Tierärztliche Hochschule Hannover

Nachweis von Rhodococcus equi in Kot und Trachealsekret bei Fohlen: Vergleichende Untersuchung zwischen gesunden Fohlen und Fohlen mit Lungenabszessen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae – ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Marc Lämmer Kaufungen (Hess.)

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung:

PD. Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD. Klinik für Pferde, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachterin:

PD. Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD.

2. Gutachter:

Univ.- Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann

Tag der mündlichen Prüfung:

21. Mai 2010

Meinen Eltern und Birgit und Wolfgang Kähn

INHALTSVERZEICHNIS 1

EINLEITUNG .................................................................................. 13

2

LITERATURÜBERSICHT ............................................................... 15

2.1

Atemwegsinfektionen bei Fohlen ............................................................... 15

2.2

Rhodococcus equi ....................................................................................... 16

2.2.2 Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi.................................. 17 2.2.3 Morphologie, Kultivierung und biochemische Eigenschaften ..................... 18 2.2.4 Virulenzfaktoren ......................................................................................... 20 2.2.5 Rhodococcus equi bedingte Erkrankungen bei Fohlen ................................ 21 2.2.6 Pathogenese der Rhodokokkose ................................................................. 23 2.3 Diagnose von Rhodococcus equi-Erkrankungen bei Fohlen ....................... 24 2.3.1 Hämatologische Parameter .......................................................................... 25 2.3.2 Bildgebende Verfahren ................................................................................ 25 2.3.3 Nachweis von R. equi .................................................................................. 27 2.3.4 Ausscheidung von R. equi beim Pferd ......................................................... 29 2.3.5 Pathologie und Pathohistologie der R. equi-Pneumonie .............................. 31 2.4 Therapie der R. equi-Pneumonie des Fohlens ............................................... 32

3

MATERIAL UND METHODE .......................................................... 34

3.1

Material ......................................................................................................... 34

3.1.1 Probanden .................................................................................................. 34 3.1.2 Haltung und Management der neonaten Fohlen ........................................ 34 3.1.3 Haltung und Management der älteren Fohlen ............................................ 35 3.1.4 Impfung und Entwurmung .......................................................................... 35

3.2.1 Methode ........................................................................................................ 36 3.2.1 Klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen ............................................ 36 3.2.2 Spezielle klinische Untersuchung des Respirationstrakts .......................... 36 3.2.3 Labordiagnostische Untersuchung ............................................................. 38 3.2.4 Ultrasonographische Untersuchung der Lungen ........................................ 38 3.2.5 Röntgenologische Lungenuntersuchung .................................................... 39 3.3

Probenentnahme.......................................................................................... 40

3.3.1 Aufnahmekriterien und Gruppeneinteilung der Fohlen ............................... 40 3.3.2 Zeitpunkt der Gewinnung von Tracheobronchialsekret und Kotproben ..... 41 3.3.3 Endoskopische Probenentnahme aus der Trachea (TBS .......................... 42 3.3.4 Kotprobrnentnahme.................................................................................... 43 3.3.5 Handhabung der Proben nach der Entnahme ............................................ 44 3.3.6 Mikrobiologische Untersuchung ................................................................. 44 3.3.7 Mikroskopische Beurteilung ....................................................................... 45 3.3.8 Statistische Auswertung ............................................................................. 46

4

ERGEBNISSE ................................................................................ 49

4.1

Anzahl und Geschlecht der Fohlen ............................................................ 49

4.2

Alter der Fohlen zu Studienbeginn............................................................. 49

4.3

Befunde der klinischen Lungenuntersuchung zu Studienbeginn ........... 50

4.4

Blutleukozytenzahl bei den Fohlen zu Studienbeginn ............................. 51

4.5

Befunde der sonographischen Lungenuntersuchung zu Studienbeginn 52

4.6

Nachweis von Rhodococcus equi im Kot und Tracheobronchialsekret . 53

4.6.1 R. equi-Nachweis im Tracheobronchialsekret an Tag 0, Tag 7 und ........... 53 Tag 14 ................................................................................................................... 53 4.6.2 R. equi-Nachweis im Kot an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 ............................... 55

4.7

Zusammenhang des Nachweises von R. equi im Kot und im

Tracheobronchialsekret ......................................................................................... 57 4.8

Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi

bei den drei Fohlengruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase ............... 58 4.8.1 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret am Tag 0 ........................................................................ 58 4.8.2 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Kot am Tag 0 ........................................................................................................ 59 4.9

Zusammenhang des Nachweises von R. equi und dem

Blutleukozytenwert am Tag der Diagnose in allen drei Fohlengruppen ............ 60 4.9.1 Blutleukozytenwert und Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret bei den drei Fohlengruppen am Tag 0 .................................................................. 60 4.9.2 Blutleukozytenwert und Nachweis von R. equi im Kot bei den drei Fohlengruppen am Tag 0 ...................................................................................... 60 4.10

Zusammenhang des Nachweises von R. equi und dem Abszess-Score

am Tag der Diagnose in allen drei Fohlengruppen ............................................. 61 4.10.1 Zusammenhang des Abszess-Score und des R. equi-Nachweises im TBS der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0) ......................................... 61 4.10.2 Zusammenhang des Abszess-Score und des R. equi-Nachweises im Kot der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0) ......................................... 62 4.11

Vergleich des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret über

die zweiwöchige Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen ................... 64 4.12

Vergleich des Nachweises von R. equi im Kot über die zweiwöchige

Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen ................................................ 66 4.13

Nachweis von R. equi über die zweiwöchige Beobachtungsphase in den

drei Fohlengruppen ................................................................................................ 68

5

DISKUSSION.................................................................................. 71

5.1

Probanden .................................................................................................... 71

5.2

Probenentnahme.......................................................................................... 72

5.3

Ergebnisse ................................................................................................... 73

5.3.1 Beziehung zwischen dem Erkrankungsalter der Fohlen und dem .............. 73 Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret und im Kot .............................. 73 5.3.2 Gegenüberstellung der kulturellen Anzucht von R. equi aus dem Tracheobronchialsekret und Kot mit den Befunden der klinischen und sonographischen Untersuchung ........................................................................... 74 5.3.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der kulturellen Anzucht von R. equi aus Tracheobronchialsekret und Kot ........................................................................... 77 5.4

Schlussfolgerung......................................................................................... 78

6

ZUSAMMENFASSUNG .................................................................. 80

7

SUMMARY ..................................................................................... 82

8

LITERATURVERZEICHNIS ............................................................ 84

9

ANHANG…………………………………………………………….…105

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen A

Abszess

Abb.

Abbildung

AG

Aktiengesellschaft

AGID

Agar-Gel-Immundiffusionstest

Art. Nr.

Artikelnummer

BAL

Bronchoalveoläre Lavage

bzw.

beziehungsweise

C

Celsius

ca.

circa

CAMP

Christie-Aktins-Munch-Petersen

cm

Centimeter

CRP

C-reaktives-Protein

d

Day

dest.

destillata

dl

Deziliter

DNA

Desoxyribonukleinsäure

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

EHV

Equines Herpes Virus

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assey

g

Gramm

ggr.

geringgradig

GmbH

Gesellschaft mit beschränkter Haftung

h

Stunde

HIV

Humanes Immundefizienz Virus

hgr.

hochgradig

IgG

Immunglobulin G

i. m.

intramuskulär

i. v.

intravenös

kb

Kilobase

kDA

Kilodalton

kg

Kilogramm

KM

Körpermasse

kV

Kilovolt

l

Liter

Lnn

Lymphonodii

m

Meter

M.

Musculus

mAs

Milliampere-Sekunde

mg

Milligramm

mgr.

mittelgradig

MHz

Megahertz

min.

Minute

ml

Milliliter

mm

Millimeter

MW

Mittelwert

µl

Mikroliter

µm

Mikrometer

n

Anzahl

NANAT

Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit

Nr.

Nummer

o.b.B.

ohne besonderen Befund

PCR

Polymerase-Chain-Reaction

Pn

Pneumonie

RNA

Ribonukleinsäure

s.

siehe

SAA

Serum-Amyloid A

spp.

species

Staph.

Staphylokokkus

Stdabw.

Standartabweichung

Strep.

Streptokokkus

Tab.

Tabelle

TBS

Tracheobronchialsekret

TCP

Trimethoprim-Cefoperazon-Polymyxin B

u. a.

unter anderem

U

Unit

Vap

Virulenz assoziiertes Protein

z.B.

zum Beispiel

♀

weiblich

♂

männlich

Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt

1. Einleitung _________________________________________________________________________________

1

Einleitung

Atemwegserkrankungen gehören bei Fohlen im Alter von bis zu sechs Monaten zu den häufigsten Erkrankungen. Dafür gibt es zahlreiche Ursachen. Wobei einer der häufigsten

bakteriellen

Auslöser

von

schweren

Pneumonien

bei

Fohlen

Rhodococcus equi ist. Rhodococcus equi (R. equi) ist ein weltweit verbreiteter Infektionserreger, der bei Fohlen zu Bronchopneumonien und pyogranulomatösen Entzündungen der Lunge führt. Die Erkrankung kann sowohl sporadisch als auch endemisch in Zuchtbetrieben auftreten. In betroffenen Beständen liegt die Morbidität bei bis zu 80 %, die Mortalität bei 5 % bis 17 %. Die Krankheit verläuft über mehrere Wochen subklinisch. Deshalb werden die kranken Fohlen häufig erst spät für den Besitzer auffällig, obwohl bereits zahlreiche Lungenabszesse vorliegen. Oft sind die Lungenveränderungen daher sehr fortgeschritten, wenn die Diagnose gestellt wird. Nur durch eine frühe Diagnose und eine gezielte antibiotische Therapie lassen sich die Verluste bei den Fohlen reduzieren. Durch die antibiotische Therapie kann die Überlebensrate von 20 % auf bis zu 90 % gesteigert werden. Die Therapie sollte mindestens vier Wochen durchgeführt werden, sie kann in manchen Fällen bis zu neun Wochen erfordern und ist deshalb sehr kostenaufwendig. In endemisch betroffenen Betrieben wird daher zu einem Screeningsystem geraten, da die frühestmögliche Erkennung der R. equi- Pneumonie die Prognose verbessert und eine kürzere Behandlungsdauer ermöglicht. Die weltweite Verbreitung von R. equi in der Umwelt und die ausgesprochene Widerstandsfähigkeit des Keims im Boden und im Kot von Pferden erklären den Verbleib und das Vorkommen auf endemisch betroffenen Betrieben. Die Fohlen infizieren sich durch aerogene Aufnahme von kontaminierter, staubiger Luft und möglicherweise durch die orale Aufnahme von Kot.

13

1. Einleitung _________________________________________________________________________________

Um eine Infektion bei den Tieren nachzuweisen oder eine Verdachtsdiagnose zu bestätigen, werden Proben aus den tieferen Atemwegen oder Kotproben empfohlen. Die Diagnose über die exspiratorische Atemluft konnte nicht als sicheres Diagnostikum bestätigt werden. Der Nachweis des Erregers ist über die kulturelle Anzucht am zuverlässigsten, jedoch durch die intrazelluläre Überlebensstrategie des Erregers nicht immer möglich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob der kulturelle Nachweis von R. equi aus den Atemwegen mit dem Nachweis aus Kot bei gesunden und bei kranken Fohlen vergleichbar ist. Weiterhin soll untersucht werden, wie lange erkrankte Fohlen unter antibiotischer Therapie R. equi über die Atemwege und den Kot ausscheiden. Daraus liesse sich der richtige Zeitpunkt bestimmen, zu dem ein behandeltes Fohlen wieder in eine Pferde-Gruppe integriert werden kann.

14

2. Literaturübersicht

2

Literaturübersicht

2.1

Atemwegsinfektionen bei Fohlen

Atemwegsinfektionen und Durchfallerkrankungen sind die häufigsten Krankheits- und Todesursachen bei Fohlen bis zum sechsten Lebensmonat (LEENDERTSE u. KÖHLER 1996). Die Gesundheit der jungen Tiere kann durch den Verlauf der Trächtigkeit, den Zeitpunkt und den Verlauf der Geburt, aber auch die Haltungs- und Umweltbedingungen, das Stallklima, die Besatzdichte und die Witterung beeinflusst werden (BEECH 1985; BOSTEDT 1999). Aber nicht nur äußere Umstände können bei Fohlen die Entstehung der Lungenerkrankungen fördern, sondern auch anatomische Besonderheiten des juvenilen Atmungsapparates, wie z.B. die zur Lungenoberfläche verhältnismäßig kleinen Alveolen und die bei der Geburt noch unzureichend entwickelte mukoziliäre Clearance (BEECH 1985). Demzufolge sind die Ursachen für eine auftretende Erkrankung nach einer Infektion meist multifaktoriell. Als Krankheitsursache müssen daher viele verschiedene Erreger in Betracht gezogen werden. Von besonderer Bedeutung als virale Erreger von Atemwegsinfektionen sind Herpesviren der Serotypen 1 und 2, Influenzaviren, Adenoviren und das Equine Arteriitis Virus (BOSTEDT 1999). Diese und andere Viren werden ebenso wie Endoparasiten, wie z.B. Parascaris equorum als Wegbereiter für bakterielle Infektionen angesehen (BEECH 1985; CHAPMAN 2000; TIMONEY 2004; VARGA et al. 1997). Pilze, wie Aspergillus spp., Sporozoa und Hefen wie Histoplasma capsulatum und Pneumocystis carinii werden bei Fohlen wie auch bei Säuglingen immer wieder im Zusammenhang mit Atemwegsinfektionen genannt (BEECH u. SWEENEY 1991; PERRON-LAPAGE et. al. 1999).

15

2. Literaturübersicht

2.2

Rhodococcus equi

2.2.1 Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung

Die erste Beschreibung von Rhodococcus equi (R. equi) als Erreger von eitriger Bronchopneumonie bei Fohlen geht auf MAGNUSSON (1923) in Schweden zurück. Zunächst ordnete MAGNUSSON den Erreger, den er beschrieb, auf Grund seiner Unbeweglichkeit, der fehlenden Sporenbildung, der grampositiven Anfärbbarkeit, der Pleomorphie und der Indolbildung der Gattung Corynebakterium zu. In Deutschland wurde im selben Jahr von MIESSNER und WETZEL (1923) der gleiche Erreger isoliert. Die Autoren bezeichneten ihn auf

Grund seiner

eiterbildenden Eigenschaften als Corynebakterium pyogenes equi. LÜTJE schlug ebenfalls 1923 vor, den Erreger Corynebakterium pyogenes equi roseum zu nennen. In den folgenden Jahren wurde der Erreger weltweit von unterschiedlichen Autoren isoliert, u.a. von BULL (1924) in Australien, von DIMOCK und EDWARDS (1931) in den USA, in Indien durch RAJAGOPLANA (1936) und durch die Engländer CRAIG und DAVIES (1940) in Großbritannien. Nachdem es möglich wurde den Erreger durch moderne Methoden besser zu untersuchen und eine Ähnlichkeit zu Mykobakterien festgestellt wurde, entstand die Benennung Mycobacterium equi (JENSEN 1934; KRASIL’NIKOV 1966). GORDON wollte 1966 das Bakterium auf Grund seiner Eigenschaften zwischen Mykobakterien und Nocardien als neue Spezies mit dem Namen Mycobacterium rhodochrous einordnen. Nachdem man die Erkenntnis hatte, dass in der Zellwand des Erregers N-glykolierte Muraminreste enthalten sind (UCHIDA u. KO 1977), welche man sonst nur bei Mykobakterien, Nokardien und Rhodokokken kannte, wurde der Erreger nach Vorschlägen von GOODFELLOW und ALDERSON (1977) in Rhodococcus equi umbenannt. Die Bezeichnung Rhodococcus ist auf Grund seiner unterschiedlichen Morphologie, von stäbchenförmig bis kugelig (rod to coccus), gewählt worden (PRESCOTT 1991).

16

2. Literaturübersicht

2.2.2 Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi

Rhodococcus equi (R. equi) ist ein ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt mit ausgesprochen hoher Tenazität (KNOTTENBELT 1993; MAKRAI et al. 2002; MEYER-HAMME 2004; MUSCATELLO et. al. 2006). Es ist möglich R. equi weltweit, außer in der Antarktis, nachzuweisen (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986). Der Nachweis gelang 1984 (BARTON u. HUGHES) nicht nur bei Pferden, sondern auch bei Rindern, Schafen, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Außerdem wurde gezeigt, dass sich der Erreger innerhalb von 14 Tagen bei allen Tierarten, bei denen er nachgewiesen wurde, um das 10.000 fache vermehren kann. JENSEN (1934) konnte den Keim aus Böden ohne Tierpopulation isolieren, jedoch wird der Keim in Gegenden mit Tierhaltungen vermehrt angetroffen. Dass es sich bei dem Bakterium um einen Bestandteil der physiologischen Darmflora handelt, wurde 1980 von WOOLCOCK, MUTIMER und FARMER publiziert. R. equi kann im Frühjahr ab April und über die Sommermonate in der nördlichen Hemisphäre in steigenden Konzentrationen im Boden isoliert werden (TAKAI et. al. 1987). Das Überleben des Erregers in der Umwelt ist von verschiedenen Faktoren abhängig. R. equi ist ein obligat aerober Keim, der sein Wachstumsoptimum bei einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5 und einer Temperatur von ca. 30° C hat. Ausreichende Konzentrationen von Propionat oder Acetat im Pferdekot können das Wachstum des Erregers

positiv

beeinflussen

(HUGHES

u.

SULAIMAN

1987).

