Arbeitsanleitung – Instruction Manual
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit
V0815
INHALT EINLEITUNG
1
KITBESTANDTEILE
1
LAGERUNG
1
VORBEREITUNG
1
PEQGOLD XCHANGE PLASMID PURIFICATION KIT PROTOKOLL
2
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER PLASMID-DNA
3
BESTELLINFORMATIONEN
3
TROUBLESHOOTING TIPS
4
CONTENT INTRODUCTION
5
PRINCIPLE
5
KIT COMPONENTS
6
STORAGE AND STABILITY
6
BEFORE STARTING
7
PEQGOLD XCHANGE PLASMID PURIFICATION KIT PROTOCOL
7
YIELD AND QUALITY OF DNA
8
ORDERING INFORMATION
8
TROUBLESHOOTING TIPS
9
EINLEITUNG Der peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um in wenigen Minuten bis zu 500 µg hochreine Plasmid-DNA aufzureinigen und zu entsalzen. Die Probe wird mittels Isopropanol präzipitiert und anschließend an der peqGOLD XChange Plasmid Purification-Membran gebunden. Durch Waschen mit Ethanol und anschließendem Eluieren in einem salzarmen Puffer, kann die hochreine DNA bereits nach 5 Minuten für alle Arten von Folgeexperimenten eingesetzt werden. Durch die Verwendung der neuartigen Spritzentechnologie entfallen die lästigen Zentrifugationsschritte vollständig.
KITBESTANDTEILE peqGOLD XChange Plasmid Purification Kits
20 Reinigungen
40 Reinigungen
12-7403-01
12-7403-02
XChange Filter
20
40
30 ml Syringes
20
40
1 ml Syringes
20
40
Arbeitsanleitung
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Best.-Nr. Bestandteile
LAGERUNG Die Aufbewahrung der Komponenten des peqGOLD XChange Plasmid Purification Kits kann bei Raumtemperatur erfolgen. Bei entsprechender Lagerung bleiben alle Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil.
VORBEREITUNG Bitte lesen Sie die vorliegende Bedienungsanleitung sorgfältig durch und machen Sie sich mit dem Arbeitsablauf vertraut. Bereiten Sie alle Komponenten vor und legen Sie die zur Durchführung des Kits notwendigen Materialien bereit.
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-7403
PEQGOLD XCHANGE PLASMID PURIFICATION KIT PROTOKOLL Benötigte Materialien, die nicht im Lieferumfang enthalten sind: ! Isopropanol ! 70 % Ethanol 1. Präzipitieren der DNA Das Eluat einer Anionaustauscher-Aufreinigung mit 0,7 fachem Volumen Isopropanol (20 °C) versetzen. Ausgiebig vortexen und das Präzipitat anschließend für 2 Minuten ruhen lassen. Die DNA muss hohe Salzkonzentrationen von Natriumacetat (0.3 M) oder Natriumchlorid (0.2 M) enthalten. Wenn diese Konzentrationen nicht gegeben sind, fügen sie der DNA 1/10 des Volumens an 3 M Natriumacetat hinzu. (Wichtig: Die Salz-Zugabe muss vor der Präzipitation mit Isopropanol erfolgen!).
2. Laden und Binden Das Präzipitat vorsichtig in eine 30 ml Spritze (Syringe) füllen, die auf einen XChange Filter geschraubt wurde. Das Präzipitat gleichmäßig durch den Filter drücken. Durchfluss verwerfen. 3. Waschen Den XChange Filter von der Spritze entfernen, den Stempel aus der Spritze ziehen und anschließend den XChange Filter erneut auf die Spritze schrauben. 2 ml 70 % Ethanol in die Spritze füllen. Ethanol gleichmäßig durch den Filter drücken. Durchfluss verwerfen. 4. Trocknen des Filters Den XChange Filter von der Spritze entfernen, den Stempel aus der Spritze ziehen und anschließend den XChange Filter erneut auf die Spritze schrauben. Durch das Einführen des Stempels vorhandene Luft gleichmäßig durch den XChange Filter drücken. Reste des Ethanols durch ein Zellstofftuch am Ende des XChange Filters aufsaugen. Diesen Vorgang mindestens 2 x wiederholen. 5. Elution Den XChange Filter von der Spritze entfernen, den Stempel aus einer 1 ml Spritze ziehen und anschließend den XChange Filter erneut auf die Spritze schrauben und mit 500 bis 800 µl TE Buffer eluieren. Anschließend das Eluat erneut in die Spritze füllen und gleichmäßig durch den Filter drücken.
