NUEVOS BLANCOS TERAPEUTICOS EN LEUCEMIA AGUDA PEDIATRICA: CARACTERIZACION DE LAS MUTACIONES DEL GEN FLT3

TRABAJOS ORIGINALES NUEVOS BLANCOS TERAPEUTICOS EN LEUCEMIA AGUDA PEDIATRICA: CARACTERIZACION DE LAS MUTACIONES DEL GEN FLT3 Dres. C. N. Alonso, P. L...
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TRABAJOS ORIGINALES

NUEVOS BLANCOS TERAPEUTICOS EN LEUCEMIA AGUDA PEDIATRICA: CARACTERIZACION DE LAS MUTACIONES DEL GEN FLT3 Dres. C. N. Alonso, P. L. Rubio Longo, S. Luppo, A. Medina, M. S. Gallego, M. J. Scopinaro, M. S. Felice RESUMEN

ABSTRACT

El tratamiento de elección para las leucemias agudas pediátricas es la quimioterapia convencional, que ha permitido obtener tasas de sobrevida que actualmente parecen difíciles de superar. En los últimos años se han intensificado las investigaciones dirigidas a descubrir nuevos blancos terapéuticos, entre los que se encuentra el receptor FLT3. Los blastos leucémicos pueden presentar formas mutadas de dicho receptor, siendo las más frecuentes mutaciones internas en tándem (FLT3-ITD) y mutaciones puntuales en la zona de activación (FLT3-ALM). Objetivos: Poner a punto la detección de mutaciones de FLT3, analizar su prevalencia en nuestra población de pacientes con diagnóstico de Leucemia Mieloblástica Aguda (LMA) o de Leucemia Linfoblástica Aguda en Infantes (LLA-I), y evaluar su asociación con parámetros clínicos y de laboratorio. Pacientes y Método: El estudio de las mutaciones se realizó por RT-PCR, en un total de 122 pacientes (92 LMA y 30 LLA-I). Resultados: Se detectaron mutaciones en el 15,2% de las LMA y en 10% de las LLA-I. La prevalencia de las FLT3-ITD mostró un aumento gradual con la edad de los pacientes, y la media de edad fue significativamente mayor. Con respecto a asociaciones con recuentos leucocitarios, alteraciones genéticas, subtipos FAB y valor pronóstico, si bien hubo diferencias, éstas no fueron significativas. Conclusiones: Este es el primer estudio de mutaciones en FLT3 realizado en población pediátrica en nuestro país. La detección de estas mutaciones permitirá individualizar, en el futuro, a los niños candidatos a recibir drogas inhibidoras de FLT3, actualmente en desarrollo.

Chemotherapy is the conventional treatment for pediatric acute leukemia, achieving survival rates that seem difficult to further improve. Over the last years there has been an increasing concern in the detection of new therapeutic targets, and a good example of them is the FLT3 receptor. The leukemic cells may disclose mutant forms of these receptor, being the internal tandem duplications (FLT3-ITD) and activating loop mutations (FLT3-ALM) the two more frequent ones. Objectives: To search FLT3 mutations in our population of patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) and with Infant Acute Lymphoblastic Leukemia (I-ALL), to analyse their prevalence and to evaluate their association with clinical and laboratory parameters. Patients and method: FLT3 mutations were analyzed by RT-PCR in 122 patients (92 AML and 30 I-ALL). Results: Mutations were detected in 15,2% of AML and 10% of I-ALL patients. The FLT3-ITD prevalence showed a gradual increase with the age of patients and the medium age of this group was significantly higher. Although we observed some differences respect to leukocyte counts, genetic aberrations, FAB subtypes and prognostic value, these differences were not statistically significant. Conclusions: This is the first study of FLT3 mutations in childhood leukemia in our country. The detection of these mutations will allow us -in a future- to identify children to be treated with developing FLT3-inhibitors drugs.

Palabras clave: LMA, LLA, pediatría, FLT3, duplicaciones internas en tándem, D835.

Key words: AML, ALL, children, FLT3, internal tandem duplications, D835. Medicina Infantil 2007; XIV: 116 - 123.

Medicina Infantil 2007; XIV: 116 - 123.