Seine

Widerstandsfähigkeit gegenüber Säuren, Basen und Desinfektionsmitteln ist von diversen Autoren beschrieben worden (MAGNUSSON 1938; WILSON 1955; BARTON u. HUGHES 1980; TAKAI et. al. 1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993). R. equi ist für unterschiedliche Krankheitsgeschehen bei Mensch und Tier verantwortlich (PRESCOTT 1991; HONDALUS 1997; TKACUK-SAAD et al. 1998; HYLTON et al. 2006). In der Humanmedizin ist der Keim vor allem bei immunsuppremierten Patienten mit dem HI-Virus als pathogener Keim in Erscheinung getreten (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).

17

2. Literaturübersicht

In der Veterinärmedizin ist der wichtigste Wirt von R. equi das Fohlen. Bei Fohlen im Alter von bis zu sechs Monaten führt R. equi vor allem während der Sommermonate, also in der Zeit, in der die Konzentration des Erregers in der Umwelt am höchsten ist (TAKAI et al. 1987), zu abszedierenden Bronchopneumonien, die sporadisch oder endemisch auftreten können (MAGNUSSON 1923; WILSON 1955; PRESCOTT et al. 1984; YAGER 1987; BEECH u. SWEENEY 1991; AINSWORTH 1999; ALTHAUS 2004). Der Krankheitsverlauf soll nach TAKAI et. al. (1991, 1994) allerdings nicht mit dem Keimdruck, sondern mit dem Vorhandensein des Virulenzproteins A (Vap A) korrelieren. Die Morbidität durch R. equi-Infektionen bei Fohlen eines Betriebes mit endemischer Rhodokokkose liegt zwischen 5 % und 60 %, bei einer Letalität von 40 % bis 80 % und einer Mortalität von 5 % bis 17 %. Die Todesfälle zeigen eine Häufung im Lebensalter von zwei Monaten (BEECH u. SWEENEY 1991). Es treten bei ca. 50 % der an R. equi erkrankten Fohlen zusätzlich extrapulmonale Erkrankungsanzeichen auf (CIMPRICH u. ROONEY 1977; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999). Adulte Pferde erkranken im Gegensatz zu Fohlen äußerst selten, sie können aber Träger bzw. Überträger des Bakteriums sein und R. equi kann bei Infektionen des Genitaltraktes der Stute, bei Fertilitätsproblemen und Abortgeschehen eine Rolle spielen (BRUNER et al. 1939; SIPPEL et al. 1968; SZEREDI et al. 2006). Infektionswege für den Erreger sind vor allem das Einatmen von R. equi-haltigem Staub und die orale Aufnahme von kontaminiertem Kot (PRESCOTT et al. 1985). Eine weitere Möglichkeit sind omphalogene und intrauterine Infektionswege und eine kontaminierte Umgebung (BARTON u. HUGHES 1980; BEECH u. SWEENEY 1991; MUSCATELLO et al. 2006).

2.2.3 Morphologie, Kultivierung und biochemische Eigenschaften

Rhodococcus equi ist ein grampositives, säurefestes, pleomorphes, unbewegliches, ca. 1,2 x 1,4 µm großes Stäbchen mit einer Polysaccharidkapsel (WILSON 1955;

18

2. Literaturübersicht

SMITH 1966; WOOLCOCK u. MUTIMER 1978; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997). R. equi ist obligat aerob und stellt keine besonderen Ansprüche an Nährmedien (PRESCOTT 1991; TAKAI et al. 1994, 1996). Das Bakterium wächst auf bluthaltigen Nährböden ohne Hämolyse, in feuchten, großen Kolonien, die zunächst schleimig weiß-grau glänzend erscheinen, bis sie nach 48 h Bebrütung zu rötlichlachsfarbenen, 1-4 mm großen Kolonien mit erdigem

Geruch konfluieren

(MIESSNER u. WETZEL 1923; MUTIMER u. WOOLCOCK 1981; PRESCOTT 1991). In flüssigen Medien können bazilläre Formen zu beobachten sein, diese sind teilweise in der Lage Verzweigungen zu bilden (GOODFELLOW 1989; PRESCOTT 1991). Zur kulturellen Anzucht eignen sich das NANAT-Selektivmedium (NalidixinAcid-Novobiocin-Acid-Tellurit), auf dem das Bakterium in schwarzen Kolonien wächst (WOOLCOCK et al. 1979; BARTON u. HUGHES 1981; MUSCATELLO u. BROWNING 2004) und das CAZ-NB-Agar (Ceftazidim-Novobiocin) nach VON GRAEVENITZ und PÜNTER-STREIT (1995). Auf Blutagar haben MUTIMER und WOOLCOCK (1981) eine Unterscheidung von vier Typen nach der jeweiligen Morphologie, von klassisch-schleimig bis sehr klein und trocken, vorgenommen. Das optimale Wachstumsmilieu für R. equi liegt bei 37°Celsius. Überleben ist den Isolaten jedoch auch noch bei Temperaturen zwischen 10° und 40°C möglich. Ein schwach saurer pH-Wert zwischen 6 und 8 begünstigen das Wachstum des Bakteriums (MAGNUSSON 1923; BARTON u. HUGHES 1980). Während der mikroskopischen Untersuchung ist eine Veränderung von R. equi je nach Bebrütungsdauer zu erkennen. Nach einer Inkubation von 6 h zeigen die Kulturen eine eher bazilläre Form, wohingegen nach einer Bebrütung von 24 h kokkoide Formen dominieren (Mc NEIL u. BROWN 1994). Diese Veränderung der Gestalt

entsteht

durch

Fragmentierung

der

stäbchenförmigen

Keime

(GOODFELLOW 1989). Die Größe und Form von R. equi variieren je nach Milieu und Temperatur der Bebrütung (MAGNUSSON 1938; ROGOSA et al. 1974). Mikroskopisch stellt sich das einzelne Bakterium in einer Größe von 1 µm im Durchmesser und ca. 2 µm in der Länge dar und es kann einzeln, paarweise oder in Haufen zu sehen sein (BOHN u. ROTHSCHILD 2002).

19

2. Literaturübersicht

Die charakteristischen biochemischen Eigenschaften von R. equi sind die Bildung von Urease und Katalase, sowie von Lipase und Phosphatase und die Reduktion von Nitrat. Einige Stämme bilden Schwefelwasserstoff oder hydrolysieren Hippurat und Äskulin oder zeigen eine positive Leucin-Arylamidase-, Varyl-Arylamidase- und αGlucosidasereaktion (SIPPEL et al. 1968; BARTON u. HUGHES 1980; MUTIMER u, WOOLCOCK 1981, 1983; PRESCOTT 1991) R. equi kann verschiedene Kohlenstoffquellen wie Alkohole und Natriumlaktat nutzen (GOODFELLOW 1986), auch kann es Kaliumnitrat und Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle verwenden (ROWBOTHAM u. CROSS 1977; PRADIP et al. 1966) und Glucose verstoffwechseln (Mc NEIL u. BROWN 1994).

2.2.4 Virulenzfaktoren

Die Virulenz von R. equi ist auf die Fähigkeit zurückzuführen, dass das Bakterium sich in Makrophagen vermehren und dort von immunschwachen Individuen nicht erfolgreich bekämpft werden kann (HONDULAS u. MOSER 1994). Dies ist dem Erreger möglich, weil er in der Lage ist, die endosomale Reifung der Makrophagen zu beeinflussen und die Ansäuerung der Vakuole, in der er sich befindet, zu verhindern (ZINK et al. 1987; FERNANDEZ-MORA et al. 2005; TOYOOKA et al. 2005). Es wird vermutet, dass R. equi-Stämme nicht immer die gleichen Virulenzfaktoren besitzen, da das Bakterium zwar in den meisten Pferdebeständen nachgewiesen werden kann, jedoch nicht immer zu endemischen Krankheitsausbrüchen bei Fohlen führt (ROONEY 1966). Es besteht auch ein großer Unterschied in der Virulenz zwischen R. equi-Stämmen aus endemisch-infizierten Betrieben und Stämmen aus Betrieben ohne Krankheitsausbrüche, die auf R. equi zurückzuführen sind (BOWLES et al. 1987; TAKAI et al. 1991). Außerdem weisen Isolate, die man von klinisch kranken Fohlen gewonnen hat, eine höhere Virulenz als Isolate aus der Umgebung auf (ROONEY 1966).

20

2. Literaturübersicht

Mögliche Virulenzfaktoren sind so genannte „Equi-Faktoren“. Als „Equi-Faktoren“ bezeichnet man Exoenzyme mit membranolytischen Eigenschaften, zum Beispiel Cholesteroloxidase

und

Phospholipase

C.

Möglicherweise

spielen

auch

Kapselpolysaccharide eine Rolle, indem sie die Phagozytose des Wirts verhindern (PRESCOTT et al. 1982, 1984; HONDALUS 1997). Der wichtigste Virulenzfaktor von R. equi ist jedoch das Protein Vap A (Virulence associated protein A), ein 15 - 17 kDa großes Protein, welches auf der Bakterienoberfläche exprimiert wird (TAKAI et al. 1995; GIGUÈRE et al. 1999; LÜHRMANN et al. 2004). Das Vap A Gen ist auf einem Plasmid von 80 – 85 kb Größe lokalisiert, welches ausschließlich von virulentem R. equi-Stämmen exprimiert wird. Avirulenten Stämmen, die das Vap A-Gen nicht bilden können, fehlt durch das fehlende Gen die Fähigkeit sich in Makrophagen zu vermehren (HONDALUS u. MOSSER 1994; WADA et al. 1997; GIGUÈRE et al. 1999; MEIJER u. PRESCOTT 2004). Das Vorhandensein des Vap A -Gens wird durch einen pH-Wert von 5,0 bis 6,5 und eine Temperatur von 37° bis 38° C und eine erhöhte Eisenkonzentration begünstigt. Hingegen hemmt ein Magnesiummangel die Expression des Proteins auf der Bakterienoberfläche (TAKAI et al. 1996; JORDAN et al. 2003; MEIJER u. PRESCOTT 2004). Es sind weitere sieben extrazelluläre Proteine bekannt, die in der Lage sind, Vap-Gene zu kodieren (BYRNE et al. 2001; POLIDORI u. HAAS 2006). Das Vap B-Gen konnte von TAKAI (1996) und LÜHRMANN et al. (2004) isoliert werden, es ist ein 20 kDa großes Protein, das in R. equi-Stämmen erkrankter Hausschweine gefunden wurde.

2.2.5 Rhodococcus equi bedingte Erkrankungen bei Fohlen

Die charakteristische Erkrankung, die durch R. equi bei Fohlen hervorgerufen wird, ist eine abszedierende Bronchopneumonie mit eitriger Lymphadenitis. Dieses Krankheitsgeschehen tritt meist im Alter von bis zu sechs Monaten auf und bleibt klinisch inapparent, bis die durch den Erreger hervorgerufenen Läsionen in einem

21

2. Literaturübersicht

fortgeschrittenen Stadium sind. Die Symptome der R. equi-Erkrankung sind nicht pathognomisch, sondern gleichen Befunden von Lungenerkrankungen, die auch von anderen Erregern hervorgerufen werden können (BEECH u. SWEENEY 1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999; ALTHAUS 2004). Es wird bei der R. equi -Erkrankung zwischen perakuten, akuten und chronischen Verlaufsformen unterschieden. Bei der perakuten Verlaufsform sind die klinischen Anzeichen plötzliche Atemnot und hohes Fieber bei zuvor unauffälligen Tieren. Der perakute Verlauf der Infektion hat nicht selten den Tod des betroffenen Fohlens zu Folge (MARTENS et al. 1982; BEECH u. SWEENEY 1991). Bei der akuten Verlaufsform kann hohes Fieber (bis 41,5°C), Lethargie, Tachypnoe, Husten, abdominal verstärkte Atmung, Inappetenz und ein- oder beidseitiger muköser bis purulenter Nasenausfluss beobachtet werden. Bei einer eingehenden Untersuchung der Lunge können auskultatorisch ein verschärftes Atemgeräusch, Rasseln oder Giemen in der Lunge und Trachea festgestellt werden. Die Befunde der Auskultation sind

meist

im

kranioventralen

Thoraxbereich

verstärkt

festzustellen.

Die

Atemgeräusche können durch eine Bronchopneumonie oder fokal durch Abszesse vermindert

sein,

was

einen

Rückschluss

zwischen

Atemgeräusch

und

Krankheitszustand nicht zulässig macht (MARTENS et al. 1982; FALCON et al. 1985; BEECH u. SWEENEY 1991; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999). Der chronische Verlauf der R. equi-Erkrankung stellt sich mit deutlich abgeschwächten Symptomen dar. Zusätzlich können typische Anzeichen von chronischen Erkrankungen, wie Abmagerung und struppiges Haarkleid oder trockener Husten, festgestellt werden (FALCON et al. 1985). Die Lungenabszesse, die durch R. equi bei Fohlen auftreten, können in allen Bereichen der Lunge und in allen Größen vereinzelt sowie zahlreich nachgewiesen werden. Bei einer geringen Anzahl und einem kleinem Abszess-Durchmesser (bis max. 5,0 cm) kann es bei diesen Lungenabszessen auch zu Spontanheilungen kommen (GRAVERT 2006). Im Zusammenhang mit R. equi-Infektionen werden selten auch extrapulmonale Krankheitsbilder beobachtet. So können Abszesse nicht nur im Lungengewebe

22

2. Literaturübersicht

sondern auch intrathorakal, intraabdominal, intrakranial, vertebral und paravertebral nachgewiesen werden (CHAFFIN et al. 1995; WION et al. 2001; BOHN u. ROTHSCHILD 2002; VALDES u. JOHNSON 2005; JANICEK et al. 2006). Weiterhin treten bei ca. 50% der an R. equi erkrankten Fohlen Durchfälle und Kolik auf, die durch eine ulzerative Typhlocolitis hervorgerufen werden (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; CHAFFIN u. MARTENS 1997; HONDALUS, 1997). Vereinzelt können auch septische Arthritiden oder Osteomyelitiden und Polysynovitis auftreten (MARKEL et al. 1988; MADISON u. SCARRATT 1990; FIRTH et al. 1993; GIGUÈRE u. LAVOIE 1994; OLCHOWY 1994; COLLATOS et al. 1999). Weiterhin sind Uveitis, Hypopyon, Anämie und Thrombozytopenie beschrieben (BLOGG et al. 1983; CHAFFIN u. MARTENS 1997). Infektionen mit R. equi führen in einzelnen Fällen auch

bei

adulten

Pferden

in

stark

abgeschwächter

Form

zu

denselben

Krankheitsbildern wie beim Fohlen (PRESCOTT 1991).

2.2.6 Pathogenese der Rhodokokkose

Erkrankungen durch R. equi sind in einigen Pferdebeständen endemisch, in anderen sporadisch und in den meisten Beständen nicht bekannt (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; MEIJER u. PRESCOTT 2003). Diese Unterschiede hängen auch mit unterschiedlichen klimatischen Verhältnissen zusammen. In Gebieten mit höheren Temperaturen und staubigen Böden tritt eine Erkrankung durch R. equi häufiger auf. Auch der pH-Wert der Böden, die Luftfeuchtigkeit und die bakterielle Umgebung nehmen Einfluss auf den Erreger (TAKAI et al. 1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993). Das Hygiene-Management auf einem betroffenen Betrieb kann eine Rolle für die Häufigkeit einer R. equi Erkrankung spielen. Mit Pferdekot kontaminierte Böden und staubige oder graslose Ausläufe stellen für die Tiere einen starken Infektionsherd dar, da der Erreger sich in einem solchen Milieu optimal vermehren kann (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; MEIJER u. PRESCOTT 2003; CHAFFIN et al. 2007). Unabhängig von der

23

2. Literaturübersicht

Umgebung nehmen auch die Fohlen selbst Einfluss auf die Entwicklung des Bakteriums,

da

diese

eine besondere Anfälligkeit aufweisen

können.

Die

Erstbesiedlung oder eine Infektion der Fohlen mit dem Erreger erfolgen meist durch Inhalation mit Staub oder durch Ingestion von Kot der Stute oder Boden aus der Umgebung. Im Darm kann sich der aerobe R. equi nicht besonders gut vermehren, aber der Kot im Darm lässt eine Vermehrung des Erregers bis zu einem Faktor von 1000 zu (BARTON u. HUGHES 1984; HUGES u. SULAIMAN 1987). Infizierte Fohlen stellen allerdings die größte Infektionsquelle dar, da sie in großer Anzahl den Erreger ausscheiden und so ihre gesamte Umgebung kontaminieren (TAKAI 1997). Als Infektionswege werden neben oraler Aufnahme und Inhalation die Infektion über den Nabel und die intrauterine Infektion beschrieben (BARTON u. HUGHES 1980). Für eine Erkrankung begünstigend wirkende Faktoren sind unter anderem eine Schwäche des Immunsystems, Endoparasitenbefall, Stress durch Transporte, zu große Besatzdichte oder veränderte Herdenzusammenstellungen oder andere Erkrankungen (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).

2.3 Diagnose von Rhodococcus equi-Erkrankungen bei Fohlen

Eine möglichst frühe Diagnose der R. equi-Pneumonie verbessert die Prognose für die erkrankten Tiere erheblich. Eine klinische Verdachtsdiagnose ist nicht in allen Fällen durch einen kulturellen Nachweis zu bestätigen. Erschwerend für die Diagnose ist, dass der Erreger nur bei knapp 50 % der betroffenen Fohlen isoliert wird, da der Erreger über eine intrazelluläre Überlebensstrategie verfügt und nur periodisch ausgeschieden wird (MARTENS 1982; VENNER et al. 2007). Um eine möglichst

sichere

Diagnose

stellen

zu

können,

sollten

daher

mehrere

Untersuchungsverfahren gewählt werden. Neben den klinischen Befunden sollte eine genaue Anamnese erhoben werden. Um die dadurch gestellte Verdachtsdiagnose zu festigen, stellt die Methode der Wahl eine Kombination aus kultureller und zytologischer Untersuchung von Tracheobronchialsekret dar und die Untersuchung

24

2. Literaturübersicht

mit Hilfe von bildgebenden Verfahren wie Ultraschall oder Röntgen (PRESCOTT 1991; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; ALTHAUS 2004; WEIMAR 2006).

