UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
NATHALIE HELEN PAES BARRETO BORGES
N-FENILMALEIMIDAS: ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DA RESISTÊNCIA A DROGAS EM Staphylococcus aureus
JOÃO PESSOA – PB 2013
NATHALIE HELEN PAES BARRETO BORGES
N-FENILMALEIMIDAS: ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DA RESISTÊNCIA A DROGAS EM Staphylococcus aureus
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento aos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Produtos Naturais e sintéticos Bioativos, com área de concentração em Farmacologia
ORIENTADOR: Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior
JOÃO PESSOA – PB 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
NATHALIE HELEN PAES BARRETO BORGES
N-FENILMALEIMIDAS: ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULADORA DA RESISTÊNCIA A DROGAS EM Staphylococcus aureus
Dissertação de Mestrado avaliada em: ____/____/____
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________________________________ Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior ORIENTADOR
_______________________________________________ Prof. Dr. Luis Fernando Marques dos Santos MEMBRO INTERNO
_______________________________________________ Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio MEMBRO EXTERNO
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética de Microrganismos, do Departamento de Biologia Molecular, do Centro de Ciências Exatas e da Natureza da Universidade Federal da Paraíba, subvencionado pelo CNPq, CAPES e FAPESQ/PB
A Deus, aos meus pais, Rildo e Vera, e aos meus irmãos, Marcos e Eduardo.
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. José Pinto de Siqueira Júnior, pela oportunidade de voltar ao mundo da pesquisa científica, por todos os ensinamentos adquiridos nos últimos três anos, pelos momentos de descontração e principalmente pelas críticas construtivas. Ao Prof. Dr. Luis Fernando Marques dos Santos, querido e inesquecível professor de biologia celular, por me apresentar como possível futura orientanda de mestrado ao Professor Siqueira. À Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima, por nos “apresentar” às imidas cíclicas, com a disponibilização de materiais, de substâncias e por intermediar os primeiros contatos com Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho. Ao Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho, pesquisador do Núcleo de Investigações QuímicoFarmacêuticas, Universidade Vale do Itajaí (UNIVALI), pela disponibilização de todas as imidas cíclicas utilizadas no trabalho, além disso, por ter estado sempre disponível para tirar dúvidas via e-mail e fornecer materiais de estudo. Aos membros da banca, Profª. Drª. Edeltrudes, Professor Dr. Fábio Correia Sampaio e Prof. Dr. Luis Fernando, pela disponibilidade e contribuições. Aos técnicos de Laboratório de Genética de Microrganismos (LGM), Dona Severina e Sr. Bosco, por todo carinho e atenção, pelas conversas à toa que diminuía o estresse do dia-adia, dos experimentos culinários e do famoso (e delicioso) café de Sr. Bosco. Às integrantes do LGM, as meninas: Vivyanne Falcão, Suellen de Menezes, Isis Cirino, Cybelle Pereira,Taiz Siqueira, Jéssica Bezerra, Emanuelle Batista e Carolina Bassetto, por todos os ensinamentos de bancada, pelas orientações, disponibilidade, incentivo nos momentos difíceis e por todos os bons momentos. Aos meus queridos colegas da turma de mestrado, pelas trocas de experiência e de conhecimento, pelos momentos divertidos e também pelo apoio nos momentos mais complicados e estressantes. Aos amigos da graduação, principalmente a Jonathas Saldanha e Jéssica Celestino, pelo apoio, carinho e compreensão durante todo o curso do mestrado, sempre oferecendo ajuda quando era preciso.
À Juliana Moura Mendes, pela disponibilização de todos os materiais de estudo para a seleção de mestrado. Com certeza, sem eles seria mais difícil de obter aprovação. À minha família, pela educação, por todo o esforço, dedicação, preocupação nos estudos e, principalmente, pelo amor incondicional. A Mauro Castro, meu namorado, pelas palavras de motivação, otimismo, carinho e muita paciência nos momentos mais críticos. Aos funcionários do Departamento de Biologia Molecular, pela disponibilidade e convívio agradável. A Tânia e Caroline, secretárias do curso de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, pela ajuda, esclarecimentos e pelo apoio. Aos meus professores da Graduação (Farmácia e Análises Clínicas) e Pós-Graduação, por todos os ensinamentos, de sala de aula e de vida, que foram de grande importância na minha formação profissional e pessoal. À CAPES, ao CNPq e a FAPESQ-PB, pelo apoio financeiro para elaboração deste trabalho.
“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais inteligente, mas o que melhor se adapta às mudanças”.
RESUMO
Charles Darwin
RESUMO
BORGES, Nathalie Helen Paes Barreto. N-Fenilmaleimidas: atividade antibacteriana e moduladora da resistência a drogas em Staphylococcus aureus. 2013. 62 p. Dissertação (Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia), Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB.
Compostos derivados de vegetais ou animais têm sido cruciais na descoberta de drogas antiinfecciosas, e atualmente muitas drogas antimicrobianas sintéticas baseiam-se em modelos estruturais de substâncias de origem natural. Diversos compostos químicos, sintéticos e naturais, têm sido relatados como inibidores de bombas de efluxo, atuando como ferramentas adicionais importantes no desenvolvimento de fármacos co-formulados com os antibióticos apropriados. Neste trabalho foram avaliados sete N-Fenilmaleimidas (NFM), cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI), obtidas por síntese orgânica. Foram determinados os valores das concentrações inibitórias mínimas e bactericida (CIM e CBM) de N-Fenilmaleimidas, dos antibióticos e dos compostos NAB, pelo método da microdiluição em placa. Na atividade moduladora de drogas, as CIM dos antibióticos e compostos NAB foram determinadas na presença e ausência de concentrações subinibitórias das N-Fenilmaleimidas. Ambos os estudos foram complementados com análise in silico dos parâmetros ADMET. Os derivados 3,4-Cl-NFM, 4-Cl-NFM e 4-CH3-NFM mostraram atividade antibacteriana moderada, com CIM de até 64 µg/mL em cepas MSSA e MRSA. No ensaio da modulação da resistência a drogas, a 4-NO2-NFM reduziu em até 4 vezes a CIM dos antibióticos tetraciclina e eritromicina. A 4-CH3 NFM apresentou o melhor resultado, com redução da CIM dos antibióticos tetraciclina (até 4 vezes), eritromicina (até 16 vezes), alguns representantes das fluoroquinolonas (até 4 vezes) e compostos NAB (até 4 vezes). Ao reduzir a CIM do brometo de etídio, a 4-CH3 NFM é considerada de fato como inibidor putativo do sistema de efluxo em bactéria. Na análise da modelagem molecular, os derivados 3,4-Cl-NFM e 4-CH3 NFM, os quais apresentaram melhor atividade antibacteriana e moduladora da resistencia, respectivamente, mostraram um perfil com baixo risco tóxico teórico, resultado promissor para serem utilizados no desenho de novos derivados mais ativos e mais seguros. Os resultados aqui apresentaram mostram que derivados imídicos podem ser utilizados para potenciar o efeito de agentes antimicrobianos, de modo a facilitar a reintrodução de antibióticos atualmente ineficazes para o tratamento clínico de infecções multirresistentes.
Palavras-chave: Staphylococcus aureus, imidas cíclicas, Fenilmaleimidas, risco toxicológico
bombas
de efluxo,
N-
ABSTRACT
BORGES, Nathalie Helen Paes Barreto. N-Phenylmaleimides: antibacterial activity and modulator of drug resistance in Staphylococcus aureus. 2013. 62 p. Dissertação (Pósgraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa – PB.
Compounds derived from plants or animals have been instrumental in the discovery of antiinfective drugs, and now many synthetic antimicrobial drugs based on structural models of substances of natural origin. Several chemical compounds, natural and synthetic, have been reported as inhibitors of efflux pumps, acting as important additional tools in drug development co-formulated with appropriate antibiotics. In this study were evaluated seven N-Fenylmaleimides (NFM), gently assigned by Dr. Valdir Cechinel Filho (UNIVALI), obtained by organic synthesis. The values of the minimum inhibitory and bactericidal concentrations (MIC and MBC) of N-Fenylmaleimides (NFM), antibiotics and compounds NAB, by the broth microdilution method.Were determined the values of minimum inhibitory concentrations (MIC) of NFM, antibiotics and compounds NAB. In modulation of drug resistance, the MIC of the antibiotic compounds and NAB were determined in the presence and absence of subinibitory concentrations of NFM. Both studies were supplemented with analysis of in silico ADMET parameters. The derivatives 3,4-Cl-NFM, NFM-4-Cl and 4-CH3NFM showed moderate antibacterial activity with MIC of up to 64 µg/mL in MSSA and MRSA strains. In the assay of modulation of drug resistance, 4-NO2-NFM reduced by up to four times the MIC of the antibiotic tetracycline and erythromycin. The 4-CH3 NFM showed the best results, with a reduction in MIC of the antibiotics tetracycline (up to 4-fold), erythromycin (16-fold), some representatives of fluoroquinolones (up to 4-fold) and compounds NAB (up to 4 times). By reducing the MIC of ethidium bromide, 4-CH3 NFM is considered in fact as a putative inhibitor of the efflux system in bacteria. In the analysis of molecular modeling, derivatives 3,4-Cl-NFM and 4-CH3-NFM, improved antibacterial and modulator compounds respectively, showed a profile with low toxic risk theoretical profile since they are promising to be used in drawing new derivatives more active and safer. The results presented here show that imidic derivatives may be used to potentiate the effect of antimicrobial agents to facilitate reintroduction of antibiotics currently ineffective for the clinical treatment of multiresistant infections.