Servicios de Hemato-Oncología y Genética, Laboratorios de Biología Molecular y Citogenética. Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan. Correspondencia: Cristina Noemí Alonso Hospital de Pediatría Juan P. Garrahan. Combate de los Pozos 1881, Ciudad de Buenos Aires, (CP 1245). TE: 4308-4300 (Int. 1448)

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INTRODUCCION Los esquemas de tratamiento de leucemia aguda (LA) pediátrica basados en esquemas de quimioterapia tradicional han evolucionado notablemente en las últimas décadas, logrando mejorar las tasas de curación hasta llegar en la ac-

tualidad a valores de probabilidad de sobrevida libre de eventos (pSLE) de alrededor del 70% para leucemia linfoblástica aguda (LLA) en nuestra Institución 1. En leucemia mieloblástica aguda (LMA) la situación es diferente, ya que no más del 50% de los niños que la padecen logran curarse a pesar de la intensificación de los tratamientos aplicados 2,3. Por otro lado, existe un grupo especial de pacientes constituido por niños menores de un año (a los que nos referiremos como “infantes”) con diagnóstico de LLA (LLAI), que presentan características clínicas y alteraciones genéticas particulares, y también alcanzan valores de pSLE cercanos al 50% 4,5 . Los agentes quimioterápicos convencionales constituyen la herramienta terapéutica de elección para las LA, pero actualmente parece difícil poder mejorar aún más los resultados alcanzados utilizando el arsenal terapéutico disponible. Los avances crecientes en el conocimiento de los procesos moleculares involucrados en la fisiopatogenia de las leucemias han permitido, en los últimos años, orientar los esfuerzos hacia la búsqueda de drogas dirigidas específicamente contra nuevos blancos terapéuticos. La identificación de alteraciones genéticas en moléculas involucradas en el proceso leucemogénico permite utilizarlas como blanco de nuevas drogas, con el fin de lograr la erradicación selectiva de las células leucémicas. Uno de los ejemplos más difundidos de este tipo de terapias es el inhibidor de

tirosina-quinasa mesilato de Imatinib (STI-571, Glivec‚) que se utiliza con buena efectividad terapéutica, especialmente en leucemia mieloide crónica (LMC) 6-8. En este sentido, una de las moléculas que ha despertado mayor interés en los últimos años ha sido el receptor FLT3 (Receptor Tirosina-quinasa 3 similar a FMS) presente en los precursores hematopoyéticos normales de médula ósea. Dicho receptor se encuentra involucrado en el desarrollo de las stem cells (células madre), progenitores de linfocitos B, de células dendríticas y de células NK, entre otras. La unión de su ligando al dominio extracelular de FLT3 induce la dimerización de este receptor y la activación de sus dominios quinasa, su auto-fosforilación y posterior fosforilación de sus proteínas sustrato: STAT-5, PI3K, RAS, PLC, MAPK, ERK1/2, SHC, SHP2 y SHIP, todas ellas relacionadas con los mecanismos de proliferación, diferenciación y sobrevida de las células hematopoyéticas 9-10 (Figura 1). Tanto FLT3 como su ligando se encuentran sobre-expresados de manera aberrante en la mayoría de las LA pediátricas, incluyendo las LLA precursor B, las LLA-I, LMA y crisis blásticas de LMC. Además de estas alteraciones en los niveles de expresión del gen normal, muchas LA presentan mutaciones en el gen FLT3 que resultan en la activación constitutiva de este receptor; esto genera señales de proliferación anormal-

Figura 1: Vías de Señalización Intracelular de FLT3.

Nuevos blancos terapéuticos en leucemia pediátrica

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mente elevadas que se encuentran directamente asociadas al proceso leucemogénico 10 . Las mutaciones más frecuentemente encontradas son las duplicaciones internas en tándem (FLT3ITD) del dominio juxta-membrana del receptor, codificado por los exones 14 y 15 del gen FLT3. Dichas mutaciones resultan de la repetición en tándem de un número variable de pares de bases de la secuencia de FLT3 manteniendo el marco de lectura, dando como resultado una proteína de mayor longitud que la normal 11. El segundo tipo más frecuente de mutación involucra la zona de activación (FLT3-ALM: activating loop mutations) en el dominio tirosina-quinasa (TKD) de FLT3, codificada por el exón 20, y consiste fundamentalmente en mutaciones puntuales o deleciones que afectan al Aspartato o a la Isoleucina de las posiciones 835 (D835) y 836 (I836)12 (Figura 2). También se han descripto casos esporádicos de mutaciones puntuales en el dominio juxtamembrana y en la Serina de la posición 840 del TKD 13,14.