2.3.1 Hämatologische Parameter

Die hämatologischen Parameter zur Erkennung einer R. equi-Erkrankung können nur als Hilfsmittel angesehen werden. Es steht kein spezifischer Parameter zur Verfügung, an dem sich ein eindeutiges Anzeichen für eine Rhodococcus equiErkrankung erkennen lässt, da bei einer Rhodokokkose nur unspezifische Veränderungen des Blutes festzustellen sind. Hinweise für eine R. equi-Erkrankung kann eine Leukozytose mit einer Leukozytenzahl von > 13.000 Zellen / µl Blut und eine Hyperfibrinogenämie über 500 mg / dl geben. Die Aussagekraft der Leukozyten erwies

sich

als

zuverlässiger,

als die

Bestimmung der Plasmafibrinogen-

Konzentration (GIGUÈRE 2003). Bisher hat sich die Bestimmung des C-reaktiven-Protein als nicht diagnostisch verwertbar bei der R. equi-Pneumonie des Fohlens erwiesen (HEYERS 2004).

2.3.2 Bildgebende Verfahren

Als Standard zur Erkennung von R. equi-Erkrankungen haben sich besonders die röntgenologische und die ultrasonographische Untersuchung etabliert. In der Literatur

werden

auch

computertomographische

und

szintigraphische

Untersuchungen beschrieben. Ihre Durchführung hat sich allerdings auf Grund von Aufwand und Kosten als unakzeptable und nicht praxisrelevant erwiesen (MARKEL et al. 1986, 1988; WION et al. 2001). Die durch die R. equi-Infektion hervorgerufenen Lungenveränderungen sind mittels Röntgentechnik bereits vor Auftreten klinischer Befunde zu erkennen (HILLIDGE 1987; ZERTUCHE u. HILLIDGE 1987). Als technische Ausstattung wird eine Film-Folien-Kombination mit einer Körnung von 400

25

2. Literaturübersicht

empfohlen, bei einem Film-Focus-Abstand von 100 cm (WALTHER 2006). Im laterolateralen Strahlengang werden beide Lungenhälften zwar übereinander projiziert, jedoch sind die relevanten Bereiche gut zu diagnostizieren, da sich die röntgenkassettennahe Lungenhälfte deutlicher darstellt als die Kassettenferne (LESTER u. LESTER 2001; SANDE u. TUCKER 2004). Veränderte Bereiche stellen sich röntgenologisch als regionale Verschattung dar, ein Abszess wird als rundliches Gebilde auf den Röntgenfilm projiziert (FALCON et al. 1985; WALTHER 2006). Die transkutane Ultraschalluntersuchung ist ebenfalls gut geeignet um veränderte Befunde im Lungenbereich festzustellen, wobei die veränderten Bereiche hier im peripheren Lungengewebe vorhanden sein müssen und die Ausdehnung und die Anzahl der Veränderungen teilweise nicht genau festzustellen sind (WALTHER 2006). Die Kombination aus sonographischer und röntgenologischer Untersuchung hat sich bewährt und wird empfohlen (REEF 1991; RAMIREZ et al. 2004; WALTHER 2006). Die transkutane Ultraschalluntersuchung der Lunge sollte von möglichst weit kaudal nach möglichst weit kranial in den Rippenzwischenräumen, dem sogenannten akustischen Fenster (SCHWERK 1993), beidseits durchgeführt werden. In den meisten Untersuchungen ist eine Befundung des 3. bis 17. Rippenzwischenraums möglich. Für die Untersuchung am Fohlen werden Ultraschallgeräte mit einer Linearoder Sektor-Sonde und einer Frequenz von 5,0 bis 7,5 MHz empfohlen, es sollte eine Eindringtiefe von vier bis zwölf Zentimetern gewählt werden (O’BRIEN u. BILLER 1997; ALTHAUS 2004; WALTHER 2006). Bei Untersuchungen von Fohlen auf einem Gestüt mit endemischer R. equiPneumonie konnte nach Diagnosestellung durch bildgebende Verfahren bei vier von fünf Fohlen post mortem der Erreger R. equi aus dem Abszess-Material isoliert werden (WEIMAR 2006). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Ultraschall- und Röntgentechnik zur Diagnostik von R. equi-Erkrankungen.

26

2. Literaturübersicht

2.3.3 Nachweis von R. equi

2.3.3.1 Probenmaterialien

R. equi ist als ubiquitär vorhandener, nocardiformer Actinomycet in Erde, Wasser und Dung zu finden, auch als Erdsaprophyt wurde er nachgewiesen (JENSEN 1934; ROONEY 1966; SMITH 1966). Ebenso wurde R. equi als physiologischer Bestandteil der Gastrointestinalflora des Pferdes beschrieben (KARLSON et al. 1940). Der kulturelle Nachweis von R. equi erfolgt beim Pferd bzw. Fohlen üblicherweise aus Proben

der

Atemwege,

meistens

aus

Tracheobronchialsekret

oder

einer

Trachealspülprobe. Bei Fohlen sind Nasentupfer als Nachweismaterial nicht geeignet. In einer klinischen Studie an 217 Fohlen eines endemisch-infizierten Betriebes konnte der Erreger nur bei 52 von 217 (24%) Proben aus dem Nasentupfer isoliert werden. Der Keim wurde hingegen aus dem Tracheobronchialsekret bei den gleichen 217 Fohlen in 118 Proben (54%) nachgewiesen (MEYER-HAMME 2004). Der Nachweis aus dem Kot ist auch bei Pferden möglich, die keinerlei Kontakt mit R. equi hatten (ARDENS et al. 1986). Um den Nachweis zu optimieren, werden Selektivmedien eingesetzt (BARTON u. HUGHES 1981). Selektivmedien enthalten verschiedene antibiotische Substanzen, die das Wachstum anderer Keime, als den zu Untersuchenden hindern sollen. So wurde von WOLLCOCK et al. (1979) z.B. das NANAT-Selektivnährmedium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit)

entwickelt.

R.

equi

stellt

zwar

keine

besonderen Ansprüche an Nährmedien und wächst gut auf Blutagar (PRESCOTT 1991; TAKAI et al. 1994, 1996), wird aber auf Grund seines langsamen Wachstums, häufig von anderen, schneller wachsenden Bakterien überwuchert. Mit dem von WOOLCOCK et al. entwickeltem Medium war es SMITH und ROBINSON (1981) möglich, R. equi selbst aus staubigen Spinnenweben nachzuweisen. Ebenso kann der Erreger auch in der Stallluft nachgewiesen werden, indem die Agar-Platten einen Meter hoch für 15 Minuten im Stall platziert und anschließend kultiviert werden (TAKAI et al. 1986). Der Nachweis aus der Atemluft von Fohlen auf endemischen

27

2. Literaturübersicht

Betrieben gelang MUSCATELLO (2007). In einer Studie von KILIAN (2008) konnte diese Methode nicht als sensitives Diagnostikum bestätigt werden. In einer Vergleichsstudie an acht Selektivnährmedien konnten mit dem CAZ-NB Medium (Ceftazidim-Novobiocin-Cycloheximd)

und

dem

TCP-Medium

(Trimethoprim-

Cefoperazon-Polymyxin B) die besten Anzuchtresultate erzielt werden (MAKRAI et 2005). Eine Unterscheidung zwischen virulenten und avirulenten R. equi-Stämmen in der Kultur ist aber nicht möglich (MUSCATELLO u. BROWNING 2004). Auf Grund der unterschiedlichen Ergebnisse in den verschiedenen Untersuchungen zum Nachweis des Erregers, sollten zur Diagnose der R. equi-Pneumonie neben dem kulturellen Nachweis stets die Befunde der klinischen und bildgebenden Untersuchungen mit berücksichtigt werden (GIGUÈRE u PRESCOTT 1997).

2.3.3.2 Molekularbiologischer Nachweis, Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine In-vitro-Methode, um spezifische DNASequenzen zu vermehren (amplifizieren) und zu identifizieren. Der Vorteil gegenüber der Kultivierung eines Erregers liegt bei der PCR in der Möglichkeit ein schnelleres Ergebnis zu erhalten und auch von toten Mikroorganismen oder deren Bestandteilen noch einen Nachweis in einer Probe anfertigen zu können (SELLON et al. 2001). Ein Nachteil gegenüber der Kultur ist allerdings, dass die Sensitivität derzeit noch geringer ist als die der kulturellen Isolierung (NEUDERT 2007) und dass ein Resistenztest bei der PCR nicht möglich ist. Eine Kombination aus beiden mikrobiologischen Verfahren ist daher ratsam (SELLON et al. 2001; BOHN u. ROTHSCHILD 2002; VENNER et al. 2007).

28

2. Literaturübersicht

2.3.3.3 Zytologischer Nachweis

So wie der kulturelle Nachweis ist auch die zytologische Untersuchung ein semiquantitatives Nachweisverfahren, bei dem eine Aussage über die Virulenz von Rhodococcus equi-Stämmen nicht möglich ist. Für

die

Darstellung

der

Bakterien

im

zytologischen

Ausstrich

aus

einer

Atemwegsprobe ist die Gram-Färbung am besten geeignet. Die grampositiven Keime, wie Rhodokokken, werden durch die Färbung dunkelblau von den übrigen, gramnegativen Zellen hervorgehoben (BEECH 1991; BOHN u. ROTHSCHILD 2002). In einer vergleichenden Untersuchung konnte bei 61 % der kulturell-positiven Proben der Erreger aus Tracheobronchialsekret auch zytologisch bestätigt werden (SWEENEY et al. 1987). Bei einer Atemwegsprobe sollte zusätzlich eine Zelldifferenzierung durchgeführt werden, da die Zellzusammensetzung der Probe eine weitere Aussage über den aktuellen Krankheitszustand erlauben kann (NEUDERT 2007). Weiterführende Untersuchungen mit Hilfe der Immunzytologie stehen noch aus.

2.3.4 Ausscheidung von R. equi beim Pferd

Die Erkenntnis über die Ausscheidung von R. equi von infizierten Tieren trägt zum Verständnis des Erregers erheblich bei. R. equi kann oft im Boden nachgewiesen werden und ist ebenfalls in Kot von grasenden Tieren nachweisbar (BARTON u. HUGHES 1984). Das Bakterium wird von den grasenden oder vom Erdboden fressenden Tieren in den Verdauungstrakt aufgenommen und überlebt und vermehrt sich im Darm der Tiere. Der Erreger wird mit dem Kot wieder ausgeschieden (MUSCATELLO et al. 2007). Die Bodenverhältnisse nehmen Einfluss auf das Wachstum von R. equi im Boden und somit auch auf die Konzentration. So sind der pH, die Feuchtigkeit und die Temperatur im Erdboden entscheidende Kriterien für die

29

2. Literaturübersicht

Entwicklung des Keimes in der Umwelt bzw. im Erdboden (HUGHES u. SULAIMAN 1987). Die Ausscheidung über den Kot ist sowohl bei Stuten als auch bei Fohlen untersucht worden. Auf endemischen Farmen ist ein Nachweis des Erregers aus dem Kot bei Stuten und Fohlen bei bis zu 100 % der Proben möglich (TAKAI et al. 1991). Der Nachweis im Kot von Fohlen ist als signifikant höher beschrieben worden, als der Nachweis aus dem Kot der Stuten (TAKAI et al. 1985). In anderen Untersuchungen wurde kein signifikanter Unterschied in der Ausscheidung bei Stuten und Fohlen festgestellt (NAKAZAWA et al. 1983). Bei Fohlen ist der Nachweis aus dem Kot schon ab der ersten Lebenswoche möglich. Die stärkste Ausscheidung ist in den ersten acht Lebenswochen festzustellen (TAKAI et al. 1986), wobei die Ausscheidung von R. equi über den Kot bei klinisch unauffälligen Fohlen nicht signifikant niedriger ist, als bei Fohlen bei denen eine R. equi assoziierte Pneumonie festzustellen ist (MARTENS et al. 2007). Neben der Ausscheidung über den Kot gilt die Ausscheidung des Erregers über die Atemwege als bedeutend. Auf endemisch oder sporadisch betroffenen Farmen ist die Anzahl der positiven Ergebnisse aus den Atemwegen signifikant höher als bei Proben von Tieren auf einer Farm ohne bekannte R. equi Problematik (TAKAI et al. 1998). Die Ergebnisse des Nachweises aus den Atemwegen sind stark abhängig vom Ort der Probenentnahme. Ein Tupferabstrich der Nasenschleimhaut bzw. Sekret der oberen Atemwege zum Nachweis von R. equi ist weniger sensitiv als ein Nachweis aus Tracheobronchialsekret. So waren bei 217 beprobten Fohlen mit sonographisch nachgewiesenen

Lungenabszessen

auf

einem

Betrieb

mit

endemischer

Rhodokokkose nur bei 24 % der Nasentupfer R. equi-positiv. Im Vergleich dazu konnte R. equi bei 54 % der 217 Fohlen aus dem Tracheobronchialsekret nachgewiesen werden (MEYER-HAMME 2004). Dass R. equi auch aus Proben der Atemluft von Fohlen nachgewiesen werden kann, wurde von MUSCATELLO et al. (2006) beschrieben. Die Autoren sammelten Proben

30

2. Literaturübersicht

von 55 Fohlen, von denen bei 48 Tieren vorher eine R. equi-Pneumonie mit einem transkutanen Ultraschall diagnostiziert wurde. Die Atemproben wurden gewonnen, indem ein Gerät, welches die Atemluft ansaugt, vor das Fohlenmaul gehalten und 100 oder 250 Liter Luft ansaugt wurde. 31 dieser 48 Probanden (64,4 %) hatten nachweisbare Gehalte an virulenten R. equi in den Atemluftproben. Von den übrigen sieben klinisch gesunden Fohlen haben sechs virulente R. equi ausgeatmet. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, dass das Gewinnen von Proben der Atemluft ein sensitives diagnostisches Mittel zur Früherkennung infizierter Fohlen ist und somit die Ausscheidung des Erregers über die Atemluft ebenfalls eine Bedeutung hat. In einer Studie von KILIAN (2008) konnten die Ergebnisse von MUSCATELLO et al. (2006) in einer Studie an 60 Fohlen nicht reproduziert werden.

2.3.5 Pathologie und Pathohistologie der R. equi-Pneumonie

Die durch R. equi hervorgerufene Pneumonie ist charakterisiert durch eine uni- oder meist bilateral abszedierende Bronchopneumonie (MARTENS et al. 1982; ZINK et al. 1986; AINSWORTH 1999; WEIMAR 2006). Das typische Erkrankungsalter liegt bei Fohlen bis zum sechsten Lebensmonat. Bei der chronischen Verlaufsform treten vor allem im cranio-ventralen Bereich der Lunge Abszesse auf, die bis zu mehreren Zentimetern im Durchmesser erreichen können. Die Abszesse zeigen pathologisch einen purulentem, gelb-schmierigem bis bröckelig-käsigem Inhalt (MAGNUSSON 1923; ELLENBERGER u. GENETZKY 1986; ALTHAUS 2004). Die Lungenveränderungen im Bereich der Abszesse variieren im Anschnitt von speckig und derb bis rahmig und zähflüssig. Außerdem können

in

der

pathologischen

Untersuchung

palpatorisch

ödematöse

und

emphysematöse Bereiche beobachtet werden (WEIMAR 2006). Die Abszedierung kann auf die bronchialen und mediastinalen Lymphknoten übergreifen und die gesamte Lunge kann sich als schweres, dunkel verfärbtes und nicht kollabiertes

31

2. Literaturübersicht

Organ darstellen (SMITH u. ROBINSON 1981). Die luftführenden Wege sind in der Sektion im betroffenen Abschnitt mit mukopurulenten Sekret gefüllt. Histologisch stellen sich Veränderungen im Charakter einer granulomatösen Entzündung dar. In den nekrotischen Bereichen sind randständig massenhaft Makrophagen

und

neutrophile

Granulozyten

zu

erkennen.

In

diesen

phagozytierenden Zellen sind unbeschädigte Rhodokokken darzustellen (HILLIDGE 1986; PRESCOTT 1991). Die histologisch zu erkennenden Lungenveränderungen können eitrige, eitrignekrotisierende oder katarrhalisch-eitrige Pneumonien sein. Ebenfalls können alveoläre und alveolär-interstitielle Ödeme festgestellt werden (WEIMAR 2006). Die seltenere akute Verlaufsform stellt sich mit milliären, dünnwandigen Abszessen im Parenchym der Lunge dar (BARTON u. HUGHES 1980; MARTENS et al. 1982). Bei einem gastrointestinalen Verlauf der R. equi-Infektion können in der Sektion Veränderungen im gesamten unteren Verdauungsapparat festgestellt werden. Meist wird eine ulzerative Typhlitis oder Kolitis diagnostiziert (BARTON u. HUGHES 1980; BEECH u. SWEENEY 1991).