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-7403
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER PLASMID-DNA Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (20- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 50 x Verdünnungsfaktor
Das A260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit erzielbare A260/280-Verhältnis von 1.8 bis 2.0 entspricht deshalb DNA einer Reinheit von 90 % bis 100 %. Üblicherweise liegt der größte Teil der isolierten Plasmide in der monomeren supercoiled Form vor. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen Plasmid-DNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten DNA-Proben bestimmt werden.
Plasmid-DNA, die mit dem peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit aufgereinigt wurde, kann in Elutionspuffer, TE-Puffer oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei –20 °C aufbewahrt werden.
BESTELLINFORMATIONEN Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen: peqGOLD XChange Plasmid Midi Kit
peqGOLD XChange Plasmid Maxi Kit
peqGOLD XChange Plasmid Maxi EF Kit
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_D
12-7401-01
10 Reinigungen
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20 Reinigungen
12-7401-03
40 Reinigungen
12-7402-01
10 Reinigungen
12-7402-02
20 Reinigungen
12-7402-03
40 Reinigungen
12-7404-01
10 Reinigungen
12-7404-02
20 Reinigungen
12-7403-01
20 Reinigungen
12-7403-02
40 Reinigungen
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Art.-Nr. 12-7403
TROUBLESHOOTING TIPS Problem
Ursache
Niedrige DNAErträge
Schlechte Präzipitation
Abhilfe Es können alle Plasmide und Cosmide einer Größe von 2 – 50 kbp mit einer Recoveryrate von 90 % aufgereinigt werden, wenn hohe Salzkonzentrationen (0,2 M Natriumchlorid oder 0,3 M Natriumacetat) und 40 % Isopropanol vorhanden sind.
Totvolumen zu hoch
Spritze vorsichtig auf die Laborbench schlagen um Tropfen des Elutionspuffers auf den Filter zu drücken. Spritze anschließend mit Luft füllen und nach der Elution das Totvolumen ausblasen. Schritte mehrmals wiederholen. Das akzeptable Totvolumen liegt bei etwa 30 µl.
Elutionsvolumen zu klein
Elutionsvolumen von 100 µl nicht unterschreiten, da sonst die Membran nicht vollständig benetzt wird.
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_D
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Art.-Nr. 12-7403
INTRODUCTION The peqGOLD family of products is an innovative system that radically simplifies extraction and purification of nucleic acids from a variety of sources. XChange Plasmid Purification Kit is designed for quick concentration and desalination of plasmid and cosmid DNA eluates from anion-exchange DNA purification kits.
PRINCIPLE The XChange Plasmid Purification Kit combines the power of XChange technology with the replacing of time-consuming centrifugation steps which follow every isopropanol precipitation of diluted DNA samples. The Plasmid DNA binds effectively to the membrane of the XChange column and can easily be purified from contaminants and enzyme inhibitors. Purified plasmid DNA is easily eluted from the column with Elution buffer. The XChange column binding capacity is 500 µg. The protocols are suitable for purifying most plasmids ranging from 3 to 10 kb, cosmids from 10 to 50 kb.
