochem icznych istnieje c&ła grupa czynników chem icznych, m ogą­ cych w pływ ać na proces dysocjacji hem oglobiny. P rzed kilkom a laty badaliśm y przenoszenie tle n u przez hem oglobinę w przypadkach niedokrw istości złośliwej. L i t a r ć e k , K o z a i M e l k a w ykazali, że krzyw a dysocjacji hem oglobiny w tych przypadkach je st bardzo znacznie przesunięta w praw o, w artości stałej H illa spadły do 6,23 «lO- 5 — 7,90 «lO-5 . W celu znalezienia przyczyny tych zm ian prze­ prow adziliśm y następujące doświadczenia. W ydzielono ery tro cy ty i oso­ cze osobników zdrow ych i z niedokrw istością złośliw ą (tej sam ej g rupy krw i). K rw inki od chorych zawieszono w osoczu osobników zdrow ych, zaś k rw inki osobników zdrow ych w osoczu osób chorych na niedokrw i­ stość złośliw ą. N astępnie wyznaczono krzyw ą dysocjacji pobranej k rw i obu rodzajów i krw i sztucznej o zam ienionych ery tro cy tach . P oró w n u ­ jąc ze sobą otrzym ane krzyw e stw ierdziliśm y, że w artości stałej H illa odpow iadają krw i, z k tórej pochodzą erytrocyty, niezależnie od rodzaju osocza. Na przykład stała H illa dla k rw i praw idłow ej w ynosiła 1,06* 10~ 4 a dla krw i osobnika z niedokrw istością złośliwą 6,09* 10~5. Dla k rw i sztucznej z „n orm alnym i” ery tro cy tam i 1,09 *10-4 , a z e ry tro cy tam i po­ chodzącym i od chorych 6,4*10-5 . Na podstaw ie tych dośw iadczeń w yciąg­

http://rcin.org.pl

[3]

II K R A JO W E SY M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

543

nęliśm y wniosek, że zm iany krzyw ej dysocjacji hem oglobiny w niedo­ krw istości złośliwej nie są w yw ołane zm ianam i w osoczu, lecz w sam ych krw inkach. J e s t rzeczą znaną, że ery tro cy t zaw iera dość znaczną ilość glu tatio n u w przeciw ieństw ie do osocza, w k tó ry m brak tego związku. Zw róciło to naszą uw agę na zagadnienie w olnych grup —SH w e krw i i postanow iliś­ m y spraw dzić, czy istn ieje zależność pom iędzy ilością związków zaw ie­ rają cy c h grupy —SH a w artością stałej Hilla. Do oznaczania g lutationu we k rw i stosow ano początkowo jodom etryczną m etodę T u n i c 1 i f f e ’a a później m etodę P r e d t e ć e ń s k i e g o i C h y t i l a . Ilość zred u ­ kow anego glu tatio n u w yrażano w stosunku do liczby erytrocytów , uzys­ k u jąc w ten sposób w skaźnik opisany przez G a b b e g o i C a m p a n a c c i e g o . W artości praw idłow e tego w skaźnika wynoszą od 3,9 do 6,0. W niedokrw istości złośliw ej stw ierdziliśm y jego podw yższenie do w artości 4,8—20,5. W ykreślając krzyw ą zależności pom iędzy w artościa­ m i w skaźnika Gabbego a w artościam i stałej Hilla stw ierdziliśm y, że ma ona k ształt hiperboli. W przypadkach o w ysokich w artościach w skaźnika Gabbego w ystępow ały jedynie nieznaczne zm iany w artości stałej Hilla, n atom iast raptow ny w zrost w artości tej stałej zaobserw ow aliśm y w p rzy ­ padkach, gdy w artość w skaźnika była poniżej 8 ,0 . W innych seriach doświadczeń usiłow ano w ykazać bezpośrednio ist­ nienie w pływ u żwiązków zaw ierających g ru p y —SH na krzyw ą dyso­ cjacji hem oglobiny. Z redukow any g lutation krw i utleniano przepuszcza­ jąc tle n w ciągu 10 min. poprzez krew . P róby tej krw i badano stosow aną uprzednio techniką i w yznaczano krzyw ą dysocjacji hem oglobiny. Zgod­ nie z oczekiw aniam i niska zaw artość zredukow anego g lu tatio n u spow odo­ wała przesunięcie krzyw ej dysocjacji w lewo, w porów naniu z w artościa­ mi uzyskanym i dla krw i przed jej utlenieniem . W dalszych badaniach dodaw ano do badanych prób krw i w zrastające ilości zredukow anego glutationu. Stw ierdziliśm y, że tak we krw i, jak i jej hem olizatach krzyw a dysocjacji ulegała przesunięciu w praw o — w artość stałej Hilla spadała. Podobne, jednak nie tak w yraźne w yniki uzyskaliśm y stosując cysteinę zam iast glutationu. W reszcie dodaw aliśm y do badanej krw i fenyloboranu rtęci, sądząc, że blokada grup —SH — w przypadku, gdy m ają one jak i­ kolw iek w pływ na proces dysocjacji hem oglobiny — pow inna w płynąć na kształt krzyw ej dysocjacji. W celu w ykluczenia ew entualnego w pły­ wu sam ych am inokw asów przeprow adziliśm y serię badań kontrolnych w układzie zaw ierającym glicynę zam iast glu tatio n u lub cysteiny. U zyskane w yniki były zupełnie jednoznaczne: w zrastające ilości w ol­ nych gru p —SH — tak w postaci g lu tatio n u jak i cysteiny — pow odow a­ ły przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o. O dw rotny efekt w ystępow ał w przypadku m alejących ilości gru p —SH lub ich zablokow ania. A m i­ nokwasy nie zaw ierające siarki nie m iały w pływ u na krzyw ą dysocjacji.

http://rcin.org.pl

544

J. H O ftE J S l

[4]

Podobne rez u lta ty uzyskali później R i g g s i W o l b a c h . S tw ie r­ dzili oni, że chlorortęciobenzoesan zm niejszał w zajem ne oddziaływ anie cząsteczek hem u i obniżał ilość związanego przez hem oglobinę tlen u . W pływ g lu tatio n u i rtęci przedstaw iono na rys. 1. Na ry su n k u tym w idać w yraźnie znaczenie zm ian kształtu i nachylenia krzyw ej dla pro­ cesu przenoszenia tlen u do tkanek. Można zaobserwow ać, że w ty ch sa­ m ych w arunkach z tej sam ej ilości hem oglobiny przy spadku ciśnienia

Rys. 1. W pływ p rzesunięcia krzyw ej dysocjacji hem oglobiny na przenoszenie tlenu. P rzesunięcie krzyw ej w p raw o m ożna osiągnąć przez dodanie GSH. Z ablokow anie g ru p y —SH przez H g p rzesu w a krzy w ą w lewo. L in ie pionow e w p raw y m górnym rogu ry su n k u w y ra ża ją w zględne ilości tle n u uw olnionego z ty c h sam ych ilości he­ m oglobiny przy sp a d k u ciśnienia cząstkow ego tle n u ze 100 do 40 mm Hg.

cząstkowego tlen u ze 100 do 40 m m Hg uw alnia się ty m w iększa ilość tlenu, im bardziej krzyw a dysocjacji jest pochylona w praw o; efekt prze­ ciw ny w yw ołuje pochylenie krzyw ej w lewo. U żyw ając roztw orów czystej krystalicznej hem oglobiny przygotow a­ nej w edług m etody D r a b k i n a nie stw ierdziliśm y w pływ u g lu tatio n u na krzyw ą dysocjacji, natom iast zachow anie się hem olizatów było podob­ ne do zachow ania się pełnej krw i. W yciągnęliśm y z tego w niosek, że w e ry tro cy tach (praw dopodobnie w ich zrębie) w y stęp u je czynnik nie­ zbędny do działania gru p —SH. Przypuszczenie to znalazło potw ierdze­ nie w obserw acji, że dodanie do roztw orów hem oglobiny osadu, uzyska­ nego przez w irow anie hem olizatów , przyw racało efekt grup —SH. Co w ięcej, zaobserwow ano, że dodatek zrębu e ry tro cy tó w bez g lu tatio n u powodow ał również przesunięcie krzyw ej dysocjacji hem oglobiny w p ra ­ wo. W badaniach nad w yjaśnieniem tego zjaw iska w pierw szym rzędzie zw róciliśm y uw agę na anhydrazę w ęglanow ą, enzym znajdujący się w erytrocytach w dość znacznym stężeniu. W iem y dobrze, że enzym te n

http://rcin.org.pl

[5]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

545

w pły w a bezpośrednio na tra n sp o rt C 0 2, ale b rak jest dotychczas danych, k tó re m ogłyby wskazywać, że jego w pływ na ilość tle n u związanego przez hem oglobinę odbyw a się na innej drodze niż poprzez efekt Bohra, k tó ry jak wiadomo jest w ynikiem pośredniego w pływ u ciśnienia cząstko­ wego C 0 2 determ inującego w artość pH. Do naszych doświadczeń przygotow yw aliśm y anhydrazę węglanow ą m etodą K e i l i n a i M a n n a . W roztw orach o w zrastającej zaw artości an h y d ra z y w ęglanow ej w yznaczaliśm y krzyw ą dysocjacji hem oglobiny, ja k rów nież badaliśm y w pływ związków blokujących działanie tego en­ zym u. a) W pływ blokowania działania anh y d razy w ęglanow ej. Blokowanie działania anhydrazy uzyskiw aliśm y przy pom ocy cyjanków lub pewnego ro d zaju sulfonam idów (Diamox). Oba typy związków powodow ały prze­ sunięcie krzyw ej dysocjacji w lewo — w artość stałej Hilla w zrastała. b) W pływ w zrastających ilości anhydrazy w ęglanow ej. A ktyw ność tego en zy m u badano m etodą m anom etryczną M e l d r u m a i R o u g h t o n a . W pierw szych seriach doświadczeń użyto praw idłow ej krw i; do części jej dodano roztw oru anhydrazy, do drugiej części Diam oxu. W następ­ n y ch seriach doświadczeń używ aliśm y roztw oru czystej hem oglobiny k ry stalicznej w buforze fosforanow ym R ingera; stężenie roztw oru odpo­ w iadało stężeniu hem oglobiny we krw i, z k tórej ją wyosobniono. S tw ier­ dziliśm y, że w zrastające ilości anhydrazy w ęglanow ej we k rw i pow odują przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o — odw rotnie niż związki blo­ k u jące działanie tego enzym u. Na podkreślenie zasługuje fak t jednako­ wej zm iany zarów no w pełnej krw i, jak i w roztw orze czystej hem oglo­ biny. F a k t ten, naszym zdaniem, przem aw ia za poglądem , że anhydraza w ęglanow a, obok w pływ u pośredniego poprzez zm iany ciśnienia dw u­ tle n k u węgla, w yw iera działanie bezpośrednie na zdolność w iązania tle ­ n u przez hem oglobinę. W dalszych dośw iadczeniach zbadano w pływ kw asu askorbinowego. J e st rzeczą znaną, że związek ten w pływ a na glutation pow odując jego przejście z postaci utlenionej w zredukow aną. Po dodaniu doprow adzo­ nego do pH 7,0 roztw oru kw asu askorbinow ego do krw i lub roztw orów hem oglobiny obserw ow ano w yraźne przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o. Efekt ten był znacznie bardziej zaznaczony niż w doświadcze­ niach z anhydrazą węglanową. Był on jeszcze w yraźniejszy w układach zaw ierających obok kw asu askorbinow ego duże ilości anhydrazy w ęglano­ wej. Za pomocą kw asu askorbinow ego m ożna było do pewnego stopnia cofnąć ham ujące działanie cyjanków na anhydrazę węglanow ą. Dalsze badania doprow adziły do stw ierdzenia, że istnieje liniowa za­ leżność pom iędzy stężeniem kw asu askorbinow ego we krw i a w artościa­ m i stałej Hilla. Działanie kw asu askorbinow ego ham ow ane jest przez jon m iedziow y Cu 2 . W dośw iadczeniach kontrolnych zam iast kw asu askor­ binowego używano kw asu octowego (pH roztw oru doprow adzone rów nież

http://rcin.org.pl

546

J. h o r e j s i

[6]

do 7,0). W dośw iadczeniach tych nie stw ierdziliśm y zm ian w k rzy w e j dysocjacji, co potw ierdza hipotezę działania kw asu askorbinow ego nie jako kw asu organicznego, lecz zw iązku o specyficznej budowie. W obecności kw asu askorbinow ego nie stw ierdziliśm y zm ian w w idm ie roztw orów hemoglobiny. Z naszych dośw iadczeń w ynika, że na krzyw ą dysocjacji hem oglobiny w pływ ają nie tylko czynniki n a tu ry fizykochem icznej, ale rów nież cały szereg czynników o charakterze raczej chem icznym , jak zw iązki z grupą sulfhydrylow ą (glutation, cysteina), anhydraza w ęglanow a, kw as askor­ binowy. Zapew ne w przyszłości zostaną odkryte i inne czynniki. W pływ grup —SH zależy niew ątpliw ie od innych czynników obecnych w zrębie erytrocytu, na co w skazuje brak takiego w pływ u w roztw orach czystej hem oglobiny. D ziałanie anh y d razy w ęglanow ej można blokow ać za po­ mocą cyjanków i D iam oxu. H am ow anie w yw ołane przez cy jan ek można z kolei cofnąć za pom cą kw asu askorbinow ego. W pływ kw asu askorbino­ wego, tj. przesunięcie krzyw ej dysocjacji w praw o, jest niezależny od obecności zrębu erytrocytów , bowiem podobny efek t w y stęp u je w przy­ padku roztw oru czystej, krystalicznej hem oglobiny. Obecnie chciałbym wspom nieć o innych seriach dośw iadczeń. W iado­ mo, że glutation zn ajd u je się jedynie w ew nątrz erytrocytów , natom iast surow ica nie zaw iera go zupełnie. W ynika z tego, że albo g lu ta tio n jest mocno zw iązany w ew nątrz e ry tro cy tu lub w jego błonie, albo też błona nie jest dla glu tatio n u przepuszczalna. Zbadaliśm y zatem zm iany stęże­ nia g lu tationu w ery tro cy tach po dodaniu roztw oru g lu tatio n u do zaw ie­ siny przem ytych erytrocytów w roztw orze soli fizjologicznej. Część erytrocytów przechow yw aliśm y w tem p e ra tu rz e 0 °, część w tem p eratu rze 20°. U żyw aliśm y dwóch stężeń glu tatio n u a m ianow icie 50 mg°/o i 100 mg°/o..W celu odcięcia dostępu tlen u z atm osfery zaw iesinę erytrocytów pokryliśm y w arstw ą płynnej parafiny. P ró b y pobieraliśm y w odstępach 15-m inutow ych i po odw irow aniu oznaczaliśm y zaw artość g lu tationu zarów no w e ry tro cy tach (zhem olizowanych), jak i su p e rn a -

Rys. 2 . G lutation dodany do zaw iesiny p rzem ytych k rw in ek czerw onych nie p r z e ­ n ik a do ich w nętrza. U żyw ano dw óch różnych stężeń GSH, p om iarów d o k o n y w an o w 0° i 20°C.

http://rcin.org.pl

[7]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

547

tancie. Z rys. 2 widać, że w ciągu godziny nie zachodziły zm iany zaw ar­ tości g lutationu w ery tro cy tach (zhem olizow anych). N ieznaczny przyrost w yw ołany był jego obecnością w roztw orze, pozostałym łącznie z kom ór­ kam i po w irow aniu. Ilość tego roztw oru w ynosiła koło 5%> całkow itej jego objętości. W yniki te w skazują, że w podanym okresie nie było przenika­ nia glutationu ze środow iska zew nętrznego do w n ętrza krw inki. W podobnie przeprow adzonych dośw iadczeniach używ aliśm y cysteiny zam iast glutationu i stw ierdziliśm y, że przenika ona do w nętrza krw inki (rys. 3). Szybkość przenikania zależy od stężenia cysteiny i w zrasta w nie­ w ielkim stopniu przy wzroście tem p e ra tu ry . Spostrzeżenia te potw ier­ dziliśm y w dośw iadczeniach z cysteiną znakow aną radioaktyw ną siarką.

Rys. 3. C ysteina przen ik a łatw o do w n ętrz a k rw in ek czerw onych po dodaniu jej do zaw iesiny przem ytych k rw in ek w roztw orze fizjologicznym . K rzyw e p rze d staw ia ją zależność p rzen ik an ia od stężenia cysteiny w roztw orze i od te m p e ra tu ry roztw oru.

P rzyjm ujem y, że glutation może być syntetyzow any w ew nątrz ery­ trocytu: in vitro stw ierdzono zarów no w łączanie cysteiny, jak i 14C-glicyny. P ew ne w ątpliw ości istnieją odnośnie w łączania kw asu glutam inow e­ go. W naszych dośw iadczeniach przy użyciu znakow anego kw asu g lu ta­ minowego stw ierdziliśm y, że am inokw as ten przechodzi do erytrocytów powoli i w m ałych ilościach. P ow staje zatem pytanie, co jest w ery tro cy ­ cie źródłem tego am inokw asu koniecznego do syntezy glutationu. V av r e c k a i M i r c e v o v a w ykazali, że w e ry tro cy ta ch syntetyzow ane są pew ne ilości kw asu a-ketoglutarow ego. Drogi m etabolizm u tego kw a­ su w ery tro cy tach badała M i r c e v o v a . W tym celu oznaczyła przede w szystkim jego zużycie z różnicy poziom u przed inkubacją i po 5 godzi­ nach inkubacji. Stw ierdziła, że w tym czasie 100 m l erytrocytów może zmetabolizować około 20 m ikrom oli kw asu a-ketoglutarow ego z 43 m ikromoli dodanych do inkubow anej m ieszaniny. N orm alnym i drogam i m etabolizm u kw asu a-ketoglutarow ego jest albo jego dekarboksylacja do kw asu bursztynow ego, albo jego transam inacja do kw asu glutam inow ego. O ksydatyw ną dekarboksylację kw asu a-keto-

http://rcin.org.pl

548

J. H O R E JSI

[8]

glutarow ego do kw asu bursztynow ego h am uje arsen i kadm . Po dodaniu tych jonów stw ierdziliśm y nie zm niejszenie, a , przeciw nie, zwiększenie zużycia kw asu a-ketoglutarow ego przez e ry tro cy ty . To stw ierdzenie, jak również i inne dośw iadczenia pozw alają na w ysunięcie w niosku, że głów ­ ną drogą m etabolizm u kw asu a-ketoglutarow ego jest jego tran sam in acja do kw asu glutam inow ego i reakcja ta jest zapew ne w ażnym elem entem w syntezie glutationu w erytrocycie. Podam teraz kilka przykładów praktycznego znaczenia badań nad zdolnością w iązania tle n u przez hem oglobinę i w pływ em zw iązków za­ w ierających grupy —SH na przenoszenie tlenu. Ja k to m ożna było zau­ ważyć na w ykresie, k tó ry P ań stw u przedstaw iłem (rys. 1), z tej sam ej ilości hem oglobiny uw alnia się ty m większa ilość tlenu, im bardziej jej krzyw a dysocjacji jest nachylona w praw o i odw rotnie — ty m m niej tle ­ nu, im bardziej krzyw a ta jest nachylona w lewo. Efekt ten m ógłby być w ykorzystany w przypadkach zm niejszonej zaw artości hem oglobiny. Zba­ daliśm y zatem u psów działanie krw i konserw ow anej, do k tórej dodano znaczne ilości glutationu, w dośw iadczalnie w yw ołanym w strząsie pokrw otocznym . W dośw iadczeniach tych pobieraliśm y tak ie ilości krw i, k tó re powodow ały spadek ciśnienia do 40 m m Hg w ciągu 15 m inut, i utrzym yw aliśm y to ciśnienie przez dalszych 70 m inut. Po tym okresie podaw aliśm y k re w w ilości 1 m l/m in/kg wagi ciała. C ałkow ita ilość po­ danej była rów na ilośęi, jaką uprzednio pobrano. W grupie kontrolnej psów, któ ry m w tych sam ych w arunkach poda­ wano krew bez glutationu, 50% zw ierząt zginęło. W grupie 73 psów, którym podaw ano krew z dodatkiem 40 mg g lu tationu na 10 m l krw i w szystkie zw ierzęta przeżyły (rys. 4). Podobnie korzystne w yniki w zw al­ czaniu w strząsu uzyskaliśm y po podaniu d e k stra n u z dodatkiem zreduko­ wanego glutationu.