2.4 Therapie der R. equi-Pneumonie des Fohlens

Die frühzeitige Diagnose ist ein wichtiges Kriterium für die Prognose bei der R. equiPneumonie des Fohlens. Bei der Behandlung steht eine antimikrobielle Therapie an erster Stelle. Bei der Wahl eines Antibiotikums müssen die charakteristischen Überlebensstrategien der Rhodokokken in einem Organismus berücksichtigt werden. Ein geeigneter antimikrobieller Wirkstoff muss intrazellulär einen ausreichenden Wirkspiegel aufbauen können und eine geeignete Affinität besitzen, um in granulomatöses Entzündungsgewebe eindringen zu können (PRESCOTT u. SWEENEY 1985; HILLIDGE 1986; AINSWORTH 1999). Damit das Antibiotikum in die Makrophagen und Granulozyten eindringen kann und gegen die intrazellulären

32

2. Literaturübersicht

Rhodokokken wirken kann, muss der Wirkstoff lipophil sein, im Lungengewebe eine gute Anreicherung erzielen und das geeignete Wirkspektrum aufweisen (HILLIDGE 1986; BOHN u. ROTSCHILD 2002). Eine Kombination aus zwei Antibiotika vermindert das Risiko einer Resistenzentwicklung und wird deshalb bei der Behandlung der Rhodokokkose empfohlen (AINSWORTH 1999; GIGUÉRE et al. 2004; ROTHHAAR 2006). Die geeignetsten Antibiotika sind zurzeit eine Kombination aus Rifampicin und einem Makrolid. Die Kombination aus Rifampicin und Erythromycin war lange Zeit die Kombination der Wahl. Da Erythromycin aber starke Nebenwirkungen bei den Tieren, insbesondere bei den Stuten, in Form von lebensbedrohlicher Kolitis hervorrufen kann, wird Erythromycin nur noch selten eingesetzt (VIVRETTE 1992; GIGUÉRE u. PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999; LAKRITZ u. WILSON 2002; KERTH 2005). Weitere sehr wirksame MakrolidAntibiotika mit weniger Nebenwirkung als Erythromycin stellen Azithromycin, Tulathromycin

(Draxxin®)

und

Clarithromycin

dar,

welche

nach

der

Umwidmungskaskade gemäß Arzneimittelrecht eingesetzt werden können (DAVIS et al. 2002; LAKRITZ u. WILSON 2002; GIGUÉRE et al. 2004; PILTZ 2004; REINHOLD 2006). Die Dauer der Antibiotikabehandlung liegt bei allen Antibiotika-Kombinationen in einem Bereich von vier bis neun Wochen. Die Behandlungsdauer sollte auch nicht kürzer gewählt werden, da eine kürzere Behandlung die Rezidivrate erhöht. Die Behandlung sollte so lange weitergeführt werden, bis klinisch, ultrasonographisch und radiologisch keine Lungenveränderungen mehr feststellbar sind (HILLIGE 1986; REEF 1998; PILTZ 2004). Als begleitende Therapie sollten neben der gezielten Behandlung mit Rifampicin und einem Makrolid noch ein schleimlösendes Medikament eingesetzt werden. Bei einer Pneumonie ist auch von einem Bronchospasmus auszugehen, was den Einsatz von Bronchodilatatoren sinnvoll macht (VIVRETTE 1992; AINSWORTH 1999).

33

3. Material und Methode

3

Material und Methode

3.1

Material

3.1.1 Probanden

Die Untersuchungen fanden in der Zeit vom 17. Mai 2007 bis zum 25. Oktober 2007 auf einem Gestüt in Mecklenburg-Vorpommern, Deutschland statt, auf dem seit geraumer Zeit endemisch Rhodococcus equi Pneumonien auftraten. Für die Untersuchungen standen Warmblutfohlen zur Verfügung. Alle Fohlen wurden auf dem Gestüt unter gleichen Bedingungen geboren und für alle Tiere herrschten dieselben Haltungs- und Fütterungsbedingungen.

3.1.2 Haltung und Management der neonaten Fohlen

Die Fohlen wurden auf dem Gestüt in seperaten Stallungen geboren. Der Stall der für die Abfohlungen zur Verfügung stand, war nur über eine Hygieneschleuse zu begehen. Für die Geburt standen Boxen mit Stroheinstreu zur Verfügung, die Geburt der Fohlen wurde von geschultem Personal überwacht. Nach der Geburt wurden die Stuten mit Fohlen innerhalb der ersten Lebensstunden in eine unbenutzte, zuvor gereinigte

und

desinfizierte

Box

mit

frischer

Stoheinstreu

innerhalb

des

Abfohlstallbereiches umgestallt. Nach der Geburt wurde den Fohlen der Nabelstumpf mit Chlorhexidindigluconat-Lösung 20 % (COM Pharma, Hamburg, Deutschland), welche auf 1 % verdünnt wurde, desinfiziert und es wurde ein Klistier (Practoclyss®, Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) rektal verabreicht. Acht bis zehn Stunden nach der Geburt wurden die Fohlen klinisch untersucht und venöses

Blut

aus

der

Vena

jugularis

34

externa

entnommen,

um

den

3. Material und Methode

Immunglobulingehalt zu bestimmen. Dies wurde mit Hilfe des Snap Foal IgG Tests® (IDEXX, Westbrook, Maine, USA) durchgeführt. Lag das Ergebniss der IgG Bestimmung unter einem Wert von 8 g / l, so wurde den Fohlen hochwertiges Kolostrum oral oder per Nasenschlundsonde eingegeben. Der IgG-Wert wurde ca. zwei Stunden nach dem eingeben des Kolostrum nochmal gemessen. War der Wert der zweiten Messung dann ebenfalls < 8 g / l, wurde den Fohlen Plasma infundiert.

3.1.3 Haltung und Management der älteren Fohlen

Zehn bis 14 Tage nach der Geburt wurden die Stuten mit ihren Fohlen in Laufställe umgestallt. Die Laufställe waren vor der Einstallung der jungen Fohlen und den Stuten gereinigt, desinfiziert (Neopredisan 4 %, Menno-Chemie, Norderstedt, Deutschland) und mit Stroh eingestreut. Jeder Laufstall verfügt über ein betoniertes Außenpaddock, die Pferdeanzahl variierte je nach Größe des Laufstalles zwischen acht und 14 Stuten mit Fohlen je Laufstall.

3.1.4 Impfung und Entwurmung

Impfungen und Entwurmungen wurden regelmäßig durchgeführt. Die Stuten waren alle gegen EHV 1 und 4, Equine Influenza und Tetanus nach ImpfstoffherstellerAngaben geimpft. Die Fohlen wurden erstmalig im Alter von 5 Monaten vacciniert. Entwurmungen wurden bei den Stuten kurz vor dem Geburtstermin und sonst in Abständen von 3 Monaten mit wechselnden Wirstoffen durchgeführt. Die Fohlen wurden erstmals am 8. Lebenstag und weiter im Abstand von sechs Wochen mit Antiparasitika behandelt.

35

3. Material und Methode

3.2.1 Methode 3.2.1 Klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen

Alle Fohlen wurden wöchentlich einer klinischen Untersuchung unterzogen. Die Tiere wurden allgemein in ihrem Verhalten und Habitus beurteilt, die Körpertemperatur wurde rektal gemessen, die Kotkonsistenz beurteilt, der Nabelstumpf wurde kontrolliert, es wurde auf Verletzungen, Schwellungen oder sonstige Besonderheiten geachtet, und es wurden die Mandibularlymphknoten nach Größe, Konsistenz und Schmerzhaftigkeit beurteilt.

3.2.2 Spezielle klinische Untersuchung des Respirationstrakts

Im Rahmen der wöchentlichen Allgemeinuntersuchung wurde eine spezielle Untersuchung des Respirationstrakts durchgeführt. Es wurden die Nüstern auf Vorhandensein von Ausfluss untersucht, die Trachea und die Lunge auskultiert und beurteilt. Bei Vorliegen von nicht physiologischen Befunden wurde die Qualität und die Art der Befunde dokumentiert. Die so erhobenen Befunde wurden anschließend nach Schweregrad in einem klinischen Score festgehalten (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998, Tab. 1).

36

3. Material und Methode

Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998)

Merkmal

Nasenausfluss

Hustenauslösung

Befund

Punktzahl

nein

0

serös, seromukös

1

purulent

2

nicht auslösbar

0

mehrfach

1

spontan

2

o.b.B.

0

vergrößert

1

nein

0

Einsinken der Interkostalräume, Nüsternblähen

3

vesikulär, vesikulär verschärft

0

rasseln, knistern, giemen

2

o.b.B

0

rasseln

2

Lnn. mandibulares

Ruhedyspnoe

Lungenauskultation

Tracheaauskultation

0 – 12

Gesamtscore

Gradeinteilung der klinischen Befunde: Klinischer Score von 0 - 1 = lungengesund Klinischer Score von 2 - 3 = geringgradig erkrankt Klinischer Score von 4 - 5 = mittelgradig erkrankt Klinischer Score von > 5 = hochgradig erkrankt

37

3. Material und Methode

3.2.3 Labordiagnostische Untersuchung

Die Bestimmung der Blutleukozytenzahl wurde bei jedem Fohlen im Rahmen der wöchentlichen klinischen Untersuchung durchgeführt. Hierzu wurden den Fohlen aus der rechten oder linken Vena jugularis externa 1 - 2 ml Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte durch die Punktion der Vene mit einer 1,2 x 40 mm großen Kanüle (20G; Becton, Dickinson and Company). Das Blut wurde in einem KaliumEDTA beschichtetem Probenröhrchen (EDTA-K, Sarstedt) aufgefangen. Das so gewonnene Blut wurde daraufhin auf seinen Leukozytengehalt untersucht. Die Untersuchung erfolgte mit Hilfe eines Blutanalysegeräts (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg) nach dem elektrischen Widerstandsprinzip.

3.2.4 Ultrasonographische Untersuchung der Lungen

Im Anschluss an die allgemeine und spezielle Untersuchung der Fohlen und der Auswertung der Blutleukozyten wurde bei Fohlen mit einem klinischen Score > 3, einer

rektal

gemessenen

Körperinnentemperatur

über

39,0°C

oder

einem

Blutleukozytenwert von > 13000 Zellen / µl eine sonograhische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Die sonographische Untersuchung wurde mit einem tragbaren Ultraschallgerät mit Akkubetrieb (Tringa L, Esaote Pie Medical, Maastricht, Niederlande) und dem mit dem Gerät fest verbundenem 5 MHz Linearschallkopf durchgeführt. Die betreffenden Fohlen wurden dabei von zwei Helfern an Hals und Hinterhand fixiert. Zur Vorbereitung des Schallbereichs wurde die Haut mit IsopropylAlkohol (2-Propanol 99 %, Pharma-Depot GmbH, Versmold) entfettet und anschließend Transmissionsgel (BLR Sonic Ultraschallgel, Waldeck, Münster) aufgetragen. Die transcutanen Ultraschall-Untersuchungsbereiche erstreckten sich auf beiden Thoraxseiten zwischen der Stammuskulatur (M. longissimus dorsi) dorsal, der Schultergürtelmuskulatur (M. tensor fasciae antebrachii, M. triceps brachii) kranial und dem Sternum sowie dem Zwerchfell ventral. Beginnend kaudodorsal im 15. Interkostalraum wurden so nach kranioventral bis zum vierten Interkostalraum

38

3. Material und Methode

beide Thoraxhälften untersucht. Jeder Interkostalraum wurde dabei in drei vertikal verlaufende Bereiche A, B, C (dorsal, mittig, ventral) eingeteilt (ALTHAUS 2004). Daraus ergibt sich, dass an der rechten und linken Körperseite jeweils 39 Bereiche sonographisch untersucht und in einem speziellen Ultraschallbefundblatt protokolliert werden konnten (s. Abb. 15). Im Anschluss an die Ultraschalluntersuchung erfolgte die Befundung. Im Ultraschallbild wurden hypoechogene, rundliche Bereiche ab einem Durchmesser von 10mm als Abszesse angesprochen. Um den AbszessScore zu errechnen, der als Indikator für den Schweregrad der Lungenveränderung verwendet wurde, musste die Summe der Abszessdurchmesser in Zentimeter berechnet werden. Die so errechnete Zahl entspricht dem angegebenen AbszessScore.

3.2.5 Röntgenologische Lungenuntersuchung

Alle Fohlen, die als gesund in die Studie aufgenommen werden sollten, wurden ein bis zwei Tage vor der Probengewinnung nach dem Protokoll von WALTHER (2006) röntgenologisch untersucht. Dies diente zur Sicherstellung der Aussage, dass es sich um lungengesunde Tiere handelte. Bei der Anfertigung der Röntgenbilder wurden ein mobiles Röntgengerät (HF 90/20, Gierth, Riesa), zwei 30 x 40 cm große Röntgenkassetten (Life Ray™ medium, Ferrania, USA und X-omatic medium, Kodak, USA),

eine

Eckernförde)

medium sowie

ein

Film-Folien-Kombination automatisches

(Vet-X-Ray,

Entwicklungssystem

Dunker/Einfeldt, (1135

X-OMAT

Processor, Kodak, USA) verwendet. Die Fohlen wurden ohne Sedierung im Stehen im latero-lateralen Strahlengang von beiden Seiten geröntgt. Sie wurden von zwei mit Bleischürzen ausgestatteten Personen an Hals und Hinterhand fixiert und von einer dritten Person mit Bleischürze wurde die Röntgenkassette so neben dem Fohlen platziert, dass der gesamte Lungenbereich abgedeckt wurde. Zur Kennzeichnung der plattennahen Thoraxseite wurde in der rechten bzw. linken oberen Ecke der Röntgenplatte ein entsprechendes Seitenzeichen angebracht. Bei einem Film-Focus-Abstand von 0,75 m wurde der Zentralstrahl so eingerichtet, dass er ca. eine handbreit hinter dem kaudalen Rand

39

3. Material und Methode

des M. triceps brachii und auf der Mittellinie des Thorax lag. Es wurde eine Belichtungszeit von 0,05 mAs bis 0,12 mAs gewählt. Die kV-Zahl variierte je nach Größe der Fohlen zwischen 78 und 88. Ausgelöst wurde jeweils am Ende der inspiratorischen Atemphase.

3.3

Probenentnahme

3.3.1 Aufnahmekriterien und Gruppeneinteilung der Fohlen

Die Fohlen, die in die Studie aufgenommen wurden, sind am Tag der klinischen Untersuchung in eine von drei Gruppen eingeteilt wurden. Die 1. Gruppe sind gesunde Fohlen, in die Gruppe 2 wurden lungenkranke Fohlen eingeteilt, die auf Grund der Befunde ein Antibiotikum bekommen haben und die 3. Gruppe sind Fohlen, die als lungenkrank diagnostiziert wurden, aber kein Antibiotikum appliziert bekommen haben.

Gruppe 1: Kontrollgruppe, gesunde Fohlen (n = 20) Die Fohlen die in die Gruppe 1 aufgenommen wurden, mußten folgende Aufnahmekriterien erfüllen: Die klinische Untersuchung der Tiere durfte am Tag der Untersuchung und bei vorausgegangenen Untersuchungen für die Gruppeneinteilung keine Auffälligkeiten aufweisen, die von den Normbefunden abweichen (klinischer Score < 2). Die Untersuchung der Blutleukozyten durfte ebenfalls am Tag der Untersuchung und bei vorausgegangenen Untersuchungen für die Gruppeneinteilung nicht über einem Wert von 13000 Zellen / µl Blut liegen. Die beidseitige sonographische Untersuchung der Lunge durfte keine pneumologischen Veränderungen aufweisen. Die Fohlen waren zuvor nicht sonographisch untersucht worden, da es klinisch keine Indikation gab. Unmittelbar vor der Aufnahme in diese Gruppe und somit vor Probenentnahme wurden Röntgenbilder der Lunge angefertigt. Auf den Röntgenbildern durften keine Auffälligkeiten zu erkennen sein.

40

3. Material und Methode

Gruppe 2: R.equi-lungenerkrankte Fohlen mit Antibiotika (n = 21) In die Gruppe 2 wurden Fohlen aufgenommen, bei denen nach der klinischen Untersuchung eine Indikation bestand die Lunge sonographisch zu untersuchen. Die Ultraschalluntersuchung der Lunge mußte einen Abszess-Score > 5 cm im untersuchten Bereich aufweisen, damit die Fohlen in die Gruppe aufgenommen werden konnten. Diesen Fohlen wurde einen Tag nach der Diagnosestellung, über den gesamten Zeitraum der vorliegenden Studie, Antibiotika verabreicht. Auf Grund der Ergebnisse von WEIMAR (2006), in der bei fünf euthanasierten Fohlen desselben Betriebes der Keimgehalt

von Lungenabszessen untersucht

wurde und dabei bei 80 % der Tiere pathomorphologisch Rhodococcus equi aus dem Abszessmaterial isoliert

werden

konnte, wird

das Auftreten

sonographisch

darstellbarer Lungenabszesse in der vorliegenden Arbeit mit einer R. equi bedingten Lungenerkrankung gleichgesetzt.

Gruppe 3: R. equi-Lungenerkrankte Fohlen ohne Antibiotika (n = 27) Fohlen, die am Tag der Untersuchung klinisch auffällig waren und bei denen daraufhin ebenfalls der Lungenbereich ultrasonographisch untersucht wurde und ein Abszess-Score < 5 cm diagnostiziert werden konnte, wurden der Gruppe 3 zugeordnet. Diese Fohlen wurden im Verlauf der Untersuchung zweimal wöchentlich klinisch und sonographisch untersucht. Wurde im zeitlichen Verlauf eine Zunahme des Abszess-Scores von > 5 cm im untersuchten Lungenbereich festgestellt, mussten die Tiere aus der Studie genommen werden und wurden entsprechend behandelt. Wenn ein Tier aus Gruppe 3 herausfiel, da es antibiotisch behandelt werden musste, wurden die bis zu diesem Zeitpunkt erhobenen Befunde und Ergebnisse mit in die Auswertung einbezogen.

3.3.2 Zeitpunkt der Gewinnung von Tracheobronchialsekret und Kotproben

Die Probengewinnung erfolgte bei allen Tieren der drei Gruppen gleich. Die Probenentnahme von Kot und Trachealsekret erfolgte immer zeitgleich.

