NOCIONES DE MEMBRANA CELULAR

NOCIONES DE MEMBRANA CELULAR Las membranas celulares son estructuras dinámicas esenciales en todas las células. En las células procariotas (bacterias), la única membrana existente cumple la función de limitar a la célula frente al medio externo. En los eucariotas, la variedad de estructuras de membrana existentes permite que se clasifiquen en cinco grupos, de acuerdo a su función: • Barreras físicas entre compartimentos, que proveen un medio ambiente adecuado para que ocurran procesos biológicos con la máxima eficiencia. • Transporte de iones y moléculas entre compartimentos para mantener esos ambientes. • Transporte de moléculas por una variedad de mecanismos en los diferentes compartimentos para su procesamiento. • Receptoras

de

señales

químicas

y

transductoras

de

esas

señales

entre

compartimentos. • Productoras de energía y transductoras de esa energía entre compartimentos. Los organismos eucariotas, sumada a la membrana plasmática, tienen una variedad muy grande de membranas en el citoplasma (mitocondrias, retículo endoplasmático liso y rugoso, lisosomas, peroxisomas, aparato de Golgi, etc.). La membrana plasmática es una barrera semipermeable entre el interior y el exterior de la célula, lo que le permite mantener una condición homeostática apropiada para las reacciones bioquímicas necesarias para el sostenimiento de la vida. Esta semipermeabilidad implica selectividad en el pasaje de diferentes moléculas.

Composición de las Membranas Todas las membranas son de naturaleza anfipática, es decir tienen una estructura no polar (hidrofóbica) central, rodeada por dos capas polares (hidrofílicas) (Figura 1). La unidad básica tiene un grosor de 5 a 10 nm, siendo sus principales componentes: lípidos, proteínas y carbohidratos.

Universidad de Buenos Aires – Cátedra de Física Biológica – 2004

53

Curso de Física Biológica

Figura 1

Lípidos Las membranas están compuestas fundamentalmente por una bicapa lipídica, aunque pueden encontrarse, en menor grado, otras disposiciones (formas hexagonales o micelares). La bicapa se caracteriza por: • Ser permeable a pequeñas partículas no ionizadas, como glicerol, urea, agua, oxígeno y dióxido de carbono, y a todas las moléculas lipofílicas. • Proveer la estructura y el entorno apropiados para el funcionamiento de gran parte de las proteínas. La cantidad total de lípidos de la membrana se expresa normalmente como razón proteína-lípido, siendo generalmente mayor que 1, especialmente en las membranas metabólicamente activas, donde puede llegar a 4. No obstante, las membranas celulares tienden a tener mayor cantidad de lípidos que las membranas de las organelas, aunque solamente en las membranas ricas en mielina, el valor baja de 1. Generalmente los lípidos pueden dividirse en cuatro grandes grupos: • Ácidos grasos libres • Ésteres de ácidos grasos (triacilglicerol, fosfolípidos, etc.) • Isoprenoides (esteroles, etc.) • Glicolípidos Los fosfolípidos son el mayor componente lipídico, y con excepción de la mielina, representan más del 50% del total de la masa de lípidos de la membrana. Los glicolípidos y el colesterol están usualmente concentrados en la membrana plasmática de las células animales. Recientemente se ha determinado que algunos isoprenoides 54

Nociones de Membrana Celular

diferentes a los esteroles (derivados del farnesol, geranil-geranol, etc.) son importantes en el metabolismo celular. En la tabla siguiente se observan ejemplos de las cantidades porcentuales de cada tipo de lípido en la membrana de células de mamíferos.

Membrana

Fosfolípidos

Glicolípidos

Esteroles

Plasmática

50 - 60

5 - 17

15 - 22

Organelas

70 - 95

Ci

J e

Ci = conc. intracelular ; Ce = conc. extracelular ; e = espesor de la membrana Aplicando la ley de Fick:

J = −D

( Ci − Ce ) D = ( Ce − Ci ) = P ( Ce − Ci ) e e

Se denomina influjo al flujo de entrada a la célula y eflujo al flujo de salida de la célula. Si se representa en un par de ejes cartesianos el flujo (J) en función de la diferencia de concentraciones (Ce - Ci) se obtiene una recta que pasa por el origen de coordenadas. La pendiente de la misma es el coeficiente de permeabilidad. J T gα = P

(Ce - Ci)

Como no actúan sitios específicos en la membrana, no se produce saturación aún cuando haya grandes concentraciones de soluto. No obstante, la ley de Fick no es aplicable a partículas cargadas, ya que la tasa de difusión de estas partículas no está determinada únicamente por el gradiente de concentración, sino también por el potencial eléctrico (diferencia de potencial) existente a través de la membrana, tal como se verá más adelante. La velocidad del pasaje a través de una membrana para una sustancia determinada, se 68

Nociones de Membrana Celular

calcula como: V=J.A donde:

V = velocidad de flujo ;

J = flujo ;

A = área de contacto

La ley de Fick asume que no hay ninguna restricción impuesta a la molécula durante el pasaje a través de la membrana. No obstante, para cruzar la membrana las moléculas deberán disolverse en el corazón no polar de los ácidos grasos, lo que hará que las moléculas más hidrofóbicas, pasen más fácilmente. Esta facilidad para atravesar la membrana disolviéndose en la fase no polar, se conoce como liposolubilidad. Como la liposolubilidad de muchos compuestos orgánicos y la permeabilidad están relacionadas, puede establecerse si la sustancia atravesará o no la membrana por este medio, determinando el coeficiente de partición. Éste se determina colocando en un recipiente las dos fases inmiscibles entre sí (acuosa - orgánica), y luego agregando el soluto a investigar. Se determinan las concentraciones de soluto en ambas fases en equilibrio y se calcula como:

