•PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy

•Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację – zwielokrotnienie fragmentu DNA) •Jest to reakcja powielania (replikacji) DNA w próbówce •Częściowo uniezależnia nas od klonowania molekularnego

Metoda PCR naśladuje replikację DNA in vivo: replikacja in vivo 1. powstają widełki replikacyjne (przy udziale białek następuje lokalne rozplecenie DNA) 2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3’, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5'  3 3. startery RNA wiążą się specyficznie na zasadzie komplementarności z określonymi miejscami na obydwu niciach 4. polimeraza DNA wydłuża końce starterów syntetyzując jedną nić w sposób ciągły, a drugą jako tzw. pasmo opóźnione

cykliczne powielanie DNA w próbówce 1. ssDNA uzyskuje się ogrzewając DNA dwuniciowe (dsDNA) matrycowe do temperatury ok. 94-100C 2. polimeraza DNA wymaga wolnych końców 3’, aby zapoczątkować syntezę nowej nici w kierunku 5'  3’ 3. Startery są dostarczanie w postaci z syntetycznych oligonukleotydowych fragmentów DNA. Ponieważ są syntetyczne dobiera się je tak, aby otaczały odcinek DNA, który ma być powielony. Startery przyłączają się do ss DNA na zasadzie komplementarności pod wpływem obniżenia temperatury. To oznacza że musimy częściowo znać sekwencję (kolejność nt) w powielanym fragmencie DNA) 4. Termostabilna polimeraza DNA wydłuża startery na końcach 3’

W każdym cyklu liczba cząsteczek syntetyzowanego DNA jest podwajana – uzyskane kopie stanowią matrycę w kolejnych rundach amplifikacji. Efektem replikacji DNA techniką PCR jest więc amplifikacja (zwielokrotnienie) specyficznego obszaru DNA.

Pierwsze zamierzone produkty amplifikacji powstają w trzecim cyklu reakcji

Typowy schemat reakcji PCR jest więc szeregiem powtarzanych cykli złożonych z następujących etapów: •denaturacji DNA (30 sek.-5 min.; 94-96C)

•przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów (15 sek.-1 min.; 50-65C)

Temperatura ( C)

•wydłużania (elongacji) starterów (syntezy DNA) (68-75C)

95 3-5’ 60’’

72 45

30’’

30’’ 30’’

5-7’

60’’ 30’’

4

30’’

20-40x Czas

Reakcję przeprowadza się w specjalnym aparacie zwanym termocyklerem (ang. thermal cycler), w którym programuje się temperaturę i czas trwania poszczególnych etapów reakcji oraz liczbę cykli

Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: •dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) •dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji

•dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej tj.: stężenia dNTP, polimerazy, starterów, magnezu

Warunki temperaturowe reakcji

Denaturacja •Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji •wstępna denaturacja - ogrzewanie DNA przez okres 3-5 min w temp. 9496C jest wystarczające do denaturacji genomowego DNA •opcjonalnie etapy denaturacji w kolejnych cyklach mogą być krótsze i przebiegać w niższej temperaturze

Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów •czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min •jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR •temperatura przyłączania starterów powinna być o 5C niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (Tm). Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej komplementarności Istnieje wiele wzorów na obliczenie temperatury topnienia starterów. Do najprostszych, a zarazem najczęściej używanych należy wzór:

Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] (C) Optymalna temperatura przyłączania starterów najczęściej dobierana jest eksperymentalnie

Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera •zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi 72-75C (szybkość przyłączania nowych nukleotydów 100 nt/s) •przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min.

Temperatura elongacji startera c. d. •obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość syntezy np. już przy 70C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok. 60 nt/s. •obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub wówczas gdy amplifikowany fragment będzie klonowany do wektorów ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury 6068C i wydłużamy czas elongacji.

•Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i wydłużania starterów. Jest to tzw. dwustopniowy PCR

Ilość cykli w reakcji PCR •wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA. Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się 40- 50 cykli •teoretyczna wydajność reakcji po “n” cyklach wynosi 2n dwuniciowych, specyficznych cząsteczek DNA

•rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek ilości dNTP, zmniejszenie aktywności polimerazy).

Składniki reakcji PCR •matrycowe DNA •startery

•termostabilna polimeraza DNA •odpowiedni bufor reakcyjny

•jony magnezu •mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dNTP)

Startery •długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad, a temp. ich topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od 45-65C •opcjonalnie: jeśli amplifikowane produkty mają wielkość kilkuset pz startery mogą być nieco krótsze (16-18 nt), dla fragmentów rzędu kilku kpz startery powinny być dłuższe (24 i więcej nt)

•startery mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, najczęstsze modyfikacje to: znakowanie fluorochromami, biotyną, digoksgeniną czy wbudowywanie tionukleotydów

Parametry dobrego startera •powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch identycznych 20 nt starterów wynosi 420 czyli 1099511627776. Oznacza to, że sekwencja danego startera występuje raz na 1012 nukleotydów. Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich starterów w genomie. •obecność na 3’ końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 nt objawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak – AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. –ATATAT-.

