PCR ,,,,, DNA, DNA DNA DNA

中药材分子标记鉴别的现状及其应用 193 综述与专论 中药材分子标记鉴别的现状及其应用 Ξ 王义权1, 3  周开亚1  徐珞珊2, 3  詹华强3 ( 1 南京师范大学生物学系 南京 210097;  2 中国药科大学生药研究室 南京 210009; 3 香港科技大学生物系生物技术研究...
Author: Clifford Ryan
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中药材分子标记鉴别的现状及其应用

193

综述与专论

中药材分子标记鉴别的现状及其应用

Ξ

王义权1, 3  周开亚1  徐珞珊2, 3  詹华强3 ( 1 南京师范大学生物学系 南京 210097;  2 中国药科大学生药研究室 南京 210009; 3

香港科技大学生物系生物技术研究所 香港 九龙)

摘 要 分子遗传标记技术在中药材品种鉴别中的应用是中药现代化研究的一个重要方面, 它将有助于解决中药鉴定中的一些难题, 提高中药鉴定水平。 本文回顾国内外中药分子标记鉴定 研究的现状, 分析了目前分子标记在中药鉴定应用中存在的问题, 指出运用高特异性鉴别引物的 PCR 鉴别是一种具有实际应用价值的分子标记鉴别方法。

关键词 中药材 分子标记 鉴别

  随着西方后工业社会的到来, 人们回归 自然的愿望越来越强烈, 天然药物倍受青睐, 我国的传统医药也日益受到人们的关注。 这 为中药走向世界提供了良好契机, 同时也对

道地药材除了与其特定的生长环境和特殊的 采收加工有关外, 还与其产区内这一物种的 地方种群的遗传性状有关, 而这种遗传特性 的差异, 造成道地药材与非道地药材品质的

中药的发展提出了更高的要求, 即如何使我 国的传统中药符合国际医药市场的需要, 实 现中药研究现代化。因此, 在继承传统中药的 基础上, 还需要运用先进的科技手段和方法, 研制出优质高效、安全可靠、质量可控的现代

差异。 但道地药材与非道地药材为同种异地 生物, 两者形态、组织构造等特征的差别往往 不十分明显, 给道地药材的鉴别带来困难。 分子遗传标记就是利用生物体内遗传信 息载体——DNA 分子对物种进行鉴别的方

中药。 分子遗传标记技术在中药材品种鉴别 中的应用是中药现代化研究的一个重要方 面。 1 分子标记在中药品种鉴定中的作用 大多数药材可以通过性状、显微和理化

法。在 DNA 分子上, 不同区域编码的各种基 因对物种存活有着不同的重要性, 另外还有 些区域不编码任何基因。 基因组 DNA 的这 些不同区域在生物进化过程中所受到的选择 压力不同, 与物种存活紧密相关的基因编码

鉴定方法得到准确鉴定。然而, 中药材种类繁 多, 产地广泛, 各地名称及用药习惯不同, 同 名异物或同物异名现象较普遍存在。 有的因 形状相似, 鉴别特征不明显而不易辨认, 特别 是对同科属的种类及中药复方制剂中组成药

区域所受选择压力大, 表现出高度保守, 另一 些区域承受的选择压力小, 表现出较大的变 异。 正是由于这种 DNA 分子不同区域承受 的选择压力不同, 使得 DNA 分子的不同区 域有不同程度的遗传变异。 我们能够选择适

物的鉴别显得力不从心。此外, 道地药材的使 用一直为历代医家所重视, 如今道地药材研 究已成为研究中药材质量的重要课题之一。

当的 DNA 分子遗传标记, 在属、种、变种、亚 种、居群或个体水平上准确地鉴别研究对象。 DNA 分子的信息量大, 且不受外界因素和生

Ξ

国家自然科学基金 (N o. 39870913) 和江苏省教委科学基金 (N o. 98KJB 360010) 资助项目

                   药 学 进 展          1999 年 23 卷 第 4 期 194

物体发育阶段及器官组织差异的影响, 每一 个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。 因此, 用 DNA 分子特征进行物种鉴别更为 准确可靠, 它能够解决中药品种鉴定中的某 些难题, 并有鉴定准确性高、重现性好等优