41

3. Material und Methode

Die erste Probenentnahme von Kot und Trachealsekret erfolgte am Tag der Diagnosestellung (Tag 0). Die zweite Kotprobe wurde an Tag 3 gewonnen. An Tag 7 nach

Diagnose

erfolgte

Kotprobenentnahme. Kotprobenentnahme

die Die

wurde

zweite dritte

TrachealsekretprobenTrachealsekretproben-

schließlich

an

Tag

14

nach

und und

die die

dritte vierte

Diagnosestellung

durchgeführt.

Tab. 2:

Zeitpunkt der Probenentnahme

Entnahme am: ___________ Probe aus:

Tag 0

Tag 3

Tag 7

Tag 14

Atemwege

X

X

X

(TBS)

Probe 1

Probe 2

Probe 3

Kot

X

X

X

X

Probe 1

Probe 2

Probe 3

Probe 4

3.3.3 Endoskopische Probenentnahme aus der Trachea

Allen Fohlen, die in die Gruppen 1, 2 und 3 für die Durchführung der vorliegenden Studie aufgenommen wurden, wurden endoskopische Tracheobronchialsekretproben (TBS) entnommen. Hierfür

wurden

die

Stuten

mit

ihren

Fohlen

in

nebeneinanderliegende

Untersuchungsstände geführt. Die Fohlen wurden mit Xylazin in einer Dosierung von 0,5 mg / kg KM i.v. sediert. Nach einsetztender Wirkung der Sedation wurden die Fohlen von zwei Personen im Untersuchungsstand an Kopf und Hinterhand fixiert. Vor Beginn der endoskopischen Probenentnahme wurden die Nüstern mit einem trockenen Papiertuch gereinigt. Für die Probenentnahme wurde ein 140 cm langes, flexibles Videoendoskop (Video-Endoskop Serie 138xx, 139 xx, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) mit einem Durchmesser von 9,0 mm verwendet. Das Videoendoskop wurde an eine Lichtquelle (Xenon 100

42

Typ

3. Material und Methode

20132520, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) angeschlossen und mit dem Bildprozessor (Tele pack pal Typ 200430 20, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) verbunden. Die Möglichkeit, die Optik des Endoskops zu reinigen, bestand über eine Spüleinrichtung, die mit demineralisierten Wasser (IGEFA Handelsg. mbH & Co. KG, Dahlewitz, Deutschland) gefüllt war. Zur Probenentnahme aus der Trachea wurde in den Arbeitskanal des Videoendoskops ein 250 cm langer, steriler Kunststoffkatheter eingeführt. Zur Probenaspiration wurde am hinteren Ende des Katheters eine 20 ml Einmalspritze (B. Braun, Melsungen, Deutschland) aufgesetzt. Das Videoendoskop wurde von einer Person über den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt und von einer weiteren Person wurde vorhandenes Trachealsekret aspiriert. Nach der Endoskopie wurde das Videoendoskop zunächst manuell gereinigt und der Arbeitskanal mit einer Reinigungsbürste gesäubert. Die weitere Reinigung und Desinfektion fand in einer Endoskopwaschmaschine (Dr. Fritz, Germany) statt. Als Reinigungsmittel

wurde

Neodisher

mediclean

(Dr.

Weigert

GmbH,

Wien,

Österreich), und als Desinfektionsmittel Neodisher Septo DN (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) verwendet. Die benutzten Kunststoffkatheter wurden manuell gereinigt, getrocknet und mit einem Folienschweißgerät (Melaseal  101 comfort, Melag Apparate GmbH, Berlin) eingeschweißt. Danach wurden sie im Autoklaven (Autoklav 23, Melag Apparate GmbH, Berlin) bei 1 bar für 50 min autoklaviert.

3.3.4 Kotprobenentnahme

Die Kotprobenentnahme bei den Fohlen

erfolgte mit Hilfe eines sterilen

Tupferprobenentnahmebesteck mit Transportmedium nach Amies CLR (Meus, Piove di Sacco, Italien). Zur Beprobung wurde das sterile Tupferstäbchen des Probenbestecks in das Rektum des Fohlens vorsichtig 6,0 bis 8,0 cm eingeführt. Das Probenstäbchen wurde, um eine gute Haftung des Rektuminhaltes an dem Probenstäbchen zu erreichen, in kurzen Bewegungen hin und her bewegt und anschließend in das sterile Transportmedium eingeführt.

43

3. Material und Methode

3.3.5 Handhabung der Proben nach der Entnahme

Nach der Gewinnung wurde das gewonnene Tracheobronchialsekret (TBS) mit Hilfe des verwendeten Katheterschlauches auf ein steriles Probenstäbchen eines Tupferprobenentnahmebestecks

gegeben

und

mit

Begleitschreiben

zur

mikrobiologischen Untersuchung an das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover versandt. Die Versendung der Kotproben, die wie oben beschrieben gewonnen wurden, erfolgte mit den Tracheobronchialproben zusammen an das Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.

3.3.6 Mikrobiologische Untersuchung

Die kulturelle Untersuchung des Tracheobronchialsekrets und des Kotmaterials auf das Vorkommen von Rhodococcus equi wurde am Institut für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Für die Anzüchtung von Rhodococcus equi aus dem Tracheobronchialsekret wurden die Tupfer, auf die das Sekret nach der Entnahme aufgebracht wurde, auf ColumbiaAgar mit Schafblut (Oxoid, Wesel), Wasserblau-Metachromgelb-Laktose-Agar nach Gassner (Oxoid, Wesel), Kochblut-Platten und Staphylokokken-StreptokokkenSelektivnährböden (siehe Tab. 10, 11 im Anhang) ausgestrichen und zweimal fraktioniert. Alle Nährmedien, außer den Kochblut-Platten, wurden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 35 - 37 °C für mindestens 48 Stunden in einem Brutraum inkubiert. Die Inkubation des Kochblut-Agars, der zum Nachweis mikroaerophiler Bakterien dient, erfolgte in einem speziellen CO2-Brutschrank (CO2Auto-Zero, Heraeus Holding GmbH, Hannover–Hamburg) unter 10 %iger CO2Atmosphäre bei 35 - 37 °C für mindestens 48 Stunden. Außerdem wurden Anreicherungskulturen mit Nährbouillon (siehe Tab. 12 im Anhang) angesetzt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 35 - 37 °C wurden diese wiederum auf Columbia-Agar

44

3. Material und Methode

mit Schafblut, Gassner-Platten und Staphylokokken-Streptokokken-Selektivmedium ausgestrichenund fraktioniert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kulturen visuell beurteilt. Kolonien mit feuchtem, zunächst transperentem, weißlichem, später rötlichem Wachstum wurden auf Columbia-Agar subkultiviert. Von den entstandenen Reinkulturen wurden GramFärbungen angefertigt und die Präparate mikroskopisch beurteilt, wobei ein Keimgehalt von bis zu 10³ als geringgradig, von 104 bis 105 als mittelgradig und von über 106 als hochgradig eingestuft wurde. Rhodococcus ssp. stellen sich als grampositive,

pleomorphe

Stäbchen

dar.

Zur

Bestätigung

des

Verdachts

Rhodococcus equi wurde der CAMP-Test zum Nachweis des Equi-Faktors durchgeführt. Konnte die Diagnose Rhodococcus equi danach nicht eindeutig gestellt werden, wurde zusätzlich das api-Coryne-Testsystem (bio Merieux, Nürtingen) zur Absicherung der Dianose eingesetzt. In Einzelfällen wurde zur endgültigen Diagnose zusätzlich eine Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Die mikrobiologischen Untersuchungen der Kottupfer wurden in gleicher Weise durchgeführt.

3.3.7 Mikroskopische Beurteilung

Für die mikroskopische Beurteilung wurde ein Mikroskop der Firma Zeiss (III RS, Zeiss, Jena) verwendet. Jeder Objektträger wurde zuerst mit einer 6,3 fachen Vergrößerung im Überblick und danach mit einer 100 fachen Vergrößerung mit Immersionsöl (Zeiss, Jena) im Detail betrachtet. An jedem Ende des Ausstriches wurden jeweils zehn Gesichtsfelder untersucht. Es wurde zunächst beurteilt, ob genügend Zellen für eine Auswertung vorhanden waren (> 10 / Untersuchungsfeld). Als erstes wurden jeweils die nach Gram gefärbten Präparate betrachtet. Hierbei wurde auf das Vorhandensein und die Anzahl von Rhodococcus equi geachtet. R. equi stellen sich als grampositive Keime dunkelblau dar. Wurden in den untersuchten Gesichtsfeldern insgesamt bis zu 10 Kolonien einer Keimart festgestellt, so wurde der Gehalt als geringgradig eingestuft, bei 10 bis 20 Kolonien als mittelgradig und bei mehr als 20 Kolonien als hochgradig.

45

3. Material und Methode

Abb. 1: Intrazellulär gelegene Kolonie von grampositiven, kokkoiden Stäbchen, die Hinweise auf Rhodococcus equi gibt (Gramfärbung, 100 fache Vergrößerung)

3.3.8 Statistische Auswertung

Die statistischen Berechnungen wurden mit dem Programmpaket STATISTICA (StatSoft Inc., Tulsa, USA) von Herrn Dr. W. REIMERS, Adendorf, durchgeführt. Die Bewertung der statistischen Tests erfolgte anhand der Irrtums Wahrscheinlichkeit p < 0,05 (Tab. 3)

46

3. Material und Methode

Tab. 3: Irrtums Wahrscheinlichkeit (p-Wert) zur Darstellung der Signifikanz

p-Wert

Signifikanz

Symbol

p > 0,05

nicht signifikant

p < 0,05

schwach signifikant

*

p < 0,01

signifikant

**

p < 0,001

hoch signifikant

***

Bei der statistischen Auswertung wurden folgende Punkte betrachtet:

1. Zunächst erfolgte die deskriptive Darstellung der Daten für die stetigen Variablen

(intervalskalierte

und

rangskalierte

Variablen)

und

für

die

nominalskalierten Variablen. Für jede Probantengruppe wurden die Anzahl der gültigen Werte (Gült. n), der arithmetische Mittelwert, der Median, die Minima und Maxima, das obere und untere Quartil und die Standardabweichung der Untersuchungsparameter ermittelt. 2. Es folgte die Bearbeitung der einzelnen Fragestellungen mit der Ermittlung von Zusammenhängen und Unterschieden, wobei nach „abhängigen“ und „unabhängigen“ Stichproben differenziert wurde. 3. Die „abhängigen Stichproben-Untersuchungen“ erfolgten unter Zuhilfenahme des

Spearman’schen

Rang-Korrelationskoeffizenten

R

um

den

Zusammenhang zwischen stetigen Variablen festzustellen. Um Auskunft über die Unterschiede in den Mittelwerten stetiger Varianten zu erhalten, wurde der Wilcocon-Test für Paardifferenzen verwendet. mehr

als

zwei

Variablen

Rangvarianzanalyse

nach

miteinander Friedman

47

zur

verglichen

wurden,

Anwendung.

Wenn

kam

die

Bei statistische

3. Material und Methode

signifikanten

Resultaten

des

Friedman-Tests

wurden

die

Rangsummendifferenzen mit Hilfe eines Post-hoc-Tests bestimmt. 4. Bei der Untersuchung „unabhängiger Stichproben“ wurde der U-Test von Mann und Whitney zur Hilfe genommen. In dem Fall, dass für diskrete Variablen mehr als zwei Kategorien bestehen, war die Varianzanalyse von Kruskal

und

Wallis

(H-Test)

erforderlich.

Auch

hier

wurden

die

Rangsummendifferenzen mit Hilfe eines Post-hoc-Tests von Tykey und Kramer bestimmt. Unterschiede in der Häufigkeitsverteilung diskreter Variablen wurde durch die Aufstellung von Vierfeldertafeln und die anschließende Überprüfung durch den X²-Test

für

die

Auswertung

von

Vierfeldertafeln

überprüft.

Eine

Verallgemeinerung auf mehrere Stichproben und Merkmale wurde durch die k*c-felder-Tafel dargestellt, die ebenfalls mit Hilfe des X²-Tests auf statistisch signifikante Unterschiede hinsichtlich der Merkmalsausprägung untersucht wurde.

48

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4

Ergebnisse

4.1

Anzahl und Geschlecht der Fohlen

In die Studie wurden 68 Fohlen aufgenommen, darunter 40 Stutfohlen und 28 Hengstfohlen. In Gruppe 1 (gesunde Fohlen) mit insgesamt 20 Probanden waren 60 % weiblich und 40 % männlich. Gruppe 2 (Fohlen mit Lungenabszessen, mit Therapie) umfasste 21 Tiere, wovon 61,9 % weiblich und 38,1 % männlich waren. Gruppe 3 (Fohlen mit Lungenabszessen, ohne Therapie) umfasste 27 Tiere, wovon 55,6 % weiblich und 44,4 % männlich waren. Die Geschlechtsverteilung unterschied sich nicht signifikant zwischen den Gruppen (p = 0,8).

4.2

Alter der Fohlen zu Studienbeginn

Das mittlere Alter der Fohlen zu Studienbeginn variierte zwischen 26,3 Tagen und 104,8 Tagen. Die Tabelle 4 gibt das Alter der Fohlen zu Studienbeginn in den drei Studiengruppen wieder.

49

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 4: Alter der Fohlen in Gruppe 1, 2 und 3 zu Studienbeginn

Anzahl

Alter in Tagen,

der Fohlen

MW ± Stdabw.

1: Gesund

20

26,2 ± 7,0

2: mit Therapie

21

86,7 ± 38,6

3: ohne Therapie

27

104,8 ± 31,9

Alle Gruppen

68

76,1 ± 44,3

Gruppe

Die gesunden Fohlen (Gruppe 1) waren signifikant jünger als die der beiden anderen Gruppen

(p


0,05).

4.3

Befunde der klinischen Lungenuntersuchung zu Studienbeginn

Die gesunden Fohlen (Gruppe 1) hatten einen klinischen Score von 0 bis 2. Die Fohlen mit Lungenabszessen größer als 5 cm Durchmesser und mit Therapie (Gruppe 2) einen klinischen Score von 1 bis 6 und bei den Fohlen mit Lungenabszess kleiner 5 cm und ohne Therapie (Gruppe 3) lag der klinische Score zwischen 0 und 5. Bei der klinischen Lungenuntersuchung der Fohlen vor der Probenentnahme waren die Fohlen der Gruppe 1 definitionsgemäß klinisch gesund. Die Fohlen der Gruppen 2 und 3 zeigten einzelne oder mehrere klinische Befunde einer Erkrankung des Atmungsapparates (Tab. 5).

50

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 5: Klinischer Score der Fohlen in Gruppe 1, 2 und 3

Gruppe

4.4

Anzahl

Klinischer

Klinischer

Klinischer

Score

Score

Score

(Skala 0-9)

(Skala 0-9)

(Skala 0-9)

unteres

oberes

Quartil

Quartil

N

Median

1: Gesund

20

1,00

1,00

1,00

2: mit Therapie

21

2,00

2,00

3,00

3: ohne Therapie

27

2,00

1,00

3,00

Alle Gruppen

68

2,00

1,00

3,00

Blutleukozytenzahl bei den Fohlen zu Studienbeginn

In die Gruppe 1 (gesunde Fohlen) wurden nur Tiere aufgenommen, deren Leukozytenzahl im Blut 13.000 / µl nicht überschritt. Die Blutleukozytenzahl lag in dieser Gruppe zwischen 5.600 / µl Blut und 12.400 / µl Blut (der Mittelwert betrug 8.805 ± 1.974 / µl Blut). In Gruppe 2 (kranke Fohlen mit Therapie) lag die Zahl der Blutleukozyten zwischen 5.900 / µl und 27.100 / µl (der Mittelwert betrug 15.733 ± 5.083 / µl Blut). Die Leukozytenzahl der Gruppe 3 (kranke Fohlen ohne Therapie) lag zwischen 7.800 / µl und 19.900 / µl Blut, (der Mittelwert betrug 14.585 ± 3.439 / µl Blut). Die Unterschiede zwischen den gesunden Fohlen der Gruppe 1 und den lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppe 2 und 3) waren signifikant (p < 0,05).

51

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.5

Befunde

der

sonographischen

Lungenuntersuchung

zu

Studienbeginn

In Gruppe 1 (gesunde Fohlen) wurden nur klinisch gesunde Fohlen aufgenommen, bei denen außerdem sonographisch und radiologisch keine pneumologischen Veränderungen nachzuweisen waren. In Gruppe 2 und 3 wurden nur Fohlen mit sonographisch darstellbaren Lungenabszessen aufgenommen. Bei Gruppe 2 gab es keine Begrenzung der Größe der Abszesse für die Aufnahme in die Gruppe. Bei den Fohlen der Gruppe 3 (Lungenabszesse ohne Therapie) war die Summe der sonographisch ermittelten Abszessdurchmesser kleiner als 5,0 cm.

Tab. 6: Summe der Durchmesser der Lungenabszesse (in cm) der Fohlen in Gruppe 1, 2 und 3

Gruppe

Anzahl

N

Summe der Durchmesser der Lungenabszesse

Summe der Durchmesser der Lungenabszesse

Summe der Durchmesser der Lungenabszesse

in cm

in cm

in cm

MW ± Stdabw.

Minimum

Maximum

in cm

in cm

in cm 1: Gesund

20

0,00

0,00

0,00

2: mit Therapie

21

8,7 ± 5,2

2,0

27,0

3: ohne Therapie

27

2,4 ± 1,1

1,0

4,5

Alle Gruppen

68

3,6 ± 4,6

-

-

52

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Die lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) hatten zu Studienbeginn in der Summe signifikant (p < 0,05) größere Durchmesser der Lungenabszesse als die lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3).