Rys. 4. W pływ zredukow anego g lu ta tio n u dodanego do k rw i użytej do zw alczan ia w strząsu pokrw otocznego u psow. D odanie 40 mg°/o GSH daw ało p raw ie 100%> przeżycia psów. S łu p k i zakreskow ane — k rew bez g lu tatio n u . S łu p k i czarne — k rew z g lutationem : I 8 mg/100 ml, II 16 mg/100 ml, III 40 mg/100 ml.

http://rcin.org.pl

[9]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

549

D odatnie działanie glu tatio n u w zw alczaniu w strząsu pokrw otocznego uzyskaliśm y także u królików . K rzyw e dysocjacji hem oglobiny zw ierząt, k tó re otrzym ały k rew lub dekstran z dużą zaw artością glutationu, były zawsze przesunięte w praw o. Ilość tlen u uw olnionego z tej sam ej ilości hem oglobiny była u tych zw ierząt o 20—25% większa niż u zw ierząt kon­ trolnych, otrzym ujących krew bez glutationu. B adania krzyw ej dysocjacji hem oglobiny mogą być rów nież użytecz­ ne w pracach nad zagadnieniem konserw acji krw i. W artość biologiczną krw i 'konserw ow anej wyznacza, poza szeregiem innych czynników , rów ­ nież i jej zdolność do przenoszenia tlenu. Je st rzeczą dobrze znaną, że podczas przechow yw ania krw i w zrasta w niej ilość m ethem oglobiny. Ilości te są bardzo niew ielkie w pierw szym okresie przechow yw ania, ale bardzo szybko w zrastają w m iarę w yczerpyw ania się źródeł energetycz­ nych erytrocytu. U tlenienie hem oglobiny do oksyhem oglobiny jest w p ra ­ w idłow ych w arunkach reakcją odw racalną, któ rej rów now aga jest w y­ raźnie przesunięta w lewo. W m iarę w zrostu zaw artości m ethem oglobiny krzyw a dysocjacji krw i przesuw a się w lewo, a zatem zm niejsza się ilość tle n u przenoszonego z krw i do tkanek. Ja k donieśli R u m m e l i B r u n s , ilość g lu tationu w konserw ow anej krw i zm niejsza się w m iarę w zrostu czasu jej przechow yw ania. Nasze badania potw ierdziły te wyniki. Spadek zaw artości grup —SH odbija się niekorzystnie rów nież na m etabolizm ie w ęglow odanow ym ery tro cy tu . W iadomo z w ielu publikacji, że zm niej­ szenie się natężenia glikolizy w krw ince przyspiesza produkcję m ethe­ m oglobiny. Oba te procesy, tj. podw yższenie zaw artości m ethem oglobiny i spadek zaw artości grup —SH, m ają, jak w iem y, niekorzystny w pływ na ilość wiązanego przez hem oglobinę tle n u i pow odują przesunięcie krzyw ej dysocjacji w lewo. Badaliśm y procesy m etaboliczne zachodzące we krw i, porów nując w pływ przechow yw ania jej z roztw orem konserw ującym ACD oraz z m ieszaniną roztworu ACD i różnych środków przeciw histam inow ych (fenergan). Badania obejm ow ały: zm iany krzyw ej dysocjacji, zaw artość m ethem oglobiny i choleglobiny, d e n atu rację alkaliczną hem oglobiny, po­ ziom kw asu m lekowego i pirogronow ego oraz aktyw ność glikolityczną i zaw artość trioz. Stw ierdziliśm y, że w norm alnych w arunkach konser­ wacji krw i zaw artość choleglobiny jest bardzo niew ielka. Dodanie fenerganu powodowało tw orzenie się jego kom pleksu z hem oglobiną, bardziej podatnego na d etan u rację pod działaniem w odorotlenku sodu niż hem o­ globina krw i konserw ow anej ACD i ACD z dodatkiem analerginy. Two­ rzenie się m ethem oglobiny przebiega w obecności fenerganu szybciej niż we krw i konserw ow anej tylko ACD; w ciągu 24 godzin w ytw arzało się powyżej 15% m ethem oglobiny. W czasie przechow yw ania krw i stała Hilla rośnie, a krzyw a dysocjacji przesuw a się w lewo. Zm iany te p ostępują znacznie szybciej w obecności fenerganu niż we krw i konserw ow anej ACD.

http://rcin.org.pl

550

J. H O ftE J S l

[10]

Na podstaw ie zm ian w poziomie kwasu m lekowego i pirogronow ego, aktyw ności glikolitycznej i tw orzenia się trioz w yw nioskow aliśm y, że fenergan obniża przede w szystkim aktyw ność dehydrogenazy kw asu m le­ kowego. W yniki te są zgodne z obserw acjam i zwiększonego poziom u m e t­ hem oglobiny w konserw ow anej krw i. Jak wiem y, tw orzenie się m ethem o­ globiny w ystępuje w erytrocycie stale, ale jednocześnie p ro d u k t ten jest z pow rotem redukow any do hemoglobiny. Rów now aga tej reakcji jest przesunięta w lewo i stąd w norm alnych w arunkach zaw artość m eth e­ m oglobiny we krw i żywego organizm u nie przekracza nigdy 0 , 4 % ilości hem oglobiny. Poprzez zaham ow anie dehydrogenazy kw asu m lekowego i dehydro­ genazy triozofosforanow ej konw ersja m ethem oglobiny w hem oglobinę ulega zw olnieniu. W zrost poziom u m ethem oglobiny zaobserw ow any przez nas po dodaniu fenerganu można tłum aczyć jako w ynik zaham ow ania aktyw ności dehydrogenazy kw asu m lekowego, a być może rów nież i in­ nych dehydrogenaz. N iekorzystny w pływ zaham ow ania pew nych proce­ sów m etabolicznych w krw ince może objaw ić się jako zw olnienie kon­ w ersji m ethem oglobiny w hem oglobinę. Podw yższenie poziom u m eth e­ m oglobiny w raz ze zm niejszeniem zaw artości g lu tatio n u i kw asu askor­ binowego w pływ a u jem nie na zdolność w iązania tlen u przez hem oglobinę. W niniejszym referacie usiłow ałem dokonać krótkiego przeglądu w y­ ników naszych badań nad zdolnością w iązania tle n u przez hem oglobinę i czynnikam i na ten proces w pływ ającym i. Stw ierdziliśm y, że obok całego szeregu znanych czynników fizykochem icznych w pływ ają na ten proces czynniki chemiczne. K ilka z nich: zredukow any glutation, kw as askorbi­ nowy i anhydrazę w ęglanow ą poddaliśm y szczegółow ym badaniom , uzy­ skując interesujące w yniki. Dla w yśw ietlenia niektórych problem ów , a szczególnie m echanizm u działania g lutationu konieczne są jednak d a l­ sze p race doświadczalne. W drugiej części re fe ra tu przedstaw iłem możliwość praktycznych zastosow ań naszych prac nad zdolnością w iązania tle n u przez hem oglo­ binę. Jed n ą z nich jest zw alczanie w strząsu pokrw otocznego u zw ierząt przez podanie krw i lub środków krw iozastępczych z dodatkiem zreduko­ wanego glutationu. W ykazałem rów nież w artość naszych w yników i w niosków dla badania zm ian zachodzących w e krw i konserw ow anej, przechow yw anej w różnych w arunkach. Cieszyłbym się gdyby P aństw o odnieśli w rażenie, że badania nad zdolnością w iązania tle n u przez hem o­ globinę i nad czynnikam i o tym decydującym i m ają znaczenie nie tylko czysto teoretyczne, ale mogą rów nież dopomóc w rozw iązaniu pew nych zagadnień zw iązanych z przenoszeniem tlen u z krw i do tkanek. Tłum aczył: M. Trenkner

http://rcin.org.pl

[11]

II K R A JO W E SY M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

LITER A TU RA

1. H o f e j s i J., Cas. L ek. Ces. 72, 227 (1933). 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

H o f e j s i J., K o m a r k o v a A., C eskoslov. F ysiol. 8 , 19 (1959). H o f e j s i J., K o m a r k o v a A., Clin. C him . A cta 3, 131 (1957) H o r e j s i J., K o m a r k o v a A., V n itfn i L e k a fs tv i 5, 12 (1959). H o f e j s i J , K o m a r k o v a A , A cta U niv. C arolinae-M ed., 419 (1958). D r a b k i n D. L., A rch. B iochem . 21, 224 (1949). K e i l i n D, M a n n T., B iochem . J. 34, 1163 (1940). Meldrum N. K , R o u g h t o n F. J. W ., J. P hysiol. 80, 113 (1934).

http://rcin.org.pl

PAŃSTWOWE WYDAWNICTWO NAUKOWE

http://rcin.org.pl

P

O

S

T

Ę

P

Y

B

TOM VIII

I

O

C

H

E

1962

M

I

I

ZESZYT 4

DONIESIENIA

Metabolizm kwasu cytrynowego i a-ketoglutarowego w erytrocytach ludzkich M etabolism of Citric and a-K atoglutaric Acids in Humań Erythrocytes L. MIRCEVOVA, J. VOSYKOWA Z

In s t y t u t u

H em a tolo gii

i

P rze ta cza n ia

K rw i,

Praha,

C z ech o sło w a cja

Z badano, czy erytrocyty ludzkie są zdolne do syntezy k w asu cytrynow ego. W ce­ lu zaham ow ania dalszej przem iany ew e n tu aln ie pow stającego k w asu cytrynow ego stosow ano 2,5*10—3 M roztw ór p iro fo sfo ran u (ham ow anie dehy d ro g en azy izocytrynianow ej) lub jony Ba2+ (1). K w as fluorooctow y stosow ano ty lk o w b a d a n ia ch k o n ­ trolnych. Ja k o su b stra tó w do syntezy k w asu cytrynow ego użyto: glikozę, fu m a ra n + octan, szczaw iooctan + octan. W yniki nie dały w yraźn ej odpow iedzi na p o sta­ w io n e pytanie. D latego też w ydzielono ery tro cy ty m etodą po d an ą p rzez M a r k s a i G r o s s a (2). W niższych w arstw ac h erytrocytów , nie zaw ierający ch retik u lo cy tó w , nie stw ierd zono syntezy k w asu cytrynow ego; zachodziła ona w słab y m stopniu w w arstw ach wyższych, zaw ierających pew ną ilość retiku lo cy tó w ( 1—10 m-M k w asu cytrynow ego n a 100 ml erytrocytów ). D odanie zagotow anego w yciągu z w ątro b y jak o źródła CoA nie w płynęło sty m u lu jąco na syntezę kw asu cytrynow ego. Do­ św iadczenia w ykazały zatem , że w ery tro cy tac h nie zachodzi sy n teza k w asu cy­ trynow ego. Po tym stw ierdzeniu zbadano, czy dodany k w as cytrynow y może być m etab o ­ lizow any w erytrocycie do k w asu a-ketoglutarow ego. E w en tu a ln ą d alszą p rzem ian ę tego zw iązku ham ow ano przez dodanie hydrazyny, A TP, N aF, KCN, k w asu jodooctowego lub różnych m ieszanin tych zw iązków . O trzym ano w y n ik i n egatyw ne, jednakże po zastosow aniu hydrazydu k w asu izonikotynow ego stw ierd zo n o n ieznacz­ ne w y tw arzan ie kw asu a-keto g lu taro w eg o z dodanego k w asu cytrynow ego (0,3— 2,7 ptM k w asu a-ketoglutarow ego na 100 ml ery tro cy tó w w czasie 5 godz. in k u b a cji w te m p eratu rz e 37°). Z badano zatem jego dalsze przem iany. W ykazano, że 100 m l ery tro cy tó w może zużytkow ać 3,6—21,0 nM z 43 ¡¿M dodanego k w asu a -k e to g lu ta ro ­ w ego w czasie 5 godz. inkubacji. P oniew aż p rzem iany tej nie h am ow ały, a n aw et ją stym ulow ały: arsenian i jony C a2+, nie jest ona oksy d aty w n ą d ek arb o k sy lacją. M ożliwa by ła zatem p rzem iana do k w asu glutam inow ego w re a k c ji k atalizo w an ej przez dehydrogenazę kw asu glutam inow ego lub tran sam in azę. D odanie jonów NH 4 + ham ow ało zużycie a -k e to g lu ta ra n u przez erytro cy ty , n ato m ia st dodanie k w asu a sp a­ raginow ego, alaniny i glu tam in y m iało działanie stym u lu jące. E fe k t sty m u lac ji w z ra ­ sta ł po do d aniu arsenianu. W ydaje się zatem , że głów ną drogą p rze m ian y a -k e to ­ g lu ta ran u w erytrocytach je st tra n sa m in a c ja do k w asu glutam inow ego. W ynik te n

http://rcin.org.pl

554

D O N IE S IE N IA

[2]

je st zgodny z o b serw acją G a v o s t o i w spółpracow ników (3) oraz L ó h r a i W a l l e r a (4), że w ery tro cy tach z n a jd u ją się tran sa m in a zy : g lu ta ra n —alan in a i g lu ta ra n —asp arag in ian ; w ykazuje ponadto obecność ak ty w n ej tra n s a m in y g lu ta ­ ra n —glutam ina. W ydaje się zatem , że w erytro cy tach w y stę p u ją enzym y cyklu K rebsa, zw iązane z przem ian ą am inokw asów .

LITERATURA

1. K l e i n z e l l e r A., M a ł e k J., V r b a R., M anom etricke m eto d y a jejich poużiti v biologii a biochem ii, S tat. zdrav. nakład., P ra h a 1954. 2. M a r k s P. A., G r o s s R. T., J. Clin. Invest. 38, 2253 (1959). 3. G a v o s t o T., B u f f a F., D i S t a s i M., M a r i a n i Sci. Med. 108, 377 (1959).

G., V e r g n a n o F,, A rch.

4. L ó h r G. W., W a 11 e r H. D., K lin. W ochenschr. 37, 833 (1959).

W pływ azotynów na związki adeninowe w hemolizatach krwi ludzkiej The Effects of N itrite on A denine Compounds in the Humań Blood H em olysates W. LEYKO, A. DMOCHOWSKI, W. BO LANOW SK A, J. LORENC Z Z a kła du Bio ch em ii UŁ i Z a kła du Chem ii F iz j o l o g ic z n e j AM w Ł o d zi

Z badano w pływ N a N 0 2 i gazowego NO na zaw artość ad en in y w roztw o rach w zorcow ych o stężeniu 200—500 ng adeniny w 20 ml. A deninę w y trąc an o za pomocą AgoO w środow isku kw aśnym , o trzy m an ą sól sreb ro w ą ro zk ład an o HC1 i oznaczano adeninę m etodą spek tro fo to m etry czn ą i polarograficzną. A g20 w y trą c a 91—99,7% ad en in y w stosunku do jej zaw artości w roztw orze w yjściow ym . Stw ierdzono, że N a N 0 2 w stężeniu 1 : 10 000 pow oduje k ilk u n asto p ro cen to w y spadek zaw artości adeniny, jeśli je d n ak jednocześnie dodać N a 2S 20 4, nie w y stęp u je zm iana jej zaw artości. W stężeniu 1 : 1000 NaNO-> w yw ołuje całkow itą d ezam in ację ad en in y do hip o k san ty n y . D odanie N a 2S 20 4 chroni i w tym p rzy p ad k u ad en in ę od ro zk ład u . P rzy stężeniu 1 : 500 N a N 0 2 n astępow ała całkow ita d ezam in acja ad en in y ; po do­ d an iu N a 2S 20 4 obserw ow ano tylko częściow ą dezam inację w g ran ic ac h od k ilk u do trzy d ziestu k ilk u procent. K ilk u m inutow e przepuszczanie NO gazowego przez ro ztw ó r ad en in y pow oduje jej całkow itą dezam inację, dezam inacji tej zapobiega w pew nych w aru n k ac h do­ danie N a 2S 20 4. W dalszym etapie pracy zbadano w pływ azotynów i NO na całk o w itą zaw artość adeniny, pochodzącej ze w szystkich jej kw asorozpuszczalnych zw iązków zaw arty ch w hem olizatach k rw i ludzkiej. W ybrano w tym celu w aru n k i, w k tó ry ch nie o b ser­ w ow ano zm ian zaw artości adeniny w roztw orach w zorcow ych, a m ianow icie: 1) stężenie N a N 0 2 1 : 1000, z dodatkiem N a 2S 20 4; 2) 1-m inutow e przepuszczanie NO, z dodatkiem N a 2S 20 4. Do oznaczeń p o bierano 4 m l k rw i z żyły łokciow ej, hem olizow ano i poddaw ano d ziałan iu pow yższych odczynników , pob ierając p ró b k i do oznaczeń w określonych

http://rcin.org.pl

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

[3]

555

o d stęp ach czasu. W p rzy p a d k u N a N 0 2 1 : 1000, z dodatk iem N a 2S-204 , zaw artość ad en in y w ynosiła średnio (24 oznaczenia): po 0h 8,5 mg % (100 %), po l h 10,3 mg % (121 %), po 2h 11,0 mg % (129%), po 3h 10,0 mg % (118%). Z aw arto ść adeniny w hem olizacie k rw i przed dodaniem odczynników p rzyjęto za 100%. W p rz y p a d k u działania NO z dodatkiem N a 2S 204 otrzym ano n astęp u jące w y n ik i (śre d n ia z 18 oznaczeń): po 01' 100%, po 1 m in. 133,2%, po 3 m in. 80,8%. Na p o d staw ie pow yższych w yników m ożna stw ierdzić, że pod d ziałan iem azoty­ nów lu b gazow ego NO n a stę p u je przejściow y w zro st całko w itej zaw arto ści ad en in y dochodzący do około 130% w stosunku do jej p ierw o tn ej zaw artości w hem olizatach k rw i lu dzkiej. Praca

częścio w o su b syd iow ana

przez

K om itet

B ioch em iczn y

PA N .

Zjawisko rewersji hemolizy krwinek czerwonych i próba jego interpretacji ilościowej The R eversion of H em olysis of the Erythrocyte and Q uantitative Interprétation of this Phenom enon Z. STOLZMANN, CZ. PIETZ Z Z a k ła d u

Chem ii F iz jo lo g ic zn ej AM w

Poznan iu

H em oliza k rw in ek czerw onych, w yw ołana roztw o ram i hipotonicznym i, może być w w aru n k ac h dośw iadczalnych odw rócona, przez doprow adzenie stężenia roz­ tw o ru do w arto ści izotonicznej. Isto tą tego m ało znanego zjaw iska, opisanego przez B r i n g m a n n ’ a i S z e n t -Gyórgiego (1, 2 ) jest pow rotne przen ik an ie hem oglobiny z ro ztw o ru do za­ w ieszonych w nim cieni krw inek czerw onych. Tok p ostępow ania jest następujący. K rw in k i czerw one p rzem yte d w u k ro tn ie roz­ tw o rem 0,17 M N aC l-P 04 przygotow anym w edług (3) hem olizuje się dw iem a ob jętościam i w ody destylow anej i pozostaw ia w te m p e ra tu rz e pokojow ej. Po upływ ie 15 m in u t doprow adza się roztw ór do stężenia izotonicznego przez dodanie 9% roz­ tw o ru NaCl. Ilość hem oglobiny, k tó ra pow rotnie p rzen ik n ęła do k rw in ek , w ylicza się z różnicy stężenia hem oglobiny pozostałej w roztw orze po o dw irow aniu k rw i­ nek czerw onych po odw róceniu hem olizy w poró w n an iu z jej zaw arto ścią w p ierw o tn y m hem olizacie. D ośw iadczenia w ykazały, że średnio w raca do k rw in ek 37% hem oglobiny, jeżeli k rw in k i są po b ran e od dorosłych daw ców , zaś 46% w w y ­ padku k rw i pępow inow ej. S tąd należy w ysunąć w niosek, że n ajw yższą zdolność rew ersji w y k azu ją k rw in k i najm łodsze. S topień rew ersji jest także zależny od sposobu przecho w y w an ia k rw i i dodanych su b stan cji do konserw ow anej k rw i. P oró w n u jąc k rw in k i h irudynow e, h eparynow e i cytry n ian o w e tego sam ego daw cy spostrzega się n ajm niejszy sto p ień rew ersji dla k rw in ek cy trynianow ych w porów naniu z k rw in k a m i k rw i odw łóknionej. Jeszcze niższe w arto ści pow rotnego p rze n ik an ia hem oglobiny w y k azu je k rew z dod atk iem płynu k o nserw ującego, stosow anego w S tacjach K rw iodaw stw a. K ilk a k ro tn e p rze­ m yw anie k rw in e k roztw orem 0,17 M N a C l-P 0 4 nie w y k azu je różnic w zdolności krw in ek do odw rócenia hem olizy, n ato m iast cztero k ro tn e p rzem y w an ie płynem konserw ującym pozbaw ia k rw in k i w łaściw ości rew ersji. S tąd w niosek, że dodatek

http://rcin.org.pl

[4] czynników obcych środow isku k rw i obniża zdolność rew ersji. K rw in k i czerw one k rw i, do k tó rej dodano szczaw ianu sodowego, potasow ego i am onow ego oraz flu o r­ k u sodowego w celu zapobieżenia krzepnięciu, zacho w u ją się podobnie ja k k rw in k i cytrynianow e. K rw in k i czerw one, do któ ry ch w zjaw isku rew ersji p rze n ik n ęła z p o w ro tem hem oglobina, zachow ują dalej zdolność p ow tórzenia tego zjaw iska. W ykazano, że m ożna trzy k ro tn ie przeprow adzić proces odw rócenia hem olizy n a k rw in k a c h w dniu ich pobrania. K rw in k i przechow ane w te m p eratu rz e + 4° p rzez 72 godziny zachow ują zdolność re w e rsji tylko dw ukrotnie. Stopień rew ersji w zależności od sta rzen ia się k w in ek in vitro: k rw in k i p rz e ­ chow yw ane in vitro w te m p e ra tu rz e + 4° tra c ą zdolność odw rócenia hem olizy m ię­ dzy 12 a 15 dniem przechow yw ania (4). Podobne w łaściw ości w sensie ilościow ym ja k k rw in k i człow ieka w y k a z u ją k rw in k i św inki m orskiej i szczura. Nieższe w arto ści d ają k rw in k i królicze, kocie, krow ie, kozie i gołębie, a w ięc i jąd rzaste. M echanizm p rze n ik an ia pow rotnego hem oglobiny je st nieznany, lecz zależny od s tru k tu ry i w łasności otoczki i w ym aga dalszych dośw iadczeń.

LITERATURA

1. B o g e n d o r f e r L., H a l l e B., Biochem . Z., 160, 199 (1925). 2. S t o l z m a n n Z., C h m i e l J., P i e t z Cz., Ilościow e u jęcie stopnia odw racalności hem olizy krw dnek czerw onych, B ull. Soc. A m is. Sci., Ser. C, L ivr. VI (1956). 3. P a r p a r t A. K., Lorenz P. B., Parpart E. R., Gryg J. R„ C h a r e A. M ., J. Clin. In vest. 26, 636 (1947). 4. P i e t z Cz., W pływ czasu i środow iska na o dw racaln o ść k rw in e k czerw onych, B ull. Soc. A m is Sci., Ser. C., L ivr. IX (1959).