K=

solub. en fase orgánica solub. en fase acuosa

Siendo K = coeficiente de partición Si el valor es mayor que 1, la sustancia es liposoluble, si es menor, no será liposoluble. La teoría del enrejado explica adecuadamente la habilidad de muchas partículas no cargadas para difundir a través de las membranas. Esta teoría establece que la difusión ocurre por el movimiento de las partículas en vacancias producidas en la estructura de la capa lipídica, producidas por el movimiento aleatorio de los lípidos. Cuando la difusión lateral de los lípidos está aumentada (aumento de la temperatura o disminución del contenido de colesterol) aumenta el flujo de algunas sustancias. No obstante, esta teoría no sirve para interpretar la difusión de todas las moléculas a través de las membranas. El agua y los gases como el O2, CO2 y N2, cruzan la membrana a mayor velocidad de la esperada, lo que sugiere la existencia de poros en la membrana. Estos poros pueden estar formados por el reacomodamiento de los lípidos de la membrana o por proteínas transmembrana, que permitirían el paso de sustancias polares. Por ejemplo, el agua cruza a través de la membrana por poros proteicos 69

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llamados aguaporinas. Moléculas más grandes como azúcares, aminoácidos, y pequeñas partículas cargadas como Ca++, Na+, K+, e H+, no atraviesan la membrana por difusión simple o lo hacen muy lentamente, por lo que algunas teorías postulan la existencia de carga positiva dentro de estos poros. Se ha determinado experimentalmente que solamente sustancias de tamaño inferior a 8 Å atraviesan los poros.

Sustancia

Tamaño

Velocidad relativa de pasaje

Na+ hidratado

5,12 Å

1

agua

3Å

50.000.000

urea

3,6 Å

40.000.000

K+ hidratado

3,96 Å

100

Cl- hidratado

3,86 Å

36.000.000

glucosa

8,6 Å

0,4

Transporte mediado por transportadores Como las paredes lipídicas son impermeables a compuestos iónicos o polares, éstos deben atravesar las membranas con la ayuda de proteínas transportadoras específicas o “carriers”, embebidas en la bicapa lipídica. Las membranas diferirán en la permeabilidad a ciertos compuestos de acuerdo al tipo de proteína transportadora que posean. De acuerdo al gasto energético producido se clasifican en difusión facilitada y transporte activo.

El transporte mediado se diferencia significativamente de la difusión simple. Estas diferencias son: • Es altamente específico para diferentes moléculas e iones • Es más rápido • Presenta cinética de saturación, esto es, existe una máxima tasa de transporte cuando todos los transportadores están saturados La cinética de este proceso se describe por la ecuación de la catálisis enzimática: 70

Nociones de Membrana Celular

J = Jmax

[S ] Km + [ S ]

donde: J = Flujo ; Jmáx = Flujo máximo ; [S] = conc. de la sustancia a ser transportada Km = constante que depende del proceso enzimático correspondiente (carriers) Analizando esta expresión, vemos que: Si

[S] = 0

; J=0

[S] = Km ; J = Jmáx/2 [S] = ∞

; J

Jmáx

La representación gráfica mediante cuadro de valores da:

J

J max

∆c

donde: y = J y x = ∆C El transporte a través de transportadores puede ser pasivo o activo. El transporte pasivo por transportadores se conoce como difusión facilitada, y se produce cuando un

ion o molécula cruza la membrana “a favor” de su gradiente electroquímico o de concentración, hasta que se obtiene el equilibrio. No hay gasto energético, ya que la diferencia de energía libre (∆G) para este proceso es negativa por moverse “a favor” de su gradiente. Nótese que “a favor” del gradiente no implica el sentido matemático, sino desde donde hay mayor concentración hacia donde hay menor concentración. Básicamente pueden darse dos formas diferentes de transporte. En la primera (caso 1), el soluto se une al transportador en el exterior, es transportado, liberado en el interior, y 71

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luego el transportador vuelve al lado inicial.

Caso 1 Líq. Extracelular

Membrana

A (Soluto)

XA

XA

Transportador

X

X

Líq. Intracelular

A (Soluto)

En el segundo caso, el transportador no vuelve solo, sino que se ha unido a un soluto del lado interior de la membrana, que lo acompañará en su vuelta al lado externo.

Caso 2 Líq. Extracelular

Membrana

Líq. Intracelular

Ae

AeX

AeX

Ae

Bi

BiX

BiX

Bi

Para un mol de una sustancia, la energía libre se calcularía como: ∆G = -2.3 R T log [C2] / [C1] En el equilibrio, como ambas concentraciones son iguales, ∆G vale cero. Para sustancias cargadas, se debe tomar en consideración el gradiente de potencial eléctrico existente a través de la membrana, siendo entonces ∆G igual a: ∆G = -2.3 R T log [C2] / [C1] + z F ∆V donde: z = valencia del ion ; F = constante de Faraday ; ∆V = diferencia de potencial a través de la membrana Básicamente el mecanismo de transporte tiene cuatro etapas que son:

72

Nociones de Membrana Celular

• unión reversible del soluto a transportar a sitios específicos del transportador (receptores) • desplazamiento del par receptor-ligando hacia la superficie opuesta de la membrana • liberación del soluto • vuelta del sistema al estado inicial La cantidad de sustancia que atraviesa la membrana por este mecanismo depende de: • la diferencia de concentración del soluto a transportar entre ambos lados de la membrana • la cantidad de transportador disponible. Cuando se saturan los transportadores se alcanza un flujo máximo (Cinética de saturación) • la velocidad con que tiene lugar la unión y la separación entre el soluto y el transportador. A medida que aumenta la diferencia de concentraciones aumenta el flujo. A partir de una ∆C determinada, los transportadores se saturan y el flujo alcanza un valor constante, llamado flujo máximo. Cualquier aumento de concentración a partir de ese punto no traerá aparejado cambio alguno en el flujo. Este tipo de comportamiento obedece a la ecuación de Michaelis - Menten, como se observa en la representación gráfica. Diferentes sustancias como azúcares, aminoácidos y pequeños iones son transportados por difusión facilitada a través de las membranas. Un ejemplo es el transporte de glucosa a través de la pared del eritrocito desde el plasma sanguíneo hacia el interior de la célula. El transportador es una proteína estructural. La molécula de glucosa se une a un sitio específico en la superficie exterior de la proteína, e induce una modificación en la conformación del transportador que genera un “poro-exclusa” para que la glucosa unida a la proteína llegue al citosol. Los transportadores se caracterizan por tener una gran especificidad. Esto implica que sustancias muy parecidas al soluto transportado, no atraviesan la membrana por este medio. 73