Keywords: Staphylococcus aureus, cyclic imides, efflux pumps, N-phenylmaleimides, toxicological risk
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desenvolvimento de antimicrobianos e aquisição de resistência
18
Figura 2 - Mecanismos de resistência a drogas em bactérias
21
Figura 3 - Diagrama esquemático de sistemas exportadores de drogas representativos em Gram-positiva
23
Figura 4 - Estrutura molecular de representantes de compostos sintéticos heterocíclicos
28
Figura 5 - Estrutura das principais subclasses das imidas cíclicas
29
Figura 6 - Estrutura da 2-etil-3-metil-maleimido-N-β-D-glucopiranosídeo na forma acetilada, isolada de Garcinia mangostana
29
Figura 7 - Estrutura molecular das maleimidas utilizadas no estudo
35
Figura 8 - Esquema das reações para obtenção de derivados maleicos
36
Figura 9 - Relação dos efeitos causados pelos derivados
37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - CIM e CBM das imidas cíclicas frente a cepas de S. aureus
38
Tabela 2 - Análise das propriedades fisico-quimicas teóricas das N-Fenilmaleimidas
40
Tabela 3 - CIM de N-Fenilmaleimidas e antibióticos em cepas que superexpressam bombas de efluxo
41
Tabela 4 - CIM dos antibióticos tetraciclina, eritromicina e norfloxacino na ausência e na presença de concentração subinibitória de clorpromazina (controle positivo) e N-fenilmaleimidas
42
Tabela 5 - CIM das fluoroquinolonas e compostos NAB na ausência e presença de clorpromazina, NFM e 4-CH3-NFM, respectivamente
44
Tabela 6 - Risco de toxicidade calculado das N-Fenilmaleimidas e de alguns antibióticos
45
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABC - Superfamília ATP binding cassette ADMET - Absorção, Distribuição, Metabolismo, Eliminação, Toxicidade AMPs - Peptídeos antimicrobianos ATCC - American Type Culture Collection BAB - Blood Agar Base BHI - Brain and Heart Infusion CBM - Concentração Bactericida Mínima CIM - Concentração Inibitória Mínima CPZ - Clorpromazina DMSO - Dimetilsulfóxido EPI - Efflux Pump Inhibitors MDR - Resistência múltipla as drogas MM - Massa Molar MRSA - Staphylococcus aureus resistente a meticilina MSF - Major Facilitator Superfamily MsrA - Proteína de efluxo para eritromicina MSSA - Staphylococcus aureus sensível a meticilina NAB - Nucleic acid binding nALD - Número de aceptores de Hidrogênio NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards nDLH - Número de doadores de Hidrogênio NFM - N-Fenilmaleimida NorA - Proteína de efluxo para fluoroquinolonas e outras substâncias Orf’s - Opened Read Frame Pgp - Glicoproteína-P PMF - Força Motriz Protônica RND - Resistance/Nodulation/Division SMR - Small Multidrug Resistance TetK - Proteína de efluxo para tetraciclina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................
15
2. REFERENCIAL TEÓRICO ................................................................................. 2.1 A era da resistência aos antibióticos................................................................... 2.2 Mecanismos de resistência bacteriana................................................................ 2.3 Bombas de efluxo (Proteínas transportadoras)................................................... 2.4 Inibidores de bomba de efluxo...................................................................... 2.5 Atividade antibacteriana de compostos heterocíclicos sintéticos................... 2.6 Imidas cíclicas........................................................................................... 2.7 Modelagem Molecular e Otimização dos Candidatos a Fármacos ...................
17 17 19 22 25 26 28 30
3. OBJETIVOS ......................................................................................................
33
4. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 4.1 Local de estudo.............................................................................................. 4.2 Linhagens de Staphylococcus aureus........................................................... 4.3 Agentes antimicrobianos e compostos NAB.............................................. 4.4 Imidas cíclicas.................................................................................................... 4.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)................................. 4.6 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)............................ 4.7 Avaliação da atividade moduladora da resistência a drogas............................. 4.8 Análise in silico dos parâmetros farmacocinéticos.....................................
34 34 34 34 35 36 36 37 37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................
38
6. CONCLUSÕES ....................................................................................................... 47 7. REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 48 8. ANEXOS ..............................................................................................................
62
Introdução
O número crescente de infecções e o surgimento de microrganismos cada vez mais resistentes a antibióticos tornam a química medicinal imprescindível para a saúde pública (CLARK, 2002; THOMAS, 2003). Desde o sucesso com a descoberta da penicilina por Alexander Fleming (1928), esforços foram gerados por parte do governo, empresas farmacêuticas, bem como por grupos de pesquisa acadêmicos, a fim de se descobrir outras fontes de compostos para o tratamento de infecções bacterianas (BUSH et al., 2007; WIDMER, 2008). Uma das bactérias de maior significado na clínica, Staphylococcus aureus tem sido historicamente reconhecida como importante causa de doenças no mundo e tornou-se o maior patógeno associado a infecções hospitalares e comunitárias (MOTAMEDI; MIRZABEIGI; SHIRALI, 2010). É considerada uma espécie versátil, capaz de ultrapassar o sistema de defesa do hospedeiro e de expressar diversos fatores de virulência, além de permitir o desenvolvimento de resistência de forma rápida, tornando ineficazes aqueles fármacos já utilizados na terapêutica (TRABULSI; ALTHERTUM, 2002). A taxa de mortalidade anual de infecções por S. aureus multiresistentes foi relatada como sendo maior em relação à morte causada devido a AIDS, tuberculose e hepatite viral (BOUCHER; COREY, 2008). As sérias consequências desta infecção levaram a medidas efetivas de prevenção (NOSKIN et al., 2005) e, de acordo com pesquisas anteriores, o período de hospitalização, procedimentos invasivos e a antibioticoterapia são considerados fatores de risco para infecções invasivas por MRSA – Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (OZTOPRAK et al., 2006), sendo quatro vezes mais susceptíveis do que em indivíduos colonizados
por MSSA
- Methicillin-sensitive Staphylococcus
aureus
(SAFDAR;
BRADLEY, 2008). O nível de mortalidade é crescente, de modo a atingir até 50% dos pacientes colonizados com cepas resistentes (WANG; CHEN; LIU, 2008). O surgimento da multirresistência bacteriana causou, na última década, redução significante em investimentos para a descoberta de novos agentes antimicrobianos, de modo que novas alternativas têm sido usadas no intuito de melhorar a atividade de drogas já existentes (BUSH et al., 2007; SWAIN; PAYNE; ROBERTS, 2007). Um dos campos promissores para o aumento da eficácia de agentes antimicrobianos é a combinação com compostos adjuvantes, a exemplo dos inibidores de bombas de efluxo (EPI – Efflux Pump Inhibitors), de modo a expandir a utilidade de antibióticos já existentes, bem como reduzir o surgimento de cepas mutantes (LYNCH, 2006). Diversos compostos de origem natural e
sintética já foram descobertos como efeito inibidor em bombas de efluxo distintas, muitos dos quais possuem baixa atividade antimicrobiana quando exposto sozinho, no entanto, podem apresentar excelente efeito adjuvante quando associados a antibióticos importantes, potencializando a ação destes frente a cepas resistentes. Dentre os fármacos de origem sintética, existem diversas classes de compostos orgânicos inseridos neste conjunto, dentre as quais se ressalta as imidas cíclicas. Esta classe inclui compostos de origem natural, bem como podem ser obtidos por síntese orgânica. São vastamente conhecidas por suas propriedades antiespasmolítica, antitumoral, antinociceptiva, antiinflamatória, analgésica e, principalmente, pelas atividades antibacteriana e antifúngica (AZIZ-ABDEL, 2007; CECHINEL-FILHO et al., 2003; CORREA et al., 1996; ORZESZKO; KAMINSKA; STAROSCIAK, 2002; PRADO, 2005; ZENTZ et al., 2002).
Fundamentação Teórica
2.1 A ERA DA RESISTENCIA AOS ANTIBIÓTICOS
No inicio do século XX, as doenças infecciosas foram a principal causa de morte em todo o mundo. Com o passar dos anos, as reduções na morbidade e mortalidade por infecções bacterianas foram atribuídas, principalmente, a introdução de agentes antimicrobianos (COHEN, 2000; GOLD; MOELLERING, 1996). Até o início do nosso século, mesmo com a diversidade de antibióticos disponíveis comercialmente, a mortalidade causada por bactérias continuava a crescer, seja em países favorecidos ou desfavorecidos economicamente, correspondendo em mais de 20% das mortes em todo o mundo (WHO, 2003). Apesar de o mundo vivenciar uma era de tecnologias avançadas e inovadoras para a elucidação do mecanismo de diversas patologias, bem como conceber molecularmente a descoberta de novas drogas, as doenças infecciosas continuam a ser um dos maiores desafios da área de saúde em todo o mundo. Os agentes antimicrobianos convencionais apresentam o inconveniente de permitir o desenvolvimento da resistência a drogas, sem mencionar os efeitos adversos ao organismo humano, o que leva a administração de doses elevadas, muitas vezes causando toxicidade intolerável (FERNEBRO, 2011; UHU; KWON, 2011). Alternativas para resolver problemas devido à resistência bacteriana incluem a descoberta de novos agentes antimicrobianos ou a modificação química de moléculas já existentes. Assim, os compostos semissintéticos foram relatados após os primeiros casos de resistência aos antibióticos naturais descritos na literatura, a fim de melhorar a atividade das moléculas já existentes (TRABULSI, 2005; RAVAT et al., 2010). Na década de 60, a descoberta do processo semissintético de obtenção de novas penicilinas, tais como meticilina e oxacilina (Figura 1), trouxe certa tranquilidade na terapêutica antiestafilocócica e consequente desaceleração nos investimentos de empresas farmacêuticas em programas de desenvolvimento de novos agentes antibacterianos (STEFANI; VARALDO, 2003). No entanto, o seu uso extensivo aumentou o aparecimento de cepas resistentes, denominadas MRSA, cujo padrão de resistência se estende a outros antibióticos beta-lactâmicos (SOUZA; REIS; PIMENTA, 2005; STRYJEWSKI; COREY, 2010). A utilidade clínica de outros antibióticos importantes, como aqueles das classes das fluoroquinolonas, tetraciclinas e macrolídeos também foi significativamente impactada pelo
surgimento e difusão de traços de resistência baseados no efluxo de drogas. No entanto, caracterização dos sistemas de efluxos em bactérias Gram positivas e Gram negativas tem fornecido uma base de conhecimento para a geração de novos derivados orgânicos que tenham capacidade de contornar este mecanismo de resistência (CHOPRA, 2002; ASAKA; MANAKA; SUGIYANA, 2003; BUTAYE; CLOECKAERT; SCHWARZ, 2003).