Związki fosforanowe krwinek czerwonych psa jako metabolity i koeuzyny przemiany węglowodanowej Organic Phosphates — M etabolites and Coenzymes in the Carbohydrates M etabolism of the Dog Erythrocytes J. CHMIEL Z Z a kła du C h em ii F izjologic zn ej AM w Pozn an iu o ra z L a b o r a t o r i u m F oundation w La Jolla, K alifo rn ia

S crip p s

Clinic

W naw iązan iu do poprzednich b a d a ń n ad istotą zw iązku m iędzy trw ało ścią stru k tu ry a aktyw nością m etaboliczną czerw onych ciałek krw i, przeprow adzono oznaczanie zw iązków fosforanow ych w k rw in k ac h czerw onych psa. Celem p racy było stw ierdzenie czy odm ienny stopień trw ałości k rw in ek psa w po ró w n an iu z k rw in k am i człow ieka a dość znaczne różnice w zakresie p rzem ian energetycznych zw iązanych z tran sp o rte m jonów nie zn a jd ą odbicia w ilościow ym lub jakościow ym składzie zw iązków fosforanow ych i nie pozw olą w nioskow ać o pew nych o d rę­ bnościach m echanizm u w ykorzy sty w an ia glikozy. K rew uzyskiw ano od zdrow ych psów przez n ak łu cia serca. O ddzielone i p rz e ­ m y te k rw in k i zadaw ano kw asem trójchlorooctow ym , k tó ry po odw irow aniu w y ­

http://rcin.org.pl

[5]

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

557

trąco n eg o b ia łk a u&uwano przez e k stra k cję eterem . U zyskany w yciąg, zaw ierający około 95% rozpuszczalnych w w odzie zw iązków fosforanow ych k rw in ek , zo b o jętn ia­ n o i przepuszczano przez kolum nę 1 X 20 cm. D ow ex 1 X 8(100—325 oczek, form a m rów czanow a). Z aadsorbow ane na kolum nie fo sforany eluow ano za pom ocą sto p ­ niow ego w zrastająceg o stężenia 0 -> 4 N b u fo ru m rów czanego przy szybkości p rze­ p ły w u 1 ml na m inutę, zbierając fra k c je za p o średnictw em autom atycznego k o ­ le k to ra. We w szystkich uzyskanych fra k c ja c h przeprow adzon o oznaczenie fosforu ca ł­ kow itego m etodą F iskiego-S ubbarow a oraz odczytyw ano ab so rp cję w nadfiolecie (D, 260 mu) na sp ektrofotom etrze B eckm ana celem uchw ycenia sk ład n ik ó w n u k leotydow ych. H eksozy oznaczano rea k cją an tro n o w ą (Dreywood), fru k to zę za pom ocą czułej re a k c ji z cysteiną i karb azo lem (D i s c h e), pentozę na podstaw ie re a k c ji z orcyną (M e j b a u m), kw as glicerolow y za pom ocą re a k c ji z kw asem chrom otropow ym (B a r 1 1 e 11). S k ład n ik i nukleotydow e id en ty fik o w an o przez w yznaczanie w idm a absorpcji w nadfiolecie; w n iektóry ch p rzy p ad k ach id e n ty fi­ k o w an ia zw iązków posługiw ano się testam i enzym atycznym i. Pozycję eluow ania szeregu sk ładników spraw dzano przez porów nanie z chro m ato g raficzn y m rozdzia­ łem ro ztw o rów w zorcow ych. Z ek stra k tó w k rw in ek czerw onych psa w ydzielono, zid en ty fik o w an o i określono ilościow o n astęp u jące połączenia k w asu fosforow ego: jed n o fo sfo ran y heksoz, glik o zo -i, 6 -d w ufosforan, fru k to z o -I, 6 -dw ufosforan, kw as jednofosfoglicerolow y, kw as 2,3-dw ufosfoglicerolow y, AMP, ADP, A TP, G TP, NAD, NADP, adenozynodw usfosforybozę, urydynodw ufosfoglikozę oraz o rto fo sfo ran nieorganiczny. S um ary czn a za­ w arto ść fosforu w w yizolow anych zw iązkach p o k ry w ała się w dużym przybliżeniu z glo b aln ą ilością fosforu całkow itego, oznaczoną bezpośrednio w e k stra k ta ch w yjściow ych. G łów na fra k c ja zw iązków fosforanow ych k rw in ek psa (około 80°/o) p rzy p ad a n a kw as 2,3-dw ufosfoglicerolow y (9,7—10,1 ¡.iM P na 1 m l krw in ek ), drugim pod w zględem ilościow ym składnikiem je st A TP (0,37—0,97), trzecim — fo sfo ran n ieo rg a­ niczny (0,20—0,33) i estry dw ufosforow e heksoz (0,20—0,33), w śród k tó ry ch pokaźną frak cję stanow i glikozo-J, 6 -d w ufosforan. Poziom kw asu jednofosfoglicerolow ego jest w k rw in k ac h czerw onych psa stosunkow o niski (0,07 nM). E stry jednofosforow e •heksoz w y stę p u ją w znikom ych ilościach (0,02 nM). P oszukiw anie pośrednich p ro ­ duktów przem iany pentozow ej, ja k sedoheptulozo-7-fosforan lub rybozo-5-fosforan, nie dało pozytyw nych rezultatów . W śród oznaczonych w k rw in k ac h psa w olnych nukleo ty d ó w p rzew ażają n u k leotydy adenilow e: ATP, ADP, AMP, adenozynodw ufosforyboza. Z aw artość n u k le­ otydów nikotynam idow ych w ynosi w p rzebadanych przyp ad k ach od 0,08 do 0,12 ¡.iM P na 1 m l krw inek. W p o ró w naniu z danym i B a r 1 1 e 11 a dla skład n ik ó w k rw in ek ludzkich, zw iązki fosforanow e k rw in ek czerw onych psa w y k azu ją tylko niew ielkie różnice jakościow e i ilościowe. G łów na różnica polega na zaw artości ATP, k tó ra w k rw in ­ kach psa jest około 70n/o niższa, niż w ludzkich. W śród heksozodw ufosforanów ester g lik o z o -l, 6 -dw ufosforow y w k rw in k ac h psa w y d aje się nie posiadać ta k w y ­ raźnej ilościow ej przew agi nad estrem fruktozodw ufosforow ym , ja k to stw ierd zo ­ no w k rw in k ac h czerw onych człow ieka. Z aw artość NADP w k rw in k ac h psa jest wyższa (0,07—0,11 ,uM P na 1 m l krw inek) aniżeli w k rw in k ac h człow ieka. W yizolow ane zw iązki fosforanow e obejm u ją grupę m etab o litó w p rzem iany w ęglow odanow ej, głów nie u k ład u glikolizy, oraz grup ę koenzym ów o budow ie nukleotydow ej. Ilościow e stosunki tych połączeń odnoszące się do stan u sta c jo n a r­ nego dojrzałej k rw in k i psa d ają pew ien w gląd w procesy m etaboliczne tej kom órki w jej fizjologicznym środow isku.

http://rcin.org.pl

558

D O N IE S IE N IA

[6]

Wolne nukleotydy w krwinkach czerwonych psa, królika i świnki morskiej The N ucleotides in Erythrocytes of Dog, Rabbit and G uinea Pig H. KAROŃ Z

Z a kła du

Chem ii

F iz jolo gic zn ej

AM

w

Pozn aniu

O kreślono zaw artość poszczególnych nukleotydów w k rw in k a c h zw ierząt, uży­ w anych najczęściej do prac dośw iadczalnych, m ianow icie psa, k ró lik a oraz św inki m orskiej. K rew p o b ran ą z żyły piszczelow ej u psów, a z serca u św in ek m orsk ich i k ró ­ lików , zb ierano bezpośrednio do obłożonego lodem n aczynia zaw ierająceg o h epa­ rynę. N astępnie k rew w irow ano; osocze oraz g órną w arstw ę zaw ierając ą k rw in k i białe usuw ano. K rw in k i czerw one hem olizow ano d w u k ro tn ą objętością w ody i hem olizat zakw aszano kw asem nadchlorow ym . Część w y trąc o n ą ek stra h o w an o po­ now nie kw asem nadchlorow ym . Połączone e k s tra k ty zobojętniano ługiem potaso­ w ym w obec czerw ieni fenolow ej. W szystkie czynności w ykon y w an o w te m p e ra ­ tu rze zbliżonej do 0° w celu uniknięcia rozkładu nukleotydów . Po odw irow aniu w ytrąconego n ad c h lo ran u potasu przeprow adzono rozdzielenie za w arty ch w fazie płynnej w olnych nukleotydów za pom ocą ch ro m ato g rafii kolum now ej na żywicy. Do rozdziału zastosow ano technikę Cohna w m odyfikacji S chm itza i w sp ó łp raco w ­ ników , w k tó re j w ym yw ania poszczególnych fra k c ji z k o lum ny d o k o n u je się za po­ mocą kw asu m rów kow ego, a następnie m rów czanu am onu o w zrastają cy c h stę­ żeniach. Poszczególne fra k cje zbierano przy użyciu autom atycznego k o lek to ra i p rze­ prow adzono w nich pom iar absorpcji (spektrofotom etr PMQ 2) p rzy długościach fali 2600, 2750 i 2800 À. W yniki uzyskane z odczytów przy długości fali 2600 A w y k o rzystyw ano dla otrzym ania krzyw ych absorpcji. N ato m iast sto su n ek odczytów uzyskanych przy 2800 i 2750 A w odniesieniu do odczytów p rzy 2600 A pozw alał na przybliżoną, o rien tacy jn ą identyfikację znalezionych n ukleotydów . D alszej id en ­ ty fik a cji dokonyw ano po usunięciu k w asu m rów kow ego i m rów czan u na p o d sta­ w ie k rzyw ych ab sorpcji w u ltrafiolecie zw iązków w y stęp u jący ch w poszczególnych frak cjach. Z aw artość fosforu w poszczególnych n u k leo ty d ach o k reślan o m etodą Briggsa lu b (w przy p ad k u niew ielkich ilości) m etodą C hen, T o rib ara i W arnera, rybozę zaś oznaczano m etodą B iała w m odyfikacji M ejbaum . U zyskano n astęp u jące w yniki (w artości w yrażone w m ik ro m o lach fosforu na

100 m l k rw in e k czerw onych): AM P

ADP

ATP

psy

4,7

16,7

41,2

króliki

4,4

19,3

49,9

m orskie św in k i

9,4

15,4

40,7

GMP

GDP

GTP

UDPCo

2,8

5,1

21,4

1,6

0,8

2,9

9,1

2,5

2,0

3,9

20,4

4,2

Z w raca uw agę duża zaw artość nukleotydów guanozyny w k rw in k ac h czerw o­ nych psa i m orskiej św inki, znacznie przew yższająca zarów no zaw arto ść tych n u ­ kleotydów w k rw in k ac h królika, ja k i szczura czy człow ieka. P onadto stw ierdzono w k rw in k ac h czerw onych w szystkich b ad an y ch zw ierząt obecność NAD i NADP oraz w ery tro cy tac h psa i św inki m orskiej obecność n u k le ­ otydów cytydyny i inozyny. Praca ta

b yła

częściow o d otow ana

przez K om itet B ioch em iczn y

http://rcin.org.pl

i B iofizyczn y P A N .

[7]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

Wolne nukleotydy krwinek czerwonych szczura po naśw ietleniu promieniami X The N ucleotides of Rat Erythrocytes after X Rays Irradiation P. CHAMBON, H. KAROŃ, P. MANDEL Z In s t y t u t u Bio chem ii W y d zia łu L ek a rsk ieg o w S t ra s b u rg u oraz Z a k ła d u C h em ii F izjo log ic zn ej AM w Pozn aniu

K rw in k i czerw one stanow ią jeden ze składników u stro ju , k tó reg o b ad a n ie m o­ że w y d atn ie rozszerzyć zakres naszych w iadom ości dotyczących w p ły w u p ro m ie­ ni X na żywy organizm , gdyż naw et stosunkow o niew ielkie d aw k i ty c h prom ieni zm n iejszają w ybitnie przechodzenie praw idłow ych skład n ik ó w m orfo ty czn y ch ze szpiku kostnego do k rw i krążącej na okres m niej lub bard ziej długi. P o n a d to o b ser­ w acja k rw in ek czerw onych stw arza możliwość dokonyw ania b a d a ń w różnych o k resach po naśw ietlaniu. Istn ie ją dwie drogi bad an ia w pływ u p rom ieni X na k rw in k i czerw one. Je d n a z nich polega na o kreślaniu zm ian aktyw ności szeregu enzym ów , d ru g a — na a n a ­ lizie sk ład u chem icznego k rw in ek i b ad a n iu czy n o rm aln e sk ła d n ik i elem entów m orfotycznych z n a jd u ją się w stanie p raw idłow ej rów now agi. W naszej pracy postanow iliśm y uzyskać dane dotyczące zaw arto ści w k rw in ­ k ach czerw onych w olnych nukleotydów , tych zw iązków , k tó ry ch c h a ra k te r zw iąza­ ny z aktyw nością procesów m etabolicznych jest w szystkim d oskonale znany. Do dośw iadczeń używ aliśm y białych szczurów rasy W istar, płci m ęskiej, k tó re n aśw ietlan e były jednorazow o daw ką 700 r — su b le ta ln ą dla b a d a n y ch zw ierząt, pow odującą, szczególnie w n arząd ach krw iotw órczych, bardzo w y ra źn e i trw a łe zab u rzen ia. Jednocześnie z g ru p ą zw ierząt n aśw ietlan y ch b ad an e b yły każdorazow o zw ierzęta kontrolne, k tó re przebyw ały w tych sam ych w aru n k ac h i otrzy m y w ały tę sam ą dietę. Szczury zab ijan o przez d ek ap itację w n astęp u jący ch o k resach po n aśw ietlen iu : 12 godzin, 2,5 dnia, 4,5 dnia, 7 dni i 21 dni. M a teria ł potrzebny do p rzeprow adzenia rozdziału chro m ato g raficzn eg o uzy­ skiw aliśm y w sposób przedstaw iony w poprzednim k om u n ik acie (str. 558), ta sam a była rów nież technika chro m ato g rafii kolum now ej. N ajw yraźniejsze zm iany w zaw artości poszczególnych n u k leo ty d ó w u zy sk a­ liśm y 7 i 21 dnia po naśw ietleniu. D otyczą one głów nie ATP, G TP i U D P -k o en zy mów, ch a ra k te ry z u ją c się ich znacznym obniżeniem 7 dnia po p o d d an iu zw ierząt działan iu prom ieni X. N atom iast w artości uzyskane dla ADP w ty m sam ym o k re­ sie zn a jd u ją się raczej pow yżej w artości o trzym anych dla zw ierząt k o n tro ln y ch . S postrzegane przez nas obniżenie zaw artości A TP w y d aje się być w ynikiem zm niejszenia intensyw ności procesów glikolizy i zw olnieniem bio sy n tezy tego n u kleotydu. Na zm niejszenie procesów fo sforylacji w skazy w ałb y ró w n ież w zględny w zrost ADP, obserw ow any przez nas 7 dn ia po n aśw ietlen iu , a w ięc w ty m sa ­ m ym okresie, kiedy zaw artość ATP ulega obniżeniu. P o tw ierd zen ie n aszych p rzy ­ puszczeń znajdujem y zarów no w b ad a n ia ch S c h n e i d e r a i w spółpacow ników , którzy stw ierdzili spadek intensyw ności procesów glikolizy w p ierw szy ch d niach po n aśw ietlen iu p rom ieniam i X, ja k i w p rac ach R a p o p o r t a , k tó ry w k rw in k ac h czerw onych szczurów n aśw ietlan y ch d aw k a m i 500 do 100 r w y k azał w y raźn e zm niejszenie syntezy estrów fosforow ych pom iędzy 2 i 7 dniem n aśw ietlen ia. Nie w y d aje się nam , aby obniżenie zaw artości A TP m ogło być spow odow ane w zrostem aktyw ności A T P-azy, poniew aż, ja k dotąd, stw ierd zan o znaczne zm n iej­ szenie aktyw ności tego enzym u pod w pływ em pro m ien i X.

http://rcin.org.pl

D O N IE S IE N IA

[8]

21 dnia po n aśw ietlan iu stw ierdziliśm y znaczny w zrost ATP, GDP G TP i U D Pkoenzym ów . W zrost ten w ynosi średnio 90°/o dla A TP i GDP, 167°/o dla GTP i 1450/0 dla U D P—koenzym ów . P on ad to stosunek A T P/A M P w zrasta z 7,0 do 16,2, sto su ­ nek A T P/A D P z 2,4 do 4,2 a stosunek G TP/G D P z 1,9 do 2,8, co w sk azu je w y raźn ie n a wzmożenie w k rw in k ac h procesów fosforylacji 21 dnia po n aśw ietlan iu w p o ró w ­ n a n iu z k rw in k am i zw ierząt kontrolnych.

W ykazany przez n a s znaczny w zrost ATP, GDP, G TP i U D P-koenzym ew w yw ołany jest pojaw ieniem się we k rw i k rążącej 30 do 50% retik u lo cy tó w , jak o dow odu procesów odnow y toczących się w n arząd ach k rw iotw órczych. Te procesy odnow y dotyczą zresztą nie ty lk o u k ład u krw iotw órczego, gdyż ja k w y k azały b a ­ d an ia M andela i w spółpracow ników w tym sam ym okresie po n aśw ietlan iu zacho­ dzi znaczny w zrost biosyntezy kw asów nukleinow ych w różnych tk an k ach .

Krwinki czerwone w roli nośników produktów proteidolizy trawiennej białka Erythrocytes as Carriers of the Products of Protein D igestion 0

Z. STOLZM ANN, Z. WALIGÓRA Z Z a k ła d u Chem ii F izjolo gic zn ej

AM w

Pozn an iu

F ak t w y kazania w d o jrzałej k rw ince czerw onej m etabolizm u w ęglow odano­ w ego zarów no n a torze glikozy, jak i cyklu pentozow ego n a su n ą ł m yśl, czy i w jak im stopniu k rw in k a czerw ona bierze udział w p rzem ian ie azotow ej. K oncepcja była o tyle uzasadniona, że już przedtem w ykazano zdolność g ro m adzenîâ niebiałkow ych skład n ik ó w azotow ych w krw ince, szczególnie na szczycie tra w ie n ia ciał białkow ych (7), a Z b a r s k i j (8) zw rócił uw agę na podobną w ła ś­ ciwość kum u lacji przez k rw in k ę azotu am inow ego. M echanizm tego tra n s p o rtu am inokw asów w brew różnicy stężeń je st jeszcze stale sp raw ą o tw a rtą (2, 3, 4). P rz y ­ ro st azotu am inow ego po podaży b iałk a daje się głów nie stw ierd zić w k rw in k ach . P rzedstaw ione dośw iadczenia są pró b ą w y jaśn ien ia tego szczególnego obrazu, ja k i pow staje w sk u tek nierów nego rozm ieszczenia sk ład n ik ó w azotow ych m iędzy k rw in k i a osocze. P ra c a m iała na celu w ykazanie sto p n ia k u m u la cji am inokw asów w ujęciu jakościow ym i ilościow ym przez k rw in k i czerw one ze szczególnym uw zględnieniem okresu szczytu proteidolizy traw ie n n ej u człow ieka. N ależało się przekonać, czy istnieje sw oista w ybiórczość k u m u lacji przez k rw in k ę dla o k reślo ­ nych am inokw asów , czy też k rw in k a zdolna jest grom adzić w szystkie am inokw asy w jednakow ym stopniu, skoro dojrzałe k rw in k i w y k azu ją zdolność ak ty w acji am i­ n okw asów (5) czyli za w ierają potrzebne do tego procesu u k ład y enzym atyczne. Oznaczono 14 am inokw asów , oddzielnie w k rw in k ac h i osoczu, sześciokrotnie; p ierw szy raz n a czczo, a n astępnie w ustalonych te rm in ac h po spożyciu bogatego w białko posiłku, a m ianow icie po 2,5-, 5,0-, 7,5-, 10,0-, 22,5 godzinach. P rzez czas dośw iadczenia, prócz napojów , b adany nie przyjm ow ał pożyw ienia. Dla k o n tro li p rzeprow adzono podobne oznaczenia am inokw asów przy zachow aniu diety bezb iałkow ej. A m inokw asy rozdzielono chrom atograficznie, sto su jąc m etodę je d n o ­ k ie ru n k o w ą w stęp u jącą z trz y k ro tn ą rech ro m a to g rafią w uk ład zie n -b u tan o l — k w as octow y lodow aty — w oda w stosunku 4:1:1. A m inokw asy oznaczano ilościowo jak o k om pleksy barw n e m iedziow e stosując m etodę fotom etryczną (Coleman J u n io r 530 ^iM) ( 1, 6). Rozdzielono n astęp u jące am inokw asy lub ich zespoły: lizynę, h isty -

http://rcin.org.pl

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

561

dynę, glicynę z seryną i asp arag in ą, kw as gutam inow y z treo n in ą, alaninę, m e­ tio n in ę z w aliną, fenyloalaninę, leucynę z izoleucyną. O znaczenia am inokw asów w ykazały jednoznacznie, że zw iązki te zn a jd u ją się zaw sze w w iększym stężeniu w k rw in k ac h w p o ró w n an iu z osoczem. Różnice w y ­ stę p u ją szczególnie w yraźnie na szczycie tra w ie n ia b iałka. W spółczynnik rozm iesz­ czenia stężeń jest w yższy od jedności i w ynosi od 1,1 do 2 ,8 , a p rzy uw zględnieniu p o p ra w k i na zaw artość w ody w obu fazach k rw i od 1,1 do 4,2. Z asada ta dotyczy w szy stk ich 14 oznaczonych am inokw asów . Nie zauw ażono sw oistej selektyw ności w ybiórczej k rw in ek w odniesieniu do określonych am inokw asów , chociaż w sto ­ su n k u do ośmiu, m ianow icie k w asu glutam inow ego z treo n in ą, leucyny z izole­ ucyną, fen y loalaniny, w aliny z m etioniną, w spółczynnik rozdziału jest zawsze w yższy w p o rów naniu z innym i am inokw asam i. N ajw yższą w arto ść w ykazuje kw as glu tam in o w y (od 1,8 do 2, 0, a po uw zględnieniu zaw artości w ody 2,7— 2,8 jako w a r­ tości średnie). W yraźna zm ienność tego stosunku zaw artości am inokw asów w k rw in k ac h i oso­ czu w różnych etap ach b ad a n ia dow odzi stałej w ym ian y tych elem entów azoto­ w ych czyli sta n u dynam icznego k rw in k i czerw onej. Zdolność k u m u la cji am in o ­ kw asó w w krw ince przem aw ia za ak tyw nym tra n sp o rte m am inokw asów , którego jed n y m z pow odów może być proces biosyntezy b ia łk a w k rw in ce czerw onej.