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Estos mecanismos pueden ser activados o inhibidos por ciertas sustancias específicas. Por ejemplo, la insulina es capaz de aumentar la velocidad en el transporte de la glucosa de 7 a 10 veces, mientras que la ouabaína es utilizada para inhibir el funcionamiento de la bomba de Na+ y K+. El transporte activo (transporte activo primario), a diferencia de la difusión facilitada, usa energía metabólica para transportar iones o moléculas en contra de su gradiente electroquímico o de concentración. La permeabilidad selectiva de las membranas biológicas es importante en la homeostasis celular. La célula mantiene una alta concentración de K+ y una baja concentración de Na+, estableciendo gradientes iónicos que usará para conducir otros procesos de transporte. Así también, como el Ca++ es un importante segundo mensajero, su concentración intracelular se mantiene muy baja en la célula en reposo. Para mantener este medio iónico tan definido, la célula usa el transporte activo. Esto implica que la célula basa gran parte de su actividad en mantener el desequilibrio iónico. Este sistema consume más del 50% de la energía disponible, y es por lo tanto un factor muy importante en el metabolismo celular. El ion Na+ ingresa a la célula por flujo pasivo, mientras que el K+ sale al medio extracelular. Para que las concentraciones de Na+ y K+ permanezcan constantes, el flujo activo de cada ion debe ser igual pero de signo opuesto al correspondiente flujo pasivo. La bomba de Na+ y K+ mantiene constantes las concentraciones.

Intracelular

Extracelular J activo Na+

Na+ J pasivo Na+

Na+

J activo K+

K+

74

K+ J pasivo K+

Nociones de Membrana Celular

Por ejemplo, el transporte activo de Na+ y K+ a través de muchas células eucariotas es mediado por una proteína (PM 275.000 Dalton) llamada Adenosin Tri Fosfatasa Na+ K+ dependiente (ATPasa Na+K+), también conocida como bomba de Na+ y K+ , que envuelve directamente la hidrólisis del ATP. En la mayoría de las células en las que está presente “bombea” tres Na+ hacia el exterior de la célula, transportando simultáneamente dos K+ hacia el interior.

Medio Intracelular

Membrana

Medio Extracelular

3 Na+ ATP

ADP + Pi + Energía

2 K+

Se observan tres fenómenos simultáneos y acoplados: ingreso de dos K+, egreso de tres Na+, e hidrólisis del ATP a ADP + Pi + energía en el medio intracelular. Para la ocurrencia del fenómeno, los tres factores deben estar presentes. En ciertas células animales, la bomba es importante para general el potencial de la membrana, dada la facilidad con que el K+ tiende a salir de la célula a favor de su gradiente de concentración, favoreciendo que el interior de la membrana quede cargado negativamente. En el organismo hay otras bombas, como por ejemplo bombas de H+ en el epitelio del estómago, bomba de I en la glándula tiroides, bomba de Ca++ en el retículo sarcoplasmático muscular, bombas de Na+, Cl-, Ca++e H+en las células intestinales y en los túbulos renales, etc. La signología de ciertas patologías pueden afectar el mecanismo de la bomba, como por ejemplo la degeneración globosa producida por el virus aftoso, o la diarrea profusa en el 75

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enfermo de cólera. El mecanismo de cotransporte activo (transporte activo secundario) es aquél que implica el movimiento de una molécula a favor de su gradiente eléctrico o de concentración, acoplado al pasaje de otra molécula en contra de su gradiente de concentración. El cotransporte puede suceder tanto si la molécula transportada y el ion cotransportado se mueven en la misma dirección, como la absorción de glucosa y aminoácidos unidos a la entrada de Na+ en la luz intestinal, o en direcciones opuestas, como la entrada de Na+ unida a la salida de Ca++ en las células musculares cardíacas.

Actividad Eléctrica de la Membrana Introducción

Hay dos sistemas que operan a nivel supracelular para coordinar las acciones realizadas por células y tejidos. Éstos son el sistema endocrino y el sistema nervioso. Mientras que el primero se encuentra tanto en animales como en plantas, el sistema nervioso es exclusivo de los animales. Una diferencia de potencial eléctrico existe en todas las células vivas entre las caras externa e interna de la membrana celular. Esta diferencia de potencial se llama potencial de membrana en reposo, y, en la mayoría de las células, su valor se

encuentra entre -70 y -90 mV (con el lado interno negativo). El potencial en reposo resulta de la inequidad en la distribución de iones a ambos lados de la membrana, existiendo siempre un exceso de cationes por fuera de la célula. En un tipo especial de células animales, las llamadas células excitables, el potencial de membrana puede modificarse temporariamente de su valor de equilibrio, como respuesta a un estímulo dado. Esta respuesta se llama potencial de acción, que llega a valores aproximados de +30 mV, con el interior de la célula positivo con respecto al exterior. Este potencial puede transmitirse a través de la membrana plasmática de la célula, e inclusive pasar de una célula a otra. La transmisión de este potencial es la base del impulso nervioso.