Penicilina (1942) Estreptomicina (1947) Tetraciclina (1952) Vancomicina (1958)
Meticilina (1959) Cefalotina (1964) Gentamicina (1967) Cefotaxime: FDA aprovado (1981) Imipenem, 1º carbapenem (1984) Linezolina, 1ª oxazolidinona (2000) Desenvolvimento dos antibióticos
Desenvolvimento de Resistência Aparecimento extensivo da penicilinase (1945) Penicilinases transferidas a Gonococcus (1976) Enterecoccus resistente a penicilina (1983) Resistência à estreptomicina (1947) Resistência à tetraciclina (1956) Raramente utilizada até os anos 80 Enterococcus resistente a vancomicina - VRE (1987) S. aureus resistente intermediário a vancomicina - VISA (1996) S. aureus resistente a vancomicina - VRSA (2002) S. aureus resistente a meticilina - MRSA (1961) MRSA adquirida na comunidade (1999) Resistência à cefalotina: 1ª Cefalosporina (1966) Resistência a Gentamicina (1970) Resistência a Cefotaxime (1983) Primeiro surto de K. pneumoniae resistente a cefalosporina de 3ª geração (1987) Acinetobacter baumanii resistente a Carbapenem (1998) S. aureus e VRE resistente a linezolida (2001)
Figura 1 - Desenvolvimento de antimicrobianos e aquisição de resistência por microrganismos Fonte: HUH; KWON, 2011.
Nas classes das tetraciclinas e macrolídeos, foram desenvolvidos análogos semissintéticos denominados de glicilciclinas e cetolídeos, respectivamente, que diferem dos seus progenitores devido ao fato de não serem substratos de alta afinidade para as bombas de efluxo pertinentes, mostrando atividade antibacteriana eficaz em cepas clinicas que ostentam de sistemas ativados de efluxo (CHOLLET et al., 2004; SHORTRIDGE et al., 2002; ZHANEL et al., 2003). Da mesma forma ocorreu com as novas fluoroquinolonas desenvolvidas, tais como: moxifloxacina, gemifloxacina, gatifloxacina e garenofloxacina, que também não são afetadas pelas proteínas de efluxo MDR, NorA (Staphylococcus aureus) e PmrA (Streptococcus pneumoniae) (LOMOVSKAYA; BOSTIAN, 2006). Infelizmente não há garantia de que o desenvolvimento de novas drogas possa fazer frente ao surgimento rápido e frequente da resistência em microrganismos patogênicos.
Infecções causadas por cepas multirresistentes estão crescendo de forma alarmante e a evolução contínua da resistência antimicrobiana tem prejudicado a saúde humana, de modo a comprometer seriamente a capacidade de tratar infecções graves. Um exemplo desta problemática é a nova classe de antibióticos oxazolidinonas, a qual tem como representante mais conhecido a linezolida, que teve seu uso clínico aprovado no ano de 2000 para o tratamento de infecções causadas por cepas resistentes à vancomicina e, no entanto, no ano seguinte já haviam sido descritas linhagens resistentes ao novo antibiótico (GONZALES et al., 2001; ANDEREGG et al., 2005). Este padrão desafiador e dinâmico de doenças infecciosas e o aparecimento de cepas resistentes a múltiplos antibióticos demandam soluções em longo prazo. Uma das alternativas é o uso de substancias antibióticas não tradicionais, que têm sido amplamente estudadas e usadas como protótipos de drogas moduladoras da resistência bacteriana. Dentre eles têm-se os peptídeos antimicrobianos (AMPs) (RILEY; WERTZ, 2002), estratégias de anti-virulência (KAUFMANN et al., 2008), terapia com fagos (KUTATELADZE; ADAMIA, 2008), anticorpos terapêuticos (BEBBINGTON; YARRANTON, 2008), inibidores de bombas de efluxo (McMURRY; PETRUCCI; LEVY, 1980), nanopartículas antimicrobianas (PAL; TAK; SONG, 2007) e vacinas antibióticas (RAPPUOLI, 2000). Além disso, uma variedade de substâncias empregadas no tratamento de doenças não infecciosas tem mostrado efeito antibacteriano de amplo espectro em estudos in vitro e in vivo. Tais compostos são chamados de drogas “não-antibióticas” e tem como principais exemplos a prometazina, clorpromazina, tioridazida, verapamil, diclofenaco de sódio, clavulanato, entre outros (MOLNÁR; KIRÁLY; MÁNDI, 1975; MOLNÁR et al., 1997, MAZUMDAR et al., 2006). O aumento do efeito antimicrobiano e a reversão da resistência aos antibióticos não convencionais proporciona a classificação destes compostos como modificadores da atividade antibacteriana (RAJYAGURU; MUSZYNSKI, 2007).
2.2 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA BACTERIANA
As bactérias, que estão em processo de evolução em mais de 3,5 bilhões de anos, são, indiscutivelmente os organismos mais adaptáveis da terra, com capacidade de habitar os lugares mais inóspitos possíveis (SYKES, 2009). O surgimento de bactérias resistentes a
drogas pode ser considerado uma manifestação natural regida pelo principio evolutivo da adaptação genética de organismos a mudanças no seu ambiente, bem como pode estar relacionada com a pressão seletiva devido à exposição a agentes antimicrobianos (GOLDSTEIN; CITRON, 2011). Desta forma, cepas variantes podem ser selecionadas a partir de uma população naturalmente susceptível ou pela aquisição dos chamados “genes de resistência” (CANTÓN; RUIZ-GARBAJOSA, 2011). A frequência de mutações em populações bacterianas é extremamente baixa, aproximadamente uma a cada 109 a 1010 células por divisão (BRIDGE, 2001). No entanto, na presença de uma infecção, é gerado um número bem maior de microrganismos, de modo a ter os alvos de antimicrobianos alterados, supressão dos sistemas de inativação ou aumento do efluxo de drogas (LIVERMORE et al., 2003). De modo semelhante ocorre com tratamentos em nível subterapêutico, com crescimento e proliferação de cepas resistentes (KOHANSKI; DePRISTO; COLLINS, 2010). A resistência bacteriana pode ocorrer de forma ativa, como resultado de uma determinada pressão evolutiva para se adaptar a um mecanismo de defesa contra um antibiótico ou uma classe de antibióticos, ou, passiva, como consequência de processos adaptativos não necessariamente relacionados à presença do fármaco (WRIGHT, 2005). O principal mecanismo para rápida disseminação de genes de resistência a antibióticos é por meio dos plasmídios, produzidos de forma independente e facilmente transportados entre bactérias, seja patogênica ou não-patogênica (WRIGHT, 2007). Além disso, alguns destes genes podem ser segregados dentro de transposons, a partir do DNA cromossômico e transferir-se para outros locais, movendo a carga genética que confere resistência ao agente antimicrobiano (HUGHES; DATTA, 1987). Os principais mecanismos usados pelas bactérias para evitar a ação de agentes antimicrobianos são mostradas na Figura 2. No geral, os microrganismos podem usar um ou múltiplos mecanismos contra um único ou uma classe de antibióticos, bem como uma única alteração em alvo pode comprometer a ação de diferentes agentes não relacionados estruturalmente (CHEN; CHOPRA; KAYE, 2011). Dentre os mecanismos de resistência descritos para microrganismos, aqueles que ocorrem especificamente em bactérias Gram-positivas podem ser classificados em três grupos distintos (HANCOCK, 2005):
Inativação do agente antimicrobiano: Um dos exemplos clássicos é a inativação do anel betalactâmico de penicilinas e cefalosporinas pela produção de enzimas hidrolíticas por cepas resistentes, denominadas β-lactamases (NEU, 1992). O arranjo firme dos quatro membros do anel β-lactâmico permite funcionalidade ativa das drogas, que atuam por modificar irreversivelmente a configuração estrutural da parede celular (MASSOVA, 1998). Outros exemplos de enzimas também incluem esterases, que tem sido associada à resistência aos macrolídeos e resistência a fosfomicina, por meio da abertura do anel pela ação das epoxidases (FILLGROVE et al., 2003).
AUMENTO DO EFLUXO ALTERAÇÃO DA MOLÉCULA-ALVO
Tetraciclinas (TetA, TetK)
Quinolonas (modificações na girase)
Quinolonas (NorA)
Rifampicina (ligante de DNA polimerase)
Macrolídeos (MefA, MsrA)
β-lactâmico (alterações de PBPs)
Múltiplas drogas (mexAB-OprF, NorA)
Macrolídeos (metilação do rRNA) Linezolida (alteração na subunidade 23S de rRNA) Bomba de Efluxo
Antibiótico
Enzima degradando
Plasmídeo
antibiótico Antibiótico Genes de resistência a antibiótico s Antibiótico Enzima Inativando o antibiótico INATIVAÇÃO ENZIMÁTICA DE DROGAS β-lactâmico (β-lactamase) Carbapenens (carbapenemase) Aminoglicosídeos (enzimas modificadas) Cloranfenicol (enzimas inativadas)
Figura 2 - Mecanismos de resistência a drogas em bactérias Fonte: Adaptado de TODAR, 2009.