LITERATURA

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

B o d e F., B iochem . Z. 327, 433 (1955). Christensen H. N., J. Biol. Chem . 163, 741 (1946). C h r i s t e n s e n H. N., J. Biol. Chem . 168, 191 (1947). C h r i s t e n s e n H. N., J. Biol. Chem . 194, 41 (1952). H i e r o w s k i M., B ull. Soc. A m is. Sc. 11, 49 (1962). Miedwiediewa M. H., K u g i e n i e w P. W., B iochim ija 23, 429 (1958). S t o l z m a n n Z., Rozpr. W ydz. L e k . P AU 6 , 1 (1939). Z b a r s k i j H. B., B iul. E ksp tl. Biol. Med. 17 64 (1944).

Aktywacja aminokwasów w czerwonych ciałkach krwi ludzkiej w odniesieniu do syntezy hemoglobiny The A ctivation of Amino Acids in Erythrocytes of Humań Blood in R elation to Hemo^lobine Synthesis M. HIËROWSKT Z

Zakła du Chem ii F izjo log ic zn ej

AM w

Pozn an iu

Z b ad an o w czerw onych ciałkach k rw i poziom y ak ty w a cji 14 am inokw asów u żyw ając m etody hydroksam ow ej. K rw in k i czerw one otrzym yw ano przez w irow anie, a n astęp n ie p rep aro w an o proszek acetonow y przez działanie oziębionym do — 30° acetonem . P roszek aceto­ nowy zaw ieszano w izotonicznym roztw orze KC1, dodaw ano nasyconego siarczan u am onu do 0,6 nasycenia i doprow adzano pH ro z tw o ru 0,2 H HC1 do pH 5. O trzy ­ m ane w ten sposób p re p a ra ty enzym atyczne rozpuszczano w buforze T ris i u ży10 P o stęp y B iochem ii

http://rcin.org.pl

562

DONIESIENIA

[10]

w ano w m ieszaninie in k u b acy jn ej sk ład ającej się z: M gCl2, b u fo ru T ris, b ad an e­ go L -am inokw asu, soli dw upotasow tj ATP, NH 2OH, p iro fo sfatazy i p re p a ra tu enzym u pH 5. M ieszanina in k u b acy jn a k o n tro ln a zawierała w szystkie w yżej w y­ m ienione sk ła d n ik i za w yjątk iem L -am inokw asu, w m iejsce k tórego dodaw ano ta k ą sam ą objętość b u fo ru T ris. Po ink u b acji w 37° przez 30 m in. d odaw ano od­ czynnik H oag lan d a a pow stałe kw asy hydroksamowe L-am inokwasów oznaczano sp ek trofotom etrycznie (sp ektrofotom etr U nicam S. P. 500) przy długości fali 520 mu. Ilości kw asó w hydroksam ow ych badanych L-am inokwasów obliczano z krzyw ej w zorcow ej sporządzonej przy użyciu kw asu hydroksam ow ego glicyny wg S a f ir a i W i 11 i a m s a. B iałko w p rep a ra cie enzym u pH 5 oznaczano m eto d ą biuretow ą w g K i n g s l e y a. Stw ierdzono aktywację następujących am inokwasów:

L-leucyny,

L-argininy,

kwasu L-asparaginowego, L-lizyny, L - ty r o z y n y oraz śladową aktyw ację L-alaniny, glicyny. L -lizoleucyny i L-tryptofanu. Ponieważ nie stw ierdzono a k ty w a c ji kw asu L-glutam inowego, L-histydyny i L-proliny, zaś zawartość tych am inokw asów w he­ m oglobinie jest znaczna, nasunęło się pytanie na jakiej drodze te am inokwasy występują w w iązania peptydowe hemoglobiny. Podjęto zatem badania nad m ożli­ wością transacylacji m iędzy am inokwasami nie podlegającym i aktyw acji i amino­ kwasam i aktyw ow anym i. M ieszanina in k u b a cy jn a skład ała się z: M gCl2, soli d w upotasow ej ATP, NH 2OH, m ieszaniny 9 aktyw ow anych poprzednio am inokw asów , am in o k w asu nie ulegającego ak ty w a cji ( L - h is ły d y n a lub L-prolina), p iro fo sfatazy , b u fo ru T ris i p r e ­ p a ra tu enzym u pH 5. M ieszaninę inkubow ano przez 1 godz. w te m p e ra tu rz e 37° a n astęp n ie p rzery w an o rea k cję enzym atyczną przez d o d an ie HCIO 4. Po odpow ied­ nim p rzygotow aniu prób przeprow adzono d w u k ieru n k o w ą ch ro m ato g rafię w stę p u ­ jącą w układ zie rozpuszczalników : I. 2:4:6-kolidyna nasy co n a w odą, II. n -b u ta n °l kw as octow y—w oda (4:1:1). P lam y na bibule w y k ry w an o przez sp ry sk an ie 6°/o FeC l 3 w 0,2 N HC1. R eak cji tran sa cy lac ji nie stw ierdzono. F ak t, że L - h is ty d y n a i L -p ro lin a nie ulegają ani ak ty w acji, an i tran sa cy lac ji, można tłum aczyć innym pH optim um dla enzym ów ak ty w u jący ch te am inokw asy lub ich in a k ty w a c ją podczas p rep aro w an ia. S iadow a a k ty w a cja L-izoleucyny w sk a­ zuje na m ożliw ość syntezy innych białek oprócz hem oglobiny.

Wolne am inokwasy w krwinkach czerwonych kobiety rodzącej i płodu Free A m inoacids in Red Blood Cells of a Parturient Woman and the Foetus J. CHMIEL, H. WIERZBICKA, T. WYRZYKIEWICZ Z Z a k ła d u

C h em ii F izjologic zn ej AM w P ozn aniu o ra z i Chorób K o b i e c y c h w Pozn aniu

1II

Kliniki

P o ło ż n ic tw a

Celem w y jaśn ien ia roli k rw in k i czerw onej w procesie ak u m u lo w an ia i p rz e ­ k azy w an ia am inokw asów m iędzy układem krw ionośnym m a tk i a k rążen iem płodu, przep row adzono oznaczenia n iek tó ry ch w olnych am inokw asów w k rw in k a c h i oso­ czu kobiety rodzącej i płodu. U kobiet rodzących p o b ieran o pró b y k rw i z żyły łokciow ej n a początku trzeciego o k resu porodu, n aty ch m iast po uro d zen iu się płodu. K re w płodu uzyskiw ano z żyły pępow inow ej p rzed w yd alen iem łożyska. W p rzeb ad an y c h siedm iu p rzy p ad k ach k rew pochodziła z porodów fizjologicznych — płody były donoszone i zdrow e.

http://rcin.org.pl

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

563

Osocze, jak i oddzielone drogą w irow ania k rw in k i zadaw ano alkoholem ety lo ­ w ym . W yciągi alkoholow e k rw in ek i osocza zaw ierające m ieszaninę w olnych am i­ n o k w asó w odparow yw ano, suchą pozostałość rozpuszczano w w odnym roztw orze izo p ro p an o lu zakw aszonym kw asem solnym i poddaw ano analizie ch ro m a to g ra­ ficznej. W bad aniach posługiw ano się m etodą bibułow ej ch ro m ato g rafii w stęp u jącej, je d n o k ieru n k o w ej w układzie: b u tan o l — kw as octow y — w oda w stosunku 4:1:1 (wg R e e d a ) . Na bibułę W hatm an 1 nanoszono pun k to w o 100 m-1 roztw oru, k tó re odpow iadały 0,2 ml k rw in ek lu b osocza. C hrom ato g ram y ro zw ijan o trz y ­ k ro tn ie w te m ep ratu rz e 21—23°, doprow adzając każdorazow o czoło rozp u szczaln i­ k a do w ysokości 25 cm. B arw ne plam y am inokw asów z n in h y d ry n ą kom pleksow ano acetonow ym roztw orem azotanu m iedzi przygotow anym w g B o d e ’ a, a n a ­ stę p n ie eluow ano alkoholem m etylow ym . G ęstość optyczną kom p lek su n in h y d ry no-m iedziow ego oznaczano na spektrofotom etrze C olem ana przy długości fali 510 mu. P rzed staw io n ą m etodą udało się rozdzielić i określić ilościowo n astęp u jące am in o k w asy : lizynę, histydynę, glicynę z sery n ą oraz asparaginę, k w as g lu ta m i­ now y z treo niną, alaninę, tyrozynę, m etioninę z w aliną, fen y lo alan in ę oraz leucynę z izoleucyną. W in te rp re ta c ji ilościow ej posługiw ano się krzy w y m i w yznaczonym i oddzielnie dla każdego am inokw asu. B łąd m etody oznaczania poszczególnych am i­ n okw asów nie przekraczał 10"/o. Oznaczano wolne am inokwasy w krwinkach i osoczu u płodu, kobiety w czasie porodu i na czwarty dzień po porodzie. Stw ierdzono, że poziom w olnych am inokw asów w jed n o stce objętości k rw in ek je st ró w n y lub w yższy aniżeli w jednostce objętości osocza zarów no we k rw i płodu, ja k i k obiety w czasie porodu i na czw arty dzień po porodzie. Poziom poszczególnych am inokw asow w osoczu płodu jest w yższy aniżeli w osoczu m atki. S tosunek "zaw artości w olnych am inokw asów w osoczu płodu do zaw arto ści w osoczu kobiety rodzącej (OP/OM) w ah a się w przepro w ad zo n y ch p ró b ach od 1,0 do 2,5 i jest różny w odniesieniu do tych sam ych am inokw asów w poszczególnych przypadkach porodów. N ajw yższe jego w arto ści w ykazano dla lizyny, histydyny, alaniny i kw asu glutam inow ego z treo n in ą. W yższy poziom azotu a-am inow ego w olnych am inokw asów w osoczu płodu w p o ró w n aniu z osoczem m a tk i został już stw ierdzo n y przez C r u m p e r a i L i n d a n a, a ostatnio rów nież przez W i r t s c h a i t e r a . S ta n te n n ależa­ łoby tłum aczyć czynną fu n k cją łożyska, w spółdziałającego z procesem biosyntezy b iałk a w organizm ie płodu. W b ad an iach naszych w ykazano zarów no u kobiety rodzącej, ja k i płodu wyższy poziom poszczególnych am inokw asów w k rw in k ach czerw onych niż w osoczu. Szczególnie w ysoki stosunek rozdziału w olnych am in o ­ kw asów (KM/OM) w krw i kobiety rodzącej w y n ik a praw d o p o d o b n ie z obniżonej zaw arto ści am inokw asów w osoczu kobiety, k tó re p rzek azu je te zw iązki poprzez łożysko do układu krw ionośnego płodu. B ad an ia nasze nie w skazują na szczególną w ybiórczość w zagęszczaniu am in o ­ kw asów przez k rw in k i czerw one. U zyskano w praw dzie wyższe w arto śc i ak u m u lo w ania histydyny, lizyny i kw asu glutam inow ego z treo n in ą niż pozostałych am in o ­ kw asów , zbyt m ała liczba przypadków nie upow ażnia je d n ak do uogó ln ian ia tego spostrzeżenia. Na podstaw ie przeprow adzonych b ad a ń należy stw ierdzić, że zarów no k rw in k i płodu, ja k i m atk i grom adzą am inokw asy w k ie ru n k u przeciw nym do sp ad k u stę ­ żeń i w sp ó łdziałają w ten sposób z m echanizm em ich przek azy w an ia m iędzy u s tro ­ jem m a tk i i płodu. 10*

http://rcin.org.pl

DONIESIENIA

[12]

Wpływ temperatury środowiska na trwałość osmotyczną krwinki czerwonej The Influence of Temperature on the Osmotic Resistance of Erythrocytes J. (Z Z a M a du

C H M IE L ,

H. K A R O Ñ

C h em ii F izjologic zn ej

AM w

Poznan iu

P rzeprow adziliśm y obserw acje n ad w pływ em te m p e ra tu ry śro d o w isk a na trw a ­ łość osm otyczną erytrocytów . S kłoniły nas do tego m. in. dość d aw n o poczynione przez H a r r i s a , a później przez S t r a u b a spostrzeżenia, że w y m ian a jonów potasow ych i sodow ych pom iędzy k rw in k am i czerw onym i a osoczem uzależniona je s t w dużej m ierze od te m p e ra tu ry . N ależało przeto spodziew ać się zm ian osm oty czn ej oporności ery tro cy tó w w zależności od te m p e ra tu ry środow iska, w k tó ry m k rw in k i się znajdują. W pierw szej serii dośw iadczeń w ykazaliśm y, ja k i jest w pływ te m p e ra tu ry na k rw in k i czerw one człow ieka in vitro. W tym celu k rew bezpośrednio po p o b ran iu z żyły dodaw ano do roztw orów NaCl o m alejących stężeniach od 0,500%> do 0,325%> o te m p eratu rz e 10°, 18°, 27°, 37° i 45°. Po upływ ie 3 godzin poszczególne roztw ory w iro w a n o i oznaczano ilościow o stopień hem olizy na sp ek tro fo to m etrze Colem ana. B ad an ia tak ie przeprow adzono na k rw i 30 zdrow ych m ężczyzn i kobiet. D ośw iadczenia te w ykazały, że oporność osm otyczną k rw in ek jest tym w iększa, im w yższa była te m p e ra tu ra roztw orów NaCl. N astępne dośw iadczenie przeprow adziliśm y tą sam ą m etodą z k rw ią p rzech o ­ w y w an ą przez 3 lu b 24 godziny w określonej, stałej te m p eratu rz e. D ośw iadczenia te w ykazały, że k rw in k i tak ie, dodaw ane do roztw orów N aCl o te m p e ra tu rz e w yż­ szej niż te m p e ra tu ra przechow yw ania, w ykazyw ały w iększą trw ało ść niż k rw in k i do d aw ane do roztw orów o te m p eratu rz e niższej. S zu kając potw ierdzenia naszych o bserw acji in vivo p ostanow iliśm y p rze p ro w a­ dzić dalsze dośw iadczenia n a psach. W stępne b ad a n ia na k rw in k a c h czerw onych p sa in vitro dały w 10 w ykonanych próbach w yniki zgodne z w y n ik am i dla k rw i­ n ek ludzkich. B adania in vivo w ykonano na psach poddanych d ziałan iu w ysokiej lub niskiej te m p e ra tu ry przez zanurzenie ich na przeciąg 30 m in u t w k ąp ieli o ciepłocie 43° lu b 23°. U w szystkich 11 przeb ad an y ch psów stw ierd zo n o zw iększenie oporności osm otycznej k rw in ek bezpośrednio po kąp ieli gorącej, n ato m ia st po k ąp ieli zim ­ nej u 10 z 11 p rzebadanych zw ierząt stw ierdzono zm niejszenie oporności osm o­ tycznej krw in ek czerw onych w stosunku do oporności w yjściow ej. U zyskane w naszych dośw iadczeniach w yniki w sk az u ją na w y raźn y w pływ te m ­ p e ra tu ry na trw ałość osm otyczną k rw in k i czerw onej. Z arów no w y n ik i o trzy m an e w pró b ach w ykonanych z k rw in k am i człow ieka i psa in vitro, ja k i uzyskane w do­ św iadczeniach przeprow adzonych na k rw i psów poddanych d ziałan iu gorącej lub zim ­ nej k ąp ieli w y d ają się w skazyw ać na to, że trw ałość k rw in k i zależna je st od in ten sy w ­ ności i szybkości procesów enzym atycznych zachodzących w krw ince, p rzeb ieg ający ch szybciej w w yższych te m p e ra tu ra c h , w olniej zaś w niższych. P oniew aż zaś k rw in ­ ki czerw one p otrzebną im energię u zyskują głów nie d rogą beztlenow ej glikolizy, n ależy przyjąć, że podw yższenie te m p e ra tu ry środow iska, w k tó ry m się k rw in k i zn a jd u ją , w pływ a k orzystnie na przebieg tego procesu.

http://rcin.org.pl

[13]

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

565

Zjawisko deplazmolizy krwinek czerwonych człowieka The D eplasm olysis of Human Erythrocytes J . C H M IE L ,

& Z a k ła d u C h em ii F izjo log ic zn ej

AM w

Pozn aniu

W to k u w ykonyw ania dośw iadczeń n ad w pływ em środow iska hipertonicznego n a trw ało ść osm otyczną k rw in k i czerw onej człow ieka zaobserw ow ano c h a ra k te ­ ry sty czn e zachow anie się objętości k rw in k i w czasie jej p rzeb y w an ia w środow i­ skach hip erto nicznych o określonym stałym stężeniu. Po nagłym obniżeniu się w a r­ tości h em ato k ry to w ej w m om encie w prow adzenia k rw in k i do ro ztw o ru h ip e rto ­ nicznego o stężeniu do 0,6 M N aCl uw idacznia się stopniow y w zrost w zględnej ob jęto ści k rw in k i w oznaczeniach w ykonyw anych w różnych odstępach czasu do 180 m in u t od chw ili w prow adzenia. W zależności od zm ian objętościow ych k sz ta ł­ tu ją się w artości średniego stężenia hem oglobiny k rw in e k oraz zaw artości wody. K rw in k i w y kazują rów nież ch a rak te ry sty cz n e zm iany k sz tałtó w w obrazie m ik ro ­ skopow ym . Aby spraw dzić w ystępow anie tego zjaw iska na w iększym m a te ria le dośw iad­ czalnym , w ykonano b ad an ia z k rw in k am i pochodzącym i od różnych daw ców z za­ stosow aniem roztw orów hipertonicznych różnych soli (NaCl, KC1) i zw iązków o r ­ ganicznych (glikoza, sacharoza, m altoza, laktoza). Na p o d staw ie uzyskanych danych należy przy jąć, że w p rzy p a d k u zaw ieszenia k rw in e k czerw onych w środow isku hipertonicznym zachodzi w nich zjaw isko po­ k rew n e deplazm olizie opisanej u kom órek roślinnych przez O v e r t o n a . B łona k rw in k i w rażliw a na zm iany ciśnienia osm otycznego w ykazu je ja k w iadom o różną w ybiórczość p rze n ik an ia dla jonów i cząsteczek, je st n ato m iast łatw o p rzen ik liw a dla d ro b in wody. Z aw ieszona w hipertonicznym roztw orze ch lo rk u sodu (do 0,6 M). k rw in k a tra c i początkow o w odę i ulega odkurczeniu. W dalszym ciągu tego procesu, na sk u te k zm ian w stru k tu rz e błony, n astęp u je p rzen ik an ie jonów i d robin w ody do w n ętrz a k rw in k i, co prow adzi do stopniow ego w yró w n y w an ia się ciśnień osm otycznych i p rzy ro stu objętości obkurczonej k rw in k i. Ilościow e ujęcie tych zm ian daje pew ien w gląd w m echanizm hem olizy w śro ­ dow iskach hipertonicznych.

Wpływ procesów metabolicznych krwinek na aktywność GOT oraz GTP osocza w zależności od środowiska konserwującego, czasu i tem peratury przechowywania The Influence of Storage Conditions of Blood on Plasm a-G OT and -GTP A ctivity M. L IM A N SK I Z W o j e w ó d z k i e j sta\cji K r w i o d a w s t w a w

K a to w ic a c h

Wpływ dodawania largaktilu i chininy do krwi konserwowanej na przemianę fosforanową krwinek, badaną przy użyciu 32P The Influence of Addition of Largactil and Quinine to Preserved Blood on Phosphate M etabolism in the Erythrocytes F.

D O R O B IN ,

S. P R Z E S T A L S K I,

K.