Primery c. d. starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temperatura działania polimerazy

• wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT niemożliwe jest jego spełnienie • przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż amplifikowana matryca •nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów •nie powinny zawierać w części 3’ końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera

•odległość między starterami w amplifikowanym DNA powinna wynosić od 0.1 do kilku kpz, ponieważ... •Większość „standardowych” polimeraz używanych w reakcji PCR wydajnie amplifikuje fragmenty do kilku tysięcy nukleotydów. •Amplifikacja dłuższych fragmentów wymaga użycia specjalnie przystosowanych polimeraz lub ich mieszanin, a także specyficznych warunków amplifikacji.

Startery c. d. •robocze stężenie każdego z primerów w mieszaninie reakcyjnej

stanowi molowy nadmiar w

wynosi od 0,2 - 0,4 M i stosunku do ilości moli matrycy!

•stężenie 1M odpowiada ilości 1pmola startera w 1l roztworu

Bufor reakcyjny •bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest dostarczany razem z polimerazą

•stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej •w buforze obecne są również jednowartościowe jony w postaci KCl, ich standardowe stężenie wynosi ok. 50mM i umożliwia amplifikację fragmentów o wielkości powyżej 500pz. Większe stężenie soli (70100mM) poprawia amplifikację fragmentów poniżej 500pz

Jony dwuwartościowe •wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych kationów, zwykle są to jony Mg+2, ale niektóre polimerazy działają również po dodaniu jonów Mn+2

•ilość cząsteczek Mg+2 musi przewyższać ilość grup fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ zarówno wolne nukleotydy jak i startery wiążą jony Mg+2

•końcowe stężenie Mg+2 wynosi zwykle od 0,5 do 5 mM

Deoksynukleotydy (dNTP)

•stosowany mix dNTP powinien zawierać nukleotydów dATP, dTTP, dCTP i dGTP

równe

ilości

czterech

•końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250M (w objętości 50l jest to ilość dNTP wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 g DNA) •Wysokie stężenie dNTP (>4 mM) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie poprzez wiązanie jonów Mg+2. •Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pM-20 M)

Polimerazy DNA Pierwszym enzymem używanym w reakcji PCR był fragment Klenowa DNA Polimerazy I E. coli. Nie jest to jednak enzym odporny na działanie wysokiej temperatury i w każdym cyklu reakcji zdenaturowane cząsteczki enzymu musiały być zastępowane nowymi.

Termostabilne Polimerazy DNA •termostabilna polimeraza Taq wyizolowana z Thermus aquaticus (obecnie powszechnie dostępna jako rekombinowana)

•polimeraza Taq i jej pochodne nie posiadają aktywności egzonukleazy 3’5’ (tzw. sprawdzającej) - ilość błędnie wstawianych nukleotydów jest dość wysoka (większa niż w procesie replikacji DNA) i wynosi 2 x 10-4 do 2 x 10-5. •Produkty amplifikacji z użyciem polimerazy Taq mają charakterystyczne zakończenia

•Polimeraza Pfu (Pyrococcus furiosus) •charakteryzuje się bardzo niską częstość wstawiania błędnych nukleotydów (1.6x10-6-7x10-7) •ze względu na aktywność sprawdzającą wymaga ona dłuższego czasu działania (ok. 1.5-2 min/kpz). Optymalna temperatura działania to ok. 75C. Polimeraza Pfu zachowuje 95% aktywności po godzinnej inkubacji w 98C •produkt PCR amplifikowany polimerazą Pfu posiada tępe końce

•Polimeraza Tth (Thermus thermophilus)

•posiada zdolność odwrotnej transkrypcji tj. przepisywania cząsteczek RNA o długości do 1000 nukleotydów na DNA, w obecności jonów Mn+2. W obecności jonów Mg+2 jest polimerazą DNA i amplifikuje cząsteczki DNA w reakcji PCR. •Aktywność odwrotnej transkryptazy (RT) w podwyższonej temperaturze jest bardzo pożyteczna, gdyż pozwala uniknąć problemów związanych ze skomplikowaną budową przestrzenną cząsteczek np. RNA

•Polimeraza Deep Vent (Pyrococcus species GB-D) Deep Vent jest wyjątkowo stabilnym enzymem zarówno w wysokiej (480 min. w temp. 100C) jak i niskiej temperaturze. Ma zdolność do amplifikowania długich fragmentów DNA (do 14 kpz) – dużą procesywność Posiada aktywność sprawdzającą egzonukleazy. Amplifikacja fragmentów o długości powyżej 2 kpz wymaga zawsze większej ilości jonów magnezowych (powyżej 2mM).