4.6

Nachweis

von

Rhodococcus

equi

im

Kot

und

Tracheobronchialsekret

4.6.1 R. equi-Nachweis im Tracheobronchialsekret an Tag 0, Tag 7 und Tag 14

Bei der kulturellen Untersuchung des Tracheobronchialsekrets der Fohlen aus Gruppe 1 (Gesunde Fohlen) wurde R. equi an Tag 0 (TBS 1) bei zwei von 20 Fohlen nachgewiesen. An Tag 7 der Studie (TBS 2) wurde R. equi bei fünf von 20 Fohlen nachgewiesen und an Tag 14 (TBS 3) wurde R. equi im Tracheobronchialsekret bei neun von 20 Fohlen nachgewiesen. In Gruppe 1 stieg der Nachweis von R. equi im TBS im Laufe der Untersuchung signifikant an (p < 0,05; Abb. 2). In Gruppe 2 (Lungenkranke Fohlen mit Therapie) wurde an Tag 0 (TBS 1) bei neun von 21 Fohlen R. equi kulturell nachgewiesen. An Tag 7 (TBS 2) wurde bei sieben von 20 Fohlen der Erreger im TBS nachgewiesen und an Tag 14 (TBS 3) bei vier von 20 Fohlen (Abb. 1). Ein Fohlen musste an Tag 7 auf Grund einer Verletzung der Mutter-Stute aus der Studie ausgeschieden. Der kulturelle Erregernachweis von R. equi im TBS bei den Fohlen der Gruppe 2 nahm von Tag 0 bis Tag 14 signifikant ab (p < 0,05). In Gruppe 3 (Lungenkranke Fohlen ohne Therapie) wurde an Tag 0 (TBS 1) bei acht von 27 Fohlen R. equi kulturell im Tracheobronchialsekret nachgewiesen, an Tag 7 (TBS 2) bei fünf von 21 Fohlen und an Tag 14 (TBS 3) bei zwei von 16 Fohlen. Die Abnahme der Anzahl der Fohlen in dieser Gruppe ist durch die Verschlechterung des

53

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Krankheitszustandes der Fohlen ohne Therapie zu erklären. Die Verschlechterung des Gesundheitszustandes machte eine Behandlung erforderlich und bewirkte somit den Ausfall aus der Studiengruppe. Der Nachweis von R. equi änderte sich in dieser Gruppe über die zwei-wöchige Beobachtungsphase nicht signifikant (p > 0,05; Abb. 2).

Abb. 2: Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret der drei Fohlengruppen über die zweiwöchige Beobachtungsphase Gruppe 1: lungengesunde Fohlen Gruppe 2: Fohlen mit Lungenabszessen und antibiotischer Therapie Gruppe 3: Fohlen mit Lungenabszessen ohne antibiotische Therapie

Bei den gesunden Fohlen (Gruppe 1) wurden an Tag 0 weniger R. equi im TBS nachgewiesen als bei den lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppen 2 und 3; p = 0,06). An Tag 7 nach der Diagnose bestand kein Unterschied im Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret zwischen den drei Fohlengruppen

54

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

(p > 0,05). An Tag 14 nach der Diagnose bestand wiederum ein Unterschied hinsichtlich des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret der drei Fohlengruppen, dieser war jedoch statistisch nicht signifikant (p = 0,06).

Abb. 3: Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret der drei Fohlengruppen an den Untersuchungstagen

4.6.2 R. equi-Nachweis im Kot an Tag 0, Tag 7 und Tag 14

In Gruppe 1 (Gesunde Fohlen, n = 20) ergab die Auswertung einen stetigen Anstieg des Nachweises von R. equi im Kot der Fohlen von Tag 0 bis Tag 14 (p = 0,05; Abb. 3). Bei den Lungenkranken Fohlen mit Therapie in Gruppe 2 (n= 20) zeigte sich unter der antibiotischen Behandlung ein deutlicher Rückgang des Nachweises von R. equi aus dem Kot von Tag 0 bis Tag 14 (p < 0,05; Abb. 3). Bei den lungenkranken Fohlen ohne Therapie, (Gruppe 3, n = 16) konnten keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05) beim Nachweis von R. equi im Kot von Tag 0

55

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

bis Tag 14 festgestellt werden. Die Anzahl der Fohlen, die in die Auswertung genommen werden konnten, nahm über die zweiwöchige Beobachtungsphase ab (Abb. 4). Der Unterschied zwischen den Gruppen bei der kulturellen Anzucht von R. equi aus dem Kot am Tag der Diagnose (Tag 0) war statistisch signifikant (p = 0,01). An den Tagen 7 und 14 waren keine signifikanten Unterschiede feststellbar (p > 0,05).

Abb. 4: Nachweis von R. equi im Kot in den drei Fohlengruppen über die 14-tägige Beobachtungsphase Gruppe 1: lungengesunde Fohlen Gruppe 2: Fohlen mit Lungenabszessen und antibiotischer Therapie Gruppe 3: Fohlen mit Lungenabszessen ohne antibiotische Therapie

56

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.7

Zusammenhang des Nachweises von R. equi im Kot und im Tracheobronchialsekret

Das kulturelle Ergebnis von R. equi im TBS und Kot bei jedem Fohlen und zum gleichen Entnahme-Zeitpunkt zeigte eine große Übereinstimmung (Abb. 5).

Abb. 5: Übereinstimmung des Nachweises von R. equi in den Probenpaaren (Kot und TBS) der drei Gruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase Gruppe 1: lungengesunde Fohlen Gruppe 2: Fohlen mit Lungenabszessen mit antibiotischer Therapie Gruppe 3: Fohlen mit Lungenabszessen ohne antibiotische Therapie

Somit lag bei den Fohlen der drei Gruppen eine Übereinstimmung der Ergebnisse der Probenpaare von insgesamt 86 % vor. Wird nur der Tag der Diagnosestellung (Tag 0) betrachtet, so lag die Übereinstimmung der Ergebnisse aus TBS und Kot bei insgesamt 68 Fohlen und somit auch 68 gepaarten Proben bei 93 %. Dies lässt die

57

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Aussage zu, dass zur Diagnosestellung am ersten Untersuchungstag der Nachweis von R. equi im Kot nahezu identisch mit dem Nachweis im Tracheobronchialsekret war.

4.8

Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi bei den drei Fohlengruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase

4.8.1 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret am Tag 0

Bei den gesunden Fohlen (Gruppe 1) lag der Median des klinischen Score bei 1. Der Nachweis von R. equi im TBS konnte bei zwei von 20 Fohlen dieser Gruppe geführt werden, wobei eines der Fohlen einen klinischen Score von 1 hatte, dass andere Fohlen einen Score von 0. Bei den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) lag der Median des klinischen Score bei 2 und der Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret konnte bei neun der 21 Fohlen dieser Gruppe geführt werden. Der klinische Score bei diesen neun Fohlen lag zwischen 1 und 4. Der Median des klinischen Score bei den 12 Fohlen ohne R. equi Nachweis im Tracheobronchialsekret lag bei 3, der klinische Score zwischen 1 und 5. Bei den lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) lag der Median des klinischen Score bei 2, der Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret konnte bei acht von 27 Fohlen geführt werden. Bei diesen acht Fohlen lag der klinische Score zwischen 1 und 4. Der Median des klinischen Score bei den 21 Fohlen ohne R. equi Nachweis im Tracheobronchialsekret lag bei 3, der klinische Score zwischen 0 und 5.

58

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Die Korrelationsberechnung nach Spearman (R) zeigte für keine der drei FohlenGruppen einen Zusammenhang zwischen dem klinischen Score und dem Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret am Tag der Diagnose (Tag 0).

4.8.2 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Kot am Tag 0

Mit der Korrelationsberechnung nach Spearman (R) konnte gezeigt werden, dass in keiner der drei Fohlen-Gruppen ein Zusammenhang zwischen dem klinischen Score und dem Nachweis von R. equi im Kot bestand. Tab. 7:

Ergebnisse

der

Korrelationsberechnung

(Spearman)

zwischen

dem

klinischen Score und dem Nachweis im Kot der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose Spearmans Rangkorrelation Klinischer Score und

Gültige N

Spearman R

p

20

0,03

0,91

21

-0,32

0,14

27

-0,26

0,18

Kot 1, Tag 0 Gruppe 1 Gesunde Fohlen Gruppe 2 Lungenkranke Fohlen mit Therapie Gruppe 3 Lungenkranke Fohlen ohne Therapie

59

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.9

Zusammenhang des Nachweises von R. equi und dem Blutleukozytenwert am Tag der Diagnose (Tag 0) in allen drei Fohlengruppen

4.9.1 Blutleukozytenwert

und

Nachweis

von

R.

equi

im

Tracheobronchialsekret bei den drei Fohlengruppen am Tag 0

Die Betrachtung der Blutleukozytenzahl zusammen mit dem Nachweis von R. equi im TBS an Tag 0 mit Hilfe von Spearmans Rangkorrelation ergab in keiner der drei Gruppen einen Zusammenhang.

4.9.2 Blutleukozytenwert und Nachweis von R. equi im Kot bei den drei Fohlengruppen am Tag 0

Die Betrachtung der Blutleukozytenzahl zusammen mit dem Nachweis von R. equi im Kot der Fohlen an Tag 0 mit Hilfe von Spearmans Rangkorrelation ergab in keiner der drei Gruppen einen Zusammenhang.

60

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.10 Zusammenhang des Nachweises von Rhodococcus equi und dem Abszess-Score am Tag der Diagnose in allen drei Fohlengruppen

4.10.1 Zusammenhang des Abszess-Score und des R. equi-Nachweises im TBS der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0)

Die gesunden Fohlen (Gruppe 1) hatten keine Lungenabszesse und wurden deshalb nicht in die Auswertung mit einbezogen. Die lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) bei denen R. equi im TBS (Tag 0) isoliert werden konnte (n = 9), hatten einen durchschnittlichen AbszessDurchmesser von 9,8 cm ± 6,9 cm. Die lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2), bei denen der R. equi nicht im TBS (Tag 0) isoliert werden konnte (n = 12), hatten einen durchschnittlichen Abszess-Durchmesser von 7,8 cm ± 3,5 cm. Die Ergebnisse der lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppe 2 und 3) sind in Tabelle 8 dargestellt.

61

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Tab. 8: Abszess-Durchmesser bei den lungenkranken Fohlen mit und ohne Nachweis von R. equi im TBS am Tag der Diagnose (Tag 0)

Nachweis von R. equi im TBS (Tag 0)

Gruppe 2

Gruppe 3

Kranke Fohlen mit Therapie

Kranke Fohlen o. Therapie

Nachweis

kein Nachweis

Nachweis

kein Nachweis

9 Fohlen

12 Fohlen

8 Fohlen

19 Fohlen

9,8 ± 6,9

7,8 ± 3,5

2,7 ± 1,2

2,2 ±1,0

Anzahl der Fohlen Summe der AbszessDurchmesser in cm (MW ± Stdabw.)

Es bestand kein Zusammenhang zwischen dem Abszess-Score und dem Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret der lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppe 2 und 3) am Tag der Diagnose (Tag 0).

4.10.2 Zusammenhang des Abszess-Scores und des R. equi-Nachweises im Kot der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0)

Die lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3), bei denen R. equi im Kot (Tag 0) isoliert werden konnte (n = 6), hatten einen durchschnittlichen AbszessDurchmesser von 2,7 cm. Die Fohlen dieser Gruppe, bei denen der R. equi nicht im

62

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Kot (Tag 0) isoliert werden konnte (n = 21), hatten einen durchschnittlichen Abszesse-Score von 2,2 cm. Die Ergebnisse der lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppe 2 und 3) sind in Tabelle 9 dargestellt. Tab. 9: Abszess-Durchmesser bei den lungenkranken Fohlen mit und ohne Nachweis von R. equi im Kot am Tag der Diagnose (Tag 0)

Nachweis von R. equi im Kot (Tag 0)

Gruppe 2

Gruppe 3

Kranke Fohlen mit Therapie

Kranke Fohlen o. Therapie

Nachweis

kein Nachweis

Nachweis

kein Nachweis

9 Fohlen

12 Fohlen

6 Fohlen

21 Fohlen

9,8 ± 6,9

7,8 ± 3,5

2,7 ± 1,1

2,3 ± 1,1

Anzahl Fohlen MW Abszesse in cm (Stdabw.)

Es bestand kein Zusammenhang zwischen dem Abszess-Score und dem Nachweis von R. equi im Kot der lungenkranken Fohlen mit und ohne Therapie (Gruppen 2 und 3) am Tag der Diagnose (Tag 0).

63

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.11 Vergleich

des

Nachweises

Tracheobronchialsekret

von über

Rhodococcus die

equi

im

zweiwöchige

Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen

Bei den gesunden Fohlen (Gruppe 1, n = 20) stieg der Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret auf einer Skala von 0 = “keine Ausscheidung“ bis 3 = “hochgradige Ausscheidung“ stetig an (p = 0,001; Abb. 6).

Abb. 6: Nachweis von R. equi aus TBS der gesunden Fohlen (Gruppe 1) über die 14. tägige Beobachtungsphase (ggr.: geringgradig, mgr.: mittelgradig, hgr.: hochgradig)

Bei den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2, n = 20) wurden unter der Antibiotika-Therapie eine Reduzierung der Ausscheidung über das TBS beobachtet (p = 0,05; Abb. 7).

64

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Abb. 7: Nachweis von R. equi aus TBS der lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) über die 14. Tägige Beobachtungsphase (ggr.: geringgradig, mgr.: mittelgradig, hgr.: hochgradig) Die lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3, n = 16) zeigten keine Veränderung der Nachweismenge von R. equi in TBS (p = 0,15; Abb. 8).

Abb. 8: Nachweis von R. equi aus TBS der lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) über die 14. Tägige Beobachtungsphase

65

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.12 Vergleich des Nachweises von Rhodococcus equi im Kot über die

zweiwöchige

Beobachtungsphase

in

den

drei

Fohlengruppen

Bei den gesunden Fohlen (Gruppe 1, n = 20) stieg der Nachweis von R. equi im Kot auf einer Skala von 0= “keine Ausscheidung“ bis 3= “hochgradige Ausscheidung“ über den 14 tägigen Beobachtungszeitraum gering aber signifikant an (p = 0,05; Abb. 9).

Abb. 9: Nachweis von R. equi aus Kot der gesunden Fohlen (Gruppe 1) über die 14. tägige Beobachtungsphase (ggr.: geringgradig, mgr.: mittelgradig, hgr.: hochgradig)

Bei den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2, n = 20) wurde unter der Antibiotika-Therapie eine Reduzierung der Ausscheidung über den Kot beobachtet (wie auch im TBS, siehe 4.11) (p = 0,001; Abb. 10).

66

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Abb. 10: Nachweis von R. equi aus Kot der lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) über die 14. Tägige Beobachtungsphase

Die lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3, n = 16) zeigten keine Veränderung der Nachweismenge von R. equi in TBS (p = 0,91; Abb. 11).

Abb. 11: Nachweis von R. equi aus Kot der lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) über die 14. Tägige Beobachtungsphase

67

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

4.13 Nachweis von Rhodococcus equi über die zweiwöchige Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen

Die gesunden Fohlen (Gruppe 1) zeigten während der Untersuchung keine Krankheitsanzeichen einer Lungenerkrankung. Der Nachweis von R. equi über den Kot und die Atemwege ist gering, nimmt aber über 14 Tage stetig zu (p < 0,05; Abb. 12).

Abb. 12: Nachweis von R. equi im TBS und im Kot der gesunden Fohlen über der 14 tägigen Beobachtungsphase

Der Nachweis von R. equi im Kot und TBS bei den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) nahm über die zweiwöchige Beobachtungsphase stetig ab (p < 0,05; Abb. 13).

68

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Abb. 13: Nachweis von R. equi im TBS und im Kot der lungenkranken Fohlen mit Therapie über der 14 tägigen Beobachtungsphase Die lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3), die über die gesamte Beobachtungsdauer von 14 Tagen ausgewertet werden konnten, zeigten eine geringe Abnahme des Nachweises von R. equi im Kot und TBS (Abb. 14).

Abb. 14: Nachweis von R. equi im TBS und im Kot der lungenkranken Fohlen ohne Therapie über der 14 tägigen Beobachtungsphase

69

4. Ergebnisse _________________________________________________________________________________

Der Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret und Kot an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 der drei Gruppen zeigte einen Zusammenhang der Ergebnisse der Proben der Tage 0 und 7 (p < 0,05). Die Ergebnisse des Nachweises aus R. equi am Tag 14 standen nicht im Zusammenhang mit den Ergebnissen des Nachweises von Tag 0 und 7 (p > 0,05). Die Zusammenhänge der Ergebnisse aus der kulturellen Anzucht von R. equi waren im Kot der Fohlen deutlicher als im Tracheobronchialsekret.

70

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

5

Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, zu untersuchen, wie stark Rhodococcus equi (R. equi) über den Kot und die Atemwege bei Fohlen mit und ohne Lungenabszesse ausgeschieden wird und ob der Nachweis aus dem Kot mit dem Nachweis aus den Atemwegen korreliert. Des Weiteren sollte untersucht werden, wie lange Fohlen mit Lungenabszessen nach Beginn einer Antibiotika-Therapie R. equi ausscheiden. Dazu wurden von 20 gesunden Fohlen, von 21 Fohlen die an einer abszedierenden Pneumonie litten und ab dem Tag der Beurteilung Antibiotika erhielten und von 27 Fohlen mit abszedierender Pneumonie, die ohne antibiotische Therapie blieben, jeweils Tracheobronchialsekret und Kot gewonnen. Die Probenentnahme wurde noch zweimal im Abstand von sieben Tagen wiederholt. Alle Proben wurden bakteriologisch untersucht. Es sollte auch untersucht werden, ob der kulturelle Nachweis von R. equi aus den Atemwegen und dem Kot kranker Fohlen mit dem Erkrankungsalter, dem klinischen Score, dem Blutleukozytenwert und dem sonographischen Lungenbefund korreliert.