讨 论。 在 应 用 DNA 序 列 分 析 手 段 上, [ 13 ] M izukam i 用通用引物扩增当归 (A ng elica acu tiloba ) 、三岛柴胡 (B up len rum f a lca tum ) 和珊瑚菜 (G lehn ia littora lis ) 的 5S rRNA 基

点。 2 分子标记鉴别在中药鉴定中的研究进展 国内外最早运用 DNA 分子遗传标记对 中药材品种进行鉴别的报道是 1994 年香港 中 文大学的 Cheung 等[ 1 ] 用 A P 2PCR ( a rb i2 t ra rily p rim ed po lym era se cha in react ion ) 方

序列的差异, 选用限制性内切酶 H ind g 消 化 PCR 产物 ( PCR 2R FL P ) , 可有效地鉴别这 3 种药材。 Fu sh im i 等 [ 14 ] 用 18S rRNA 基因 的序列对中药川芎进行了鉴别。 在动物类药材的分子标记鉴别中, 王义

因片段, 通过 DNA 测序, 针对该片段核苷酸

法对西洋参、人参的鉴别研究, 他们从干药材 标本中提取总 DNA , 经 C sC l 超速离心纯化, 用 3 种任意引物, 在较低的复性温度下, 对人 参属两种药材的 DNA 模板进行 PCR 扩增,

权等[ 15 ] 从乌梢蛇及 3 种混淆品和金钱白花 蛇及 2 种伪品中提取 DNA , 并用 10bp 的随 机引物进行 RA PD 分析, 得到了可以区别正 品与伪、混淆品药材的 RA PD 图谱。 对蛇类 药材的 Cyt b 基因片段序列分析结果也显

得到可以区分上述两种药材的 DNA 指纹图 谱。随后 Shaw 等[ 2, 3 ] 又用此方法对包括西洋 参和人参在内的 3 种人参属药材及 4 种伪品 作了进一步的鉴别研究。 曹晖等[ 4~ 6 ] 用同样 的方法鉴别了中药材地胆草与白花地胆草以

示, 不同种间 DNA 序列有显著差异, 同种间 则高度相似, 通过部分 DNA 片段的序列分 析能够准确区分不同种蛇类药材[ 16 ]。在中药 材龟板、鳖甲和海马的鉴别中, 通过线粒体 DNA 部分基因片段的序列分析, 亦能准确地

及蒲公英与 6 种土公英的混淆品。张荣等[ 7, 8 ] 用随机扩增多态性 DNA (RA PD ) 分析鉴定 了 铁 线 莲 属 ( C lem a tis ) 7 种 和 木 蓝 属 ( I n 2

区分其原动物和药材的种类[ 17~ 19 ]。 此外, 王 建云等[ 20, 21 ] 用 DNA 测序的方法鉴定了鸡内 金和鹿鞭。H a sh im o to 等[ 22 ] 用 PCR 方法扩增 了鹿茸、蝮蛇和海马的 12S rRNA 和 Cyt b 基因片段, 并对鹿茸的 PCR 产物进行了测

d ig of erae) 8 种生药。 Yam azak i 等

从不同 产地的 4 种甘草属植物商品药材中提取总 [9 ]

DNA , 用 RA PD 分析鉴定了这 4 种不同产地

的甘草。O zek i 等 从贮存 6 年之久的人参 属药材和从冻存的同种药材原植物叶片中提 取 DNA 作 RA PD 分 析, 发 现 他 们 所 用 的 GTC ( guan id ine iso th iocyana te ) 提取缓冲液 [ 10 ]