76

Nociones de Membrana Celular

Concentración de iones en los líquidos intra y extracelular El líquido extracelular, fluido que se encuentra en el exterior de la membrana, se divide en varios tipos de acuerdo a su ubicación en el organismo. El líquido que baña a las células se conoce como intersticial, y se diferencia del vascular (discurre en los vasos del sistema circulatorio), en no tener proteínas ionizadas disueltas. Normalmente, los iones se distribuyen a ambos lados de la membrana (en estado estacionario) en forma particular, no equilibrada. Esto es, manteniéndose un desequilibrio entre las concentraciones de cada uno de los iones. Dentro de los iones que se encuentran en mayor cantidad en el líquido intersticial encontramos: Na+, Ca++, Cl- y HCO3-, mientras que en el líquido intracelular encontramos: K+, Mg++, PO4H- y aniones no difusibles, en general, proteicos.

Potencial de membrana en reposo El potencial de membrana en reposo está dado por una cantidad de cationes ubicados en el exterior de la célula, no compensados por el mismo número de aniones. El exceso de cationes no es detectable químicamente, ya que la diferencia es del orden de 1.10-6 en promedio. El pequeño desbalance iónico es suficiente para mantener el potencial de membrana, ya que la capacidad eléctrica de la membrana es baja. Varios mecanismos metabólicos mantienen el exceso de cationes afuera de la célula. Algunos de esos procesos son antagonistas entre sí, sin embargo, la actividad total resulta en el mantenimiento de un equilibrio estable. Tres procesos están implicados: • Bomba de Na+ y K+, que cotransporta Na+ hacia afuera y K+ hacia adentro de la célula, con hidrólisis de ATP. • Difusión pasiva de Na+ y K+, mecanismo opuesto a la bomba. • Difusión pasiva de otros iones, mayormente Cl-, como consecuencia de gradientes de potenciales electroquímicos generados por una variedad de mecanismos. El mantenimiento del potencial de membrana en reposo estable está determinado entonces por gradientes iónicos específicos, sumado a la permeabilidad selectiva de la membrana para los diferentes iones. 77

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Determinación experimental del potencial de membrana Básicamente se realiza un circuito formado por una célula que tendrá insertado un microelectrodo de vidrio con una aguja no mayor de 1µ lleno de solución concentrada de KCl, un osciloscopio y otro electrodo sumergido en el líquido que baña a la célula. Dado que los valores de potencial son del orden de mV (10-3V), se incorpora un amplificador que permite determinar esas pequeñas diferencias.

Pasaje de partículas cargadas Como hemos visto anteriormente, las partículas pequeñas no cargadas difunden a través de la membrana respondiendo a la Ley de Fick. Cuando las partículas son cargadas, no solamente atraviesan las membranas por diferencias de concentración, sino que también por diferencias de potencial. Esto se debe a que la membrana se comporta como un condensador plano, siendo cada cara una placa del condensador, y el espesor de la membrana, el espacio entre las placas. Los siguientes gráficos muestran como son los flujos para los iones mayoritarios.

78

Nociones de Membrana Celular

Para el Na+:

I

Na

-

+

+ + + + + + + + +

Na+

E

[Na+]e > [Na+]i

J (∆c) (Flujo debido a ∆c) J (∆v) (Flujo debido a ∆v) Jneto = J(∆c) + J(∆v)

Para el K+:

I

K+

-

+ + + + + + + +

E

K+

[K+]e < [K+]i

J (∆c) (Flujo debido a ∆c) J (∆v) (Flujo debido a ∆v) Jneto = J(∆c) - J(∆v)

Resumiendo: ∆ de Potencial

∆ de Concentración

Flujo Neto

Na+

Influjo

Influjo

Influjo

K+

Influjo

Eflujo

Eflujo

Cl-

Eflujo

Influjo

0

Ion

En el caso del Cl-, como el flujo neto es 0, se dice que el ion está en equilibrio pasivo. Entonces se denomina equilibrio pasivo al caso en que el flujo neto es nulo. Esto implica que no hay pasaje neto de iones y, en consecuencia, las concentraciones 79

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permanecen constantes. En términos físicos, el potencial de membrana en reposo, que es la diferencia de potencial que puede medirse a ambos lados de la membrana, puede ser asimilado a un potencial de difusión, pasible de ser estimado por las concentraciones en equilibrio de los iones, utilizando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz, que responde a:

[ [

] ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

+ + − RT ⎛⎜ Nai .PNa + + K i .PK + + Cle .PCl − E= ln F ⎜⎝ Nae+ .PNa + + K e+ .PK + + Cli− .PCl −

⎞ ⎟ ⎟ ⎠

donde: E = Potencial de membrana en reposo P = Coeficiente de permeabilidad para cada ion i = Concentración interna e = Concentración externa R = Constante de los gases T = Temperatura en grados K F = Constante de Faraday

En la práctica, solamente el Na+, K+ y Cl- tienen concentración suficiente o coeficientes de permeabilidad importantes para tener influencia en el valor final del potencial de membrana en reposo. La capacidad eléctrica de un capacitor (usualmente llamado condensador), se define como la razón de la carga eléctrica sobre la diferencia de potencial entre las caras. La bicapa lipídica actúa como un dieléctrico, separando los medios conductores intra y extracelular. La capacidad por cm2 de las membranas biológicas se estima en aproximadamente 10-6 Faradios (1 Faradio = 1 culombio / 1 voltio), lo que corresponde a una diferencia de concentraciones de 10-12 mol/cm2. Estas pequeñas diferencias de concentraciones son suficientes para originar una diferencia de potencial de 100 mVolt. Suele usarse los valores de permeabilidad relativa al K+ de los iones monovalentes, siendo: PK+ = 1 ; PNa + = 0.04 ; Pcl- = 0.45 Esta distribución iónica no homogénea entre los dos compartimentos separados por una membrana se mantiene alejada del equilibrio pasivo a causa de los procesos de 80

Nociones de Membrana Celular

transporte con gasto de energía (transporte activo). La membrana alcanza un estado estacionario cuando los flujos que tienden a alejar el sistema del equilibrio igualan a los flujos que tienden a llevarlo al equilibrio. De acuerdo a lo visto hasta ahora, los factores que influyen en la formación del potencial de membrana celular son en consecuencia los aniones no difusibles (como fosfato orgánico, sulfato y proteinatos), que juntamente con los iones difusibles tienden a mantener un equilibrio de Gibbs - Donnan (ver más adelante) y por otro lado la bomba de sodio y potasio, que aleja a la membrana del equilibrio pasivo. En el estado estacionario, el valor del potencial de membrana depende tanto de las concentraciones -

+

+

intra y extracelular de los iones Cl , Na y K como de sus respectivas permeabilidades. -

Si se analiza individualmente cada ion se comprueba que el Cl alcanza un equilibrio +

+

Gibbs - Donnan (pasivo), en tanto que el Na y el K se alejan de este equilibrio por la acción de mecanismos activos.