Figura 2: Representación esquemática de la estructura del receptor FLT3 y ubicación de las mutaciones más frecuentes.

En LMA pediátrica las mutaciones más frecuentes son las FLT3-ITD, con prevalencias que varían entre 10 y 17% en las distintas series publicadas y que se presentan con mayor frecuencia en los subtipos FAB-M3 y M5 15-17. Las FLT3ALM ocurren aproximadamente en un 8% de los pacientes, con lo cual ambos tipos de mutaciones afectan en conjunto a un 18-25% de las LMA pediátricas, representando una de las alteraciones moleculares más frecuentes en esta patolo-

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gía 18. Por otra parte, distintos estudios han demostrado el valor de las mutaciones en FLT3, especialmente las FLT3-ITD, como factor de riesgo adverso independiente 15,16,19,20. Con respecto a las LLA pediátricas, las frecuencias reportadas de mutaciones en FLT3 son muy bajas, excepto cuando se trata de leucemias de infantes con rearreglos del gen MLL, en las cuales se ha reportado hasta un 17% de FLT3ALM 21,22 . Teniendo en cuenta que aproximadamente un 70-80% de las LLA-I presentan alteraciones en el gen MLL, ellas constituyen otro grupo de especial interés para el estudio de mutaciones en FLT3. En la actualidad se han descripto varias drogas con capacidad inhibitoria sobre FLT3 demostrada tanto en estudios sobre líneas celulares como en modelos animales, entre ellas PKC412, AG1295, CT53518, CEP-701, SU5416, SU5614, SU11248 y MLN518. Los primeros ensayos clínicos en adultos presentan resultados preliminares promisorios y se proyecta realizar ensayos clínicos en niños 7,20,22,23. La expectativa se encuentra centrada en que la adición de drogas que inhiban en forma selectiva la actividad del receptor FLT3 mutado o sobre-expresado a los esquemas de quimioterapia clásica, permita aumentar la eficacia del tratamiento sin agregar efectos tóxicos no deseados. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar las frecuencias de mutaciones de FLT3 en nuestra población de pacientes con diagnóstico de LMA y LLA-I, así como también evaluar su asociación con distintos parámetros clínicos, de laboratorio y con el pronóstico, y realizar la puesta a punto de esta determinación para -en un futuro- individualizar a los pacientes que podrían beneficiarse con el tratamiento con drogas inhibidoras de FLT3. PACIENTES Y METODOS Población en Estudio La investigación de mutaciones de FLT3 se realizó en forma retrospectiva sobre muestras de pacientes con diagnóstico de LA ingresadas al Laboratorio de Biología Molecular del Servicio de Hemato-Oncología del Hospital de Pediatría Garrahan (HPG) entre los meses de Noviembre de 1999 y Agosto de 2006. En todos los casos el diagnóstico de LA fue realizado de acuerdo a los criterios internacionales de morfología, inmunofenotipo y citogenética previamente descriptos 24. Además, en el 65% de las LMA y en el 100% de las LLA-I se realizaron estudios moleculares para la detección por RT-PCR de uno o más de los genes de fusión BCR/ABL, TEL/AML1, E2A/PBX1, MLL/AF4, MLL/AF9, MLL/ENL, PML/RARα, AML1/ETO y/o CBFß/MYH11 25.