•Long PCR Enzyme Mix Mieszanki różnych polimeraz, np. Taq i Deep Vent, w różnych proporcjach, tak aby zoptymalizować amplifikację długich fragmentów (do 200 kpz!!!)

1 - 40 kb PCR fragment 2 - 35 kb PCR fragment 3 - 30 kb PCR fragment 4 - 25 kb PCR fragment 5 - 20 kb PCR fragment

Czułość reakcji PCR •ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA).

•Ilość matrycy potrzebnej do wydajnej amplifikacji zależy od jej złożoności. Np. w 4kb plazmid niosącym 1 kb wstawkę interesujący nas „target” stanowi 25%. Dla porównania 1 kb „target” w genomie ludzkim (3.3 × 109bp) stanowi ok. 0.00003%. A zatem dla utrzymania tej samej ilości docelowego DNA matrycowego na starcie reakcji PCR należy użyć 1,000,000-razy więcej ludzkiego genomowego DNA niż plazmidu 1μg of 1kb dsDNA = 9.12 × 1011 molecules 1μg of pGEM® Vector DNA = 2.85 × 1011 molecules 1μg of lambda DNA = 1.9 × 1010 molecules 1μg of E. coli genomic DNA = 2 × 108 molecules

1μg of human genomic DNA = 3.04 × 105 molecules •Mała ilość matrycy – mała wydajność amplifikacji, zbyt duża ilość matrycy – niespecyficzna amplifikacja. •Jeśli to możliwe końcowe stężenie DNA w próbce powinno być rzędu ng.

Unikanie zanieczyszczeń w reakcji PCR •Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i reakcji PCR •Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety automatyczne powinny być używane tylko do określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)

Podstawowe zastosowania Biologia molekularna: •uzyskiwanie dużych ilości DNA np. do klonowania •znakowanie fragmentów DNA

•cykliczne sekwencjonowanie •analizy ekspresji genów (transkryptomu komórki)

Medycyna •diagnostyka np. chorób, polimorfizmu

Kryminalistyka i paleobiologia •powielanie DNA ze śladowych ilości materiału będącego matrycą do badań ze •identyfikacja organizmów – genotypowanie Wiele innych ..........................

Wybrane odmiany techniki PCR •Hot Start PCR – poprawia specyficzność amplifikacji fragmentu DNA •w reakcji PCR tempreatura jest głównym czynnikiem warunkującym specyficzność reakcji. W reakcji HotStart PCR przynajmniej jeden z substratów (Polimeraza, Mg+2, lub dNTP) jest nieobecny w mieszaninie reakcyjnej i dopiero po osiągnięciu wysokiej temperatury brak ten jest uzupełniany. •Opóźnienie reakcji można osiągnąć różnymi drogami. np. przez polimerazy do reakcji pod koniec początkowej denaturacji

dodanie

• inaktywacji polimerazy przez blokowanie jej centrum aktywnego przeciwciałami lub innymi ligandami. Ogrzewanie mieszaniny reakcyjnej w czasie wstępnej denaturacji powoduje denaturację termolabilnych substancji (przeciwciał, ligandów) i uwolnienie polimerazy.

Asymetryczny PCR •w reakcji używany jest jeden starter lub dwa w nierównych stężeniach •amplifikacji ulega tylko jedna nić •Stosowany np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania DNA

•Multipleksowy PCR Metoda ta polega na amplifikacji kilku regionów DNA w czasie jednej reakcji PCR. Reakcja ta wymaga użycia kilku par starterów o podobnej temperaturze topnienia tak by można było użyć jeden profil temperaturowy reakcji. Multipleksowy PCR jest wykorzystywany np. do diagnostyki osobników, gatunków czy chorób genetycznych.

•Real-Time PCR Reakcja PCR z wykrywaniem (detekcją) produktów amplifikacji w czasie rzeczywistym. Intensywność świecenia jest skorelowana z ilością odłączanego znacznika a zatem ilością powstającego produktu. W reakcji można wykorzystywać kilka sond wyznakowanych różnymi fluorochromami, co umożliwia obserwację amplifikacji różnych fragmentów DNA.

•Kolonijny PCR – matrycowe DNA pochodzi bezpośrednio z kolonii bakteryjnej, tkanki (bez etapu izolacji) •Zdegenerowany PCR – startery do reakcji amplifikacji fragmentu DNA projektujemy na podstawie sekwencji jego produktu białkowego – czyli uwzględniamy jedną z właściwości kodu genetycznego, którą jest jego zdegenerowanie