可以从药材和新鲜样品中提得同样高质量的 DNA 模板, 得到相同的 RA PD 图谱。陈林姣 等[ 11 ] 用 RA PD 技术鉴别了溪黄草类原植物, 认为该方法对药材的“地道性” 研究有重要意 [ 12 ] 义。 黄璐琦等 以细辛类药材的鉴别为例, 对 RA PD 方法在中药材鉴别中存在的问题 进行探讨, 结果表明, 药材 DNA 模板浓度、 降解程度及药材产地均对 RA PD 产物有不 同程度的影响, 并对 RA PD 适用范围进行了

序, 结果表明, 动物类药材可以用标准的药材 标本作参照, 同时进行 PCR 扩增, 经电泳检 测达到鉴别的目的。 DNA 分子的多态性研究通常用新鲜的 动植物材料, 因为新鲜材料中的 DNA 保存 较为完整, 便于 DNA 的提取和研究。 大麻 (C annabis sa tiv a ) 是一种广泛分布的植物, 其变种非常多, 由于它是毒品的原料植物, 受 到各国政府的严格限制, 因此在许多情况下 需 要 分 辨 出 它 的 原 产 地。 Sh iro ta 等[ 23 ] 用 RA PD 和 R FL P ( rest rict ion fragm en t leng th po lym o rp h ism ) 方法分析了产地不同的 3 个 大麻品系, 得到区别这 3 种品系的 DNA 指 纹图谱, 认为这两种 DNA 分子标记方法的

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结合可以有效地辨别具有不同化学型的大麻 品系。 5S rRNA 基因存在于高等真核生物 内, 由约 120bp 编码区域的重复单位构成, 编码区序列高度保守, 两编码区之间的非编 码区在不同的种类中, 其长度和序列均有程

一定区别, 不同产地当归质量不尽相同。Ko 2 [ 31, 32 ] 用 RA PD 方法对来自不同 h jyoum a 等 产地的苍术类 4 个种和 1 个变种进行了遗传 变 异 分 析, 并 结 合 气 相 色 谱 分 析 揭 示 了 A 1 lancea 存在着较大的种内变异; 最近他们

度不同的变异。M izukam i 等[ 24 ] 根据这一特 点, 在两编码区内设计一对 5SP 1 和 5SP 2 引 物, 对产于日本的当归两变种、一个栽培品种 及三岛柴胡、珊瑚菜和一种蛇床子 (C n id ium

又用 RA PD 方法研究了当归及其变种, 表明 该方法是鉴别当归及变种的有效方法。 Ya 2 [ 33, 34 ] 从羽扇豆属 (L up inus ) 5 种植 m azak i 等 物种子中提取 DNA , 进行了 R FL P 分析, 重 建了系统发生树, 并首次讨论了这 5 种羽扇

of f icina le ) 的 5S rRNA 基因间隔区进行了

PCR 扩增和测序, 结果表明, 5S rRNA 基因

间隔区在当归种内无变异, 而在上述 4 种伞 形科植物之间有序列差异, 这种差异可作为 上述植物种间的鉴别依据。M izukam i 等[ 25 ] 对 5 种苍术属植物叶绿体 DNA 的 trnK 基 因进行了 PCR 扩增和测序, 通过比较该属 5 个种的 trnK 基因序列发现, 该基因在苍术属 内较为保守, 并据此讨论了 5 种苍术属植物 的 演 化 关 系。W o jciechow sk i 等[ 26 ] 和 W en 等[ 27 ] 分别对黄芪属 (A strag a lus ) 26 种和人 参属 14 种植物的 rRNA 基因的内转录间隔 区 ( IT S ) 进行了测序, 讨论了同属各种植物 的起源与演化关系。 Fu sh im i 等[ 28 ] 分别从人 参、西洋参和竹节参 (J apon ici R h izom a ) 等 3 种药材的原植物中提取 DNA , 对人参类的 18S rRNA 基因进行扩增和测序, 结果表明

用从药材和原植物中提取的 DNA 分别扩增 并测序所得结果一致, 这 3 种人参属植物的 18S rRNA 基因序列表现出较高的保守性, 在 1809bp 中仅出现了 4 个碱基变异位点。 [ 29 ] M izukam i 等 用 R FL P 分析了产自不同地