SKO RA

Z i K l i n i k i C h ir u r giczn ej AM, K a t e d r y F i z y k i W S R i S t a c j i K r w i o d a w s t t c a

http://rcin.org.pl

w e W rocławiu

566

DONIESIENIA

[14]

Przyczynek do patogenezy krwinek tarczowatych w marskości wątroby u małych dzieci Pathogenesis of Target Cells in the Liver Cirrhosis H. H O F M A N , E . L IT W IN , G . K A R S K A Z ¡Instytutu M atk i i Dzieck a w

W a r sz a w ie

U tro jg a dzieci w pierw szym i drugim roku życia stw ierd zo n o n a podstaw ie b ad ań klinicznych i bioptycznych m arskość w ątro b y z żółtaczką. S chorzenie trw ało k ilk a do k ilk u n a stu m iesięcy. W m iarę nasilan ia się zm ian m a rsk ich w w ątro b ie w ystępow ała niedokrw istość m a k ro c y ta rn a z obecnością k rw in e k tarczo w aty ch i opornością osm otyczną ery tro cy tó w w 0,12—0,68°/o-owych ro ztw o rac h NaCl. B a­ dania elek tro fo rety czn e hem oglobiny nie w ykazały zm ian. W surow icy k rw i stw ie r­ dzano w zględną lipem ię (w kran icach do 800 mg°/o), p raw id ło w y lu b nieznacznie w zm ożony poziom cholesterolu całkow itego, nato m iast jak o stałe zjaw isk o w y stę­ pow ał b ra k fra k c ji a-lip o p ro te in — w bad an iu elek tro fo rety czn y m o trzy m y w an o jed y n ie fra k c ję (3~. Na podstaw ie naszych obserw acji oraz danych z p iśm ien n ictw a w przebiegu m arskości w ątro b y z żółtaczką stw ierdza się — bez w zględu na poziom b iliru b in y — w zględny w zro st poziom u tłuszczów obojętnych w surow icy i zm niejszenie się po­ ziom u kw asów tłuszczow ych. S tan ten jest w ynikiem zarów no upośledzonej h y d ro ­ lizy i w ch łan ian ia tłuszczów z przew odu pokarm ow ego n a sk u te k b ra k u żółci lub jej niedoboru w dw unastnicy, ja k i niew ydolności m a rsk iej k o m ó rk i w ątro b o w ej w p ośredniej p rzem ianie tłuszczów . Z aburzenia te p o w o d u ją u ru ch a m ian ie tłu sz­ czów tkan k o w y ch i w ystępow anie w zględnej lipem ii. S padek poziom u kw asów tłuszczow ych w surow icy odbija się na układzie lip o p ro tein surow icy, w w y n ik u czego znika fra k c ja a-. Z aburzen ia te pociągają za sobą zm iany w oporności k rw in ek czerw onych. U dzieci z m a rsk ą w ątro b ą oraz przesunięciam i ob razu lip id ó w stw ie r­ dzaliśm y w y stępow anie rów noczesne k rw in ek czerw onych o obniżonej oporności w sto sunku do roztw orów hipotonicznych chlorku sodu obok k rw in e k o w zm ożonej oporności. Jednocześnie obserw ow aliśm y w e k rw i obw odow ej liczne m ak ro cy ty , w śród nich k rw in k i tarczo w ate, któ re ja k w iadom o m a ją oporność osm otyczną w y ­ raźn ie w zm ożoną. Rozpiętość oporności m iałaby w ytłum aczenie we w sp ó łistn ien iu czynników obniżających oporność (podwyższony poziom chylom ikronów ) oraz czyn­ ników podw yższających oporność (obecność k rw in e k tarczow atych). P odw yższo­ ny poziom chylom ikronów jest bezpośrednim w ynikiem sch o rzen ia podstaw ow ego (żółtaczka i m arskość), pojaw ienie się k rw in ek tarczo w aty ch nie je st zupełnie jasne. Można by przypuszczać, że zaburzenia przem ian y tłuszczów , a w k o n se k ­ w en cji i lip o p ro tein w m arskości w ątro b y o d b ija ją się nie ty lk o na składzie su ro w i­ cy krw i, ale rów nież i na k rw in k ac h czerw onych. Specyficzny k sz tałt k rw in k i ta r czow atej byłby zatem zależny od niedoboru pew nych elem entów lipidow ych w błonie kom órkow ej. A rgum entem p rzem aw iającym za słusznością naszego ro zu m o w an ia je st fa k t w y stępow ania k rw in ek tarczow atych w ste ato rrh ea , w k tó ry ch to sta n ac h zachodzą podobne jak w m arskości w ątro b y p rzesu n ięcia w lip id ach krw i. O b ser­ w acje nasze przem aw iałyby zatem na korzyść te o rii obw odow ego, lipem icznego pochodzenia k rw in ek tarczo w aty ch i m akrocytów . W ysokiej liczbie m ak ro cy tó w odpow iadał w obrazie szpiku całkow ity b rak m akro b lastó w , a n aw et znaczny o d ­ setek m ałych erytroblastów . Jeśli by p rzyjąć szpikow e pochodzenie k rw in ek t a r ­ czow atych i m akrocytów , zasadniczym w aru n k iem m u siałab y być obecność m a k ro ­ b lastó w w szpiku.

http://rcin.org.pl

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

567

Warunki oznaczania wapnia, potasu i sodu metodą fotometrii płomienio­ wej, wykluczające w pływ różnorodności materiału biologicznego The M odification of Flame Photom etry Method for Determ ination of Ca, K and Na in Biological M aterial J.

G REG ER, H. P A N U SZ , J.

SK A R Ż Y Ń SK I

Z Z akła du C h em ii F izjolo gic zn ej AM i Z a k ład u

C h em ii Ogólnej AM w

Lodzi

P ow szechnie używ any w analizie sk ła d u m ineralnego m a te ria łu biologicznego — w szczególności k rw i — fotom etr płom ieniow y, m im o licznych m o dyfikacji i u le p ­ szeń, stosuje jako zasadę m etody spalenie bad an ej próby i w zw iązku z ty m stw a ­ rza w a ru n k i w zajem nego oddziaływ ania na siebie różnych jonów oraz su b stan cji organiczn y ch obecnych w b adanym m ateriale. Z o stała podjęta p raca n ad uniezależnieniem w y n ik u pom iarów od zm ienności sk ła d u próby. P rzeprow adzono b ad an ia n ad w pływ em su b stan cji organicznych (al­ kohole. niższe aldehydy, kw asy jednokarboksylow e, h y dro k sj'k w asy , am inokw asy — glicy n a i cysteina) na em isję C a+ + , K + i N a+. P rz eb a d an o zależność em isji om aw ia­ nych katio n ów od dużych stężeń stale spotykanych w m ateria le biologicznym am i­ n ó w HPO 4 — i SO 4 ---- (w pływ anionu C 0 3— został przez nas zbadany uprzednio). O pracow ano skład środow iska (m ieszaniny m i i m ieszaniny m 2), k tó re pozw ala na w yklu czen ie w pływ u zm ienności składu oznaczanej próby oraz na dokonyw anie po­ m ia ró w prób zm ineralizow anych przy użyciu stężonego H 2S 0 4, ja k i bez m in e ra li­ zacji. j S k ład m j : 30 m l 0,5 M kw asu w ersenow ego + 250 m l 1 M (NH 4)2 H PO 4 u zupełnia się w odą do 500 ml. 10 m l pow stałego roztw oru w raz z b a d a n ą p ró b ą rozcieńcza się n astęp n ie w odą w 50-ml kolbie m iarow ej. K ońcow e stężen ia jonów w ynoszą: 6 mM kwasiu w ersenow ego, 100 mM H PO 4---- .

S k ład m 2: 30 m l 0,5 M k w asu w ersenow ego + 250 m l 1 M (NH 4)2 H PO 4 + + 500 ml 1:1 stężonego H 2S 0 4 (9 M) u zupełnia się w odą do 1 1. 20 m l pow stałego ro ztw ro u w raz z b ad a n ą próbą rozcieńcza się w odą w 50-ml kolbie m iarow ej. K oń­ cowe stężenia jonów w ynoszą: 6 mM k w asu w ersenow ego, 100 mM H PO 4---- , 1800 mM S 0 4 ----.

Mechanizm drobinowo-kinetyczny katalazy erytrocytów The K inetics of Erythrocyte Catalase S . K O T K O W S K I, A . L A S S O C IŃ S K A Z K a t e d r y Chem ii Ogólnej P o m o r s k ie j A k a d e m i i M e d y c z n e j w

Szczecinie

Z badano aktyw ność k atala ty c zn ą czerw onych ciałek k rw i, sto su jąc stężenie H 20 2 0,05% i 0,1%, stężenie k rw i 0,0533 m l/litr i 0,1066 m l/litr, tem p. 28° i 38°. U b y tek stężenia H 20 2 m ierzono m anganom etrycznie w środow isku 2 n H 2S 04 i roz­ tw o ru 1% N a 2F 2 jako p ara liza to ra. Stw ierdzono, że aktyw ność k atala ty c zn a k rw in e k m aleje ze w zrostem stężenia H 20 2, a także w podw yższonej te m p eratu rz e. Izoterm y badanego procesu m a ją

http://rcin.org.pl

568 k ształt krzyw ych popędow ych. K rzyw ym tym w w ielu p rzy p ad k ach dla sto so w a­ nych zm ian p ara m etró w procesu odpow iada rów nanie: dx dt dx

g d z ie : ---- -- s z y b k o s ć

dt

r o z k ła d u

H 20 2;

k cn

1 —x

\i a

x

k = w s p ó łc z y n n ik

sz y b k o śc i

r e a k c ji ;

a = s t ę ż e n ie

po-

c z ą tk o w e H 20 2 w m ilim o la c h /lit r ; c = s tę ż e n ie k r w in e k (w m ililit r a c h k r w i w lit r z e r o z tw o r u H 20 2); x = s to p ie ń p r z e m ia n y H 20 2; n = s t a ł a c h a r a k t e r y z u ją c a d a n y p r o c e s .

W podw yższonej te m p e ra tu rz e (38°) dla niskich stężeń H 20 2 i w iększych ilości k rw in ek szybkość ro zk ład u H 20 2 opisuje dość dobrze ró w n an ie: dx

k cn

dt

a

l —x

x

Dla dużych ilości k rw i i m ałych ilości bardzo rozcieńczonych roztw orów H 20 2 szybkość rozkładu H 20 2 m ożna w yrazić rów naniem : dt

= k • a 11-1 • c m (1 — x ) n

3.

W yliczone z tego ró w n a n ia stałe k, n n ajlepiej c h a ra k te ry z u ją d an ą krew . Z pow yższych danych zapro jek to w an o n astęp u jący schem at d ziałan ia k a ta la ty c z nego k rw inek: I.

F e >+ + H 20 2 - > / F e 3+ 3+\\ + OH

(¿ ) h

O H + H 20 2 - > H aO + H O i

Ii F e >+\ ,+ \ + H O i - > (F e 3+) + H jO + Oa

(¿ h ) II . (F e 31-) + H 2o , ( F e s+) (H 20 2)

(F e 3+) (HsO,) (F e 3+ H O ,-) + H +

(F e 3+ H O ,') + H 2O s - > H O . + O H + O H + (F e»+) H O , + O H - > H jO + O, H + + O H - = = ± H 20

Peroksydatywne utlenianie rozcieńczonych roztworów indygokarminu za pomocą krwinek krwi ludzkiej Oxidation of Indigacarm in by Peroxidase of Humań Erythrocytes S . K O T K O W S K I , Z. M A C H O Y Z K a t e d r y Chem ii Ogólnej P A M w S zczecin ie

P o m iary peroksydatyw nego u tle n ia n ia rozcieńczonych roztw orów in d y g o k a rm i­ n u k rw in k am i k rw i ludzkiej przeprow adzono k o lorym etry czn ie, o k reśla ją c zm iany in ­ tensyw ności zabarw ienia w tem p. 28° i 38°. Stosow ano k rew cy try n ian o w ą g ru p y A 0 zbliżonej m orfologii (Hb 84'%>, e ry tr. 4 400 000, leuk. 5700) w stężeniach: 0,0015 m l 1 0,003 ml w objętości 200 m l roztw oru reagującego. Stężenie in d y g o k arm in u w y n o ­ siło: 3,12 • 10—5, 4,68 • 10—5 i 6,24 • 10—5 m o la/litr, stężen ie H 20 2 0,075°/o i 0,15%.

http://rcin.org.pl

[17]

II KRAJOWE SYMPOZJUM BIOCHEMICZNE

569

S to p ień utlen ien ia indy g o k arm in u w czasie w p rzy p a d k u znacznych ilości H 20 2 lu b zaham ow ania działan ia k atala zy p rze d staw ia ją krzyw e, k tó re z pew nym p rzy bliżeniem m ożna w yrazić rów naniem dx fc • c11 — = —— y i- x dt

g d z ie ~^X- =

j/a

s z y b k o ść r e a k c ji, c = stę ż e n ie k r w i, a = stężę lie p o c z ą tk o w e in d y g o k a r m in u , 1 — x =

dt stę ż e n ie b ie ż ą c e in d y g o k a r m in u , fc = w s p ó łc z y n n ik s z y b k o śc i r e a k c ji

W zrost te m p e ra tu ry zw iększa szybkość peroksydatyw n eg o u tle n ia n ia przy ty ch sam ych pozostałych p ara m etra ch . W ynika to z w ielkości w spółczynników te m p eo k ®8 ra tu ro w y c h obliczonych w przedziale te m p e ra tu r 28° i 38 ze w zoru: w — . fC 28

P rz y jm u ją one w ielkości od 1,5 do 4,5 zależnie od zm iany stężeń reagentów . Z w iększenie stężenia in d y g o k arm in u obniża, a w zro st stężen ia H 20 2 zw iększa szybkość procesu. W zw iązku z tym dla tego su b stra tu ró w n an ie m ożna p rz e d sta ­ wić n astęp u jąco : dt ~ =

f*n L fc [H 2Oa] — [In] 2

P rzep ro w adzone b ad a n ia w skazują, że peroksydaza k rw i nie je st h am o w an a przez żaden z prod u k tó w rea k cji (H 20 , 0 2, izatyna). Z w iększenie stężenia H 20 2 n ie h am u je, lecz przyspiesza aktyw ność d ziałania peroksydazy. W zrost ilości k rw in ek b iały ch w e k rw i w granicach fizjologicznych w ah ań w m ałych sto p n iu w pływ a n a przy sp ieszenie szybkości procesu. W pływ k rw in ek czerw onych idzie w k ie ru n k u zw iększonego rozkładu H 20 2, w konsekw encji czego proces p ero k sy d aty w n eg o u tle ­ n ian ia in d y g o k arm in u zostaje przerw an y . W te m p e ra tu rz e 38° k a ta la z a działa w olniej, p eroksydaza szybciej. D ziałanie peroksydazy m ożna ograniczyć do ak ty w o w an ia tle n u z H 20 2 w t a ­ kim stopniu, w ja k im jest to potrzebne dla całości p rzem ian w u stro ja ch żyw ych. P ogląd ten nie n aru sza w niczym niezw ykłej specyficzności i selektyw ności tego enzym u. B a d an ia pow yższe w pew nym stopniu mogą posłużyć do sch arak te ry z o w an ia 2 ]/a krw i. D la x = 1 czas całkow itej p rzem iany t — —^— . S tąd ch arak te ry sty cz n y m i

w ielkościam i dla k rw in ek są: w spółczynnik szybkości rea k cji k, czas całk o w itej 2 ]/ a p rzem ian y t = —- — oraz w y k ład n ik potęgowy n.

Badania nad metabolizmem glutationu i zawartością kwasu neuraminowego erytrocytów w przypadku nocnej napadowej hemoglobinurii G lutathione and Neuram inic Acid of Erythrocytes in Paroxysm al Nocturnal Haemoglobinuria A. K O J, T. SZ C Z E P K O W SK I iZ Za k ła d u C h em ii Fizjologiczn ej A M w K r a k o w i e

P rzedm iotem naszych dośw iadczeń był jeden z czynników w ew n ątrzk o m ó rk o ­ wych, niezbędnych dla trw ało śc i k rw in k i, a m ianow icie zred u k o w an y glutation. oraz czynnik otoczkow y b iorący udział w niek tó ry ch rea k c ja c h ag lu ty n acy jn y ch —

http://rcin.org.pl

570

D O N IE S IE N IA

k w as n euram in o w y . M ateriał dośw iadczalny stanow iły ery tro cy ty w yosobnione z k rw i d w ojga chorych z zespołem hem olitycznym nocnej napad o w ej hem oglobinurii (NNH), leczonych w II K linice Chorób Wewn. AM w K rakow ie. Z aw arto ść zredukow anego g lu ta tio n u w ery tro cy tach oznaczano m eto d ą z n itro p ru sy d k iem , zaw artość form y utlenionej g lu tatio n u m etodą re d u k c ji elek tro lity cz­ nej, b io syntezę g lu ta tio n u in vitro m etodą izotopow ą przy użyciu 2 -i 4C-glicyny oraz trw ało ść G SH testem B eutlera. Z aw artość g lu ta tio n u w e ry tro cy tac h NNH je st śred n io o 10°/o w yższa niż w k rw in k ach kontro ln y ch , a odnow a g lu tatio n u p rzeb ieg a nieco w olniej. Jed n ak że zaw artość form y u tlen io n ej g lu ta tio n u jest w g ran ic ac h norm y, a trw ałość GSH podczas in k u b a cji k rw in ek z fe n y lo h y d ra­ zyną je st id en ty czn a w ery tro cy tac h NNH i w k rw in k ac h k o n tro ln y ch . Nie stw ie r­ dza się w ięc w k rw in k ac h NNH odchyleń analogicznych do zaobserw ow anych przez B eu tlera z a b u rzeń we w rodzonych anem iach hem olitycznych z niedoborem de­ h y d ro g enazy 6 -fosfoglikozow ej. D ane te św iadczą o tym , że m ech an izm hem olizy w nocnej napad o w ej h em oglobinurii raczej nie je st bezpośrednio zw iązany z m e­ tab o lizm em glu tatio n u . K w as n eu ra m in o w y oznaczano m etodą S aifera z dw u fen y lo am in ą. O znaczenia w y k azały, że zaw artość tego zw iązku w 1 ml gąszczu k rw in ek n o rm aln y ch w ynosi około 242 i(j,g, a w p rzy p a d k u NNH 226 n,g czyli o około 7% m n iej. Pozostałość k rw in k ow a po p ró b ie hem olitycznej H am a lub K irch m ay era zaw ierała nieco w ięcej k w a­ su N -acetylo n eu ram in o w eg o w przeliczeniu na stężenie hem oglobiny niż ery tro cy ty k o n tro ln e, in k u b o w an e w surow icy nie zakw aszonej. M ożna by stąd w nioskow ać, że ro zp adow i u leg ają przede w szystkim k rw in k i o zm niejszonej zaw arto ści kw asu N -acety loneuram inow eg o, jednakże różnice te są niew ielk ie i m ogą być zw iązane z błędem dośw iadczenia. N ależy przy tym dodać, że in k u b a cja k rw in ek z tro m b in ą w zm odyfikow anej próbie C rosby’ego wg K irch m ay era nie w y w o łu je żadnych zm ian z a w arto śc i k w asu N -acetyloneuram inow ego w k rw in k ac h , a zatem d ziała­ nie tro m b in y nie w y kazuje analogii do traw ie n ia k rw in ek enzym am i p ro teo lity cz­ nym i. P rzy in k u b a c ji ery tro cy tó w z roztw orem p apainy w iększość k w asu n eu ram in o w ego zo staje odszczepiona już w ciągu pierw szych 10 m in., je d n a k pew na jego część je st nied o stęp n a dla p ap ain y i n aw et długa in k u b a cja nie zm ienia jego za­ w artości. W y d aje się, że w ery tro cy tach NNH odsetek k w asu n euram inow ego nie odszczepianego przez p ap ain ę je st nieco wyższy niż w k rw in k ac h kontrolnych. P o n iew aż je d n a k m echanizm k w aśn ej hem olizy ery tro cy tó w NNH oraz ery tro cy ­ tó w n o rm aln y ch po tra w ie n iu p ap a in ą jest nieco odm ienny n asu w a się w niosek, że k w as n eu ra m in o w y nie odgryw a decydującej roli w rozpadzie ery tro cy tó w NNH, a dostrzeżone w naszych dośw iadczeniach różnice w zaw artości k w asu n eu ram in o ­ w ego zw iązan e są ze złożonym uszkodzeniem białek i w ielocukrow ców otoczki e ry ­ tro cy tó w NNH. Hinz i Pillemer w ykazali, że k rw in k i zdrow ych ludzi ink u b o w an e ze słab y m i ro ztw o ram i ta n in y hem olizują łatw o w ró w n o im ien n ej surow icy zaw iera­ jącej p ro p e rd y n ę — zachow ują się zatem podobnie do ery tro cy tó w nocnej n a p a ­ dow ej h em oglobinurii. P o w tarza jąc dośw iadczenia tych au to ró w m ogliśm y stw ie r­ dzić, że ery tro c y ty norm alne p oddane działaniu ta n in y i h em olizujące w zak w a­ szonej surow icy w y k azu ją zm niejszoną aktyw ność esterazy acetylocholinow ej. W y­ d aje się w ięc, że defektu ery tro cy tó w nocnej napad o w ej hem oglobinurii należy się d o szukiw ać w zew nętrznych w arstw ac h białkow ej otoczki zaw ierającej esterazę acety lo cholinow ą: odszczepienie pew nych łańcuchów polipeptydow ych przez p a p a ­ in ę lub ich biologiczna in a k ty w ac ja pod w pływ em ta n in y um ożliw iają re a k c ję p ew nych b ia łek osocza z układ em receptorów k rw in k i i zapoczątkow ują jej h emolizę.

http://rcin.org.pl

[19]

571

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

Glutation krwinek czerwonych a ich trwałość osmotyczna u chorych z nadczynnością tarczycy leczonych operacyjnie G lutathione Content and Osmotic R esistance of Erythrocytes in Surgically Treated Hyperthyreoidoic Patients H. K AROŃ, M. WOJTOWICZ, Z. TYSPE'R Z Z a k ła d u Ch em ii Fizjologic zn ej AM o ra z z II K l i n i k i Ch irurg iczn ej AM w