Para el presente análisis fueron excluidos los pacientes portadores de Síndrome de Down y aquellos con diagnóstico de Sarcoma Mieloide sin compromiso de médula ósea, con la finalidad de hacer más homogénea a la población estudiada. En todos los casos se obtuvo consentimiento de los padres o tutores para la realización de estudios moleculares. Detección de mutaciones de FLT3 El estudio de las mutaciones en el gen FLT3 se realizó sobre células mononucleares obtenidas por centrifugación con gradiente de densidad a partir de muestras de médula ósea, ó sangre periférica si el recuento leucocitario era mayor a 100x10 9/L, y preservadas a -80ºC hasta su utilización. Las mutaciones de FLT3 fueron estudiadas a partir de ADN copia (ADNc) en todos los casos. El RNA total correspondiente a 10x10 6 células mononucleares fue extraído utilizando el método de tiocianato de guanidina - fenol - cloroformo (Trizol, Invitrogen). La reacción de retrotranscripción fue realizada de acuerdo a lo descripto en el protocolo BIOMED-1 25, a partir de 1µg de RNA utilizando 0,25µg de hexámeros al azar, 200 U de Transcriptasa Reversa (MMLV, Promega), 40 U de inhibidor de RNAsas (RNAguard, Amersham Biosciences), en un volumen final de 20µl. Detección de FLT3-ITD: Se realizó por amplificación de los exones 14 y 15 del gen que abarcan los dominios transmembrana y juxtamembrana de FLT3, utilizando 1µl de ADNc y los primers R5: 5’-TGTCGAGCAGTACTCTAAACA-3’ (sense) y R6: 5’-ATCCTAGTACCTTCCCAAACTC3’ (antisense), en las condiciones descriptas en la literatura 11. La presencia de duplicaciones internas se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 9% y visualización a la luz UV previa tinción con Bromuro de Etidio. El Peso Molecular (PM) de la banda correspondiente al alelo normal fue de 366 pb (Figura 3); toda banda de mayor PM que el esperado fue escindida, eluída y secuenciada utilizando el equipo de secuenciación DyEnamic ET Terminator (Amersham Biosciences) y secuenciador automático de ADN (Modelo ABI-Prism 310; Applied Biosystem). Detección de FLT3-ALM: Se realizó amplificando por PCR el exón 20 del gen FLT3 con los primers 17F’: 5’-CGCCAGGAACGTGCTTGT-3’ (sense) y 17R’: 5’-CATTGCCCCTGACAACATAGT3’ (antisense), similares a los ya publicados 12, y posterior digestión del producto obtenido con la enzima de restricción EcoRV, que reconoce como sitio de corte a la secuencia normal correspondiente a los codones 835-836 de FLT3 (GA-

Figura 3: Detección de FLT3-ITD por RT-PCR. Electroforesis en gel de poliacrilamida del producto de amplificación del ADNc de FLT3 utilizando los primers R5 y R6. Calle PM, control de Peso Molecular; calles 1, 2, 4, 6 y 7 muestras de pacientes negativos; calles 3 y 5, muestras de pacientes positivos para FLT3-ITD; calle C, control de reactivos.

TATC). El producto de PCR tratado con EcoRV se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 9%, observándose la presencia de dos bandas de 67 y 37 pb correspondientes a la digestión del producto de PCR del alelo normal y/ó una única banda de 104 pb correspondiente al alelo mutado sin digerir (Figura 4).

Figura 4: Detección de FLT3-ALM por RT-PCR. Electroforesis en gel de poliacrilamida del producto de amplificación del ADNc de FLT3 utilizando los primers 17R’ y 17F’ y posterior digestión con EcoRV. Calle PM, control de Peso Molecular; calles 2, 3 y 4, muestras de pacientes negativos; calles 1 y 5, muestras de pacientes positivos para FLT3-ALM; calle C, control de reactivos.

Análisis Estadístico Las medianas de las variables continuas fueron comparadas utilizando el test de Mann-Whitney. Las variables categóricas fueron comparadas a través del test de Chi-cuadrado. La pSLE fue estimada a través del análisis de KaplanMeier 26 y las curvas de sobrevida fueron comparadas utilizando el test de log rank 27. Valores de probabilidades (p) mayores a 0,05 fueron considerados como no significativos. RESULTADOS Se analizaron muestras de 122 pacientes con diagnóstico de LMA (92) y LLA-I (30). La edad