豆属植物中生物碱含量的变化与物种系统发 生之间的关系; 他们还从冷冻保存的植物叶 片 0 组织中提取 DNA , 用 RA PD 和 R FL P 方法研究了 4 种甘草属 (G ly cy rrh iz a ) 植物的 系 统 发 生 关 系。 N aka i 等[ 35 ] 用 RA PD 和 PCR 2R FL P 的方法分析了产于日本不同地 区的淫羊藿属 ( Ep im ed ium ) 8 种植物的遗传 距离, 重建了这些物种的系统发生树, 并认为 分子标记将是该属植物药材品质鉴定的一种 有效方法[ 35 ]。吴弢等[ 36 ] 还对几种山麦冬属植 物进行了 RA PD 分析, 为这几种植物的分类 地位提供了佐证, 并为准确鉴定麦冬类药材 提供了分子遗传学方面的依据。马小军等[ 37 ] 用毛细管 PCR 方法对人参和西洋参进行了 [ 38 ] RA PD 指纹图谱分析。 M izukam i 等 依据 3 种限制性内切酶的 R FL P 结果, 把分布在日 本的三岛柴胡分为两组, 这与形态学、细胞学 和化学成分的研究结果一致。 在对苍术类 (R h izom a A t ractylod is ) 3 种原植物的研究 中, 同样得到可以区别 3 种苍术的 R FL P 图 谱[ 39 ]。最近还有人用 RA PD 方法对贝母类原

区的珊瑚菜, 结果表明, 这些种群的遗传分化 很 小, 以 致 于 用 水 稻 的 rDNA 作 探 针 的 R FL P 分 析 不 能 检 测 到 其 间 的 差 异。 而 H PL C 检测出不同产地珊瑚菜的化学成分有 一定区别。 在对药用植物品种的鉴别上, K i2

植物和党参的道地性进行了探讨。 3  分子标记在中药鉴定及质量控制实践中 存在的问题 自 90 年代初以来, 国内外已有许多有关 用 DNA 分子标记方法鉴别中药材品种的报

[ 30 ] tanaka 等 还用 RA PD 方法区分出人参、西

道, 虽涉及多种动植物药材, 但更多的是对原 动、植物的鉴定研究, 迄今 DNA 分子标记技 术尚未成为任何一种中药材品种鉴定的常规

洋参和人参与西洋参的杂种。当归分布广泛, 有许多变种, 不同变种间在形态等特征上有

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检测手段。 这不仅因为在实践中从药材或中 成药中提取高质量的 DNA 有一定困难, 或 由于所选用的分子标记在该生物种内的遗传 变异较大[ 40 ] , 更主要的是由于现今已报道过 的 DNA 分子标记鉴别方法其本身尚未推广

剂至少 50 元g 样, 这尚不包括 DNA 提取和 PCR 扩增的费用, 而且实验操作复杂, 任何 少量的 DNA 污染 ( 如空气中的花粉、孢子和 细菌, 操作人员的头屑等) 都会造成假阳性扩 增, 致使测序的片段来自 DNA 污染物, 出现

应用。 已报道的中药材分子标记鉴别方法可归 纳为三类: ( 1) A P 2PCR 或 RA PD 标记, 两者 本质上是相同的, 即通过随机扩增多态性 DNA 的比较, 区分不同基源的药材。 实际上

鉴定错误。因此这种方法对人员素质、仪器设 备及经费的要求都比较高。 4  中药材品种高特异性鉴别引物的应用 王义权、周开亚等[ 16, 41, 42 ] 报道了中药材 品种鉴别的一种新方法—— PCR 鉴别技术。

这一方法出现后不久, 人们就注意到, 由于该 方法在扩增反应时要求的复性温度低 ( 通常 为 36℃) , 特异性不高, 结果容易受到多种因 素的影响, 在不同的实验室之间难以重复; 即 使在同一实验室内, 每次检测样品时, 都必须