5.1

Probanden

Die in der Studie untersuchten Kot- und Atemwegsproben stammen alle von Fohlen, die auf einem Gestüt in der Fohlensaison 2007 geboren und unter gleichen Bedingungen zusammen mit ihren Mutterstuten aufgezogen wurden. Es ist deshalb davon auszugehen, dass der Infektionsdruck durch R. equi für alle Fohlen ähnlich war.

71

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

Die Proben der drei Probandengruppen wurden zeitlich parallel zwischen Mai und Oktober 2007 gewonnen, so dass die jahreszeitlichen Unterschiede keinen Einfluss auf die Ergebnisse nehmen dürften. Das Alter der Fohlen war in Gruppe 1 (gesunde Fohlen) signifikant niedriger, als das der Gruppe 2 (lungenkranke Fohlen mit Therapie) und Gruppe 3 (lungenkranke Fohlen ohne Therapie). Da alle Fohlen von einem Gestüt mit endemisch auftretender Rhodokokkose, bei einer Morbidität bis 70 % eines Fohlenjahrgangs, stammen (ALTHAUS 2004; SCHULTE 2005; GRAVERT 2006), wurden in die Gruppe mit den gesunden Fohlen bevorzugt jüngere Tiere aufgenommen, um sicherstellen zu können, dass keine Fohlen mit einer unerkannte Lungenerkrankung aufgenommen wurden. Hinsichtlich der Verteilung des Geschlechts der Fohlen wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt. Für die Erhebung des Lungenstatus wurde bei allen Fohlen eine transkutane sonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Befanden sich Abszesse oder andere pneumonischen Veränderungen im peripheren Lungenbereich, ließen sich diese mit einer Ultraschalluntersuchung sehr gut darstellen (COHEN et al. 2000; ALTHAUS 2004; WEIMAR 2006). Befanden sich Abszesse jedoch in der Tiefe der Lunge, so waren diese mit der sonographischen Untersuchung nicht darstellbar. Um sicher zu stellen, dass bei den gesunden Fohlen keine pleurafernen Abszesse vorlagen, wurden zusätzlich je Tier zwei Röntgenaufnahmen der Lunge angefertigt.

5.2

Probenentnahme

In der vorliegenden Studie wurden die Proben der Atemwege mit Hilfe eines flexiblen Endoskops

nasotracheal

aus

der

distalen

Trachea

entnommen.

Diese

Vorgehensweise besitzt den Vorteil, dass während der Probengewinnung auch die Sekret-Menge

und

–Viskosität,

die

Farbe

72

der

Schleimhaut

und

sonstige

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

Veränderungen der luftführenden Wege mit beurteilt werden konnten und es möglich war, die Aspiration unter Sichtkontrolle durchzuführen. Um Kontaminationen der gewonnen Proben und eine Erregerübertragung von Tier zu Tier durch das Endoskop zu vermeiden, wurde vor jeder Probenentnahme der Arbeitskanal des Gerätes gereinigt und desinfiziert. Regelmäßig wurden Spülproben des Arbeitskanals nach der Reinigung entnommen und mikrobiologisch untersucht, um die Keimfreiheit vor

der

nasotrachealen

Probengewinnung

zu

gewährleisten.

Zu

jeder

Probenentnahme wurde in den Arbeitskanal des Endoskops ein sterilisierter Silikonkatheter eingeführt und das Sekret mit Hilfe des Katheters aspiriert. Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von Tracheobronchialsekret beim Pferd stellt die transtracheale Aspiration dar (BEECH 1991). Vorteil dieser Methode ist die Vermeidung von Kontaminationen der Probe durch Keime aus dem Nasopharynx (BEECH 1991; DARIEN et al. 1990; LARKIN 1994). HOFFMAN et al. (1991) und HASHIKURA et al. (2000) verglichen in ihren Untersuchungen die transtracheale mit der nasotrachealen Sekretgewinnung. Sie konnten jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zwischen den beiden Techniken feststellen. Zur Gewinnung der Kotproben wurde ein steriler Tupfer direkt in den Anus der Fohlen

eingeführt

und

anschließend

direkt

in

einem

sterilen

Röhrchen

Transportmedium verschlossen.

5.3

Ergebnisse

5.3.1 Beziehung zwischen dem Erkrankungsalter der Fohlen und dem Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret und im Kot

Das mittlere Lebensalter betrug in Gruppe 1 (gesunde Fohlen) zum Zeitpunkt der Probenentnahme 26 ± 7 Tage. In Gruppe 2 (lungenkranke Fohlen mit Therapie)

73

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

betrug das Alter der Fohlen im Mittel 86 ± 39 Tage und in Gruppe 3 (lungenkranke Fohlen ohne Therapie) 105 ± 32 Tage. Das Alter der Erkrankung an Rhodokokkose ist übereinstimmend mit den Angaben in der Literatur, die besagt, dass Fohlen im Alter von ein bis sechs Monaten vermehrt betroffen sind (GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999). Die Begründung der Autoren, dass die Erkrankung vermehrt bei Fohlen im Alter von ein bis sechs Monaten auftritt, war die in diesem Lebensalter noch unzureichende körpereigene Abwehr des Immunsystems und das Absinken des maternalen Antikörperspiegels. In der Gruppe mit den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) war das jüngste Fohlen mit diagnostizierten Lungenabszessen 20 Tage alt. Diese Ergebnisse widerlegen die Annahme, dass das Auftreten der Erkrankung mit dem Absinken des maternalen- oder eines unzureichenden Antikörper-Schutz in Verbindung steht (HIETALA et al. 1985; PRESCOTT 1991). Umso mehr, da bei den Fohlen dieses Gestütes die Antikörperversorgung post natum überprüft und ggf. ergänzt wird, so dass hier von einer optimalen Antikörper-Versorgung auszugehen ist. Auch andere Studien, die zum Teil im selben Tierbestand durchgeführt wurden, zeigten, dass Fohlen bereits mit 14 Lebenstagen durch R. equi verursachte Lungenabszesse haben können (ALTHAUS 2004; MEYER-HAMME 2004; HEYERS 2005). Da die Bildung der Abszesse in der Lunge einige Zeit dauert, insbesondere bevor sie klinische Symptome hervorrufen, ist der Zeitraum der Erkrankung zufällig zeitgleich mit dem Absinken des maternalen Antikörperspiegels (MEYER-HAMME 2004).

5.3.2 Gegenüberstellung der kulturellen Anzucht von R. equi aus dem Tracheobronchialsekret und Kot mit den Befunden der klinischen und sonographischen Untersuchung

In Gruppe 1 (gesunde Fohlen) wurden nur Fohlen aufgenommen, die unmittelbar vor der Probenentnahme weder klinisch, noch sonographisch, noch röntgenologisch

74

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

pathologische Lungenbefunde aufwiesen. Dennoch wurde R. equi bei zwei (10 %) der 20 Probanden im Tracheobronchialsekret und bei einem der zwei Fohlen zusätzlich im Kot isoliert. In früheren Studien im gleichen Tierbestand war die Anzahl der gesunden Fohlen, bei denen R. equi nachgewiesen wurde, weitaus höher. HEYERS (2005) und NEUDERT (2007) wiesen bei zwölf von 40 Fohlen bzw. bei sechs von 26 Fohlen, die keine klinischen oder sonographischen Lungenbefunde aufwiesen, R. equi im Tracheobronchialsekret nach. HEYERS (2005) führte jedoch, anders als NEUDERT (2007) keine röntgenologische Untersuchung der Lungen der gesunden Tiere vor der Probengewinnung durch. Hier könnten deshalb bei den vermeindlichen lungengesunden Fohlen doch tief liegende Abszesse vorgelegen haben. Die von HEYERS untersuchten Fohlen waren 79 Tage ± 26 Tage alt, die Probanten von NEUDERT mit 35 Tage ± 3 Tage jünger. Solche positiven Befunde lassen sich damit erklären, dass die Fohlen den Erreger über kontaminierten Staub in die Atemwege aufnehmen können. Möglichweise also stammt der nachgewiesene R. equi nicht aus der Lunge, sondern aus der eben eingeatmeten und kontaminierten Luft. (BARTON u. HUGHES 1980; MUSCATELLO et al. 2006). Eine weitere Erklärung könnte sein, dass sich die Fohlen kurz vor der Probenentnahme infiziert haben, klinische Symptome jedoch erst viel später aufgetreten sind. In Gruppe 2 (kranke Fohlen mit Therapie) wurde R. equi bei neun von 20 Fohlen (45 %) im Tracheobronchialsekret nachgewiesen, die kulturelle Anzucht aus dem Kot gelang bei den selben neun Fohlen auch im Kot. Bei den anderen elf Fohlen (55 %) der Gruppe 2 konnte am Tag der Diagnose weder im Tracheobronchialsekret noch im Kot R. equi kulturell nachgewiesen werden, obwohl alle Tiere dieser Gruppe klinisch und sonographisch Befunde einer Lungenerkrankung aufwiesen. In Gruppe 3 (lungenkranke Fohlen ohne Therapie, n = 27) wurde R. equi bei acht Fohlen (38 %) im Tracheobronchialsekret und bei sechs Fohlen (22 %) im Kot kulturell nachgewiesen. Bei fünf der sechs Fohlen, die ein positives Ergebnis im Kotmaterial hatten, war auch die TBS Probe positiv in der kulturellen Anzucht auf R. equi. Auch andere Studien, die auf dem gleichen Gestüt mit endemischer Rhodokokkose durchgeführt wurden, konnten R. equi nur aus rund 50 – 60 % der Proben

75

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

lungenkranker Fohlen isolieren (SELLON et al 2000; MEYER-HAMME 2004; HEYERS 2005; NEUDERT 2007). Auf Grund der Studie von WEIMAR (2006), in der bei fünf euthanasierten Fohlen desselben Betriebes der Keimgehalt von Lungenabszessen untersucht wurde und dabei bei 80 % der Tiere R. equi aus dem Abszessmaterial isoliert werden konnte, wurde

das

Auftreten

sonographisch

darstellbarer

Lungenabszesse

in

der

vorliegenden Arbeit mit einer R. equi-bedingten Lungenerkrankung gleichgesetzt. Grundsätzlich sei jedoch erwähnt, dass auch andere Erreger als R. equi in der Lage sind, beispielsweise Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus, Lungenabszesse zu verursachen (LAVOIE 1994). Eine mögliche Ursache für falsch negative Ergebnisse bei der kulturellen Anzucht von R. equi ist, dass der Keim oft intrazellulär in neutrophilen Granulozyten und Makrophagen liegt. Außerdem werden das Wachstum und die Fähigkeit zur Vermehrung von R. equi auf der Petrischale häufig durch eine schneller wachsende Begleitflora gehemmt, dies ist vor allem im Nachweis aus Kotmaterial zu bedenken (HILLIDGE 1986). Nach den Ergebnissen von WEIMAR (2006) könnte ein weiterer Grund für die negativen Ergebnisse aus den Atemwegsproben sein, dass R. equi ohne Zugang zu den Atemwegen im Lungenabszess verbleibt, also zunächst keinen Zugang zu den Atemwegen hat und somit im TBS nicht nachweisbar ist. Diese Aussage wird dadurch begründet, dass WEIMAR (2006) pathologischanatomisch feststellte, dass alle gefundenen Lungenabszesse durch eine Kapsel vollständig vom umgebenen Lungenparenchym abgegrenzt waren. Der Verdacht einer R. equi-Infektion beim lungenkranken Fohlen kann als Diagnose daher keinesfalls ausgeschlossen werden, wenn R. equi kulturell nicht nachweisbar ist. Bei der Diagnosefindung muss deshalb neben der kulturellen Anzucht stets auch die klinische Symptomatik und weitere Diagnostik (bildgebende Diagnostik) berücksichtigt bzw. angewendet werden (MARTENS et al. 1982; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; SELLON et al. 2000).

76

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

5.3.3 Gegenüberstellung

der

Ergebnisse

der

kulturellen

Anzucht

von

Rhodococcus equi aus Tracheobronchialsekret und Kot

Die Ergebnisse der kulturellen Untersuchung des Probenmaterials der drei Fohlengruppen auf R. equi zeigten bei gesunden und bei kranken Fohlen eine hohe Übereinstimmung. Die Ergebnisse der Probenuntersuchungen der Gruppe 1 stellen dar, dass klinisch gesunde Fohlen R. equi im Kot und im TBS ausscheiden können. Im Laufe der Untersuchung nahm die Ausscheidung bzw. der Nachweis aus den Atemwegen und dem Kotmaterial bei den gesunden Fohlen zu. In anderen Studien wurde R. equi auch aus Kot von Pferden isoliert, die von Betrieben stammten, in denen keine R. equi bedingten Erkrankungen bekannt waren (NAKAZAWA et al. 1983; TAKAI et al. 1991). WOOLCOCK et al. (1980) äußert sogar den Verdacht, dass R. equi ein natürlicher Darmbewohner des Pferdes sei. Diese Aussage geht jedoch nicht mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie konforn, da die gepaarten Proben aus Atemwegen und Kot am Tag der Diagnose eine Übereinstimmung von 93 % aufwiesen. Wenn R. equi ein physiologischer Darmbewohner bei Pferden wäre, müsste er im Darm in deutlich höherem Maße nachgewiesen werden können als in den Atemwegen. Andere Untersuchungen zur Ausscheidung über einen längeren Zeitraum liegen bis jetzt nicht vor, nur Untersuchungen zu einem festen Zeitpunkt. Bei den lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) konnte eine deutliche Reduzierung der Ausscheidung des Erregers unter antibiotischer Behandlung festgestellt werden. Zu Beginn der Untersuchung waren 43 % aller Fohlen dieser Gruppe in den gepaarten Proben aus TBS und Kot positiv in der kulturellen Anzucht auf R. equi. Nach einem Behandlungszeitraum von 14 Tagen waren die TBS-Proben noch zu 20 % positiv und die Kotproben nur noch zu 5 %. Erst 14 Tage nach Beginn der antibiotischen Behandlung nahm die Ausscheidung signifikant ab. Dies lässt die Aussage zu, dass kranke Fohlen im Abstand von mindestens 14 Tagen erneut beprobt werden sollten, um festzustellen, wann es sich bei den erkrankten Tieren nicht mehr um einen Ausscheider handelt.

77

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

Bei den lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) konnte keine Reduzierung der Ausscheidung von R. equi festgestellt werden. 33 % der Fohlen aus dieser Gruppe konnten jedoch auf Grund der Verschlechterung ihrer Erkrankung nicht bis zum Ende der Studie teilnehmen. Für eine Aussage über die Reduzierung der Ausscheidung bei kranken Tieren ohne antibiotische Therapie war die Untersuchungphase nicht ausreichend lang. Bei der Betrachung des Nachweises von R. equi in den gepaarten Proben aus TBS und Kot aller Fohlen konnte festgestellt werden, dass der Nachweis im Tracheobronchialsekret häufiger war als der im Kot. Die Anzahl der Erreger war im Tracheobronchialsekret vermutlich dadurch höher, weil im Kot das Probenmaterial sehr verdünnt ist, weil eine größere Menge Begleitflora vorhanden ist und eine Anzucht dadurch erschwert war.

5.4

Schlussfolgerung

Die vorliegenden Ergebnisse der gepaarten Proben aus TBS und Kot zeigen zumindest zu Anfang der Untersuchungen große Übereinstimmungen. Am Tag der Diagnosestellung lag die Übereinstimmung sowohl der positiven als auch negativen Ergebnisse aus Tracheobronchialsekret und Kot bei 93 %. Diese hohe Prozentzahl lässt die Aussage zu, dass die deutlich leichter zu gewinnende und weniger invasive Kotprobe eine einfache Möglichkeit darstellt, ohne Zuhilfenahme eines Endoskopes oder der Punktion der Trachea, untersuchungfähiges Material zu erhalten. Die Sensitivität der Untersuchungsmethode ist aus dem Tracheobronchialsekret und dem Kot gleich, obwohl die Begleitflora im Kot höher und damit die kulturelle Anzucht aus technischer Sicht anspruchsvoller ist. Trotz sonographisch nachgewiesener Lungenveränderungen ist der kulturelle Nachweis von Rhodococcus equi nicht immer positiv. Ob es sich bei den negativen Ergebnissen der kranken Tiere um falsch negative Ergebnisse handelt (SELLON et al. 2000) oder, ob die darstellbaren Lungenabszesse durch andere Erreger verursacht wurden, ist nicht sicher zu klären. Erwähnt sei jedoch, dass bei Fohlen

78

5. Diskussion _________________________________________________________________________________

desselben Tierbestandes in einer pathologischen Untersuchung bei 80 % der Fohlen in den Lungenabszessen R. equi nachgewiesen werden konnte (WEIMAR 2006). Die Frage, wann ein R. equi erkranktes Fohlen unter Therapie keine Erreger mehr ausscheidet und wieder in einen Bestand integriert werden kann, kann anhand der Ergebnisse nicht abschliessend beantwortet werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Beprobung erst nach 14 Tagen eine signifikant geringere Nachweisrate aufweist als zu Beginn der Therapie.