Potencial de equilibrio de un ion Se define como el valor del potencial de membrana tal que el ion se encuentre en equilibrio pasivo, o sea, que su flujo neto sea 0. El potencial de equilibrio puede tomar cualquier valor, dependiendo de la relación de concentraciones del ion a cada lado de la membrana. Puede calcularse por la Ecuación de Nernst:

[ ]. ⎞⎟ [ ]. ⎟⎟⎠

⎛ RT ⎜ C ln E= zF ⎜⎜ C ⎝

1

; siendo

2

E = potencial de equilibrio R = Constante de los gases T = Temperatura en grados K F = Constante de Faraday [96.500 Cb/mol] z = Carga relativa al electrón C1 y C2 = concentración intra y extracelular

Esta ecuación se obtiene al considerar que, en el equilibrio, actúan sobre el ion dos fuerzas opuestas de igual módulo, fuerzas eléctricas y fuerzas difusivas, que son iguales 81

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en magnitud, pero de distinto signo. -

Para el ion Cl se observa que el potencial de equilibrio, calculado por la ecuación de Nernst, coincide con el potencial de membrana en reposo medido en forma -

+

experimental. Es decir, el ion Cl se encuentra en equilibrio pasivo. El ion K tiene un potencial de equilibrio próximo al potencial de membrana en reposo, debido a su alta +

permeabilidad, mientras que el ion Na está más alejado de este valor. Ninguno de ellos se encuentran en equilibrio pasivo, merced a la acción de los transportes activos, mencionados anteriormente. Por otra parte debe recordarse que el valor modular del +

+

eflujo de K es menor que el correspondiente al Na , tal como se vio anteriormente. Cálculo de los trabajos eléctrico y difusivo en la obtención de la ecuación de Nernst

Trabajo realizado por las fuerzas eléctricas

∈ C1

-

+ + + + + + + + +

C2 J (∆v) C1 > C2 carga (+) 1 mol

Si una carga q está sometida a una diferencia de potencial V, el trabajo debido a las fuerzas eléctricas vale W = qV Considerando 1 mol de ion de carga positiva, que se traslade de C2 a C1, el trabajo de origen eléctrico se puede calcular como:

We = n . Z . F . E. = Z . F . E

Donde : We es el trabajo eléctrico [Joule] ; q es la carga = n . Z . F , siendo n el n° de moles y Z el equivalente de carga del ion ; F = 96.500 Cb/mol ; y E el potencial de 82

Nociones de Membrana Celular

equilibrio [en voltios]. Trabajo realizado por las fuerzas difusivas El proceso de difusión es un proceso irreversible para el cual no hay cálculo riguroso del trabajo realizado durante el mismo. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, puede ser considerado como la expansión isotérmica de un gas ideal. En este caso: Wd = R. T .ln

V2 V1

Se puede considerar que la concentración es igual al número de moles por unidad de volumen. Si tomamos un mol C = 1/V entonces: C1 =

1 V1

y

C2 =

1 V2

Reemplazando V por las concentraciones resulta: Wd = R . T . ln

C1 C2

En el equilibrio el J neto es nulo, y el trabajo de las fuerzas eléctricas es igual al trabajo de las fuerzas difusivas, o sea: We = Wd Reemplazando queda: Z . F . E = R . T . ln

C1 C2

Si se despeja se obtiene la Ecuación de Nernst: E=

R. T C1 ln Z . F C2

La ecuación de Nernst aplicada al caso específico de la membrana se expresa como: E=

R. T Ce ln Z . F Ci

donde Ce = concentración extracelular ; Ci = concentración intracelular Ejemplo: En el músculo esquelético se han determinado los valores de concentración de +

+

-

los iones Na , K y Cl , principales iones que intervienen en el valor del potencial de 83

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membrana en reposo, el valor del potencial de membrana, y el potencial de equilibrio calculado para cada ion con la ecuación de Nernst, como se observa en la tabla siguiente:

[Na+]

[K+]

[Cl-]

Em

E Na+

E K+

E Cl-

meq/l

meq/l

meq/l

(reposo)

(mV)

(mV)

(mV)

+ 56

- 105

- 90

(mV) Líq. Int.

13

140

3

Líq. Ext.

110

2,5

90

- 90

A 37ºC la ecuación se puede simplificar: E=

8,31 Joule . 310° K R . T Ce Ce ln = 2,3 log Z . F Ci Z . ° K . mol . 96.500 Cb / mol Ci

E=

0,061Volt Ce 61 mVolt Ce log = log Z Z Ci Ci

⎧Ce = 110 meq / l E Na + ⎨ ⎩ Ci = 13 meq / l

⎧ Ce = 2,5 meq / l E K+ ⎨ ⎩Ci = 140 meq / l

⎧Ce = 90 meq / l E Cl − ⎨ ⎩ Ci = 3 meq / l

84

∴ E Na + =

∴ E K+ =

61 mVolt 110 meq / l log = 56 mVolt 13 meq / l +1

61 mVolt 2,5 meq / l log = −105 mVolt 140 meq / l +1

∴ E Cl − =

61 mVolt 90 meq / l log = −90 mVolt 3 meq / l −1

Nociones de Membrana Celular

Equilibrio de Gibbs-Donnan Los experimentos llevados a cabo por Gibbs y Donnan en 1911, permitieron establecer la posibilidad de generar un potencial de membrana mediante transporte pasivo exclusivamente. En el experimento original, en una cubeta llena con agua destilada, y dividida en dos compartimentos por una membrana semipermeable selectiva, se incorporó a uno de ellos el colorante Rojo Congo, que se disocia en aniones (A-) y cationes Na+, y en el otro NaCl, que se disocia en iones Cl- y Na+. Los aniones del Rojo Congo no pueden difundir a través de la membrana, mientras que los pequeños iones Cl- y Na+ , así como el agua, pueden hacerlo en ambos sentidos.