该方法虽然也是以 PCR 反应为基础, 但在中 药鉴定中是一个新的实验设计思路, 通过对 正品药材及其伪、混淆品的某些 DNA 片段 的序列研究, 设计出高度特异性的正品药材 鉴别引物。 当有样品需要鉴定时, 提取 DNA

用已知的正品药材作为对照, 同时进行 DNA 提取、RA PD 扩增反应和电泳检测, 比较正 品药材与待检样品扩增产物电泳图谱的异同 才能进行鉴定; 实验中提取的 DNA 质量要 求高, 定量需要准确, 操作要求较严格, 检验 成本相对较高, 因此不易推广。 ( 2) R FL P 分

后, 用 鉴 别 引 物 对 样 品 的 DNA 进 行 一 次 PCR 反应, 经电泳检测便可达到准确鉴别样 品真伪的目的, 检测时不需与已知正品药材 作 对照实验。 合成一对鉴别引物, 以 60bp 计, 约需 900 元人民币, 有 25~ 30 OD 值, 至

析, 要求 DNA 无显著的降解, 这一方法只适 用于新鲜动、植物材料的研究。 在药材的加 工、贮运过程中, DNA 一般均已严重降解, 因 此 R FL P 很难应用于药材的 DNA 分子标记

少可以鉴定 8000~ 10000 个样品。 一个样品 的 鉴 定 成 本 包 括 引 物、DNA 提 取 和 鉴 别 PCR 时 用 的 T aq 酶、dN T P s 等, 不 超 过 2 元, 使中药材 DNA 分子标记鉴别成本大大 降低。 由于鉴别 PCR 所用的是高特异性引

鉴别。 上述关于 R FL P 分析的报道, 均限于 对原 植 物 的 研 究。 虽 然 对 PCR 产 物 进 行 R FL P 分析 ( PCR 2R FL P ) 能在一定程度上克 服药材中 DNA 降解的困扰, 但 PCR 产物的 片段长度有限, 一般在 115kb 以下, 能够找

物, 鉴别 PCR 反应的复性温度高, 一般 DNA 的污染不会影响鉴定结果的正确性, 对实验 操作的要求也不十分高, 因此鉴别技术较易 掌握, 具有较大的实用价值。此方法可克服用 其他 DNA 分子标记鉴别技术进行药材分子

到的合适的限制性酶切位点数有限, 而且限 制性内切酶一般都较贵, 因此 PCR 2R FL P 的 应用目前仍有难度。( 3)DNA 测序, 可以通过 PCR , 用通用引物在已严重降解的药材 DNA 中扩增出特定的片段, 然后对这些片段进行

标记鉴别时存在的成本高、重现性不好、鉴别 程序复杂等实际问题, 使 DNA 分子标记鉴 别技术推广应用于药材鉴别成为可能。 目前 这一方法在用于金钱白花蛇及其伪品的鉴别 上已获成功。今后, 随着分子生物学技术的发

测序, 不论用何种测序方法对特定片段测序 其结果都有很高的可重复性, 鉴定的结果正 确可靠。不足之处是测序成本较高, 目前一个 约 400bp 的 DNA 片段人工测序所消耗的试

展, 将会出现更新而实用的中药材鉴别方法, 如新近发展的 DNA 芯片技术将有可能用于 中药材品种的鉴定, 使中药分子标记鉴定更 加简捷。

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197

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30  K itanaka S , Kun ish iM , T a ira T , et a l. G in 2

rDNA and va ria tion of essen tia l o il com po sition

seno side p roduction, tissue cu ltu re and induc2

in A tracty lod is p lan ts. B iol P ha rm B u ll, 1996,

tion of regenera tion of in tersp ecific hyb rid gin 2

19 ( 4) : 577

seng ( P anax g inseng × P. qu inquef olium ). N a tu ra l M ed icines, 1997, 51 ( 1) : 1