Modificação da estrutura-alvo: Penicilina, bacitracina, vancomicina e novobiocina são alguns exemplos de agentes antimicrobianos que inibem a síntese da parede celular, ao se ligarem no dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala do peptideoglicano de bactérias Gram-positivas (BOGER et al., 2001). A resistência a estes antibióticos envolve genes codificam uma nova via de expressão de enzimas que reduzem o piruvato a D-lactato, adiciona D-alanina e D-lactato juntos para produzir ligações do tipo D-Ala-D-Lac (WALSH, 1996). Esta modificação produz uma interação eletrostática repulsiva no lugar da ligação do Hidrogênio e em consequência, a afinidade do fármaco com a camada de peptídeoglicano diminui em um fator superior a 1000 vezes (BUGG, 1991). Efluxo contínuo do antibiótico: Genes mutantes superexpressam proteínas transportadoras de membrana denominadas bombas de efluxo. São responsáveis pela entrada e saída de substâncias no meio citoplasmático, fazendo com que a retirada do fármaco para o meio extracelular seja mais rápida, de modo a manter uma concentração insuficiente para atuar como bloqueador das funções celulares bacterianas (LEVY, 1992).
2.3 BOMBAS DE EFLUXO (PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS)
Originalmente descrita em bactérias, as bombas de efluxo são reconhecidas como os principais determinantes de modulação do acúmulo e efluxo de substratos tóxicos, incluindo antimicrobianos (LOMOUSKAYA; BOSTIAN, 2006). Todas as células vivas contem genes que codificam estas proteínas e têm sido descritas em vários organismos, incluindo fungos e protozoários, bem como em células tumorais de mamíferos (GIBBONS; UDO, 2003; AMARAL et al., 2007). O efluxo ativo foi descrito pela primeira vez em bactérias no ano de 1980, como mecanismo causador de resistência a tetraciclinas (McMURRY; PETRUCCI; LEVY, 1980). Posteriormente, as bombas de efluxo foram relacionadas como um mecanismo de amplo espectro, que comprometem a eficácia de uma ampla variedade de antibióticos e são expressas de diferentes formas em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (JOSEPH et al., 2008). O mecanismo de resistência por proteínas de efluxo envolve a utilização de energia metabólica para transportar drogas e substancias tóxicas contra o gradiente de concentração,
que pode ser específico a uma determinada droga ou pode conferir especificidade a uma variedade de compostos estruturalmente e funcionalmente não relacionados, caracterizando a resistência a múltiplas drogas (Multidrug resistance - MDR) (ABULROB et al., 2004). De um modo geral, as bombas de efluxo podem ser classificadas em dois grupos principais (Figura 3): Transportadores dependentes de ATP (ABC Transporters) – realizam o transporte primário e utilizam a energia de hidrólise da molécula de ATP para expelir a droga da célula contra o gradiente de concentração. Um dos membros desta família, a proteína MsrA confere resistência induzida a eritromicina e estreptograminas do tipo B no gênero Staphylococcus. Força motriz protônica (PMF) – transportadores do tipo antiporte que expulsam a droga à custa da energia liberada pelo transporte secundário dos íons H+ ou Na+ a favor do gradiente eletroquímico. Podem ser subdivididas em diversas famílias baseada na homologia da sequência de aminoácidos e estrutura secundária. Fazem parte destes transportadores: Major Facilitator Superfamily (MFS), Small Multidrug Resistance (SMR), Multi Antimicrobial Extrusion (MATE) e Resistance/Nodulation/Division (RND). A última, em particular, tem papel clinicamente relevante na resistência de bactérias Gram-negativas (POOLE, 2001; POOLE; PORTUGAL, 2005).
Extracelular
Intracelular
Figura 3 - Diagrama esquemático de bombas de efluxo representativas em Gram-positivas Fonte: PUTMAN; VAN VEEN; KONINGS, 2000.
Além dos diferentes tipos de energia metabólica que as compõem, as bombas de efluxo ainda podem ser caracterizadas pelo número de proteínas que compõem a bomba, o número de domínios da proteína transportadora que abrangem a membrana plasmática, tipos de substratos expulsos através da bomba, tipos de compostos que inibem o efluxo substratos por competição com o sítio ativo do transportador ou por inibição não competitiva. O efluxo ativo de substâncias confere um nível de resistência moderada, levando um aumento da Concentração Inibitória Mínima (CIM) em até 64 vezes, em detrimento do aumento da expressão de bombas de efluxo (BROSKEY, 2000), além do sinergismo com outras formas de resistência (MAZZARIOL, 2000). A superexpressão das bombas de efluxo também pode estar relacionada quimioterapias subinibitórias (LOMOVSKAYA, 1999). As famílias de bombas de efluxo ABC, SMR e MFS representam sistemas de efluxos importantes em bactérias Gram-positivas, sendo a última a mais prevalente, que inclui proteínas transportadoras de 12 a 14 domínios transmembrana, com capacidade de transportar açúcares, metabólitos intermediários e drogas, que podem ser representadas pelas proteínas NorA e TetK (SAIER et al., 2001; GIBBONS, 2003). Por outro lado, a superfamília ABC transporta uma variedade de substâncias não relacionadas molecularmente: açúcares, aminoácidos, íons, drogas, polissacarídeos e proteínas, representada principalmente pela proteína MsrA, específica para macrolídeos. Como representante da família SMR, tem-se a proteína QacA que possui 4 domínios transmembrana e expulsa corantes, drogas e cátions (KÖHLER, et al., 1999; KUMAR e SCHWEIZER, 2005; MARQUEZ, 2005). Um número importante destas proteínas tem sido relacionado com infecções comunitárias e nosocomiais por S. aureus, incluindo principalmente NorA, transportador MDR responsável pelo efluxo de uma ampla variedade de compostos orgânicos não relacionados, incluindo fluoroquinolonas hidrofílicas e compostos NAB (Nucleic Acid Binding), tais como os compostos de amônio quaternário (cloreto de benzalcônio e cetrimida) e corantes intercalantes (brometo de Etídio e acriflavina) (KAATZ, 1993; HSIEH, 1998), os quais tem grande importância em estudos com bombas de efluxo. O ensaio de inibição com brometo de etídio é o estudo mais detalhado para avaliação de atividade moduladora de novos compostos, por ser substrato de diversas bombas de efluxo MDR e a única forma de resistência bacteriana adquirida pelo brometo de etídio ocorre
exclusivamente por meio de bomba de efluxo. Outros ensaios similares podem ser realizados com acriflavina ou pironina Y (KAATZ et al., 2000; KAATZ et al., 2003).
2.4 INIBIDORES DE BOMBA DE EFLUXO
Diversos compostos químicos, de origem sintética e natural, têm sido relatados como inibidores de bombas de efluxo (PAGÉS, 2008), de modo a atuar como importantes ferramentas adicionais no desenvolvimento de fármacos co-formulados com o antibiótico apropriado, com interesse similar aos inibidores de beta-lactamases (VAN BAMBEKE et al., 2003). A identificação e desenvolvimento de inibidores de bombas de efluxo seguros e eficazes são de grande importância e espera-se que tais moléculas tenham características específicas: capacidade de redução da resistência intrínseca de bactérias a antibióticos, reverter à resistência adquirida até mesmo em cepas MDR, além de reduzir a frequência de aparecimento de resistência em cepas mutantes (LOMOVSKAYA, 1999). Esta abordagem, no entanto, parece ser muito difícil por conta dos efeitos potenciais sobre os transportadores de efluxo de células eucarióticas. Deve ser enfatizado que a maioria dos inibidores disponíveis exibe este perfil, tais como: reserpina, omeprazol, fenotiazinas, verapamil, sertralina e sideróforos (VAN BAMBEKE et al., 2003). Outros candidatos a inibidores foram testados em ensaios pré-clínicos, porém, até então, nenhum inibidor foi aprovado para uso clínico (LOMOVSKAYA et al., 2007). A clorpromazina, uma droga amplamente utilizada na clínica como antagonista de receptores dopaminérgicos, tem sido mostrada como inibidor do sistema de efluxo MDR em S. aureus, exibindo ação sinérgica ou aditiva sobre os substratos da bomba (KAATZ et al., 2003). Outros fármacos, como trifluoperazina, verapamil e ciclosporina A, são conhecidos como inibidores da resistência MDR em mamíferos, atuando em proteínas de efluxo Glicoproteína-P, bem como em bombas de efluxo de Saccharomyces cerevisiae (BECK, 1990; KOLACZKOWSKI et al., 2003). Recentemente, a trifluoperazina tem sido relatada também como inibidor putativo de bomba de efluxo em bactéria (FALCÃO-SILVA, 2009).
É essencial que a escolha e desenvolvimento de moléculas não sejam somente projetados especificamente para inibir bombas de efluxo de procariotos, mas também que possua alguma distancia da estrutura molecular de outras drogas utilizadas na terapêutica. As propriedades farmacocinética/dinâmicas dos inibidores destas proteínas representam outra dificuldade, pois devem corresponder estreitamente as propriedades do antibiótico de escolha (BAMBEKE et al., 2003). Atualmente, a procura por substâncias que possam atuar como inibidores de proteínas transportadoras aposta em drogas capazes de evitar o efluxo, seja pela síntese de compostos considerados substratos fracos (HERCHBERGER et al., 2004), produtos que suprimem ou bloqueiam a atividade da bomba, pelo esgotamento da energia da proteína ou por modificar a sua conformação por interação do inibidor com a membrana celular bacteriana (ZLOH; KAATZ; GIBBONS, 2004; THOTA et al., 2010).
2.5 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DE COMPOSTOS HETEROCÍCLICOS SINTÉTICOS
2.5.1 Pirazolopirimidinas e Tienopirimidinas
A estrutura da tienopirimidina, um análogo da purina, é de grande interesse na química medicinal, devido ao amplo espectro de atividade biológica, incluindo ação antimicrobiana. Diversos estudos mostram efeito antibacteriano de derivados substituídos, incluindo tienodiazolopirimidinas, tienotriazolopirimidinas, tienotetrazolopirimidinas, entre outros, contra Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Enterococcus faecalis (FERREIRA, 2010).