I

Estado Inicial

ANa+ Agua

M E M B R A N A

II

ClNa+ Agua

Las dos restricciones que deben verificarse para que este equilibrio se cumpla son: • el anión A- no difunde a través de la membrana • no hay pasaje neto de cargas y se conserva la neutralidad eléctrica -

Una vez que se establece el equilibrio de distribución de iones se constata que el Cl y el +

Na se reparten en forma desigual entre las soluciones, a ambos lados de la membrana. -

La concentración de Cl es mayor en el compartimento II. La tendencia del anión no difusible a atravesar la membrana hace que se ubique sobre la cara de la misma, provocando una densidad de cargas negativas. Estas cargas negativas son equilibradas por cargas positivas de Na+, ubicadas sobre la otra cara de la membrana

(en

el

otro

compartimento).

Dada

la

electroneutralidad,

ambos 85

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compartimentos tiene carga neta 0. I

Estado Final

ANa+ Cl-

-

Agua

M E M B R A N A

+ + + +

II

Tal que: [Cl-]I < [Cl-]II [Na+]I > [Na+]II ClNa+ Agua

En el estado final, cuando se alcanza el equilibrio, se observan tres consecuencias: • El producto de las concentraciones de los iones difusibles a ambos lados de la membrana es igual. Esto se desprende de aplicar la ecuación de Nerst para cada ion,

ya que están en equilibrio pasivo, e igualarlas, de la siguiente forma: − + R. T [ Cl ] II R. T [ Na ] II E= = ln ln Z . F [ Cl − ] Z . F [ Na + ] I I

∴

− + R. T [ Cl ] I R. T [ Na ] II ln ln = F [ Cl − ] II F [ Na + ] I

[ Cl − ] I [ Na + ] II En consecuencia: = ó [ Cl − ] II [ Na + ] I

[Cl-]I . [Na+]I = [Cl-]II . [Na+]II

• Se origina un potencial de membrana. Esto se debe a la presencia del anión no difusible, que le da la polaridad al lado de la membrana donde se encuentra. Dado que es un equilibrio, puede ser calculado por la ecuación de Nerst. • Hay un desequilibrio osmótico. Se observa porque la suma de los iones del compartimento donde está el anión no difusible es mayor que en el otro. Si no existiera el ion no difusible en uno de los compartimentos, en el equilibrio se 86

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observarían iguales concentraciones de iones difusibles a ambos lados de la membrana y no habría potencial de membrana. Este equilibrio no se observa en el organismo, ya que una distribución de Gibbs-Donnan produciría un desequilibrio osmótico, que desembocaría en lisis celular. Es por ello que los mecanismos activos trabajan para mantener el desequilibrio iónico, manteniendo así también el volumen celular. Solamente se ha descripto este equilibrio en: • Líquido cefalorraquídeo • Fluidos edemáticos • Humor acuoso También se ha descripto este equilibrio entre un gel y una solución (sin que exista una membrana de promedio). Tal situación es como la que se presenta entre el líquido intersticial y el extracelular o vascular.

Gel

B A

Na+

Cl-

ACl-

Na+

Se cumple [Cl-]A × [Na+]A = [Cl-]B × [Na+]B

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Potencial de acción Se define potencial de acción como la serie de cambios físicos, químicos y eléctricos que sufre la membrana en respuesta a un estímulo umbral.

El potencial de acción se produce cuando, luego de un estímulo apropiado, la permeabilidad iónica de la membrana de una célula excitable se modifica. En particular canales específicos para el Na+ se abren en la membrana. Solamente las células excitables poseen estos canales. Los canales del Na+ son proteínas intrínsecas de la membrana que pueden existir en varias conformaciones, haciendo la membrana permeable o impermeable al Na+. Cuando los canales del Na+ se abren, ocurre un rápido influjo del ion, en contra del gradiente generado por la ATPasa. La entrada de

Na+ produce un exceso local de cargas positivas en el interior de la célula. Como consecuencia, la diferencia de potencial a ambos lados de la membrana plasmática se invierte, desde aproximadamente -70 mV hasta +30 mV. En términos fisiológicos, el potencial de membrana en reposo que es considerado polarizado, se despolariza cuando ocurre el potencial de acción. Los cambios producidos por la apertura de los canales específicos implican una modificación en la conductancia (inversa de la resistencia, medida en mhos) normal de la membrana para el ion Na+. Los cambios en el potencial de la membrana son los siguientes: • Aumento del potencial (despolarización de la membrana) • Inversión del potencial (positivización del potencial) • Disminución del potencial (repolarización de la membrana) • Período refractario (hiperpolarización) Cuando la membrana se encuentra en reposo, los canales específicos para el Na+ y el K+ están cerrados. Cualquier cambio sustancial en el potencial de la membrana puede activarlos, y comenzar la etapa de despolarización. Simultáneamente los iones Na+ empiezan a fluir masivamente hacia el interior de la célula (porque existe, según vimos, una diferencia de concentración tal que favorece su influjo), mientras que el ion K+ comienza a salir (siguiendo la diferencia de concentración que favorece el eflujo de K+). La diferencia radica en la cinética de apertura de estos canales, ya que una vez iniciado 88

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este proceso, la permeabilidad del ion Na+ aumenta en forma explosiva entre 0.5 y 1 mseg, mientras que la permeabilidad del K+ lo hace más paulatinamente. En el gráfico siguiente puede observarse los cambios producidos en una célula excitable tipo, cuando se ha desencadenado un potencial de acción, y las curvas de permeabilidad correspondientes al Na+ y al K+.