Nuevos blancos terapéuticos en leucemia pediátrica

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promedio del grupo de LMA fue 6,8 años (rango: 15 días -16 años), incluyendo 22 pacientes menores de 1 año (LMA-I), de los cuales 11 (50%) presentaron alteraciones del gen MLL. La mediana del recuento leucocitario fue 18,8 x10 9/L y la media 71,2 (rango: 1,2-527,0) x10 9/L. La distribución de los 92 pacientes con LMA de acuerdo con los subtipos FAB fue la siguiente: M1 (n=2), M2 (n=16), M3 (n=16), M4 (n=15), M5 (n=29), M6 (n=3), M7 (n=5) y leucemias bifenotípicas (n=6) (Tabla 1). Con respecto a los pacientes con LLA-I, la mediana de edad fue 4,9 (rango: 0,6-12,0) meses, la mediana de recuento de leucocitos fue 126,0 (rango: 2,3–1.010,0) x10 9/L, y en 26 de ellos (87%) se observaron alteraciones del gen MLL (Tabla 2).

Se detectó la presencia de mutaciones FLT3ITD en 9 (9,8%) de 92 pacientes con diagnóstico de LMA, todos ellos mayores de 1 año, observándose además en todos los casos la expresión del alelo normal. La secuenciación de los productos de PCR de longitud mayor que la normal mostró la presencia de fragmentos duplicados en tándem, todos ellos derivados del exón 14. En 4 de los pacientes positivos para FLT3-ITD se observaron inserciones de 1, 4, 9 y 10 nucleótidos entre las regiones duplicadas. La longitud de los fragmentos duplicados varió entre 27 y 68 pb (mediana: 48 pb), y en todos los casos las mutaciones mantuvieron el marco de lectura. En el grupo de LLA-I no se detectaron FLT3-ITD.

TABLA 1: CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES CON LMA DE ACUERDO A LAS MUTACIONES EN EL GEN FLT3. Total

FLT3-no mutado

FLT3-ITD

FLT3-ALM

92

78

9

5

Edad mediana, años (rango)

6,6 (0,0-15,9)

6,1 (0,0-15,5)

12,7 (2,2-15,9)

5,8 (0,3-11,7)

Menores 1 año, n (%)

22 (23,9)

20 (25,6)

0

2 (40)

49/43

42/36

6/3

1/4

Rto. Leucocitario, mediana, x10 9/L (rango)

18,8 (1,2-527)

17,4 (7,8-500)

29,7 (2,0-180)

69,5 (1,2-527)

Alteraciones en MLL, n (%)

21 (22,8)

18 (23,1)

0

3 (60)

2 (2,2)

2 (2,2)

0

0

M2

16 (17,4)

13 (16,7)

2 (22,2)

1 (20,0)

M3

16 (17,4)

10 (12,8)

5 (55,6)

0

M4

15 (16,3)

16 (20,5)

1 (11,1)

0

M5

29 (31,5)

17 (21,8)

1 (11,1)

4 (80,0)

M6

3 (3,3)

3 (3,8)

0

0

M7

5 (5,4)

7 (9,0)

0

0

6 (6,5)

5 (6,4)

0

0

Nº Pacientes

Sexo, n, M/F

Subtipo FAB, n (%) M1

Bifenotípicas

TABLA 2: CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES CON LLA-I DE ACUERDO A LAS MUTACIONES EN EL GEN FLT3.

Nº Pacientes Edad mediana, meses (rango) Sexo, n, M/F Rto. Leucocitario, mediana, x10 9/L (rango) Alteraciones en MLL, n (%)

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Total

FLT3-no mutado

FLT3-ITD

FLT3-ALM

30

27

-

3

4,9 (0,6-12,0)

5,2 (1,4-12,0)

-

1,5 (0,6-4,9)

13/17

13/14

-

0/3

126,0 (2,3-1010,0)

136,0 (2,3-1010,0)

-

90,0 (16,9-990,0)

26 (86,7)

23 (85,1)

-

3 (100)

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Con respecto a las FLT3-ALM, fueron detectadas en 5 (5,4%) de 92 pacientes con LMA: 2 de 22 infantes (9,1%) y 3 de 70 niños mayores de un año (4,3%). En el grupo de LLA-I, 3 de 30 pacientes presentaron este tipo de mutación (10%). La caracterización de las mutaciones correspondientes se presenta en la Tabla 3. TABLA 3: CARACTERISTICAS DE LAS MUTACIONES FLT3-ALM. Designación