Derivados de pirazolopirimidinas, outro
isóstero da purina, são conhecidos por exibirem boa atividade contra cepas ATCC de S. aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Pseudomonas mirabilis e Pseudomonas aeruginosa (EL-ABADELAHA et al., 1998). Outros efeitos biológicos: ação herbicida (ALFRED et al., 1999), antitumoral (ANDERSON et al., 1990; RASHAD et al., 2008), antileishmania (DE MELLO et al., 2004).
2.5.2 Hidrazidas-hidrazonas
Compostos hidrazida-hidrazonas não são apenas intermediários, mas também são compostos orgânicos muito eficazes em seu próprio direito. Constituem uma classe importante para o desenvolvimento de novos medicamentos, a fim de descobrir um composto eficaz contra infecções microbianas multirresistentes (BEDIA et al., 2006). Além disso, este grupo de compostos tem mostrado importante papel como antitumoral e potente atividade frente a fungos e a bactérias (FARAG et al., 2008; CHALINA; CHAKAROVA, 1998). Apresentou excelente atividade antimicrobiana frente S. aureus, Bacillus subtilis, E. coli, P. aeruginosas, bem como contra duas cepas de fungos, Candida albicans e Aspergillus niger. A adição de substituintes halogênios melhoraram a atividade antimicrobiana, enquanto a presença de grupos –nitro (NO2) foram importantes para o efeito antifúngico (DEEP et al., 2010; ROLLAS; KÜÇÜKGÜZEL, 2007).
2.5.3 Piperazinas
São compostos orgânicos N-heterocíclicos considerados importantes farmacóforos que podem ser encontrado em diversos fármacos comercializados e em drogas em fase de desenvolvimento. Uma série de derivados de piperazinas substituídas revelou atividade antimicrobiana frente S. aureus, P. aeruginosa, S. epidermidis e E. coli, bem como contra os fungos Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus e Aspergillus Níger (CHAUDHARY et al., 2006). A fim de prolongar a utilidade de antibióticos utilizados na clínica, a avaliação de dímeros do antibiótico ciprofloxacino ligados com piperazina mostrou potente atividade antibacteriana frente cepas de S. aureus resistentes por mecanismos mediados por bomba de efluxo e topoisomerase IV (KERNS et al., 2003). Além da atividade antimicrobiana, arilpiperazinas também foram capazes de reverter a resistência em cepas de E. coli, sugerindo mecanismo via inibição do efluxo de drogas (BOHNERT; KERN, 2005). Em nosso laboratório, compostos heterocíclicos de origem sintética foram avaliados como moduladores da resistência a drogas. Tais compostos têm despertado interesse na
pesquisa em química medicinal e são caracterizados principalmente por anéis heterocíclicos mesoméricos de cinco ou seis membros fortemente estabilizados por deslocamento de elétrons
π, tornando-os biologicamente ativo (ATHAYDE-FILHO et al., 1999; ATHAYDE et al., 1996). R2
R1
CH 2 HN
R3 N
(A)
S
N
N
R4
X X
N
R5
(B) H N
X
X N X'
R N H
X
(C)
(D) O
R3
NH2
R1 C
N R1
N
R2
C
N
R4
R2
(F)
(E)
Figura 4 - Estrutura molecular de alguns representantes de compostos sintéticos heterocíclicos. A. Pirazolopirimidina; B. Tienopirimidina; C. Composto mesoiônico; D. Piperazina; E. Hidrazida; F. Hidrazona.
2.6
IMIDAS CÍCLICAS
As Imidas Cíclicas são moléculas sintéticas obtidas por reação entre ácidos carboxílicos e amônia, com consequente liberação de água (HARGREAVES, 1970). Contém o grupo (–CO-N(R)-CO-), sendo o R um átomo de hidrogênio, grupo alquila ou arila, sendo a maioria destes compostos constituídos por um sistema cíclico com menos de sete átomos de carbono (NUNES, 1986). Além disso, são compostos de natureza hidrofóbica, solúveis principalmente em acetona e dimetilssulfóxido (DMSO). As principais subclasses incluem maleimidas, succinimidas, glutarimidas, ftalimidas, naftalimidas (Figura 5), e nos últimos anos, estes compostos tem atraído a atenção da
comunidade cientifica, principalmente, devido as suas potencialidades terapêuticas. Um exemplo amplamente conhecido é o fármaco Talidomida, formado pela condensação do intermediário ftalimídico com amônia, é um composto de grande interesse científico devido ao amplo espectro de suas atividades biológicas (BORGES; FROEHLICH, 2003). (A)
(B)
(C) O
O
O
H N
N
R
R
R
N
H
R O
O
O
(D)
(E) O
N
O
O
R
N
R
O
Figura 5 - Estrutura das principais subclasses das imidas cíclicas. A. Maleimida; B. Succinimida; C. Glutarimida; D. Ftalimida; E. Naftalimida Fonte: Nathalie Borges.
As maleimidas raramente ocorrem na natureza, sendo assim um importante protótipo na obtenção de outros derivados imídicos, amplamente utilizados para a síntese de derivados com potencial biológico (CECHINEL-FILHO, 1998). O composto 2-etil-3-metil-maleimidoN-β-D-glucopiranosídeo, isolado das folhas de Garcinia mangostana (Figura 6), parece ser um dos poucos exemplos de maleimidas de origem natural (KRAJEWSKI; SCHREIRER 1996).
O
N
O
OAc
O AcO (A)
OAc (B)
OAc
Figura 6 - Estrutura da 2-etil-3-metil-maleimido-N-β-D-glucopiranosídeo na forma acetilada, enfatizando o anel maléico (A), isolado de Garcinia mangostana (B)
Os efeitos biológicos das maleimidas e compostos relacionados vêm sido estudados durante muitos anos. Esta subclasse tem se mostrado mais ativa do que as succinimidas em relação à atividade antifúngica, sugerindo a importância da dupla ligação imídica na ação biológica (NUNES, 1986). O distanciamento entre o anel imídico e o anel aromático também se mostrou importante para a atividade antimicrobiana, uma vez que derivados substituídos de N-Fenilmaleimidas geralmente apresentam-se mais ativos, pois a conjugação do nitrogênio imídico com o anel aromático e a presença de elementos eletrodoadores na molécula pode proporcionar aos compostos, varias estruturas ressonantes (CECHINEL FILHO et al., 2003). O grupo alceno presente em derivados de N-etilmaleimidas é reativo em grupos tióis, cuja reação resulta em tioéster característico, com forte ligação carbono-enxofre (C-S) virtualmente irreversível (GREGORY, 1955). Por ser um reagente de baixo peso molecular e estável, é, portanto, membrana-permeável, de modo a reagir com grupos tióis em ambientes hidrofóbicos (HANSEN, 2009). Algumas N-alquilarilmaleimidas apresentaram atividades contra um amplo espectro de bactérias patogênicas de interesse clínico, como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, entre outras (CECHINEL FILHO et al., 1994), bem como contra diversos fungos leveriduriformes e filamentosos, como Microsporum canis, Candida albicans e Penicillium, importantes causadores de micoses em humanos. (CECHINEL FILHO et al., 1995). Mais recentemente, com o estabelecimento e otimização das vias de síntese para obtenção destes compostos, o interesse ressurge, sendo que várias das imidas cíclicas podem
ser encontradas dentre os compostos orgânicos com promissores efeitos biológicos (PRADO, 2005). Todavia, ainda resta muito a ser estudado, principalmente quanto à elucidação dos mecanismos de ação dos efeitos biológicos apresentados por esses compostos, bem como a sua possível toxicidade.
2.7 MODELAGEM MOLECULAR E OTIMIZAÇÃO DE CANDIDATOS A NOVOS FÁRMACOS
A obtenção de um novo fármaco envolve diversas etapas desde a identificação de um grupo de moléculas que apresentam um potencial de interação com o alvo, passando pela análise da atividade biológica das moléculas em ensaios in vitro, testes pré-clínicos para avaliação da eficácia, toxicidade e efeitos colaterais das moléculas em condições fisiológicas e finalmente a realização dos testes clínicos em seres humanos (TROULLIER et al, 2002). A farmacocinética teórica in silico (do latim in silicio, simulação computacional) é uma abordagem atualmente muito utilizada no estudo inicial das propriedades da droga no processo de absorção, distribuição, metabolismo, eliminação e toxicidade (ADMET) e tem como objetivo diminuir gastos de tempo e investimento desnecessários em ensaios biológicos de derivados com alta probabilidade de problemas farmacocinéticos e tóxicos no futuro, visto que 50% das razões que levam ao fracasso no desenvolvimento de um fármaco estão diretamente associadas ao perfil farmacotécnico e toxicológico (KADAN, 2007; HANSCH et al, 2004). As técnicas de modelagem molecular variam, a depender das informações estruturais disponíveis sobre o alvo terapêutico (enzima/receptor) e os ligantes (agonista, substrato, antagonista ou inibidor). Quando a estrutura tridimensional (3D) do alvo é conhecida é realizado o método direto, que se baseia na análise do complexo do ligante-receptor (ACHARYA et al., 2005). Por outro lado, quando se trata de um alvo desconhecido, é possível fazer a predição molecular com informações sobre compostos ativos e inativos, tais como: grupos hidrofóbicos, ligações de hidrogênio e momentos dipolo. A partir destas informações, gera-se um modelo que pode ser usado para a seleção de compostos dentro de um banco de dados (COHEN et al., 1990; OOMS, 2000; CHAVATTE et al., 2006) Levando em consideração os parâmetros farmacodinâmicos de um fármaco, uma boa disponibilidade oral é uma das propriedades mais desejáveis, pois permite redução da dose e
da frequência da administração do medicamento, proporcionando melhor adesão do paciente ao tratamento. Na predição da biodisponibilidade ocorrem múltiplos fatores biológicos e químicos como dissolução no trato gastrintestinal, permeação pelas membranas intestinais e metabolismo de primeira passagem intestinal e hepático (RANG; DALE; RITTER, 2003). Considerando tais fatores, Lipinski e colaboradores (2001) propuseram um conjunto de regras que avaliam a biodisponibilidade oral de novas moléculas com potencial terapêutico, conhecida como “Regra dos Cinco de Lipinski” e que considera parâmetros que identificam fármacos com possíveis problemas de absorção e permeabilidade. Esta predição teórica é baseada em uma coleção de 5300 fragmentos moleculares, obtidos de 3300 fármacos comerciais e 15000 compostos da coleção Fluka, fármacos não comerciais. No entanto, é importante ressaltar que os alertas de risco são considerados apenas um indicativo de que a molécula possua um fragmento que cause efeito tóxico, de modo a orientar a seleção ou alteração estrutural de compostos para futuros estudos in vitro e in vivo.