Pozn an iu

P rzep row adzono b ad a n ia m ające na celu stw ierdzenie, czy istn ieje zależność po­ m iędzy niską zaw artością g lu ta tio n u a trw ałością osm otyczną k rw in e k czerw o n y ch u chorych z nadczynnością tarczycy oraz czy leczenie, stosow ane ja k o p rzy g o to ­ w an ie przedoperacyjne, oraz zabieg operacy jn y w p ły w ają zarów no n a zaw arto ść g lu ta tio n u , ja k i na trw ałość erytrocytów . P rzeb ad aliśm y 15 chorych płci żeńskiej, z nadczynnością tarczy cy śred n ieg o i ciężkiego stopnia. W szystkie chore zakw alifikow ano do leczenia o p eracy jn eg o po odpow iednim in dyw idualnym p rzygotow aniu do zabiegu m e ty lo tio u ra cy le n i jo ­ dem . P o n ad to otrzym yw ały one środki u sp o k a jające oraz dietę w yso k o k alo ry czn ą. Z aw arto ść zredukow anego g lu ta tio n u oznaczano m etodą P a tte rs o n a i L azaro w a, oporność osm otyczną — m etodą H orsta. Z aw arto ść zredukow anego g lu ta tio n u (norm a = 37,6 mg°/o) w y n o siła średnio: 1) bezpośrednio po przyjęciu do k lin ik i 33,3 mg°/o (24,5—38,8); 2) po przygotow aniu farm akologicznym do zabiegu operacy jn eg o 27,9 mg%> (19,7—38,0); 3) w e w czesnym okresie po zabiegu operacy jn y m (5—7 dzień) 22,1 mg0/# (10,1— 29,3), 4) w 3—4 tygodnie po zabiegu 37,2 mg°/o (35,3—39,1). P oczątkow a niższa od praw idłow ej zaw artości g lu ta tio n u u cho ry ch b ad an y ch b ezpośrednio po przyjęciu do k lin ik i ulega podczas leczenia p rzy g o to w u jąceg o do zabiegu operacyjnego dalszem u znacznem u obniżeniu. M ożna to tłu m ac zy ć u tle ­ n ien iem części g lu ta tio n u obecnego w k rw in k ac h czerw onych, spow o d o w an y m p o ­ d aw an iem jodu. Podobne zjaw isko stw ierdzono ju ż w b a d a n ia ch in vitro , w k tó ­ ry ch k rw in k i czerw one konia, poddane działan iu tle n u lu b jo d u w y k azy w ały stopniow e obniżenie zaw artości g lu ta tio n u zredukow an eg o oraz zw iązan y z tym w zro st hem olizy. We wczesnym okresie po zabiegu op eracy jn y m za w arto ść g lu ­ ta tio n u w k rw in k ac h czerw onych pozostaje n ad a l b ard zo niska. Szczególnie n isk ą zaw arto ść glutationu, rzędu 10—20 mg°/o, znaleźliśm y u ty ch ch o ry ch , u k tó ry ch w przebiegu pooperacyjnym stw ierdzono w ysokie tętn o , ciepłotę podw yższoną do 39° o raz pobudzenie psychoruchow e, k tó re to o bjaw y p rzem aw iały za le k k im p rz e ­ łom em tarczycow ym . W 3—4 tygodnie po operacji zaw artość g lu ta tio n u w ra c a do norm y. W spółzależność pom iędzy zaw artością g lu ta tio n u w k rw in k a c h czerw onych a sto p n iem hem olizy (w zrost hem olizy przy zm niejszeniu ilości g lu ta tio n u ) o bjaw ia się jed y n ie w przypadkach, w k tó ry ch zaw artość tego tró jp e p ty d u sp a d ła poniżej 20 mg°/o. P rzyczyny w ystępow ania niskiego poziom u g lu ta tio n u k rw in e k czerw onych w nadczynności tarczycy są praw dopodobnie dość sko m p lik o w an e. M ogą tu d zia­ łać zarów no czynniki ham u jące syntezę tego tró jp e p ty d u (stw ierdzone za b u rzen ia w e w łączaniu cysteiny do g lu ta tio n u u zw ierząt z nadczynnością tarczy cy ), jak i czynniki pow odujące zakłócenia Ogólnej przem iany, zw łaszcza w za k resie oksyd aty w n ej fosforylacji, blokow anej pod w pływ em nad m iern eg o d ziała n ia h o rm o n u tarczycy. P ew n ą rolę może tu też odgryw ać poziom w itam in y B 12, o b n iżający się

http://rcin.org.pl

572

w nadczynności tarczycy zarów no w w ątrobie, ja k i w k rw i, jednocześnie z u w a l­ nianiem i zużyw aniem rezerw g lu ta tio n u w tych tk a n k ac h , gdyż w p ły w te j w i­ tam iny na odnow ę oksydatyw nej fosforylacji w ydaje się być istotny. S postrzeganą przez nas w spółzależność pom iędzy niskim poziom em g lu ta tio n u a zm niejszeniem trw ało ści osm otycznej k rw in ek czerw onych tłu m aczy m y z a b u ­ rzeniam i procesu glikolizy, spow odow anym i niedoborem zred u k o w an ej p o staci tego tró jp ep tydu.

Powinowactwo różnych cukrów do system u nośnikowego erytrocytów ludzkich The A ffin ity of Some Sugars to the Carrier System in Humań Erythrocytes L. LACKO Z I n s t y t u t u H em a to lo g ii i T ra n sfu zji K r w i , Praga., C z e c h o sło w a c ja

P rzeprow adzono b ad a n ie nad tra n sp o rte m cukró w przez błonę ery tro cy tó w ludzkich, w ydzielonych opracow aną uprzednio m etodą filtra c ji (1). S tw ierdzono, że p obieranie galaktozy przez w olne od glikozy ery tro cy ty w te m p e ra tu rz e 0 ° jesl w y bitnie zaham ow ane. W tej te m p e ra tu rz e w ejście jednego c u k ru do e r y tro ­ cytów jest zw iązane z w yjściem innego cu k ru (w zględnie innej cząsteczki cu k ru ), a zatem odbyw a się na zasadzie w ym iany p rzeciw p rąd o w ej. W te m p e ra tu rz e 0° w chodzenie glikozy do pozbaw ionych jej erytrocytó w jes rów nież b ard zo n ie ­ znaczne, szybko n ato m iast zachodzi w ym iana glikozy ery tro cy tó w z glikozą śro ­ dow iska. P obieranie ze środow iska galaktozy przez ery tro cy ty w tej te m p e ra tu rz e zw iększa się w raz ze w zrostem śródkom órkow ego stężen ia glikozy. W ykreślono krzyw e zależności m iędzy stężeniem cu k ru w środow isku a jego stężeniem w e ry ­ tro cy tach po u stalen iu się sta n u rów now agi w p rz y p a d k u w y m ian y p rz e c iw p rą ­ dow ej i przechodzenia bez w ym iany. W ym ianę p rzeciw p rąd o w ą w te m p e ra tu rz e 0° w yznacza krzy w a nasycenia, k tó rej część je st zgodna z izo term ą ad so rp c ji F re undlicha. Dla przechodzenia bez w ym iany do w olnych od cu k ró w ery tro cy tó w (w te m p e ra tu rz e 25°) otrzym ano linię prostą, co w skazuje, że w ty m p rzy p a d k u w stan ie rów now agi stężenie cu k ru je st tak ie sam e w ery tro cy tac h ja k i w śro d o ­ w isku. P rzy w ym ianie przeciw prądow ej stężenie cu k ru w ery tro cy tac h m oże być n aw et 14 razy w iększe niż w środow isku, a zatem proces ten zachodzi przeciw ko grad ien tow i stężenia. W ym ianę przeciw prądow ą w ykorzystano do b ad ań n ad p o w inow actw em n ie­ k tó ry ch cukrów prostych do system u nośnikow ego (2). B adano w ychodzenie g lik o ­ zy z ery trocytów w te m p eratu rz e 0 ° do środow iska zaw ierająceg o określony cu k ier prosty. S tw ierdzono, że zależnie od ro d zaju c u k ru przechodzenie glikozy może być tak ie ja k do 0,9-procentow ego roztw oru NaCl lub też w iększe. I ta k np. w y p ły w glikozy z erytrocytów do roztw o ru D -arabinozy zachodzi podobnie ja k do ro ztw o ru NaCl i D-arabinoza nie pojaw ia się w erytrocytach, n ato m ia st je st znacznie szyb­ szy, gdyż w środow isku zn a jd u je się L-arabinoza, k tó ra rów nocześnie p o jaw ia się w erytrocytach. Przypuszczam y, że w drugim p rzy p ad k u zachodzi w y m ian a p rzeciw prądow a i że glikoza z erytrocytów i L-arabinoza ze śro d o w isk a zam ien iają się m iejscam i na nośniku. M ożna przyjąć, że oba cukry w y k o rz y stu ją te n sam system nośnikow y. O trzym aliśm y dw a typy k rzyw ych dla w yp ły w u glikozy z ery trocytów , jeden typ, ch a rak te ry sty cz n y dla L -arabinozy i serii hom om orficznych cuk ró w o konfiguracji L-arabo-, D-ksylo- i D-likso-, drugi c h a ra k te ry sty c z n y dla ketoz i al-

http://rcin.org.pl

573

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

[21]

doz należących do homomorficznych serii cukrów o konfiguracji D-arabo-D-ryboi L-likso-. Wyniki te potwierdzają istnienie w erytrocycie system u nośnikowego w spólnego dla aldoz należących do homomorficznych serii cukrów o konfiguracji L-arabo-, D-ksylo- i D-likso-. D w ucukry, w edług ogólnie przy jęty ch poglądów , nie w chodzą do erytrocytów . In te re su ją c e było przeto stw ierdzenie, że n ie k tó re d w u cu k ry h am u ją w ym ianę p rzeciw p rąd ow ą aldoz w ery tro cy tach (3). Z badano w ypływ glikozy z ery tro cy tó w w te m p e ra tu rz e 0 ° do środow iska zaw ierającego galaktozę — sam ą lub ze w z ra sta ­ jącą ilością (14—83 mMole) m altozy. S tw ierdzono, że w raz ze w zrostem stężenia m alto zy w środow isku obniża się szybkość w ypływ u glikozy z erytrocytów . A za­ tem m altoza h am uje w ym ianę p rzeciw prądow ą glikozy i galaktozy w te m p e ra tu ­ rze 0°. T ak sam o działały św ieżo p rzygotow ane roztw ory, zaw ierające tylko |3-maltozę, ja k i roztw ory stare, zaw ierające m ieszaninę a- i (3-maltozy. W podobny sposób d ziałają: celobioza, izom altoza, treh a lo za i m etyloglikozyd, n ato m iast bez w p ły w u są laktoza i sacharoza. M ożna zatem w nioskow ać, że pew ne d w u cu k ry w y k az u ją pow inow actw o do system u nośnikow ego dla aldoz i dlatego nie m ogą one w chodzić do erytrocytów . W ydaje się, że blokow anie system u nośnikow ego przez d w u cu k ry zachodzi po zew nętrznej stro n ie błony erytro cy tu . Z w szystkich badanych dw ucukrów działanie ham u jące na w ym ianę p rze­ ciw p rąd o w ą m ają cu k ry red u k u jące, co w sk azu je n a udział g ru p red u k u jący ch w łączeniu się z system em nośnikow ym .

LITERATURA 1. L a c k o L., B u r g e r M., H e j m o v a L., R e j n k o v a J., w: M em brane T ra n sp o rt and M etabolism , Publ. H ouse C zechoslovak Acad. Sci., P ra g a 1960, str. 399—408. 2. L a c k o L., B u r g e r M., N ature 191 881 (1961). 3. L a c k o L., B u r g e r M., B iochem . J. 83, 622 (1962).

Synteza hemu z protoporfiryny i żelaza ferrytyny

in v itr o

Heme Synthesis from Protoporphyrin and Ferrltine-F e in vitro T. MALINOWSKA, A. MAZANOWSKA, E. KOWALSKI Z Z a k ła d u

O ch rony Z d r o w i a I n s t y t u t u

Badań J ą d r o w y c h

PAN w

W ar sz a w ie

P oniew aż poza m ikroskopow ym i p rac am i B e s s i s a (1, 2, 3) nie istn ieje do­ tychczas żaden dow ód biochem iczny, że fe rry ty n a może być w y k o rzy stan a jak o bezpośrednie źródło żelaza do syntezy hem u, zajęto się ty m zagadnieniem . Do dośw iadczeń użyto ferry ty n ę p re p a ro w a n ą w edług F i n e b e r g a i G r e ­ e n b e r g a (4 ) z w ątro b y królika, k tó rem u przez k ilk a dni przed zabiciem p o d a­ w ano dożylnie FeSC >4 oraz ferry ty n ę p re p a ro w a n ą tą sam ą m etodą ze śledziony k o ­ nia. Ja k o źródło enzym u stosow ano w w iększości dośw iadczeń w yciąg z m itochondriów w ątro b y szczura poddanych działan iu Tw eenu-20, p o n ad to w yciąg z sarkozomów serca szczura, hem olizaty k rw in ek k rw i obw odow ej k ró lik ó w anem izow anych, k u r zdrow ych oraz k u r anem izow anych. Z aw artość p ro to p o rfiry n y określano przez p o m ia r ek sty n k cji p rzy 402 mu. Z m niejszenie stężenia p ro to p o rfiry n y w próbie p rzyjm o w an o jako m iarę sto p n ia syntezy hem u z p ro to p o rfiry n y i żelaza ferry ty n y . W yniki uzy sk an e po in k u b acji porów nyw ano z w artościam i tzw. „ślepych p ró b ” w celu w y elim in o w an ia b łędu

http://rcin.org.pl

574

[22]

D O N IE S IE N IA

w ynikającego z adsorpcji p ro to p o rfiry n y na b ia łk u oraz jej zm ian w czasie tr w a ­ n ia inkubacji. Jak o środki re d u k u ją c e stosow ano glu tatio n , kw as ask o rb in o w y i cysteinę, przy czym ta ostatn ia okazała się najodpow iedniejsza, co je st zgodne z w y n ik am i M a z u r a i w spółpr. (51). W yniki uzyskane przy użyciu fe rry ty n y oraz p ro to p o rfiry n y jak o su b stra tó w w układzie zaw ierającym nieoczyszczony p re p a ra t enzym atyczny o czynności chelatazow ej z m itochondriów w ątro b y szczura w ykazały, że synteza hem u m a m iejsce i że ferry ty n a może służyć jako źró d ła żelaza. S tosow ane w u k ładzie hem olizaty k rw in ek k rw i obw odow ej anem izow anych królików daw ały rów nież pozytyw ne w yniki, k tó ry ch nie udało się u zyskać p rzy użyciu w yciągów z sarkozom ów serca szczura oraz hem olizatów k rw in e k k u r zdrow ych i anem izow anych fenylohydrazyną. W yniki nasze zdają się potw ierdzać dane B e s s i s a i p o zw alają postulow ać istnienie obok m echanizm u osoczowego in n e j drogi dla tra n sp o rtu żelaza do e ry tro blastów szpiku.

LITERATURA

1. 2. 3. 4. 5.

B e s s i s M., B r e t o n-G o r i u s J., Rev. Hematol. 12, 43 (1957). B e s s i s M., B r e t o n-G o r i u s J., Compt. Rend. Acad. Sci. 245, 1271 (1957). P o l i c a r d A., B e s s i s M., Compt. Rend. Acad. Sci. 246, 3194 (1958). F i n e b e r g R. A., G r e e n b e r g D. M., J. Biol. Chem. 214, 91 (1955). M a z u r A., B a e z S., S h o r r E., J. Biol. Chem. 213, 147 (1955).

W pływ promieniowania jonizującego na włączanie kwasu 5-aminolewulinowego i porfobilinogenu do hemu i n v i t r o The Influence of Ionising Radiation on Incorporation of 6-A m inolevulinic Acid and Porphobilinogen into Heme in vitro A. M. DANCEWICZ Z Z a k ła d u O ch ro n y Z d r o w i a In s t y t u t u

Badań J ą d r o w y c h

PAN

v; W a r sz a w ie

P rzeprow adzono pom iary stopnia w łączenia k w asu

(ii)

C H j

H H H+ I 0 © © u tlen ow an ie |q 0 H em —C—CH,: H—S—Globiną H e m - C —C H ....S —G lobiną ]__________________________ I od tlen ow an ie |____________________ !



Z bliżenie się do ce n tru m hem u silnie elek tro u je m n ej cząsteczki tle n u pow odo­ w ałoby przesunięcie rów now agi w iązania w odorow ego. N astępstw em tego fa k tu * O becny adres:

Zakład O chrony Zdrow ia In stytu tu Badań Jąd row ych w W arszawie.

http://rcin.org.pl

[27]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

579

b y ło b y uw olnienie p ro to n u (efekt Bohra) albo z łań cu ch a bocznego hem u (wzór I i II), albo z g ru p y su fh y d ry lo w ej (wzór III). S iła elektrono&sąca cząsteczki tle n u pow o d o w ałaby n astęp n ie przesunięcie elek tro n ó w w zdłuż rezonansow ego szkieletu p ro firy n o w eg o w k ie ru n k u atom u żelaza, u zu p e łn ia ją c jego zag rażający niedobór elek tro n o w y . Jednocześnie energia rezonansu u k ła d u złożonego z hem u i łań cu ch a polipeptydow ego, sprzęgniętych w iązaniem m iędzy łańcuch em bocznym h em u a g ru ­ pą —SH, u tru d n ia ła b y zredukow anie tlen u , pozostającego w w iązan iu k o w alen cy j­ n y m (wzór IV). G lobina—F e~:0+: :0:

G lob ina—Fe: :0:ó:

(IV)

D la fu n k cji hem oglobiny istotne w ydaje się zatem istn ien ie stru k tu ry p ierście­ nio w ej, w k tó re j globina połączona je st z żelazem hem u silnym w iązaniem idącym od h isty d y n y oraz la b iln y m w iązaniem od łań cu ch a bocznego do g ru p y su lfh y d ry low ej. Z bliżenie tle n u do atom u żelaza pow odow ałoby p rzek ształcen ie jonow ego w iąz an ia m iędzy żelazem a histy d y n ą w w iązanie kow alen cy jn e, a jednocześnie w zm acniałoby, dzięki przesu n ięciu elektronow em u, lab iln e w iązan ie zam y k ające pierścień. O dszczepienie tle n u p rzyw racałoby sta n poprzedni, ale szty w n a s tru k tu ra globiny u trzy m y w a łab y grupę sulfh y d ry lo w ą w położeniu p rze strzen n y m k o rzy st­ n y m dla zachow ania rezonansow o ustabilizow anego pierścienia.

LITERATURA

1. B e h l k e J., S c h e l e r W., N aturw iss. 48, 717 (1961). 2. P e r u t z M. F., R o s s m a n n M. G., C u l l i s A. F., M u i r h e a d H., W i l l G., N o r t h A. C. T., N ature 185, 416 (1960). 3. R o s s i-F a n e 11 i A., A n t o n i n i E., A rch. B iochem . B iophys. 80, 308 (1959).

Rozdział elektroforetyczny łańcuchów polipeptydowych aA i (JA hemoglobiny ludzkiej Electrophoretic Separation of aA andf3B Chains of Human Haemoglobin Z. SZYMANOW SKA, K. MURAWSKI Z Z a k ład u B ioch em ii I n s t y t u t u H em a to lo g ii w W arszaioie

Do ro zd ziału łańcuchów polipeptydow ych hem oglobiny zastosow ano m etodę elek tro fo rezy n a żelu skrobiow ym w 0,01 N buforze glicynow ym (172 = 0,03) o pH 2,2. E lek tro forezę prow adzono w aparacie pionow ym (2) o w y m ia ra ch 290 X 125 X X 8 m m przez 18 godzin p rzy prądzie 20 mA. B adane w ty ch w a ru n k a c h p re p a ra ty hem oglobiny i globiny, uzyskane z k rw i dorosłych, zdrow ych lu d zi oraz p re p a ra ty hem oglobiny z k rw i now orodków zachow yw ały się identycznie, dzieląc się n a dw ie głów ne fra k cje , w ystęp u jące w zbliżonych sto su n k ach ilościow ych. Szybsza z n ic h odpow iada łańcuchom (3A, zaś w olniejsza a ^ . Tym głów nym fra k c jo m tow arzyszył zaw sze trzeci niew ielki sk ła d n ik o n ajw ięk szej ruchliw ości katodow ej. M etoda elektroforezy n a żelu skrobiow ym by ła już u p rzed n io stosow ana do b a ­ dan ia łań cu chów polipeptydow ych hem oglobiny przez M u l l e r a (1). A u to r te n , stosując b u fo r m rów czanow y, nie u zyskał je d n ak całkow itego ro zd ziału obu ła ń c u ­ chów i stw ierd zał zaw sze (naw et w p rzy p a d k u b a d a n ia p re p a ra tó w izolow anych u*

http://rcin.org.pl

580

D O N IE S IE N IA

[28]

łańcuchów ) obecność dodatkow ej fra k cji, o pośredniej ruch liw o ści elek tro fo re ty cz nej. E fekt ten m ógł zależeć od łatw o zachodzącej ag reg acji cząsteczek b ia łk a w żelu skrobiow ym (4). Z astosow anie w niniejszej pracy b u fo ru glicynow ego pozw oliło na w yelim inow anie tego zjaw iska. Pochodzenie niew ielkiego, najszybszego sk ładnik a, tow arzyszącego dw óm głów ­ n ym rodzajom łańcuchów polipeptydow ych, nie zostało dotychczas w y jaśn io n e. Nie je st on łańcuchem vF hem oglobiny płodow ej, poniew aż zaw arto ść te j fra k c ji we k rw i now orodka (55fl/o H b F) i k rw i osobnika dorosłego (1,5% H b F) b y ła zbliżona; w zastosow anych w a ru n k a c h elektroforezy łańcu ch y w ę d ru ją najw id o czn iej w spólnie z łańcucham i pA. F ra k c ja ta nie może być ró w nież łań cu ch em 8A2 ze w zględu n a b ra k hem oglobiny A 2 w bad an y m p rep a ra cie hem oglobiny now orodka. T en n iezidentyfikow any sk ła d n ik białkow y m ógłby w ięc pochodzić b ąd ź z hem oglo­ b iny (o niezbadanej dotychczas budow ie), bądź też z innej, n ied o stateczn ie p o ­ znanej fizjologicznej odm iany hem oglobiny (por. np. 3 ).