31 Koh jyoum a M , N aka jim a S, N am era A , et a l. R andom am p lified po lym o rp h ic DNA ana lysis

40  Shaw PC , N gan FN , B u t BBH , et a l. A u then 2 tica tion of Ch inese m edicina l m a teria ls by DNA techno logy. J F ood and D rug A na ly sis, 1997, 5 ( 4) : 273

and va ria tion of essen tia l o il com ponen ts of A 2

41 王义权, 周开亚, 徐珞珊等 1 中药材分子标记鉴

tracty lod es p lan ts. B iol P ha rm B u ll , 1997, 20

别新方法—— PCR 鉴别法 1 南京大学学报 ( 自

( 5) : 502

然科学版) , 1997, 33 ( 博士后专辑) : 136

32  Koh jyoum a M , Iida O , Yo sh ida N , et a l. R an 2

42 周开亚, 王义权, 徐珞珊等 1 蛇类药材的分子标

dom am p lified po lym o rp h ic DNA ana lysis of

记鉴别研究 1 中国学术期刊文摘, 1998, 4 ( 6 ) :

A ng elica acu tiloba and its va rieties. N a tu ra l

613

M ed icines, 1998, 52 ( 2) : 130

聚合物手性固定相的研究新进展

199

The Presen t Situa tion and Appl ica tion of the M olecular Iden tif ica tion of Ch inese M ed ic ina l M a ter ia ls W ang Y iquan 1 2

1, 3

 Zhou Ka iya 1  Xu L uo shan 2, 3  Ka rl T sim 3

D ep a rtm en t of B iology , N anj ing N orm a l U n iv ersity , N anj ing 210097;

D iv ision of P ha rm acog nosy , C h ina P ha rm aceu tica l U n iv ersity , N anj ing 210009; 3

D ep a rtm en t of B iology & B iotechnology R esea rch I nstitu te , H ong K ong U n iv ersity of S cience and T echnology , H ong K ong

Abstract T he app lica t ion of m o lecu la r genet ic m a rker to the au then t ica t ion of Ch inese crude d rug s is an im po rtan t a sp ect of m odern study of Ch inese t rad it iona l m ed icine, and it w ill be help fu l to so lve som e p rob lem s tha t encoun tered in the iden t ifica t ion of Ch inese m ed icina l m a teria ls. T h is a rt icle review ed the p resen t situa t ion and app lica t ion of the m o lecu 2 la r iden t ifica t ion of Ch inese m ed icina l m a teria ls and suggested tha t h igh ly sp ecific PCR iden 2 t ifica t ion is one of the app licab le DNA m o lecu la r iden t ifica t ion m ethod s fo r Ch inese m ed icina l m a teria ls. Key words Ch inese m ed icina l m a teria l M o lecu la r m a rker   Iden t ifica t ion ( 收稿: 1998212231)

聚合物手性固定相的研究新进展 郝卫强 刘文英 安登魁 ( 中国药科大学药物分析教研室 南京 210009)

摘 要 聚多糖、聚硅氧烷类、环糊精聚合物等作为聚合物手性固定相具有较高的手性拆分 能力和良好的耐用性, 而这些性质与聚合物结构密切相关。本文旨在通过对这种结构的研究, 有助 于研制出适合药物对映体分析的高效、价廉、适用范围广的手性色谱柱。 关键词 聚合物 手性固定相 手性拆分

  近年来, 对药物对映体的分析一直是药 学领域的研究热点。 目前常用的分析方法可 概括为两类: 一类是间接法, 即柱前手性衍生 化法; 另一类是直接法, 主要包括手性流动相 添加剂法和手性固定相法。其中, 手性固定相 法近年来发展尤为迅速, 在药学领域中的应 用日益广泛。 手性固定相法是利用手性固定相 (ch ira l

sta t iona ry p ha se, CSP ) 与药物对映体形成

暂时性非对映体复合物从而实现对映体分离 的方法。其中手性固定相性能的优劣, 将直接 决定最终的分离结果。 目前一些常用的手性 固定相, 如刷型手性固定相、环糊精手性固定 相、氨基酸手性固定相等多由小分子物质制 成, 由于易受流动相极性、酸碱性及温度等因 素的影响, 所能分离的药物对映体有限, 且分