Objetivos
No Laboratório Genética de Microrganismos, vários produtos naturais de origem vegetal, avaliados como inibidores putativos de bomba de efluxo. O presente trabalho tem como objetivo geral investigar de produtos sintéticos bioativos como moduladores da resistência a drogas. Como objetivos específicos: analisar compostos da subclasse maleimidas, as N-Fenilmaleimidas, não apenas quanto a sua atividade antimicrobiana, mas principalmente, como moduladores da resistência a drogas em linhagens de Staphylococcus aureus que superexpressam bombas de efluxo.
Materiais e Métodos
4.1 LOCAL DA PESQUISA
Os estudos para avaliação da atividade antibacteriana e moduladora da resistência foram realizadas no Laboratório Genética de Microrganismos, do Departamento de Biologia Molecular (DBM), Centro de Ciência Exatas e da Natureza (CCEN), Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
4.2 LINHAGENS DE Staphylococcus aureus
Para avaliação da atividade antibacteriana foram utilizadas as cepas de origem clínica MRSA1, MRSA2 (resistentes a meticilina), MSSA1 e MSSA2 (sensíveis a meticilina), bem como a linhagem padrão ATCC 6538. Para avaliação da atividade moduladora da resistência a drogas foram usadas as seguintes cepas: SA-1199B, que possui o gene norA superexpresso, codifica a proteína de efluxo NorA, responsável pelo efluxo de fluoroquinolonas (KAATZ et al., 1993; KAATZ; SEO, 1995); RN-4220 que possui o plasmídeo pUL5054, o qual, carrega o gene que codifica a proteína MsrA, para efluxo de macrolídeos (ROSS et al., 1989) e IS-58, que possui a proteína de efluxo para tetraciclina (TetK) (GIBBONS; UDO, 2000). Todas estas linhagens foram mantidas em meio de cultura Agar sangue base (Blood Agar Base – BAB, Difco) inclinado. Antes de serem utilizadas, as células foram crescidas em caldo nutritivo de infusão (Brain and Heart Infusion - BHI, Difco) por 18-24hs a 37ºC. Estas linhagens foram cedidas pelo Dr. Simon Gibbons (University of London).
4.3 AGENTES ANTIMICROBIANOS E COMPOSTOS NAB
Os antibióticos tetraciclina, eritromicina ácido nalidíxico e as fluoroquinolonas (norfloxacino, ciprofloxacino e pefloxacino) foram preparados de acordo com NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007). As soluções-estoque dos compostos NAB foram
preparadas em água destilada. Todos os antibióticos e os compostos NAB foram obtidos da Sigma-Aldrich.
4.4 IMIDAS CÍCLICAS
O
O
N
N
O
O
NO2
O
(1)
O N
O N (2)
O Cl
O
(3)
O
N (4)
O
F
Cl Cl
N O
(5)
CH3 (6)
O N O
OCH3 (7)
Figura 7 - Estrutura das maleimidas utilizadas no estudo Fonte: Nathalie Borges.
Foram cedidos gentilmente sete derivados (Figura 7): de maleimidas pelo Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho, pesquisador do Núcleo de
Investigações
Químico-Farmacêuticas,
Universidade Vale do Itajaí (UNIVALI): N-fenilmaleimida (1), N-4-nitrofenilmaleimida (2), N-4-F-fenilmaleimida (3), N-4-clorofenilmaleimida (4), N-3,4-diclorofenilmaleimida (5), N-4-metilfenilmaleimida (6) e N-4-metoxifenilmaleimida (7), obtidos através da reação do anidrido maleico com anilinas substituídas (Figura 8), em éter, para a obtenção dos respectivos ácidos âmicos. Posteriormente, estes compostos foram ciclizados usando ácido acético como agente desidratante para a obtenção das respectivas N-Fenilmaleimidas (1-7), anteriormente descrito por Cechinel et al. (2003). As soluções-estoque foram preparadas em dimetilsulfóxido (DMSO) e a maior concentração mantida após a diluição em caldo nutritivo (4%) não causou inibição do crescimento bacteriano.
O
O
O
+ NH2R
O
Éter
NH
Agitação
OH
O
R
CH3COOH
N
R
Refluxo
O
O
Figura 8 - Esquema das reações para obtenção de derivados maleicos Fonte: Nathalie Borges.
4.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)
Os valores das Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) das N-Fenilmaleimidas, dos antibióticos e dos compostos NAB, foram determinadas em duplicata, por meio da técnica de microdiluição, usando uma suspensão de ca. 105 ufc/mL em solução salina a 0,9% de NaCl e com concentrações variando de 256µg/mL a 4 µg/mL ou 128µg/mL a 0,125 µg/mL em diluições seriadas em caldo nutritivo BHI (SMITH et al., 2005). A CIM foi definida como a menor concentração que inibiu completamente o crescimento bacteriano após 24h, visualizada com o uso da solução (0,01%) de resazurina (Sigma-Aldrich), um indicador de crescimento bacteriano.
4.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
Após a determinação da CIM, retirou-se uma alíquota de 20 µL de cada cavidade a qual não foi observada crescimento bacteriano, equivalente a CIM, CIMx2 e CIMx4, posteriormente foi recultivada em caldo BHI (100µL), incubada a 37ºC, por 24 horas. A CBM foi considerada a menor concentração em que não houve crescimento bacteriano (KLEPSER et al., 1998; ERNST et al., 1999).
CBM/CIM ≤ 2 – Efeito Bactericida 2 < CBM/CIM < 32 – Efeito Bacteriostático CBM/CIM ≥ 32 – Efeito de Tolerância
Figura 9 – Relação dos efeitos causados pelos derivados. Fonte: Nathalie Borges.
4.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MODULADORA DA RESISTÊNCIA A DROGAS
Para avaliar a atividade dos derivados imídicos como inibidores putativos de bomba de efluxo, foi determinada a CIM de antibióticos e compostos NAB, na presença e na ausência das imidas cíclicas, em cepas de S. aureus que superexpressam bombas de efluxo específicas (GIBBONS et al., 2003). A concentração dos derivados foi aquela correspondente a ¼ de sua CIM, considerada uma concentração subinibitória, de modo a não interferir diretamente na atividade antibacteriana (STAVRI et al., 2007). A clorpromazina, um inibidor de bomba de efluxo, foi usada como controle positivo para as cepas IS-58 (TetK) e SA-1199B (NorA), ambas da subfamília MFS. Após 24h de incubação a 37°C, foi realizada a visualização da presença/ausência de crescimento bacteriano, com o uso da solução (0,01%) de resazurina (Sigma-Aldrich).
4.8 ANÁLISE in silico DOS PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS
As estruturas das N-Fenilmaleimidas foram submetidas à análise in silico dos parâmetros ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade) por meio dos programas
Osiris®
Property
Explorer
(Disponível
em:
http://www.organic-
chemistry.org/prog/peo/) e Molinspiration® Products and Services (Disponível em: http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties) para avaliar o potencial teórico destas substâncias como candidatos a novos fármacos.