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_E
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Cat. No. 12-7403
KIT COMPONENTS 20 Purifications
40 Purifications
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12-7403-02
XChange Filters
20
40
30 ml Syringes
20
40
1 ml Syringes
20
40
Instruction Manual
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peqGOLD XChange Purification Kit
Plasmid
Order No. Components
STORAGE AND STABILITY All peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit components are stable for at least 12 months from the date of purchase and should be stored at room temperature (22 °C – 25 °C).
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_E
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Cat. No. 12-7403
BEFORE STARTING Please read this booklet and become familiar with each step. Prepare all components and have the required materials ready before starting.
PEQGOLD XCHANGE PLASMID PURIFICATION KIT PROTOCOL Materials not supplied with the kit: ! !
70 % Ethanol Isopropanol
1. Precipitate DNA Add 0.7 volumes of room-temperature isopropanol to eluates from anion-exchange Kits. Vortex well and incubate at room temperature for 2 minutes. Add 1/10 volume of 3 M sodium acetate before adding isopropanol, if the salt concentration of sodium chloride is less than 0,3 M (0,2 M potassium chloride or 0,3 M sodium acetate). 2. Load precipitate Remove the plunger from the syringe and attach the XChange Membrane onto the outlet nozzle. Fill the eluate/isopropanol mixture into the syringe, insert the plunger. Filter the eluate/isopropanol mixture through the membrane using constant force. Discard flowthrough. 3. Wash Membrane Remove the XChange membrane from the syringe and remove the plunger. Re-attach the membrane to the syringe and add 2 ml of 70 % Ethanol. Press the ethanol through the membrane using constant force. Discard flow-through. 4. Dry Membrane Remove the membrane from the syringe and remove the plunger. Re-attach the membrane to the syringe and press the air through the membrane with constant force. Use a tissue to dry the tip. Repeat this step at least two times.
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_E
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Cat. No. 12-7403
5. Elution Remove the membrane from the syringe and remove the plunger. Re-attach the membrane to a 1 ml syringe and eluate the plasmid DNA with 500 – 800 µl TE-Buffer. Transfer the eluate back into the syringe and elute into the same collection tube a second time.
YIELD AND QUALITY OF DNA Determine the absorption of an appropriate dilution (20- to 50-fold) of the sample at 260 nm and 280 nm. One A260 unit corresponds to 50 µg DNA/ml. The DNA concentration is calculated as follows: DNA conc. (µg/ml) = Absorption260 × 50 × Dilution Factor The ratio of A260/280 is an indicatior for nucleic acid purity. A value higher than 1.8 indicates > 90 % purity. Typically, the majority of the eluted DNA is in monomeric supercoiled form. Alternatively, quantity (as well as quality) can be determined by agarose gel/ethidium bromide electrophoresis by comparison to DNA samples of known concentration.
ORDERING INFORMATION For the purification of plasmid DNA: peqGOLD XChange Plasmid Midi Kit
peqGOLD XChange Plasmid Maxi Kit
peqGOLD XChange Plasmid Maxi EF Kit
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_E
12-7401-01
10 Reinigungen
12-7401-02
20 Reinigungen
12-7401-03
40 Reinigungen
12-7402-01
10 Reinigungen
12-7402-02
20 Reinigungen
12-7402-03
40 Reinigungen
12-7404-01
10 Reinigungen
12-7404-02
20 Reinigungen
12-7403-01
20 Preparations
12-7403-02
40 Preparations
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Cat. No. 12-7403
TROUBLESHOOTING TIPS Problem
Likely cause
Suggestion
Low DNA yields
Incomplete precipitation
Increase the presence of salt. For 90 % efficiency you need at least 0.2 M sodium chloride or 0.3 M sodium acetate and 40 % isopropanol. The acceptable dead volume is 30 µl, after elution tap the filter on the bench and blow out the filter with air. Repeat this steps 2 times. Do not elute with a volume smaller than 100 µl. For smaller volumes the membrane will not be sufficiently wet by elution buffer.
Dead volume too high Elution volume too small
peqGOLD XChange Plasmid Purification Kit PEQLAB_v0815_E
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Cat. No. 12-7403