Descripción

n

D835H

Asp → His

3

D835Y

Asp → Tyr

2

D835A

Asp → Ala

1

D835E

Asp → Glu

1

∆836

Deleción Ile

1

Resumiendo, 14 de los 92 pacientes con LMA presentaron alguna de las dos mutaciones (9 FLT3-ITD + 5 FLT3-ALM), representando un 15,2% de los casos estudiados. La mediana de edad del grupo de FLT3-ITD fue significativamente mayor que las de los grupos FLT3-ALM (p=0,02) y FLT3-no mutado (p=0,004), observándose un aumento gradual en función de la edad, desde 0/22 pacientes en el grupo de LMA-I hasta 6/29 (21%) en la franja de 10-15 años (Figura 5). La mediana de recuento leucocitario del grupo FLT3-ITD fue mayor que la del grupo FLT3-no mutado, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa. Con respecto a los subtipos FAB, se observó una alta frecuencia de FLT3-ITD en el subtipo FAB-M3 (5/16: 31%). No hubo diferencias significativas en los valores de pSLE entre los distintos grupos analizados (p=0,88). En el grupo de LMA-M3, la pSLE fue de 68% para los pacientes que no presentaron mutaciones de FLT3 y de 40% para el grupo con FLT3-ITD, pero esta diferencia no resultó estadísticamente significativa (p=0,50) probablemente debido al número de pacientes evaluados.

Figura 5: Distribución de las frecuencias de mutaciones de FLT3(%) en LMA en los distintos grupos etáreos estudiados.

En el grupo de pacientes con diagnóstico de LLA-I no se observaron diferencias significativas en las medianas de edad, de recuento leucocitario o de presencia de alteraciones en el gen MLL entre los distintos grupos. Considerando a los 52 infantes en conjunto (LLA-I + LMA-I) (Tabla 4), no se observaron diferencias entre los recuentos leucocitarios ni entre las medianas de edad de los grupos. Al igual que lo observado para el grupo de LLA-I, tampoco se detectaron pacientes con FLT3-ITD en LMA-I. En cuanto a la presencia de FLT3-ALM, se observó en un total de 5 pacientes (9,6%), todos ellos con alteraciones en el gen MLL, aunque la asociación con esta anomalía no fue estadísticamente significativa. DISCUSION Las mutaciones de FLT3 constituyen una de las alteraciones más frecuentes en LMA y confieren a la célula que las presenta una ventaja proliferativa que -si bien está claramente relacionada con el proceso leucemogénico- no resulta suficiente para explicar el desarrollo de LA 28. En relación con estas observaciones, Gilliland 9 ha propuesto un modelo de leucemogénesis de 2 eventos, en el cual la aparición de la leucemia

TABLA 4: CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES MENORES DE UN AÑO (LLA-I + LMA-I) DE ACUERDO A LAS MUTACIONES EN EL GEN FLT3.

Nº Pacientes Edad mediana, meses (rango) Rto. Leucocitario, mediana, x10 9/L (rango) Alteraciones en MLL, n (%)

Total

FLT3-no mutado

FLT3-ITD

FLT3-ALM

52

47

-

5

4,9 (0,3-12,0)

5,0 (0,3-12,0)

-

4,0 (0,6-6,0)

122,5 (2,3-1.010,0)

116,0 (2,3-1.010)

-

136,0 (16,9-990,0)

37 (71,2)

32 (68,1)

-

5 (100)