Resultados e Discussão
5.1 ATIVIDADE ANTIBACTERIANA FRENTE A CEPAS CLÍNICAS
A atividade antibacteriana das N-Fenilmaleimidas (NFM) em estudo foi determinada pela avaliação das concentrações inibitória e bactericida mínima (CIM e CBM, respectivamente). O método de microdiluição foi escolhido por ser uma forma simples e econômica de avaliar tanto compostos hidrossolúveis quanto lipossolúveis, possui grande reprodutibilidade e é 30% mais sensível do que outros métodos descritos na literatura (OSTROSKY, et al., 2008; SCORZONI et al., 2007). De acordo com a Tabela 1, as substâncias 3,4-Cl-N-fenilmaleimida, 4-Cl-Nfenilmaleimida e 4-CH3-N-fenilmaleimida mostraram atividade antibacteriana moderada, com valores da CIM menores ou iguais a 64 µg/mL. Segundo Gibbons (2008), compostos que possuem CIM acima de 100 µg/mL são considerados agentes antimicrobianos pouco ativos, enquanto que aqueles que apresentam CIM abaixo de 10 µg/mL (ideal ≤ 2 µg/mL) são considerados de grande interesse a companhias farmacêuticas. Tabela 1. Concentração Inibitória e Bactericida Mínima (µg/mL) das N-Fenilmaleimidas (NFM) frente a cepas de Staphylococcus aureus. ATCC 6538
MSSA 1
MSSA 2
MRSA 1
MRSA 2
Imida cíclica
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
NFM
128
256
256
512
256
512
128
128
128
128
3,4-Cl NFM
16
32
32
128
32
128
32
32
16
32
4-CH3 NFM
64
128
64
256
64
256
64
128
64
128
4-NO2 NFM
128
512
512
512
512
512
256
256
128
256
4-Cl NFM
64
256
64
64
32
64
64
64
64
128
4-OCH3 NFM
256
256
256
256
128
128
32
32
128
128
4-F NFM
256
256
256
256
128
128
64
64
64
64
O efeito bactericida foi definido como uma relação CBM/CIM ≤ 2 e o efeito de tolerância foi definida como CBM/CIM ≥ 32, de modo que todas as N-Fenilmaleimidas avaliadas foram consideradas de natureza bacteriostática, no entanto não houve efeito de tolerância em nenhum dos derivados (KLEPSER et al., 1998; ERNST et al., 1999). Há relatos na literatura em que maleimidas apresentaram atividade bacteriana com CIM acima de 200µg/mL (ORZESZKO et al., 2002; ZENT et al., 2004). Prado et al. (2004) relataram a atividade antibacteriana de N-antipiridino-3,4-dicloromaleimida na concentração
de 250µg/mL, frente a S. aureus. Em bactérias Gram-positivas, fatores intrínsecos de resistência podem estar relacionados com o moderado efeito antibacteriano das maleimidas, como a modificação do alvo celular, com consequente perda da afinidade entre a droga e o alvo, desta forma impedindo que a substância atue de forma eficaz sob a bactéria (TAVARES, 2000; AL-TATARI et al., 2006). A atividade antimicrobiana desses compostos parece estar relacionada à maior densidade eletrônica nas moléculas, uma vez que, tais efeitos poderiam ser devido à formação de dipolos, cujas estruturas ressonantes facilitam a interação fármaco-microrganismo, tornando-a eficiente, uma vez que a estrutura molecular da superfície celular é altamente polar. (RANG; DALE; RITTER, 2003; ROSA, 1997). A planaridade da molécula e a adição de grupos metileno (-CH3) entre o anel imídico e o anel aromático também tem sido relatados como fator estrutural importante para o efeito antimicrobiano, possibilitando melhor interação com o receptor biológico (ANDRICOPULO et al., 1998; BELLA CRUZ et al., 1996; CHECHINEL-FILHO et al., 2003). No entanto, as N-fenilmaleimidas testadas apresentam uma distância pequena entre os dois anéis, visto que o átomo de nitrogênio do grupo imídico está diretamente ligado ao anel aromático, sugerindo assim uma possível explicação para o moderado efeito antibacteriano. Além da adição de radicais da molécula, outros fatores são determinantes para a melhor interação com o receptor biológico, tais como: grupos hidrofóbicos, massa molecular, ligação de hidrogênio, momento dipolo, rotação de ligações simples, entre outros. Deste modo, o estudo conformacional das moléculas é primordial para análise da estrutura de um ligante, assim como a sua relação com alvo biológico. Atualmente, estudos in silico dos parâmetros ADMET são realizados em etapas preliminares do processo de desenvolvimento de fármacos, com a finalidade de se otimizar as propriedades da substancia por modificações moleculares (JÓNSDÓTTIR et al., 2005). Desta forma, os derivados N-fenilmaleimidas e alguns agentes antimicrobianos comercialmente disponíveis foram submetidos a uma análise in silico por meio do programa Molinspirarion® Products and Services (2012) para avaliar o potencial teórico destas substancias. Foram determinados os valores de: a) cLogP, que corresponde a lipofilicidade da substancia, que afeta na absorção, metabolismo e toxicidade da molécula; b) Massa molar, com valor aceitável ≤ 500 Daltons; c) Número de aceptores (nALD) e doadores de hidrogênio (nDLH). De acordo com esta regra, a molécula apresenta boa absorção e permeabilidade
quando segue pelo menos três de quatro características, sendo assim, com número de violações ≤ 1. Os resultados revelaram (Tabela 2) que os derivados satisfizeram a “Regra dos Cinco” de Lipinski: CLogP entre 1,06 e 2,56, Massa molar entre 173,17 e 242,06 Daltons e número de doadores de hidrogênio de até 6, não violando nenhum dos parâmetros referente a regra. Tabela 2. Análise das propriedades físico-químicas teóricas das N-fenilmaleimidas “Regra dos Cinco” de Lipinski N-Fenilmaleimidas nALD
nDLH
MM
CLogP
n violações
NFM
3
0
173,17
1,06
0
3,4-Cl NFM
3
0
242,06
2,56
0
4-CH3 NFM
3
0
187,20
1,51
0
4-NO2 NFM
6
0
218,17
1,02
0
4-Cl NFM
3
0
207,62
1,74
0
4-OCH3 NFM
4
0
203,20
1,12
0
4-F NFM
3
0
191,16
1,22
0
Este dado sugere que todos os compostos são suficientemente hidrofóbicos para que seja possível a penetração em membranas biológicas. Interessante que, o composto mais lipofílico (3,4-Cl NFM) apresentou a melhor atividade, enquanto que o composto menos lipofílico (4-NO2 NFM) foi o menos ativo.
5.2 ATIVIDADE MODULADORA DA RESISTÊNCIA A DROGAS
O processo de descoberta de novos agentes antibacterianos inclui testes in vitro que avaliem não só a habilidade de inibir a bactéria, como também a capacidade destes compostos em modificar a atividade antibacteriana em cepas MDR por inibição da bomba de efluxo (PANKEY; SABATH, 2004; APPENDINO et al., 2008). Diante disso, foi realizada a avaliação da susceptibilidade de antibióticos na ausência e na presença das N-fenilmaleimidas selecionadas neste estudo, frente as cepas de S. aureus IS-58, RN4220 e SA-1199B, que superexpressam, respectivamente, as bombas de efluxo TetK, MsrA e NorA.
Para o ensaio de modulação da resistência bacteriana, cada imida cíclica foi incorporada ao meio de cultura na concentração subinibitória correspondente a ¼ das respectivas CIM (Tabela 3). A clorpromazina (CPZ), considerada como inibidor do sistema de efluxo MDR em S. aureus (KAATZ et al., 2003), foi utilizada como controle positivo para as proteínas de efluxo da superfamília MF, TetK e NorA.
Tabela 3. Concentração inibitória mínima (CIM) de N-Fenilmaleimidas e antibióticos em µg/mL em cepas que superexpressam bombas de efluxo Cepas (bomba de efluxo)
N-Fenilmaleimidas e antibióticos
IS-58 (TetK)
RN4220 (MsrA)
SA-1199B (NorA)
NFM
128
128
64
3,4-Cl NFM
16
16
8
4-CH3 NFM
64
128
64
4-NO2 NFM
256
256
128
4-Cl NFM
32
64
64
4-OCH3 NFM
64
128
128
4-F NFM
64
128
256
Tetraciclina
64
-
-
Eritromicina
-
512
-
Norfloxacino
-
-
64
Clorpromazina *
64
-
64
(*) Controle-positivo para as bombas TetK e NorA.
No ensaio da modulação da resistência a drogas, cinco derivados (NFM, 4-CH3-NFM, 4-F-NFM, 4-NO2-NFM, 4-CH3-NFM) foram capazes de modular a resistência a drogas, ao reduzir a CIM dos agentes antimicrobianos. A N-Fenilmaleimida (NFM), o derivado que não possui grupo substituinte no anel benzeno, apresentou uma redução de duas vezes da CIM de norfloxacino, não havendo efeito na modificação da atividade bacteriana de outros antibióticos (Tabela 4). A adição do átomo de flúor e do grupo metoxila nas moléculas, 4-FNFM e 4-OCH3-NFM, respectivamente, não reduziu a CIM referente ao antibiótico norfloxacino, porém ambos apresentaram efeito modulador à tetraciclina, com redução de duas vezes da CIM. A substância 4-NO2 NFM mostrou atividade moduladora frente a cepas IS-58 (TetK) e RN4220 (MsrA), com redução de quatro vezes da CIM em ambos os antibióticos tetraciclina e eritromicina, respectivamente. O radical nitro (–NO2) é considerado um importante grupo
farmacofórico em moléculas e tem capacidade de modificar as propriedades químicas das substâncias, por promover um aumento do caráter hidrofóbico da molécula (KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1988; BARREIRO; FRAGA, 2002).