LITERATURA

1. 2. 3. 4.

M u l l e r C. J., N ature 186, 643 (1960). S m i t h i e s O., B iochem . J. 71, 585 (1959). S z c z e p k o w s k i T. W., K o n i e c z n y L., Clin. Chim . A cta 5, 383 (1960). S z y m a n o w s k a Z., P o s z w i ń s k i P., M u r a w s k i K., Z a k r z e w ­ s k i K., A cta B iochim . Polon. 9, 183 (1962).

Rola grup zasadowych w budowie hemoglobiny ludzkiej Role of Basic Groups in the Structure of Human H aem oglobin Z. VODRAZKA,

j

.

c e jk a , j

.

sa lAk

,

c.

SO BESLAVSK *

Z In s t y t u t u H em ato log ii i T ra n sf u zji K r w i , Praga, C z e c h o sło w a c ja

Pomiar współczynnika dyfuzji jonów fosforanowych w krwinkach czerwonych The D eterm ination of Phosphate Ions D iffusion C oefficient in Erythrocytes ST. PRZESTALSK I Z K a t e d r y F i z y k i W S R w e W r o c ła w iu

Zależność współczynnika dyfuzji od temperatury The Influence of Temperature on D iffusion C oefficient ST. PR ZESTALSK I, E. BIELIŃSK I, M. K IL IA N , J. BORS Z K a t e d r y F i z y k i W S R u>e W r o c ła w iu

http://rcin.org.pl

[29]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

581

W pływ promieniowania jonizującego na przenikanie jonów fosforano­ wych do krwinek czerwonych The Influence of Ionising Radiation on Phosphate Ions Pénétration into Erythrocytes T. DOROBISZ, ST. PRZE'STALSKI, E. BIELIŃSK I, K. CENA Z e S ta cji K r w i o d a w s t w a w e W r o c ła w iu i z K a t e d r y F iz y k i WSR w e W r o cła w iu

B a d a n o przen ik an ie jonów fosforanow ych 32p do k rw in e k czerw onych k o n ser­ w o w an ej k rw i ludzkiej, poddanych n ap ro m ien ien iu 6°Co w d aw k ach od 10 do 200 ty sięc y rentgenów . P o m iar przeprow adzano po upływ ie 24 godzin od n ap ro m ien ien ia i w y n ik i porów nyw ano z w ynikam i uzyskanym i d la k rw i k o n tro ln ej, p rzech o w y w a­ n ej w ty c h sam ych w aru n k ach . W y n ik dośw iadczeń pozw olił stw ierdzić b ra k różnic w p rze n ik an iu 32P do k rw i­ n ek zaró w n o m iędzy próbam i n aprom ienionym i różnym i daw k am i f>0Co, ja k i p ró ­ b am i n ap ro m ienionym i a k rw ią k o n tro ln ą. N ie stw ierdzono rów nież istotnych różnic w p rze n ik an iu 32P do k rw in ek k rw i k o n se rw o w an e j k o n tro ln ej i n aprom ienionej 200 tysięcy r w ciągu 3 tygodni p rze­ ch o w y w an ia. W k rw i naprom ienionej po 3 tygodniach p rzech o w y w an ia stw ierdzono b a rd z o znaczne zm niejszenie oporności osm otycznej k rw in ek , w idoczną m akro sk o p o ­ w o hem olizę i zm niejszenie się o 15% ilości czerw onych ciałek w po ró w n an iu z k r w ią k o n tro ln ą. B adanie ap a rate m K lisieckiego w ykazało w k rw in k ac h n a p ro ­ m ien io n y ch 2,7 vol/% tlenu, (w k o n tro ln y ch 11 vol/% ). W p re p a ra ta c h b arw ionych m e to d ą P ap p en h eim a stw ierdzono w k rw i n aprom ienion ej k rw in k i o form ie sferocy to w ej, nie u k ła d ały się one typow o w ruloniki, były rozrzucone. W k rw i k o n tro ln ej k rw in k i w ykazyw ały cechy m orw ow ate, nie różniły się od n o rm aln y ch k rw in ek k o n serw o w an y ch .

W pływ triamcinolonu i dexametazonu na wym ianę potasu w krwinkach czerwonych krwi ludzkiej i n v i t r o The Influence of Triam cinolon and D exam ethasone on 42K Exchange Rate in Erythrocytes A. HIMMEL, H. BO BIŃSK I, A. PŁONK A Z III K l i n i k i Chor ób W e w n ę t r z n y c h W o j s k o w e j A k a d e m i i M e d y c z n e j w Ł c d zi

B a d a ją c w pływ korty k o stery d ó w o różnych p o d staw n ik ach przy C-16 C h a r v a t i K ü c h e 1 (1) zauw ażyli, że w napadow ym porażeniu rodzinnym , p rzebiegającym z u tr a tą p o tasu w m ięśniu, triam cin o lo n w y w iera bardziej d o d atn i w pływ na b i­ lan s potasow y niż pozostałe sterydy. A utorzy tłu m aczą to p rzesu w an iem jonu p o ta ­ sow ego pod w pływ em triam cin o lo n u do kom órek, w tym rów nież do k rw in ek czer­ w onych, dzięki czem u u tr a ta p otasu z m oczem je st m niejsza niż w p rzy p ad k u sto ­ so w an ia d exam etazo n u lub innych sterydów . B a d an ia C h a rv a ta i K üchela oparte b y ły je d n a k n a badan iach bilansow ych. W ychodząc z założenia, że p rzesu n ięcia po­ taso w e m iędzy p łynem pozakom órkow ym a k o m ó rk ą są zw iązane ze zm ianą a k ty w ­ ności w y m ian y potasu w kom órce, p rze b ad aliśm y w pływ triam cin o lo n u oraz jego an alo g o n u — dexam etazonu na aktyw ność w ym iany p o tasu izotopow ego 42K w k rw in k a c h k rw i ludzkiej in vitro. F o to m etry czn e pom iary stężenia po tasu całkow itego w osoczu przed i po in k u b o w an iu w aparacie W arb u rg a p o k ry w ały się w g ran icach b łęd u oznaczenia foto-

http://rcin.org.pl

D O N IE S IE N IA

582

[30]

m etrycznego. W ynika z tego, iż ludzkie k rw in k i czerw one w w a ru n k a c h dośw iad­ czenia zachow ują swój u k ła d jonow y, to znaczy są niew rażliw e n a d ziałan ie tria m cinolonu i dexam etazonu, jeżeli chodzi o tra n sp o rt jonów . U zyskane przez nas w y ­ niki nie potw ierdziły zatem przypuszczenia C h a rv a ta i K uchela od n o śn ie ro li tria m cinolonu w tran sp o rcie potasu do krw inek.

LITERATURA

1. C h a r v a t

J., K ü c h e l

O., Cas. L ek. Ces. 98, 48 (1959).

Wpływ alloksanu na szybkość wym iany potasu w ludzkich krwinkach czerwonych w e krwi i n v i t r o The Influence of A lloxan on Potassium Exchange Rate in Human Erythrocytes in vitro A. HIMMEL, H. BOBIŃSKI, A. PŁONKA Z U l K l in ik i Chorób W e w n ę t r z n y c h W o j s k o w e j A k a d e m i i M e d y c z n e j to Ł o d z i

C zynnościow e zaburzenia w w ym ianie jonów pom iędzy środow iskiem zew n ętrz­ n y m a k rw in k ą czerw oną zw iązane są ściśle ze zm ianam i w łasności fizykochem icz­ nych protoplazm y i jej aktyw nością biochem iczną. Z m ieniają się w łasności fosfory lu jące, u a k ty w n ia ją się proteazy, zm ienia się pow inow actw o s tr u k tu r p rotoplazm y w odniesieniu do potasu i sodu. Zgodnie ze szkołą N a s o n o w a (4) zm ienia się stru k tu ra koloidow a protoplazm y, co prow adzi do zm iany w łasności w iązan ia ch e­ m icznego oraz absorpcji jonów m ineralnych i su b stan cji organicznych. W badan iach poprzednich (1, 2, 3) stw ierdziliśm y, że hem oliza, po w o d u jąca n ie ­ w ątp liw ie uszkodzenie błony kom órkow ej k rw in e k czerw onych, p ro w ad zi w zasadzie nie do zw iększenia w ychodzenia potasu z k rw in ek do środow iska pozakom órkow ego, lecz — w pierw szym etapie — głów nie do zaham ow an ia w chodzenia p o tasu ze śro ­ dow iska pozakom órkow ego do krw inek. Na tej podstaw ie p rzyjm ujem y, że reg u la cja katio n ó w pom iędzy k rw in k ą czer­ w oną a środow iskem zew nętrznym u w aru n k o w an a jest w łasnościam i chem iso rp cyjnym i protoplazm y a en erg ia m etaboliczna konieczna je st do u trz y m a n ia tych w łasności protoplazm y na określonym poziomie. P rzem aw ia za tym rów nież fakt, że k rw in k a czerw ona w procesie hem olizy nie zm ienia sw ych w łasności fizjologicznych i fizykochem icznych stopniow o, lecz sko­ kam i. W ten sposób m ożem y pow iedzieć, iż proces selektyw nej ak u m u lac ji jonów w k rw ince czerw onej je st „a k ty w n y ”, ale energia do starczan a nie je st bezpośrednio w y k o rzystyw ana do tra n sp o rtu su b stan cji poprzez błony kom órkow e, lecz do k sz ta ł­ to w an ia s tru k tu ry i w łasności sorpcyjnych protoplazm y.

LITERATURA 1. 2. 3. 4.

H i m m e l A., B o b i ń s k i H., P ł o n k a A., B iul. W A M , w d ru k u . H i m m e l A., B o b i ń s k i H., P ł o n k a A., B iul. W A M IV, 2, 169 (1961). P ł o n k a A., Biul. W A M , V, 1, 37 (1962). T r o s h i n S. A., Proc. Sym p. M em brane T ra n sp o rt and M etabolism , red. A. K leinzeller, A. K otyk, P ra h a 1961.

http://rcin.org.pl

(31]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

W pływ środowiska hiperglikemicznego na szybkość wym iany potasu w ludzkich krwinkach czerwonych we krwi i n v i t r o T he Influence of Hyperglycaem ic Medium on Potassium Exchange Rate in Human Erythrocytes in vitro A. HIMMEL, H. BO BIŃSKI, A. PŁONKA Z III K l i n i k i Chorób W e w n ę t r z n y c h W o j s k o w e j A k a d e m i i M e d y c z n e j w Ł od zi

U przednio stw ierdzono (2), że k rw in k a czerw ona zużyw a w jednostce czasu stałą ilość glikozy, że nie da się n ad a l utrzy m ać pojęcia „aktyw nego tr a n s p o r tu ” glikozy do w n ętrz a k rw in k i oraz, że w pew nych w a ru n k a c h pom iędzy procesem glikolizy a szybkością w ym iany w y stę p u ją zależności w p ro st odw rotne. Spow odow ało to k o ­ nieczność ocenienia w pływ u różnych stężeń glikozy na u trzy m an ie p o tasu w ew n ątrz k rw in e k i szybkość w ym iany po tasu w ew nątrzkom órkow ego. W ty m celu w ykonaliśm y pom iary szybkości w ym iany p o tasu pom iędzy ludzkim i k rw in k a m i czerw onym i a osoczem krw i, w czasie pięciogodzinnego in k u b o w an ia w te m p e ra tu rz e 37° świeżo po b ran ej k rw i hep ary n o w ej z d o d atk iem 42KC1 w trzech g ru p ach : bez dodania glikozy oraz z dodaniem 200 i 400 m g glikozy do 100 m l k rw i (3, 4). S tw ierd ziliśm y, że szybkość w ym iany po tasu pom iędzy k rw in k a m i czerw onym i a osoczem, w czasie pięciogodzinnego in k u b o w an ia k rw i bez d odania glikozy, była sta ła ; w ynosiła dla siedm iu serii pom iarów 1,61 ± 0 ,1 3 m E q*K /litr ery tro c y tó w g o d z . (5). Szybkość w ym iany potasu w e k rw i, do k tó rej dodaliśm y 200 i 400 m g’/o glikozy w ynosiła odpow iednio: 1,59 + 0,18 i 1,52 + 0,14 m E q*K /litr e ry tro c y tó w g o d z . A n aliza w a ria n c y jn a uzyskanych w yników w ykazała, że istn ieją różnice zn am ien ­ ne staty sty czn ie w szybkościach w ym iany w k rw in k a c h k rw i pochodzącej od ró ż­ nych zdrow ych osobników (stosunek w a ria n c ji w g m a te ria łu do w a ria n c ji resztow ej F ^ = 4,42 je st w iększy od w arto ści kry ty czn ej F Q05 = 3,00 i p raw ie ró w n y w arto ści k ry ty czn ej F 0 01 = 4,82), nato m iast dodanie glikozy nie m a żadnego w pływ u n a szyb­ kość w ym iany p otasu (stosunek w a ria n c ji wg g ru p F ' = 1,34 je st m niejszy od k r y ­ tycznej w arto śc i F 0 05 = 3,88). P o ró w n u jąc w ynik uzyskany z fak tem , że stężenie glikozy nie w pływ a na ilość glikozy zużyw anej przez k rw in k ę czerw oną w jednostce czasu, oraz z fak tem s ta ­ łości stężeń p o tasu po obu stro n ach błony kom órkow ej, n a tu ra ln y m w nioskiem jest tw ierd zen ie o pośredniej zależności szybkości w ym iany p o tasu od procesu glikozy. Zależność ta w yn ik a z konieczności u trzy m an ia pew nych procesów m etabolicznych w k rw in ce na określonym poziomie. K o n sek w encją tego je st podkreślan ie przez nas znaczenia ud ziału s tr u k tu r z n a j­ dujący ch się w ew n ątrz k rw in k i w m echanizm ie prow adzącym do nierów nom iernego ro zkładu jonów po obu stro n ac h błony kom órkow ej k rw in k i czerw onej. S tru k tu ry te, k tó ry ch czynność biologiczna je st n iew ątpliw ie u w aru n k o w an a ak tyw nością m e­ taboliczną k rw in k i, w y k azu ją w łasności chem isorpcyjne (1). Te chem isorpcyjne w łasności p ozw alają w yjaśnić selek ty w n ą ak u m u lację jonów w ew n ątrz k rw in k i czerw onej oraz k inetykę w ym iany jonów w pośredniej zależności od m etabolizm u w ęglow odanow ego krw inki. LITERATURA

1. 2. 3. 4. 5.

H a r r i s E., R i c e S. A., J. P hys. C hem . 61, 1360 (1957). H i m m e l A., B o b i ń s k i H., B iul. W A M IV , 2, 159 (1961). H i m m e l A., B o b i ń s k i H., P ł o n k a A., B iul. W A M IV, 2, 169 (1961). H i m m e l A., B o b i ń s k i H., P ł o n k a A., A rch. M ed. W ew.; w d ru k u . P ł o n k a A., B iul. W A M IV, 1, 37 (1962)

http://rcin.org.pl

584

D O N IE S IE N IA

[3 2 ]

Przenikanie 32P do krwinek czerwonych w zależności od ilości osocza krwi konserwowanej i od składu stabilizatora The Influence of Plasm a Concentration on 32 p Pénétration into Erythrocytes oî Preserved Blood T. DOROBISZ, J. OLEARCZYK, ST. PRZESTALSKI, K. SKÓRA Z I K l i n i k i Chirurg. AM u>e W r o cła w iu , S t a c j i K r w i o d a w s t w a w e W r o c ł a w i u i K a t e d r y F iz y k i W S R w e W ro cła w iu

B adano p rzen ik an ie 32P do k rw in ek czerw onych k w i k o n serw o w an ej o ró żn e j ilości osocza. P rzygotow ano cztery rzędy prób k rw i ko n serw o w an ej. P ierw szy rzą d tw orzyły próby k rw i konserw ow anej pełnej, z pró b drugiego rzęd u odciąg n ięto osocze w ilości odpow iadającej 2/10 objętości k rw i pełnej, z trzeciego rzęd u o d ciąg ­ nięto osocze w ilości 3/10, z czw artego w ilości 4/10 objętości k rw i p ełn ej. B a d a n ia prow adzono w ciągu 30 dni w ykonując po 7 pom iarów w odstępach k ilk u d n io w y ch . Nie stw ierdzono istotnych różnic ani w p rze n ik an iu 32P do k rw in e k poszczególnych rzędów w zależności od ilości osocza, ani też nie uw idoczniły się zn am ien n e różnice z upływ em czasu przechow yw ania prób k rw i w poszczególnych rzędach. Do dalszych b ad ań użyto trzech rzędów prób k rw i k o n serw o w an ej: 1) ze s ta b ili­ zato rem N r 7, 2) z tym sam ym stab ilizato rem z dod atk iem ch lo ro w o d o rk u ch in in y oraz 3) z tym sam ym sta b ilizato rem z dodatkiem la rg a k tilu . B ad an ia n ad p rz e n ik a ­ niem 32p prow adzono do 33 dnia przechow yw ania k rw i, w y k o n u jąc p o m iary 6 - k r o tnie. U zyskane w yniki nie w ykazały istotnych różnic an i w zależności od użytego p ły ­ n u konserw ującego, ani od upływ u czasu przechow y w an ia krw i. U zyskane w yniki m ogą św iadczyć o p rze n ik an iu jonów fo sforanow ych do k r w i­ n ek drogą dyfuzji, bez zw iązku z p rzem ian ą glikolityczną k rw in ek .

Wpływ oczyszczania na aktywność substancji grupowej A z erytrocytów ludzkich The Influence of Purification on the A ctivity of Blood Group Factor A from Humań Erythrocytes J. KOSCIELAK, E. GROCHOWSKA, K. ZAKRZEWSKI Z I n s t y t u t u im. L is tera w L o n d y n i e i I n s t y t u t u H e m a to lo g ii w W a r s z a w i e Jed n y m i z n ajb ard zie j aktyw nych p re p a ra tó w su b stan cji g ru p o w y ch A i B z k rw in ek czerw onych były p re p a ra ty uzyskane przy pom ocy e k s tra k c ji k rw in e k rozcieńczonych etanolem (1, 2). O trzym any p ro d u k t m iał ak ty w n o ść g ru p o w ą rzę d u 20% aktyw ności su b stan cji z płynów u strojow ych (pom iary m eto d ą h am o w an ia aglutynacji). P ró b y dalszego oczyszczania p re p a ra tu dop ro w ad zały je d n ak zaw sze do znacznego sp a d k u aktyw ności grupow ej. P odobny sp adek aktyw ności obserw ow ano rów nież p rzy p ró b ach ro zd ziału słab iej oczyszczonego p re p a ra tu (tzw. osadu m etanolow ego) otrzy m an eg o ze stro n y k rw in kow ej g rupy A. Z p re p a ra tu tego otrzym ano dw ie fra k cje : I i II, różniące się zn acz­ nie sk ładem chem icznym . P ierw sza z uzyskanych fra k c ji nie w ykazyw ała żadnej ak ty w n o ści w teście h am o ­ w an ia aglutynacji, druga — aktyw ność rzędu 5% m a te ria łu w yjściow ego. P rz y p o ­ m ocy testu ilościow ej precy p itacji z króliczą surow icą odpornościow ą a n ty -k rw in k i

http://rcin.org.pl

[33]

II K R A JO W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

585

czerw one stw ierdzono jednak, że fra k c ja II w y k azu je cz tero k ro tn y w zro st ak ty w ­ ności w p o ró w n an iu do m a te ria łu nałożonego n a kolum nę. F ra k c ja I by ła n ie ak ty w n a ró w n ież i w ty m teście. O bie fra k c je rozpuszczono w m ieszaninie m etan o l/ch lo ro fo rm 1:1 w sto su n k u cztery części w agow e fra k c ji I n a jed n ą część fra k c ji II, odparo w an o rozpuszczal­ n ik i pozostałość rozpuszczono w wodzie. O trzym ano ro ztw ó r, w y k azu jący silne zjaw isk o T yndalla. Z ro ztw o ru tego m ożna było p rzy 10—20 000 g odw irow ać białko w y k az u jąc e pełną rea k ty w ację aktyw ności g rupow ej m ierzonej testem h am o w an ia ag lu ty n ac ji. Z m ieszanie obu fra k c ji w środow isku w odn y m nie pow odow ało zm ian a n i w rozpuszczalności, ani też nie reak ty w o w ało ak tyw n o ści serologicznej. F ra k c ję II izolow aną z k rw in ek A m ożna było rea k ty w o w a ć rów nież fra k c ją I o trzy m an ą z k rw in e k B, przy czym pow stały kom plek s w y k azy w ał ty lk o a k ty w ­ ność A, a nie B. N ajw idoczniej fra k c ja I sp ełn iała ty lk o fu n k cję nośnika. Podobne w łaściw ości m iała w słabym sto p n iu lecy ty n a i sfingom ielina. P a ra d o k sa ln e zachow anie się fra k c ji II w obu te sta c h serologicznych (ham ow a­ n ie ag lu ty n ac ji i p rec y p itac ja z surow icą odpornościow ą) m ożna tłum aczyć ich ja ­ kościow o różnym ch a rak te re m . T est ham o w an ia a g lu ty n a c ji je st w zasadzie testem k o m p ety ty w nym , w k tó ry m cząsteczka badanego a n ty g en u w spółzaw odniczy o p rze­ ciw ciało z k rw in k ą czerw oną. W zw iązku z ty m b ad a n y an ty g en m usi m ieć w y sta r­ czająco dużą m asę cząsteczkow ą. W teście p rec y p itac ji w m ieszan in ie zn a jd u je się ty lk o an ty g en b ad a n y i przeciw ciało. R eak cja m oże w ięc zajść z m a teria łem o b ja w ia­ jący m stosunkow o m niejsze pow inow actw o do p rzeciw ciała. D odanie hydrofobow ego n o śn ik a n a dobrze rozpuszczonej fra k c ji glikolipidow ej pow oduje praw do p o d o b n ie w y tw o rzen ie się dużych m iceli, któ ry ch h y d ro filn e resz tk i cu k ró w zb ierają się na p o w ierzch n i m iceli. W ytw arza się w te n sposób „pow ierzch n ia cz y n n a”, co zapew ­ n ia w ytw orzenie się siatk i sk ład ającej się z cząsteczek an ty g en u i przeciw ciała. S ia tk a ta zapew nia trw ało ść połączenia an ty g en u z przeciw ciałem , k tó re nie ulega już"clysocjacji po dodaniu k rw in e k czerw onych. R e zu ltaty pow yższych b ad ań m ogą tłum aczyć niepow odzenia dotychczasow ych w ysiłków o trzy m an ia dobrze oczyszczonych i w yso k o ak ty w n y ch p re p a ra tó w su b ­ sta n c ji gru pow ych A i B z k rw in ek czerw onych.