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aguda es consecuencia de la existencia de por lo menos dos clases de mutaciones: una que confiera aumento anormal en su tasa de proliferación (las mutaciones de FLT3, BCR-ABL, RAS ó PDGFR son algunos ejemplos) y un segundo tipo de mutación que produzca el bloqueo en la diferenciación celular característico de esta patología (por ej. PML-RARα, AML1-ETO, CBFβMYH11 y rearreglos del gen MLL). De hecho, es habitual el hallazgo de LA con mutaciones de FLT3 acompañadas de otras alteraciones genéticas recurrentes, como las ya mencionadas. Los datos del presente estudio constituyen una primera evaluación de la incidencia de mutaciones de FLT3 en la población de niños con LMA y LLA-I del HPG. Nuestros resultados muestran que una alta proporción de los pacientes estudiados presenta algún tipo de mutaciones del gen FLT3 y que, por otra parte, la presencia de cada tipo de mutaciones fue mutuamente excluyente. La asociación de las mutaciones de FLT3 con altos recuentos leucocitarios está relacionada con los efectos proliferativos de las mismas, y contribuye a su mal pronóstico. Si bien nuestros resultados muestran una mediana de recuento de leucocitos más alta en los grupos de FLT3-ITD y FLT3-ALM, las diferencias no fueron significativas, lo cual probablemente se deba en parte al bajo número de pacientes analizado. Además, es importante tener presente que debido a que nuestro Hospital es un centro de derivación, la población de pacientes ingresados incluye un alto porcentaje de infantes, los cuales usualmente presentan LA con hiperleucocitosis. Como ejemplo, podemos decir que -mientras las LMAI representan normalmente un 1,5 a 2% del total de las LMA pediátricas- en nuestra serie corresponden a un 24% de los casos estudiados de LMA. Otra observación destacable es el aumento gradual de incidencia de las FLT3-ITD en función de la edad, no observándose ningún caso entre los infantes hasta llegar al 21% en los niños de la franja etárea de 10 a 15 años, que se encuentran en valores intermedios a los descriptos en adultos, quienes presentan valores cercanos al 30% 10,20. Con respecto a los grupos de infantes (LMAI y LLA-I), las frecuencias de pacientes con FLT3ALM fueron altamente similares y, además, en todos los casos dichos pacientes presentaron alteraciones del gen MLL. Sin embargo, la asociación entre las alteraciones de MLL y la presencia de FLT3-ALM no fue estadísticamente significativa, lo cual puede deberse no sólo al número de casos estudiados, sino también a que un alto porcentaje de infantes sin mutaciones en

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FLT3 presentan alteraciones de MLL (68%). Se postula que las alteraciones de MLL ocurren a nivel de los progenitores hematopoyéticos más inmaduros (stem cell), y es por esta razón que pueden presentarse tanto en LLA como en LMA. También se propone clasificar a estas leucemias como un sub-grupo especial, independientemente del fenotipo que presenten, como “leucemia MLL” y actualmente se han elaborado protocolos para este grupo de pacientes que incluyen elementos de los protocolos de tratamiento de LLA y de LMA 29. Según nuestro conocimiento, los resultados presentados constituyen el primer estudio de las mutaciones de FLT3 en la población pediátrica de nuestro país y, si bien coinciden con lo publicado en la literatura internacional, es necesario el análisis de un mayor número de casos para determinar su incidencia así como también el valor pronóstico de estas mutaciones. En los últimos años se han puesto a punto en el HPG las técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico de las translocaciones cromosómicas más frecuentes asociadas a LMA y LLA 30. La detección de los rearreglos genéticos producto de dichas translocaciones resulta en la actualidad prácticamente indispensable para el completo diagnóstico de las LA, ya que son utilizados como indicadores de grupo de riesgo del paciente, para la elección de su tratamiento y para la detección de enfermedad mínima residual. La incorporación del estudio de las mutaciones del gen FLT3 permitirá mejorar la caracterización molecular en las LA tratadas en el HPG, comprobar la prevalencia de dichas mutaciones, evaluar su utilidad como factor pronóstico de riesgo e individualizar a los niños candidatos a recibir -en un futuro- terapias complementarias con drogas inhibidoras de FLT3 aún no disponibles en Argentina, pero que ya se encuentran en estudio en ensayos clínicos en LA de adultos en centros internacionalmente reconocidos. Agradecimientos Este trabajo fue realizado en el marco de una Beca Carrillo-Oñativia 2006 de Iniciación a Nivel Hospitalario, CONAPRIS, Ministerio de Salud de la Nación. Agradecemos la colaboración de la Dra. Blanca Ozuna en el análisis estadístico de los datos.

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Nuevos blancos terapéuticos en leucemia pediátrica

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