Tabela 4. CIM dos antibióticos tetraciclina, eritromicina e norfloxacino na ausência e na presença de concentração subinibitória de clorpromazina (controle positivo) e N-fenilmaleimidas Cepa (Bomba de efluxo) / Antibiótico utilizado (CIM do antibiótico µg/mL) Substâncias (¼ da CIM)
IS-58 (TetK) / Tetraciclina (64)
NFM
64
512
32 (2)*
4-F NFM
32 (2)*
512
64
3,4-Cl NFM
64
512
64
4-Cl NFM
64
512
64
4-NO2 NFM
16 (4)*
64 (4)*
64
4-CH3 NFM
16 (4)*
16 (16)*
16 (4)*
4-OCH3 NFM
32 (2)*
512
64
CPZ
32 (2)*
512
16 (4)*
RN4220 (MsrA) / Eritromicina (512)
SA-1199B (NorA) / Norfloxacino (64)
( )* Entre parênteses, fatores de redução da CIM
Estudos de Rozenski et al. (1995) relacionaram a ação antibacteriana com potencial redutor de alguns nitrocompostos, comprovando que esta bioatividade é decorrente da biorredução enzimática do grupo nitro, com formação do derivado hidroxilamina (PAULA; SERRANO; TAVARES, 2009). No entanto, nitrocompostos comumente têm sido alvos de inúmeras discussões visando esclarecimentos sobre a toxicidade. O cloranfenicol, nitrocomposto amplamente utilizado como antibacteriano, destaca-se por seus efeitos tóxicos como anemia aplásica e diversas outras discrasias sanguíneas como efeitos colaterais, a depender da dose administrada e o tempo de exposição ao fármaco (WERMUTH, 2000). A maleimida 4-CH3-NFM apresentou melhor atividade moduladora dentre as substâncias ensaiadas, com redução da CIM para os antibióticos: tetraciclina (4 vezes), eritromicina (16 vezes) e norfloxacino (4 vezes). É um dado importante, principalmente no que se refere ao antibiótico eritromicina, pois poucos moduladores em cepas que expressam bombas MsrA tem sido relatados, a exemplo do diterpeno Totarol, que reduziu em oito vezes a CIM do antibiótico frente a linhagem bacteriana RN4220 (SMITH et al., 2007), a mesma utilizada neste estudo. A proteína MsrA é considerada complexa devido ao fato de não apresentar o arsenal clássico dos transportadores ABC. No entanto, algum cuidado deve ser
exercido ao se mencionar uma substância como moduladora da resistência por meio desta proteína, pois há relatos de que esta proteína pode não ser de fato uma proteína de efluxo (REYNOLDS et al., 2003). Ainda sobre 4-CH3-NFM, a presença do grupo metil (-CH3) garante lipofilicidade adequada à molécula, uma característica relatada entre diversos inibidores putativos de bombas de efluxo (GIBBONS, 2004). De acordo com Zloh et al. (2004), a solubilidade destes compostos na membrana plasmática bacteriana é de grande importância na ligação ás proteínas de efluxo, bem como aos seus substratos. É importante mencionar que outras substâncias também consideradas lipofílicas, por introdução de halogênios no anel benzeno, tais como 4-Cl NFM e 3,4-Cl NFM, não apresentaram algum efeito sobre as bombas de efluxo. Átomos que compõem esta família tem volume substancialmente maior do que o hidrogênio, de modo a interferir na interação entre droga e receptor biológico (CAREY; SUNDBERG, 1993). Em outros sistemas bacterianos de efluxo, a exemplo das proteínas AcrAB e AcrEF em E. coli, o efeito inibidor do efluxo foi potencializado pela substituição halogênica no anel benzeno de arilpiperazinas (BOHNERT; KERN, 2005). Devido o efeito das imidas NFM e 4-CH3 NFM na modulação da resistência ao antibiótico norfloxacino, foi avaliada também a susceptibilidade frente a outras fluoroquinolonas e aos compostos NAB, ambos considerados importantes substratos para a bomba de efluxo NorA. A cepa SA-1199B, que superexpressa NorA, também possui uma substituição da subunidade GrlA da enzima girase, o que confere um elevado nível de resistência as fluoroquinolonas hidrofílicas, que inclui
norfloxacino e ciprofloxacino
(KAATZ; SEO, 1995). De acordo com a Tabela 5, a presença de 4-CH3-NFM reduziu a CIM de ciprofloxacino (2 vezes) e ácido nalidíxico (4 vezes). Concentração subinibitória de NFM aumentou a susceptibilidade destes antibióticos na mesma potência (2 vezes). O pefloxacino, uma fluoroquinolona hidrofóbica, não teve a CIM reduzida por não ser considerado um substrato para a bomba NorA e, desta forma, utilizado como controle negativo no ensaio (MARQUEZ et al., 2005). O efeito modulador de NFM e 4-CH3 NFM também foi avaliado em compostos NAB, tais como cloreto de benzalcônio e brometo de etídio. Ambos os derivados testados causaram
redução da CIM de duas vezes do cloreto de benzalcônio. No entanto, somente a 4-CH3 NFM foi capaz de modular a resistência a brometo de etídio ao reduzir a CIM em quatro vezes. Tabela 5. CIM dos antibióticos da classe das fluoroquinolonas e compostos NAB na linhagem SA-1199B (NorA) de S. aureus, na ausência e presença de clorpromazina (controle positivo), N-fenil-maleimida (NFM) e 4-CH3 N-fenil-maleimida (4-CH3-NFM), respectivamente. Antibióticos / Compostos NAB (CIM µg/mL)
CIM + ¼ CIM das subtâncias) + CPZ
+ NFM
+ 4-CH3 NFM
Norfloxacino
64
16 (4)
32 (2)
16 (4)
Ciprofloxacino
16
4 (4)
8 (2)
8 (2)
Pefloxacino
16
16
16
16
Ácido Nalidíxico
64
16 (4)
32 (2)
16 (4)
Brometo de etídio
64
32 (2)
64
16 (4)
Cloreto de benzalcônio
4
1 (4)
2 (2)
2 (2)
( )* Entre parênteses, fatores de redução da CIM
Este último resultado é de grande relevância no estudo, pois a única forma de resistência adquirida pelo brometo de etídio ocorre exclusivamente por bombas de efluxo o qual o mesmo seja substrato. A sua susceptibilidade na presença e na ausência de inibidores de bombas de efluxo tem sido usada como um ensaio que avalia mecanismos de resistência relacionada ao efluxo de fármacos (DEMARCO et al., 2007). Além da proteína NorA, o brometo de etídio pode ser substrato em outras bombas de efluxo. A análise da sequência do genoma de S. aureus sugere que mais de 30 Orf’s, codificam bombas de efluxo putativas no cromossoma desta bactéria, apesar de que poucas tenham sido descritas até o momento (TRUONG-BOLDUC et al., 2006; YAMADA et al., 2006; DEMARCO et al., 2007). Este fato deu respaldo para explicar o efeito significativo obtido com o derivado tilirosídeo, que modulou 128 vezes na presença do brometo de etídio (FALCÃO-SILVA et al., 2009). Com a 4-CH3-NFM o efeito modulador não foi tão marcante, no entanto seria prematuro afirmar que este derivado não atuaria em tantas bombas de efluxo, como o faz o tilirosídeo. De acordo com estes resultados, foi mostrado que derivados imídicos podem ser utilizados para potenciar o efeito de agentes antimicrobianos, de modo a permitir a reintrodução de antibióticos atualmente ineficazes para o tratamento clínico de infecções multirresistentes.
5.3 RISCO DE TOXICIDADE in silico
Para a avaliação do risco de toxicidade das N-Fenilmaleimida e de alguns antibióticos utilizados na terapêutica, as moléculas foram analisadas in silico por meio do software Osiris® Property Explorer (2001). O programa pode apontar para a presença de fragmentos de moléculas geralmente responsáveis por efeitos irritantes, mutagênicos, tumorigênicos ou reprodutivos, baseado em uma coleção de 5300 fragmentos moleculares, obtidos de 3300 fármacos comerciais e 15000 compostos da coleção Fluka, fármacos não comerciais. No entanto, é importante ressaltar que os alertas de risco são considerados apenas um indicativo de que a molécula possua um fragmento que cause efeito tóxico, de modo a orientar a seleção ou alteração estrutural de compostos para futuros estudos in vitro e in vivo. Como mostra a Tabela 6, os derivados 3,4-Cl NFM e 4-CH3-NFM, que apresentaram melhor atividade antibacteriana e efeito modulador da resistência, respectivamente, mostraram perfil com baixo risco teórico para os efeitos mutagênico, tumorigênico, irritante e reprodutivo. Tabela 6. Risco de toxicidade calculado das N-Fenilmaleimidas e de alguns antibióticos (Avaliação do nível de risco: 1 = risco baixo, 2 = risco médio, 3 = risco alto) Substâncias
Risco de toxicidade Mutagênico
Tumorigênico
Irritante
Reprodutivo
NFM
1
1
3
1
3,4-Cl NFM
1
1
1
1
4-CH3 NFM
1
1
1
1
4-NO2 NFM
3
3
2
2
4-Cl NFM
1
1
3
1
4-OCH3 NFM
3
2
1
1
4-F NFM
1
1
1
1
Tetraciclina
1
1
1
1
Ciprofloxacino
3
1
1
2
Oxacilina
1
1
1
1
Cloranfenicol
3
3
1
3
O derivado 4-Cl NFM, que também apresentou efeito antibacteriano relevante, obteve um perfil de alto risco para o efeito irritante, porém com resultado teórico geral melhor do que alguns antibióticos comercialmente disponíveis, tais como ciprofloxacino e cloranfenicol. Dentre os raros estudos relativos à toxicidade de imidas cíclicas pode-se citar o de Reynolds et al. (1994), que avaliaram em ratas o efeito de quatro estruturas diferentes de imidas cíclicas. Os autores verificaram ausência de efeitos deletérios quando administradas por sete dias. Contudo, foi observada a redução do número de gestações, sem, porém, apresentarem efeitos teratogênicos, nem sobre a fertilidade dos animais machos. Entretanto, após o evento Talidomida e suas conhecidas consequências, seguiu-se um hiato, com ausência de estudos voltados para a aplicação, efeito e mecanismo de ação dessa classe de compostos (PRADO, 2005). Apesar de reconhecidamente preliminar, os resultados estimulam a continuação do estudo, principalmente no que tange aos ensaios in vivo, onde testes com perfil mais sistêmico devem ser realizados. Análises complementares de modelagem molecular podem ajudar a sugerir modificações estruturais que possam aprimorar a atividade destes derivados, e mesmo que o estudo teórico possua limitações quanto à predição dos resultados e dos alertas de risco toxicológico, aumenta a importância da associação com análise toxicológica in vivo para outras avaliações farmacológicas destes derivados.
Conclusões
De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se concluir que: Os
derivados
3,4-Cl-N-Fenilmaleimida,
4-Cl-N-Fenilmaleimida
e
4-CH3-N-
Fenilmaleimida apresentaram atividade moderada frente a cepas clínicas de S. aureus; A substância que apresentou menor CIM, a 3,4-Cl-N-Fenilmaleimida, foi o composto mais lipofílico, característica importante para a penetração das moléculas em membranas biológicas; N-Fenilmaleimida,
4-CH3-N-Fenilmaleimida,
4-F-N-Fenilmaleimida,
4-NO2-N-
Fenilmaleimida, 4-CH3-N-Fenilmaleimida foram capazes de modular a resistência aos antibióticos: tetraciclina, eritromicina e norfloxacino; N-Fenilmaleimida e 4-CH3-N-Fenilmaleimida apresentaram atividade moduladora frente a outros substratos da bomba NorA, tais como ciprofloxacino e ácido nalidíxico e cloreto de benzalcônio; O derivado 4-CH3-N-Fenilmaleimida foi o único que modulou a resistência ao brometo de etídio, sendo assim, considerado de fato como inibidor putativo do sistema de efluxo em bactéria; Os derivados 3,4-Cl N-Fenilmaleimida e 4-CH3-N-Fenilmaleimida, que apresentaram melhor atividade antibacteriana e moduladora da resistência, respectivamente, mostraram perfil com baixo risco teórico para os efeitos mutagênico, tumorigênico, irritante e reprodutivo.
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