LIT E R A TU R A 1. K o ś c i e l a k J., Z a k r z e w s k i K „ P roc. In t. Sym p. B iologically A ctive M ucoids, P olish A cadem y of Science, W arsaw , 1959. 2. K o ś c i e l a k J., Z a k r z e w s k i K., N ature, 182, 516 (1960).

Otrzymanie wysoko oczyszczonych substancji grupowych A z krwinek czerwonych ludzkich The Isolation of H ighly Purified Blood Group Factor A from Humań Erythrocytes J. KOSCIELAK Z I n s t y t u t u im . L is tera w L o n d y n i e i I n s t y t u t u Hematologii! w W a r sz a w ie

P ra ca n in iejsza p rzed staw ia otrzym anie z k rw in e k czerw onych dw óch g lik o li­ pidów grup ow ych o aktyw ności su b sta n c ji g ru p o w ej A, k tó re ró żn iły się ty lk o s k ła ­ dem kw asów tłuszczow ych. Jednocześnie p rze d staw ia dalsze dow ody, że aktyw ność su b stan cji grupow ych z k rw in ek czerw onych w tzw . te sta c h k o m p ety ty w n y ch (h a­

http://rcin.org.pl

58«

D O N IE S IE N IA

[34]

m ow anie ag lu ty n acji i ham ow anie hem olizy) zależy w dużym sto p n iu od ich sto p ­ n ia agregacji w roztw orze w odnym . S u b stan c je grupow e A otrzym ano z strom y krw in k o w ej g ru p y A. E k stra k c ję ro z­ puszczalnikam i organicznym i przeprow adzono wg u przednio o pisanej m etody ( 1, 2). P o rozdziale chrom atograficznym n a kolum nie celulozow ej m a te ria ł nałożono na k olum nę w ypełnioną kw asem krzem ow ym i eluow ano w sposób opisany p rze z Yamakawa i wysp. (5). F ra k c ję w y k azu jącą n ajw ięk szą ak ty w n o ść w teście ilościowej precy p itacji rozdzielano dalej n a dw a czyste glikolipidy, tzw . glikolipid rozpuszczalny i nierozpuszczalny w m etanolu, za pom ocą m etody fra k cjo n o w a n ia m etanolem w tem p eratu rz e 0°. O ba glikolipidy zachow yw ały się ja k czyste su b ­ sta n c je w u ltraw iró w ce (stała sedym entacji g lik o lip id u rozpuszczalnego 11X10—13 sek., zaś glikolipidu nierozpuszczalnego 49X10—13 sek.) i d aw ały p o je d y n ­ cze plam y w tzw . chrom atografii n a cienkiej płytce (4) w ro zp u szczaln ik u chlo­ ro fo rm — m etanol — w oda 4:6:0,4. G likolipid nierozpuszczalny b y ł rów nież je d ­ n orodny w teście frak cjo n o w an ej rozpuszczalności w y k o n an y m w g up rzed n io opi­ san ej m etody (1). G likolipid rozpuszczalny nie był w te n sposób bad an y . Po hydrolizie kw aśnej, w obu glikolipidach — nierozpuszczalnym i rozp u szczal­ nym zidentyfikow ano cukry re d u k u ją c e (43,0% i 41,4%), h eksozam iny (15,8% i 12,1%), kw as sialow y (10,4!% i 10,9%), fukozę (1,2% i 2,3%), sfingozynę (N — 0,81%, N — 0,91%). G likozam ina/galaktozam ina 3:1, galak to za/g lik o za 3:1 — w obu p rep a ra tac h . Z aw artość poszczególnych kw asów tłuszczow ych w y rażo n a w p ro cen tach ca ł­ k o w itej ilości kw asów tłuszczow ych (pom iary w yko n an o m eto d ą ch ro m ato g rafii gazow ej): C 16 (0 i 19,7); C 18 (0 i 10,7); C19 (0 i 2,3); C 20 (0 i 3,8); C 2i = (0 i 0 ,6); C 22 (8,1 i 22,9); C 22 = (0 i 1,1); C 23 (2,4 i 2,3); C 24 (89,5 i 26,8); C 24 = (0; 7,8) niezid en ty fik o w an y (0; 2,0). Z nak = oznacza kw as nienasycony. Oba glikolipidy w ykazyw ały aktyw ność serologiczną w teście ilościow ej p re ­ cy p itacji rzędu aktyw ności w ysoko oczyszczonej su b sta n c ji A z to rb ie li ja jn ik o ­ w ej. W teście ham ow ania aglu ty n acji, glikolipid niero zp u szczaln y w yk azy w ał rów nież tę sam ą aktyw ność co w spom niana w yżej su b sta n c ja w zorcow a; a k ty w ­ ność glikolipidu rozpuszczalnego w ynosiła je d n ak ty lk o 5% akty w n o ści su b stan cji w zorcow ej. G likolipid rozpuszczalny m ożna było ak ty w o w ać do poziom u a k ty w ­ ności glikolipidu nierozpuszczalnego przez dodanie n o śn ik a (3). D odanie nośnika do glikolipidu nierozpuszczalnego nie w pływ ało na jego aktyw ność serologiczną. Z m ieszanie rów nych w agow o części obu glikolipidów w środow isku ro zpuszczalnika organicznego (chloroform — m etanol 1 :1) pow odow ało in a k ty w ac ję g lik o lip id u n ie­ rozpuszczalnego do poziom u glikolipidu rozpuszczalnego. P odobne w y n ik i o trzy ­ m ano rów nież w teście ham ow ania hem olizy przy użyciu króliczej su ro w icy an ty -A i k rw in ek b aranich. B adanie kom pleksu obu glikolipidów w u ltra w iró w ce w ykazało, że n a jp ra w d o ­ podobniej tw orzą one m icele m ieszane; stała sed y m en tacji ciężkiego sk ład n ik a uległa zm niejszeniu, n ato m ia st sta ła sedy m en tacji sk ła d n ik a lżejszego u legała zw iększeniu. Różne aktyw ności glikolipidów grupow ych w te sta ch k o m p ety ty w n y ch m ożna zatem tłum aczyć różnicą ich m asy cząsteczkow ej w środow isku w odnym . G likolipid nierozupszczalny, zaw ierający dużą ilość k w asu tłuszczow ego C 24, tw o ­ rzy ł w w odzie duże m icele, zaś glikolipid rozpuszczalny — m icele o m niejszym w y ­ m iarze. M icele glikolipidu nierozpuszczalnego były w y starczająco duże, by m a teria ł te n był w ysokoaktyw ny w teście h am ow ania ag lu ty n ac ji n aw e t bez d o d a tk u nośnika. G likolipid nierozpuszczalny, na sk u te k m ałej „pow ierzchni czy n n ej”, m ógł rozw i­ nąć p ełną aktyw ność serologiczną dopiero po połączeniu z nośnikiem . In ak ty w a cję g lik o lipidu nierozpuszczalnego przez glikolipid ro zpuszczalny m ożna tłum aczyć tw o rzen iem się m iceli m ieszanych o m niejszych w y m iarach , poniew aż tw orzenie

http://rcin.org.pl

[35]

II K R A J O W E S Y M P O Z JU M B IO C H E M IC Z N E

587

ag reg ató w p rzez zw iązki tego ty p u w środow isku w odn y m zależy praw d o p o d o b n ie ty lk o od in te ra k c ji ich części hydrofobow ej, tj. części ceram id o w ej. P rz ed sta w io n e w yniki św iadczą o tym , że su b stan cje g ru p o w e z k rw in e k cz e rw odnych m a ją c h a ra k te r glikolipidów i że ich aktyw ność serologiczna, a p raw d o ­ podobnie rów nież aktyw ność innych antygenów lipidow ych, zależy w dużym sto p ­ n iu od ich stopnia agreg acji w roztw orze w odnym .

L ITER A TU R A 1. K o ś c i e l a k J., Z a k r z e w s k i K., Proc. Int. S ym p. B iologically A ctive M ucoids, P olish A cadem y of Science, W arsaw (1959). 2. K o ś c i e l a k J., Z a k r z e w s k i K., N a tu re 182, 516 (1960). 3. K o ś c i e l a k J., Grochowska E., Zakrzewski K., II K rajo w e S y m pozjum Polskiego T ow arzy stw a Biochem icznego, P o zn ań 1962. 4. S t a h l E., Schröter G., Kraft G., Renz R., P harm azie 11, 633 (1956). 5. Y a m a k a w a T., I r i e R., I w a n a g a M., J. B iochem . 48, 490 (1960).

http://rcin.org.pl

SPIS TREŚCI

4

s tr T. K ł o p o t o w s k i — Now e osiągnięcia g enetyki biochem icznej . . . 421 Z. Z i e l i ń s k a i B. G r z e l a k o w s k a — M echanizm y procesów fo rm y lac ji i h y d r o k s y m e t y l a c j i ..................................................................................................... 453 K. M.

Bełżecka i T. u zw ierząt Hierowski

Laskowska — H y d ro k sy lacja fen y lo a lan in y ............................................................................................. 475

— B iosynteza b ia łk a w czerw onych ciałk ach k rw i .

.

483

II K RA JO W E SYM PO ZJU M PO LSK IE G O TOW ARZYSTW A BIO CH EM ICZ­ NEGO. O tw arcie Sym pozjum (Z. S to lzm a n n ) ...........................................493 J. C h m i e l — B ad an ia n ad s tr u k tu rą k rw in k i c z e r w o n e j .............................495 W.

Leyko

J.

Krawczyński czerw onej

J. H o r e j ś i D oniesienia

— W spółczesne poglądy na m etabolizm e ry tro c y tu

.

.

.

511

— T ra n sp o rt jonów i d ro b in przez błonę k rw in k i ............................................................................................. 523

— R ola g lu ta tio n u w k rw in ce czerw onej .............................541 ..............................................................................................553

http://rcin.org.pl

POSTĘPY BIOCHEMII November 1962 V olum e 8

N u m b er 4 A RTICLES IN P O L ISH

T.

Kłopotowski — R ecent P rog ress in B iochem ical G enetics (Dep. Biochem., In stitu te of M other and Child, W a r s z a w a ) ............................. 421 Z. Z i e l i ń s k a a n d B. G r z e l a k o w s k a — M echanism s of th e F o r­ m y lation and H y d ro x y m éth y latio n R eactions (In stitu te E x p tl. Biol. Pol. A cad. Sei., W arszaw a) ........................................................................ 453 K . B e ł ż e c k a and T. L a s k o w s k a — H y d ro x y latio n of P h en y lalan in e in A nim als (Dep. Physiol. Chem., Schol Med., W arszaw a) . . . . 475 M.

H i e r o w s k i — P ro te in B iosynthesis in Red Blood Cells (Dep. P h y ­ siol. Chem., School Med., Poznań) ......................................................... 483

TH E SECOND N A TIO N A L SYM POSIUM OF P O L ISH BIO CH EM ICA L SO ­ CIETY. O pening L ectu re by P rof. Z. S t o l z m a n n ...........................................493 J. Chmiel — T he In v estig atio n s on th e R ed Blood S tru c tu re (Dep. Physiol. Chem., School Med., Poznań) ...................................................495 W. Leyk o — M odern V iew s on th e E ry th ro c y tes M etabolism (Dep. Biochem., Univ., Łódź) ......................................................................................511 J. K r aw c z y ń s k i — T ra n sp o rt of Ions and M olecules th ro u g h th e E ry th ro cyte M em brane (The A nalitycal L a b o ra to ry of th e In s titu te fo r A dvanced S tudies fo r M edical S taff, W arszaw a)........................................ 523 J. H o r e j s i — The Role of G lutath io n e in th e Red Blood C ell (In stitu te of H em atology and Blood T ran sfu sio n , P rah a) ....................................541 C om m unications

............................................................................................. 553

http://rcin.org.pl

Zainteresow anym mechanizmem i skutkam i prom ieniowania na organizm y żyw e polecamy

P. A lexander— Promieniowanie a życie s. 315, zł 25.—

&

http://rcin.org.pl

INFORM ACJE I W SKAZÓW KI DLA AUTORÓW 1. P ostępy B iochem ii p u b lik u ją arty k u ły referato w e ze w szystkich dziedzin b io­ chem ii nie drukow ane w innych czasopism ach. A rty k u ły drukow ane w Postępach B iochem ii nie m ogą być bez- zgody R edakcji publikow ane w innych czasopism ach. 2. P race należy przesyłać do R edakcji w 2 egzem plarzach m aszynopisu i w szel­ kich załączników . Pow inny one odpow iadać podanym dalej wskazów kom . N ieodpow iednio przygotow ane m aszynopisy lub za łą czn iki nie będą ro zp a try ­ w ane przez R ed a kcję i będą odsyłane A utorom . 3. M aszynopis pow inien być pisany jednostronnie z po d w ó jn ą in te rlin ią , z m a r ­ ginesem około 4 cm po lew ej stronie i około 1 cm po praw ej stronie, oraz z n u m eracją stron. W tekście m aszynopisu nie należy robić żadnych podkreśleń n a m aszynie ani atram entem . Po tytułach wydziełlonycn inde należy staw iać kropek. 4. Na pierw szej stro n ie m aszynopisu należy zamieścić tylko inform acje w n a ­ stępującej kolejności: im iona i nazw iska autorów , ty tu ł p racy (w języku polskim i angielskim ), om ów ienie tem atu pracy (w języku angielskim ), stopnie i ty tu ły naiukow e au torów w raz z nazw am i placów ek naukow ych. Im iona należy podaw ać w pełnym brzm ieniu. P rzy każdym nazw isku pow inien znajdow ać się odsyłacz gw iazdkow y do notki, tj. *, ** itd. (bez naw iasu). O m ów ienie te m atu pracy mcrże obejm ow ać najw yżej 5 w ierszy m aszynopisu. P rzekład na język angielski może być dokonany w red ak cji i w tym przy p ad k u należy pozostaw ić w olne m iejsce w m aszynopisie, zaś na oddzielnej k artc e dołączyć polski tek st om ów ienia. N a dole pierw szej stro n y m aszynopisu należy zam ieścić n o tk i oznaczone odsyła­ czami gw iazdkow ym i (jak przy nazw iskach). T ekst notki pow inien być podany n a ­ stępująco:* Dr, ad iu n k t Z akładu Chem ii Fizjologicznej A kadem ii M edycznej w... 5. W łaściw y te k st pracy rozpoczyna się od drugiej strony m aszynopisu. W p rzy ­ p adku podziału te k stu na rozdziały i podrozdziały należy ich ty tu ły oznaczyć od­ pow iednio nu m eracją rzym ską I., II. itd. oraz ara b sk ą 1., 2. itd. T ekstow e tytuły (tj, nie w ydzielone z tekstu) nie pow inny być num erow ane. W tekście nie należy zamieszczać żadnych tablic, ry su n k ó w an i schem atów . W tych przypadkach należy pozostaw ić w olny w iersz m aszynopisu w żądanym m iejscu i odpow iednio ozinaczyć, Tablica 1, Rys. 1, Schem at 1. T a sam a w skazów ka odnosi się do pojedynczych w zorów chem icznych i innych. Ż ądane m iejsce w w olnym w ierszu zaznacza się w ówczas odpow iednim num erem w naw iasach, do .którego należy odw ołać się po odpow iednim słowie tek stu , np. kw as glutam inow y (I). O dw oływ anie się w tekście do notek w yjaśniający ch może być stosow ane tylko w w yjątkow ych przypadkach.

http://rcin.org.pl

C ena zł 20.—

6. C ytow aną lite ra tu rę należy w ypisać oddzielnie n a o statn iej stronie (stronach) m aszynopisu, w ym ieniając pozycje w alfab ety czn ej kolejności n azw isk autorów . W w ykazie pow inny być podane kolejno: liczba porządkow a, nazw isko au to ra, pierw sze litery 'imion, skrócony ty tu ł czasopism, tom (podkreślony), stro n ica i rok w yd an ia (w naw iasach), np. 3. B ogorad L., G ranick S., J. Biol. Chem. 202, 793 (1953). N ależy w ym ienić nazw iska w szystkich w spółautorów w kolejności podanej w orygi­ n aln ej pracy. W ykaz stosow anych skrótów czasopism pod ają Post. B iochem . 7, 601 (1961). Dla cytow anych książek (nie czasopism) należy podać kolejno: nazw isko i pierw sze lite ry imion au to ra, ty tu ł dzieła, m iejsce i rok w ydania, np. P rzy łęck i S. J., Podręcznik chem ii fizjologicznej, Łódź 1947. W p rzypadku odw oływ ania się d o a rty k u łu w p racy zoiorow ej należy dodatkow o podać tom i nazw iska w ydaw ców (redaktorów ) dzieła po ty tu le oraz ną końcu — stronice, np. S chneider W. C., M ethods in Enzymology, tom III, red. S. P. Colowick i N. O. K aplan, N ew Y ork 1957, str. 680. P ow oływ anie się w tekście na odnośną pozycję cytow anej lite ra tu ry n astęp u je przez w ym ienienie liczby porządkow ej pozycji w naw iasach, np. (10). 7. Z ałączniki do p rac y obejm ują tablice, rysunki, schem aty, w zory itp. W szystkie pow inny być oznaczone u góry nazw iskiem au to ra i początkow ym i w yrazam i ty tu łu pracy. Tablice należy dołączyć na oddzielnych k artk a ch . K ażda z nich ¡powinna być oznaczona z p raw ej strony u góry kolejnym num erem arab sk im , np. T ablica 1, oraz posiadać nagłów ek opisujący jej treść. Sens tablic pow inien być zrozum iały bez odnoszenia się do tek stu pracy, a każd a ru b ry k a — zaopatrzona w odpow iedni tytuł. 8. W szelkie ry su n k i, w ykresy i fotografie należy dołączyć do m aszynopisu w p o ­ staci n a d a ją c e j się do rep ro d u k cji lub przerysow ania. W szystkie te załączniki należy oznaczyć jako ry su n k i i zaopatrzyć u dołu kolejnym num erem ara b sk im z podaniem w łaściw ego ustaw ienia, np. Rys. 1 (dół). P odpisy pod ry su n k i pow inny być dołączone n a oddzielnej k artc e. P o ty tu le należy podać odpow iednie objaśnienia lub uw agę (objaśnienia w tekście). 9. S chem aty rea k cji i pojedyńcze w zory należy zam ieścić n a oddzielnej k artc e (k artk ach ). O znaczenia, k tórych nie m ożna n ap isać n a m aszynie, pow inny być bardzo w yraźnie naniesione czarnym tuszem . S chem aty należy oznaczyć u dołu kolejnym num erem arabskim , np. Schem at 1, oraz w łaściw ym podpisem (tytuł i objaśnienia). P ojedyncze w zory pow inny posiadać n um ery rzym skie zgodne z n u m eracją w tekście. 10. R edakcja zastrzega sobie m ożność dokonania sk ró tó w i p o p raw ek nie w p ły ­ w ających na treść pracy. W p rzy p a d k u konieczności w prow adzenia zm ian w treśc i od­ syła się A utorow i egzem plarz pracy dla dokonania popraw ek; d ru g i — pozostaje w a k ta c h red a k cji. 11. A u to ra obow iązuje k o rek ta au to rsk a, k tó rą należy zw racać re d a k c ji w ciągu 3 dni. K orektę należy w ykonać kolorow ym (nie czerw onym ) ołówkiem. K oszty Sjpowodowane zmianami tekstu w korekcie, poza poprawkami błędów d ru k arsk ich , ponosi autor. 12. A rty k u ły są honorow ane w edług ustalonych staw ek. A utorzy o trzy m u ją 25 b ezpłatnych odbitek pracy. Ż ądanie w iększej ilości odbitek (płatnych) należy zgło­ sić pisem nie p rzy zw rocie korek ty autorskiej.

http://rcin.org.pl