Gráfico del potencial de membrana en función del tiempo durante el Potencial de acción.

+

+

Curvas de permeabilidad para el Na y el K

Los cambios eléctricos que se producen en la membrana como consecuencia de los cambios de permeabilidad son una Despolarización, hay una positivización del potencial de la membrana pasando de un valor negativo a invertir su polaridad 89

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(potencial invertido); una Repolarización, donde el cierre de los canales específicos para el ion Na+ disminuye su permeabilidad, en tanto que los canales del ion K+ permanecen abiertos, difundiendo éste hacia el exterior de la membrana, y negativizándola; una Hiperpolarización, correspondiente al período donde la membrana llega a valores más negativos que los iniciales; y una etapa final, que podría llamarse de Normalización, donde el potencial llega a los valores iniciales. La etapa de Hiperpolarización es sumamente importante en la conducción del impulso nervioso, ya que es la que asegura que la conducción será en una sola dirección. Este potencial de acción generado en un punto de la membrana se transmite rápidamente en todas direcciones. Esto se debe a un feed-back positivo, ya que la despolarización causa la apertura de los canales de Na+ vecinos. Como las neuronas son estructuras fibrilares, la despolarización se propaga a lo largo de la fibra. Esta propagación se conoce como impulso nervioso. Los canales de Na+ están abiertos solamente 1 mseg. Al mismo tiempo se abren canales específicos de K+, también característicos de las membranas excitables. Así se produce una salida de K+, que restaura el potencial de la membrana en 2 a 3 mseg. Al final de este proceso los canales de K+ se cierran. Es importante notar que a pesar de que pequeñas modificaciones locales en las concentraciones iónicas son suficientes para producir las variaciones observadas en el potencial de membrana, la concentración total de iones se mantiene constante. Si el metabolismo en la fibra nerviosa cesara, la

membrana seguiría siendo capaz de transmitir aproximadamente de 50.000 a 1.000.000 de impulsos nerviosos. La razón de ellos es que las cantidades de iones Na+ y K+ que difunden con cada potencial de acción son muy pequeñas. A pesar de que el potencial de acción se transmite en todas direcciones, el efecto macroscópico observado implica que el impulso se mueve en una dirección definida. Esto ocurre porque los canales iónicos cuando se cierran no pueden abrirse inmediatamente por un período de tiempo llamado período refractario. Este período permite que se transmitan diversos impulsos nerviosos a través del mismo nervio con solamente milisegundos de diferencia. Para que el potencial de acción se produzca, debe producirse un estímulo. Este estímulo (físico, químico, mecánico, eléctrico, etc.) se llama umbral cuando eleva el potencial 90

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de membrana en reposo a valores tales (potencial umbral) que activen los mecanismos del potencial de acción. Si el estímulo no es suficiente, la modificación de potencial que se produce se llama potencial de generación. La respuesta celular a un estímulo umbral es siempre la misma. Esto se conoce como la Ley del Todo o Nada, que dice que la célula responde con un potencial de acción

exactamente igual frente a cualquier estímulo umbral o superior al umbral.

Canales iónicos Hodgkin y Huxley en 1952 demostraron la existencia de canales separados para el Na+ y el K+ , trabajando sobre axones gigantes de calamar. Estos experimentos permitieron establecer la especificidad de los canales, así como la posibilidad de inhibirlos específicamente con algunas sustancias. El movimiento del Na+ y el K+ ocurre a través de poros formados por proteínas en la membrana. Sin embargo, estos poros no son solamente agujeros lineales que atraviesan las proteínas, sino que llevan iones selectivamente. Se conocen también canales para el Ca++. Los canales pueden abrirse o cerrarse, esto es, actúan como compuertas que permiten el pasaje de iones en el momento adecuado. Una variedad de estímulos están envueltos en la regulación de la apertura y cierre de los canales. Algunos canales responden a diferencias de potencial a través de las membranas, y son llamados canales voltajedependientes (como los de Na+ y K+). Otros lo hacen a la unión de un ligando, y son

llamados ligando-dependientes. Estos incluyen a aquellos canales que están controlados por la unión de neurotransmisores extracelulares, y aquellos que están regulados por la unión de nucleótidos cíclicos intracelulares. La estructura molecular de los canales de Na+ y K+ son muy similares, con cuatro dominios específicos homólogos. Sin embargo, son altamente selectivos, tal que los de Na+ transportan este ion 11 veces más rápido que el K+, y los de K+ 100 veces más K+ que Na+. Se cree que la especificidad se basa en el tamaño del ion y en la necesidad de que los iones estén deshidratados para moverse a través de la membrana. El mecanismo de funcionamiento de los canales de Na+ parece deberse a la unión de 91

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este ion con un átomo de O2 en una región del poro, sumado a un residuo aminoacídico ácido que interactúa favorablemente con iones pequeños positivos como el Na+, dando una mayor velocidad de transporte que para el K+. El canal del K+ tiene un diámetro bastante menor que el del Na+ (0.3 vs. 0.5 nm), por lo que los iones más grandes son excluidos. No obstante, el ion Na+ tiene un diámetro menor que el K+, por lo que otros mecanismos deben estar envueltos. Ambos iones son pequeños y tienen alta densidad de carga, por lo que existen en solución en forma hidratada, unidos fuertemente a una molécula de agua. El mayor tamaño del K+ favorece su pasaje a través del poro dadas las características del mismo, recubierto por moléculas de O2. El Na+ por ser más pequeño no puede formar estas interacciones, y dado que su energía de hidratación es considerablemente mayor que el K+, le es más difícil arrastrar la molécula de H2O a través del poro. Los canales voltaje-dependientes tienen un “sensor de voltaje” que puede determinar cambios en el potencial de membrana. El mecanismo se debería a su estructura, con cargas positivas en parte de sus dominios concordantes con cargas negativas durante el reposo. La despolarización interferiría con el apareamiento de cargas, produciendo cambios conformacionales de los poros (“abriendo los poros”).

