Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Nucleic Acid Extraction Methods:  DNA Chapter 4

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Objectives  Compare and contrast organic, inorganic, and solid‐phase  approaches for DNA isolation.  Compare and contrast organic and solid‐phase approaches for  isolating total RNA.  Distinguish between the isolation of total RNA with that of  messenger RNA.  Describe the gel‐based, spectrophotometric, and fluorometric  methods used to determine the quantity and quality of DNA  and RNA preparations.  Calculate the concentration and yield of DNA and RNA from a  given nucleic acid preparation. Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Specimens        

Blood Buffy coat Bone marrow Solid tissue Lavage fluids Bacteria, viruses Fungi Organelles, mitochondria

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Specimen Preparation  Bone marrow, peripheral blood  Density gradient centrifugation  Differential osmolysis

 Tissue  Freeze/crush  Mince  Enzymatic digestion – proteinase K digestion

 Plants/fungi  Homogenize  Vortex with glass beads Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Isolation of DNA  Preparing the Sample  Nucleated Cells in Suspension (Blood and Bone Marrow Aspirates)  For differential density gradient centrifugation, whole blood or bone marrow  mixed with isotonic saline is overlaid with Ficoll. Upon centrifugation, the  mononuclear WBCs (the desired cells for isolation of nucleic acid) settle into a  layer in the Ficoll gradient that is below the less dense plasma components  and above the polymorphonuclear cells and RBCs.  For differential lysis (differential osmotic fragility), Incubation of whole blood  or bone marrow in hypotonic buffer or water will result in the lysis of the RBCs  before the WBCs. The WBCs are then pelleted by centrifugation, leaving the  empty RBC membranes (ghosts) and hemoglobin, respectively, in suspension  and solution.

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition



Preparing the Sample

Isolation of DNA

Tissue Samples  Grinding the frozen tissue in liquid nitrogen, homogenizing the tissue, or simply mincing the tissue using a  scalpel can disrupt whole tissue samples.  Fixed, embedded tissue may be  deparaffinized by soaking in xylene (a mixture of three isomers of  dimethylbenzene). Less toxic xylene substitutes, such as Histosolve, Anatech Pro‐Par, or ParaClear, are also  often used for this purpose. After xylene treatment, the tissue is usually rehydrated by soaking it in  decreasing concentrations of ethanol. Alternatively, fixed tissue may be used directly without dewaxing. 

Tissue Fixatives Influencing Nucleic Acid Quality



Fixative

            

10% buffered neutral formalin Acetone Zamboni’s Clarke’s Paraformaldehyde  Metharcan Formalin‐alcohol‐ acetic acid B‐5 Carnoy’s Zenker’s Bouin’s

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Relative Quality  of Nucleic Acid

Average Fragment  Size Range (kb)

Good

2.0–5.0

Good Not as good Not as good Not as good Not as good Not as good

2.0–5.0 0.2–2.0 0.8–1.0 0.2–5.0 0.7–1.5 1.0–4.0

less desirable less desirable less desirable less desirable

330

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Contaminant Organic compounds Phenol Protein Particulate matter

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Fluorometry 

DNA‐specific dye Hoechst 33258 { 2‐[2‐(4‐hydroxyphenyl)‐(6‐benzimida‐zol)]‐6‐(1‐ methyl‐4‐piperazyl)‐benzimidazol/.3HCl} . This dye combines with adenine‐ thymine base pairs in the minor groove of the DNA double helix and is thus  specific for intact double‐stranded DNA.



PicoGreen and OliGreen (Molecular Probes, Inc.) are other DNA‐specific dyes that  can be used for fluorometric quantification. Due to brighter fluorescence upon  binding to double‐stranded DNA, PicoGreen is more sensitive than Hoechst dye.



OliGreen is designed to bind to short pieces of single‐stranded DNA  (oligonucleotides). OliGreen will not fluoresce when bound to double‐stranded  DNA or RNA.



Fluorometry measurements require calibration of the instrument with a known  amount of standard before measurement of the sample.

Copyright © 2012 F.A. Davis Company

Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods and Clinical Applications Second Edition

Summary  DNA is extracted by organic, inorganic, and solid‐phase  methods.  DNA can also be extracted by more rapid methods or methods  designed for challenging specimens.  RNA extraction methods include organic and solid‐phase  methods.  mRNA can be specifically extracted using immobilized polyT or  polyU.  DNA and RNA concentration, yield, and purity are assessed  using gel analysis, spectrophotometry, or fluorometry. Copyright © 2012 F.A. Davis Company