Transmisión sináptica El impulso nervioso se transmite de célula a célula a través del proceso que se conoce como transmisión sináptica. Este mecanismo es mediado por pequeñas moléculas llamadas neurotransmisores. El fenómeno puede suceder entre dos neuronas o entre una neurona y una célula muscular. En la sinapsis se observan tres componentes: • Terminación presináptica, limitada por la membrana presináptica, y conteniendo las vesículas sinápticas con los neurotransmisores • Espacio intersináptico • Membrana postsináptica, donde se localizan los neuroreceptores 92

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El mecanismo de acción es el siguiente. Cuando llega el impulso nervioso, la membrana presináptica se despolariza, abriéndose canales específicos para el Ca++, con la subsecuente entrada de Ca++ hacia el interior. El aumento del Ca++ intracelular induce la fusión de algunas membranas de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática, mediada por algunas proteínas especiales (sinaptogamina). Esta fusión produce la liberación de neurotransmisores al espacio intersináptico en un proceso de exocitosis. Los neurotransmisores difunden, y se unen a los receptores de la membrana postsináptica, estimulando la formación de un potencial de acción que se propaga por la célula receptora. La señal es destruida por destrucción enzimática del neurotransmisor o por captación del mismo por la membrana presináptica. Hay diversos tipos de neurotransmisores, sintetizados por diferentes tipos de neuronas. En el sistema nervioso los más importantes son: • catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) • acetilcolina • GABA ( ácido γ-aminobutírico) • histamina • serotonina La acción de los neurotransmisores no solamente puede favorecer la consecución del impulso nervioso, sino que también puede inhibir la transmisión. En este sentido, por ejemplo el GABA favorece la entrada de Cl- a la membrana postsináptica, haciéndola más negativa y, por ende, menos reactiva. Los receptores de la membrana postsináptica son proteínas integrales que se unen selectivamente al neurotransmisor, hormona u otro efector de la señal de transducción. Son sumamente específicos. Los neuroreceptores pueden dividirse en dos grupos de acuerdo a su estructura y modo de acción. Estos son: • Clase 1, que poseen un canal, lo que facilita el pasaje a través de la membrana, por lo que están asociados a respuestas rápidas a la unión de los neurotransmisores. • Clase 2, que no tienen canal, pero comunican la unión del neurotransmisor a un canal iónico separado, usualmente a través de segundos mensajeros como el AMP o 93

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el GMP, con respuestas más lentas. Un interesante ejemplo del efecto de los neurotransmisores sucede en los peces eléctricos. Una terminación nerviosa llega a un grupo de células especializadas llamadas electroplacas. Éstas, en número de 5000 en el pez torpedo, están conectadas entre sí como baterías en serie. De la estimulación se despolariza una sola membrana de cada célula, con una diferencia de potencial de 130 mV, lo que multiplicado por el número de células, llega a 650 voltios, cantidad suficiente para matar a un hombre. La especificidad de los receptores ha permitido descubrir sustancias antagonistas que actúan bloqueándolos, e impidiendo la unión del neurotransmisor.

Conducción nerviosa Como la unidad funcional de la transmisión nerviosa es el potencial de acción, la unidad morfológica es la neurona. Se la puede dividir en: • Soma o cuerpo celular • Dendritas o ramificaciones aferentes • Axón o ramificación eferente Mientras que cada neurona tiene muchas dendritas, solamente tiene un axón. A través de él se realizará la transmisión del impulso. Si el axón no está recubierto por mielina, cada potencial de acción actuará como estímulo de la porción contigua de membrana, propagándose entonces por contigüidad. La existencia de mielina, que recubre los axones, hace las veces de aislante, impidiendo el paso del impulso. En este caso existen una constricciones en la vaina de mielina, llamadas Nodos de Ranvier, que permite la propagación del potencial de acción. En este caso es entre nodos, llamada propagación saltatoria. Como la forma de llevar la información es siempre la misma, un único potencial de acción, las diferentes señales están determinadas solamente por la frecuencia del impulso, y de las conexiones que las neuronas establecen.

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Contracción muscular Está mediada por la transmisión del impulso nervioso a través de una terminación dendrítica especial llamada placa neuromuscular. En la célula muscular, el retículo sarcoplasmático actúa básicamente reteniendo y liberando Ca++ para que se produzcan las contracciones y relajaciones de las miofibrillas, en respuesta a los estímulos correspondientes. existen en el músculo canales específicos para el Ca++, voltajedependientes, que se abren en respuesta a la despolarización. Existen mediadores proteicos que aceleran el pasaje a través del sarcoplasma. Para la relajación del músculo esquelético se requiere la reabsorción del Ca++ a la luz del retículo sarcoplasmático. Este proceso es dependiente del ATP y de una bomba ATPasa de Ca++, en la membrana del retículo sarcoplasmático, llevando dos moléculas de Ca++ en contra del gradiente de concentración.

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Bibliografía "Tratado de Fisiología Médica" Guyton - Editorial Interamericana. "The fluid mosaic model of the structure of cell membranes" Singer y Nicholson - Vol 175, 720 - Science - 1972 "Transporte a través de la membrana celular" Garraham y Rega - Monografías de la OEA - Biología - N° 18 "Molecular Biology of Membranes. Structure and Functions" Petty - Ed.Plenum Press - 1993 "Cell Biology" Smith y Wood - Ed. Chapman y Hall - 1996 "Membrane Analysis" Graham y Higgins - Ed. Bios Scientific Publishers - 1997

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