79

6. Zusammenfassung _________________________________________________________________________________

6

Zusammenfassung

Lämmer, Marc: Nachweis von Rhodococcus equi in Kot und Trachealsekret bei Fohlen: Vergleichende Untersuchung zwischen gesunden Fohlen und Fohlen mit Lungenabszessen

Ziel der vorliegenden Studie war es, die Ausscheidung von Rhodococcus equi (R. equi) aus dem Kot und aus den Atemwegen bei Fohlen mit und ohne Lungenabszessen zu untersuchen. Weiterhin sollte festgestellt werden, wie lange R. equi bei erkrankten Tieren unter antibiotischer Behandlung nachgewiesen werden kann. Die untersuchten Proben stammten von insgesamt 69 Fohlen, die auf einem Betrieb mit endemischer Rhodokokkose aufgewachsen sind. Die Fohlen wurden in drei Gruppen aufgeteilt: 20 Tiere waren lungengesund, 21 Probanden waren an einer abszedierenden Pneumonie erkrankt, bei denen eine antibiotische Behandlung eingeleitet wurde und eine weitere Gruppe bestand aus 28 Probanden mit abszedierender Pneumonie ohne Behandlung. Vor der Probengewinnung wurden bei allen

Fohlen

klinische

und

hämatologische

Parameter

erhoben

und

eine

sonographische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Nach der Beurteilung des Gesundheitszustandes wurden von allem Probanden je eine transendoskopische Probe des Tracheobronchialsekretes (TBS) und eine Kotprobe gewonnen. Die Probenentnahme wurde jeweils nach 7 und 14 Tagen bei allen Tieren der drei Gruppen wiederholt. Die Proben wurden kulturell angezüchtet und mikrobiologisch untersucht. Bei den gesunden Fohlen (Alter: 26 ± 7 Tage) wurde am Tag 0 R. equi bei 10 % der Tiere im TBS und bei 5 % im Kot isoliert. Über die folgenden 14 Tage stieg der Nachweis auf 45 % im TBS und 30 % im Kot signifikant an. In der Gruppe mit den lungenkranken Fohlen mit antibiotischer Therapie (Alter: 87 ± 39 Tage) wurde am Tag 0 der Erreger bei 43 % im TBS und bei 45 % im Kot nachgewiesen, nach 14

80

6. Zusammenfassung _________________________________________________________________________________

tägiger Behandlung lag der Nachweis aus TBS bei 20 % und der Nachweis aus Kot bei 5 %. Somit konnten nach 14 Tagen Behandlungsdauer signifikant weniger R. equi nachgewiesen werden. Bei den lungenkranken Fohlen ohne antibiotische Therapie (Alter: 105 ± 32 Tage) wurde R. equi zu Beginn der Studie bei 30 % der Tiere im TBS und bei 22 % im Kot kulturell nachgewiesen. Hier lag der Nachweis nach 14 Tagen bei 22 % im TBS und 13 % im Kot, eine signifikante Veränderung des Nachweises von R. equi in TBS und in Kot lag bei diesen Fohlen nicht vor. An Tag 0 scheiden die gesunden Fohlen in Kot und TBS demnach signifikant weniger R. equi aus als die lungenkranken Fohlen. An den Tagen 7 und 14 sind zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede mehr festzustellen.

Der Nachweis von R. equi in den gepaarten Proben aus TBS und Kot ergab zu allen Zeitpunkten der Probenentnahme und bei den Fohlen der drei Gruppen eine hohe Übereinstimmung. Am Tag der Diagnosestellung lag die Übereinstimmung des R. equi-Nachweises aus Kot und Atemwegen in den drei Gruppen bei 93 %. Daher erscheint Kot ein geeignetes Probenmaterial zur Bestätigung des Verdachtes einer R. equi–Infektion bei Fohlen mit Pneumonie zu sein.

81

7. Summary _________________________________________________________________________________

7

Summary

Laemmer, Marc: Detection of Rhodococcus equi in faeces and tracheobronchial secretions of foals on a farm with endemic rhodococcosis: comparison of healthy foals and foals with pulmonary abscesses.

The aims of the study were to evaluate prevalence and amount of Rhodococcus equi (R. equi) in faeces and within airways of healthy foals and foals with pulmonary abscesses. The duration of shedding of R. equi in sick foals with and without antibiotic treatment was determined. In this study, 69 foals were examined, all being kept on a farm with endemic rhodococcosis. These foals were divided into three groups: 20 foals were healthy, 21 foals suffered from abscessing pneumonia and received treatment with antibiotics and 28 foals were sick but with fewer abscesses and did not receive any antibiotic treatment. Prior to the sampling for bacteriology (day 0), all foals underwent a clinical, haematological and an ultrasonographical examination of the lungs. Then one sample of tracheobronchial secretions (TBS) and one faecal sample were taken. These samples were examined by microbiological culture. The sampling from the foals was repeated after 7 and after 14 days. At day 0 R. equi was isolated out of the TBS samples in 10 % and from the faecal samples in 5 % of the healthy foals (age: 26 ± 7 days). 14 days later R. equi was detected in TBS samples in 45 % and in faecal samples of 30 % of the healthy foals. On day 0 R. equi was isolated from TBS in 43 % of the severely sick foals (age: 87 ± 39 days) and in the faeces of 45 % of this group. After 14 days of antibiotic treatment, the R. equi was detected in TBS in 20 % of the foals and in faeces of 5 % of the foals. Thus, after 14 days of treatment significantly fewer animals showed R. equi in any of their samples.

82

7. Summary _________________________________________________________________________________

On day 0 R. equi was isolated from TBS in 30 % and the faeces in 22 % of the foals (age: 105 ± 32 days) that were less severe sick and did not receive antibiotic treatment. The following survey within 14 days resulted in a measurement of 22 % in TBS and 13 % in the foals' faeces, namely in no remarkable difference. R. equi was detected in paired samples of TBS and faeces in high accordance in all the foals. To point it out, on day 0 the accordance of the evidence of R. equi in faeces and the different groups’ lower respiratory tracts had been 93 %. Therefore it can be concluded that healthy foals in a farm with endemic rhodococcosis shed the pathogen. Furthermore faecal samples appear to be a suitable method for detecting an R. equi infection in foals suffering from pneumonia.

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104

9. Anhang _________________________________________________________________________________

9

Anhang

Tab. 10: Zusammensetzung des Staphylokokken-Streptokokken-Selektivmediums

Reagenzien

Volumen

Aqua dest.

1000 ml 43,0 g

(Art.Nr. 1.05468,

Streptokokken-Selektiv-Agar

VWR-International, Hannover)

Agar

1,5 g

(Oxoid, Wesel, Art.Nr. L11)

Den Agar 15 min. quellen lassen, autoklavieren, auf 52 °C abkühlen lassen und anschließend 70 ml Rinderblut hinzugeben.

Tab. 11: Zusammensetzung des Kochblut-Agars

Reagenzien

Volumen

Aqua dest.

1000 ml

Columbia Agar Agar

39 g

(Fa. Oxoid, Wesel, Art. Nr. CM 0331T)

2g

(Fa. Oxoid, Wesel, Art. Nr. L11)

Den Agar 15 min. bei 121 °C autoklavieren, dem noch heißen Agar 100 ml Rinderblut hinzusetzen und gut schwenken. Anschließend auf 55 °C abkühlen lassen und ausgießen.

105

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tab. 12: Reagenzien für die Herstellung der Nährbouillon

Reagenzien Aqua dest.

Volumen 1000 ml

NaCl

5g

Pepton

10 g 10 g

(Difco, Art.Nr. 0118-01-8) (Becton Dickinson, England,

Fleischextrakt Art.Nr. 12303) NaOH

1,5 ml

106

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tabelle 13: Befundbogen zur Dokumentation der Ergebnisse der klinischen Untersuchung Datum

Lunge

Trachea

Nasenausfluss

rauh

rasseln

ohne

serös

mukös

purulent

0

0

1

0

1

1

2

0

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

107

0

Nabel

ja

obB

2

nein

rasseln/giemen

h=1

Husten

vergrößert

verschärft

0

Lnn

obB

obB

Wochen Score

Temp

1

Leukos

A/Pn

Therapie

sonstige Behandlung

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Ultraschalluntersuchung der Lunge Stutennummer

17.

Datum

16. 15. 14. 13. 12.

11.

10.

Stall / Weide

9.

8.

7.

6.

5.

4.

3.

A

B

C

rechts

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

A

B

C

Links

Allgemeinzustand: obB □, ____________

___________________ Abb.15: Befundbogen der Lungen-Ultraschall-Untersuchung 108

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tab.14: Daten der gesunden Fohlen, Gruppe 1 StutenNr.

Geboren

Alter Tag 0

Geschl. ♀=1, ♂=2

klinischer Score

91627 95160 98166 98208 99060 99089 00034 00052 01001 01016 01227 02250 02251 02267 03012 03013 03141 04139 04160 04237

08.06.2007 02.08.2007 03.08.2007 15.05.2007 07.08.2007 08.08.2007 16.05.2007 10.08.2007 01.06.2007 27.05.2007 29.07.2007 29.04.2007 01.06.2007 18.07.2007 14.05.2007 07.06.2007 25.05.2007 28.04.2007 16.05.2007 02.06.2007

20 35 34 23 23 22 21 20 20 32 39 24 20 43 24 21 32 25 21 26

2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 2 1 2 2

1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 2 1 1 1 1

Abszess- Leukoscore zyten in cm / µl Blut 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

9.700 12.100 6.100 10.100 7.100 9.000 9.100 7.300 7.800 9.800 7.200 7.700 5.600 10.300 12.400 7.200 8.500 7.500 9.300 12.300

TBS 1 Kot 1 Tag 0 Tag 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

Kot 2 TBS 2 Kot 3 Tag 3 Tag 7 Tag 7 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

1 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

TBS 3 Tag 14

Kot 4 Tag 14

2 0 2 1 3 0 1 0 0 0 1 1 0 3 0 0 1 0 0 0

1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

Alter Tag 0: Alter am Tag der ersten Probenentnahme; Klinischer Score: nach Tab. 1 (Seite 35) TBS und KOT (kulturelle Ergebnisse): 0 = kein Nachweis von R. equi; 1 = ggr. Nachweis von R. equi; 2 = mgr. Nachweis von R. equi 3 = hgr. Nachweis von R. equi

109

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tab.15: Daten der lungenkranken Fohlen mit antibiotischer Therapie, Gruppe 2 StutenNr. 92739 92804 94100 95067 96000 96046 97244 99009 99087 99092 99158 01037 01097 01233 03135 03190 04015 04019 04041 04104 04174

Alter Geschl. klinischer Geboren Tag 0 ♀=1, ♂=2 Score 13.05.2007 11.04.2007 13.04.2007 05.06.2007 10.03.2007 15.04.2007 12.05.2007 26.02.2007 02.06.2007 19.01.2007 11.03.2007 18.07.2007 27.03.2007 19.01.2007 19.04.2007 12.03.2007 30.01.2007 11.03.2007 11.04.2007 17.02.2007 14.06.2007

102 70 41 58 74 52 103 150 82 152 81 20 58 160 50 108 107 103 58 130 63

1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2 2 1 1 2 2 2 1 1

3 2 1 2 2 1 5 2 2 4 4 2 6 3 3 2 1 3 3 3 1

Abszess- Leuko- TBS TBS Kot 4 Kot 1 Kot 2 Kot 3 score zyten 1 Tag TBS 2 Tag 7 3 Tag Tag Tag 0 Tag 3 Tag 7 in cm / µl Blut 0 14 14 9 11 11,5 6 6,5 5 15 5,5 6 6 27 2 10 8 10 7 5 12,5 5 8 6

14.000 21.000 9.700 13.500 14.000 19.800 5.900 13.700 11.200 16.800 10.600 15.100 24.200 16.900 27.100 13.200 15.000 14.400 23.700 16.000 14.600

110

0 3 3 2 3 3 0 0 0 0 3 0 2 0 0 0 0 0 2 0 3

0 2 2 1 2 1 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 0 3

0 2 2 0 2 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 2 0 0

0 2 0 1 2 1 0 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 ausgeschieden 0 1

0 2 2 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0

0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0

0 0

0 0

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tab.16: Daten der lungenkranken Fohlen ohne antibiotische Therapie, Gruppe 3 StutenNr. 89365 94211 96055 97010 97165 97242 98136 98164 98207 98234 99114 99150 00010 01120 01202 01208 02119 02218 02256 02263 03034 03185 03210 04005 04016 04324 E09

Leuko- TBS Kot Kot Alter Abszessklinischer zyten 1 1 3 Geboren Tag Geschl. score Kot 2 Tag 3 TBS 2 Tag 7 ♀=1, ♂=2 Score / µl Tag Tag Tag 0 in cm Blut 0 0 7 29.05.2007 27.04.2007 27.03.2007 23.05.2007 21.04.2007 22.03.2007 27.06.2007 25.03.2007 22.04.2007 12.07.2007 06.02.2007 28.03.2007 30.03.2007 22.04.2007 11.06.2007 20.03.2007 28.06.2007 24.04.2007 18.01.2007 23.01.2007 09.05.2007 04.07.2007 09.04.2007 28.03.2007 16.03.2007 24.07.2007 16.03.2007

58 111 141 63 117 124 105 122 109 90 170 50 139 102 59 128 104 107 147 134 77 98 58 127 139 75 76

2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2 1 1 1 2 2 1 2 1 1 1 2 2 1

1 4 2 2 2 3 3 3 2 3 1 1 0 3 1 1 3 0 3 2 1 5 2 4 4 2 2

2 2 4 2 2 2 2,5 3,5 3 4 1 3 2 1 4 3 2,5 1 2 1 3 1,5 1 1 3 4,5 2

7.800 11.200 16.200 17.100 19.700 13.200 13.000 12.900 13.500 18.900 8.000 13.500 14.300 19.900 19.200 12.700 15.500 18.800 13.400 14.400 17.200 9.100 13.300 17.800 13.100 12.000 18.100

111

2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 0 0 0 0 0 1 0 2 0 0 2 3

1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1

ausgeschieden ausgeschieden ausgeschieden ausgeschieden 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 2

0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 3 0 0 0 0 0 1 ausgeschieden 3 0 ausgeschieden 0 1

TBS 3 Tag 14

Kot 4 Tag 14

0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 ausgeschieden ausgeschieden ausgeschieden ausgeschieden 0 0 0 0 ausgeschieden

0 0 0 0 0 0 0 2

2 0

2 0

0 0

0 0

0 1

0 0

0 0 1 0

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tabellenverzeichnis Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998)…………………........37 Tab. 2: Zeitpunkt der Probenentnahme……………………………………………….…..42 Tab. 3: Irrtums Wahrscheinlichkeit (p-Wert) zur Darstellung der Signifikanz………. ..47 Tab. 4: Alter der Fohlen in Gruppe 1, 2 und 3 zu Studienbeginn……………………... 50 Tab. 5: Klinischer Score der Fohlen in Gruppe 1, 2 und 3………………………….…...50 Tab. 6: Summe der Durchmesser der Lungenabszesse (in cm) der Fohlen in den Gruppen 1, 2 und 3………………………………………………..………..…52 Tab. 7: Ergebnisse der Korrelationsberechnung (Spearman) zwischen dem klinischen Score und dem Nachweis im Kot der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose………………………………………………………………….…….59 Tab. 8: Abszessdurchmesser bei den lungenkranken Fohlen mit und ohne Nachweis von R. equi im TBS am Tag der Diagnose (Tag 0)……………………….……..62 Tab. 9: Abszessdurchmesser bei den lungenkranken Fohlen mit und ohne Nachweis von R. equi im Kot am Tag der Diagnose (Tag 0)………………………....……63 Tab. 10: Zusammensetzung des Staphylokokken-Streptokokken-Selektivmediums. 105 Tab. 11: Zusammensetzung des Kochblut-Agars………………………………………..105 Tab. 12: Reagenzien für die Herstellung der Nährbouillon…………………………..…106

112

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Tab. 13: Befundbogen zur Dokumentation der Ergebnisse der klinischen Untersuchung………………………………………………………………..…….107 Tab. 14: Daten der Gesunde Fohlen, Gruppe 1 ……………...................……….……109 Tab. 15: Daten der Lungenkranken Fohlen mit antibiotischer Therapie, Gruppe 2…110 Tab. 16: Daten der Lungenkranken Fohlen ohne antibiotische Therapie, Gruppe 3.111

113

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Intrazellulär gelegene Kolonie von grampositiven, kokkoiden Stäbchen, die Hinweise auf Rhodococcus equi gibt (Gramfärbung, .100 fache Vergrößerung……………………………………............................…46 Abb. 2: Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret der drei Fohlengruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase…………………………………….......54 Abb. 3: Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret der drei Fohlengruppen an den Untersuchungstagen………………………………………….……….....55 Abb. 4: Nachweis von R. equi im Kot in den drei Fohlengruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase ……………………………………......56 Abb. 5: Übereinstimmung des Nachweises von R. equi in den Probenpaaren (Kot und TBS) der drei Gruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase….57 Abb. 6: Nachweis von R. equi aus TBS der gesunden Fohlen (Gruppe 1) über die 14 über die 14 tägige Beobachtungsphase………………………………………...64 Abb. 7: Nachweis von R. equi aus TBS der lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) über die 14 tägige Beobachtungsphase…………………………...65 Abb. 8: Nachweis von R. equi aus TBS der lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) über die 14 tägige Beobachtungsphase…………………………...65 Abb. 9: Nachweis von R. equi aus Kot der gesunden Fohlen (Gruppe 1) über die 14 tägige Beobachtungsphase……………………………….………..66 Abb. 10: Nachweis von R. equi aus Kot der lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) über die 14 tägige Beobachtungsphase………………….………..67

114

9. Anhang _________________________________________________________________________________

Abb. 11: Nachweis von R. equi aus Kot der lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) über die 14 tägige Beobachtungsphase………………….………..67 Abb. 12: Nachweis von R. equi im TBS und Kot der gesunden Fohlen (Gruppe 1) über die 14 tägige Beobachtungsphase………………….………..68 Abb. 13: Nachweis von R. equi im TBS und Kot der lungenkranken Fohlen mit Therapie (Gruppe 2) über die 14 tägige Beobachtungsphase………………….………..69 Abb. 14: Nachweis von R. equi im TBS und Kot der lungenkranken Fohlen ohne Therapie (Gruppe 3) über die 14 tägige Beobachtungsphase………………..69 Abb. 15: Befundbogen der Lungen-Ultraschall-Untersuchung………………………...108

115

Danksagung _________________________________________________________________________________

Danksagung Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD, möchte ich für die Überlassung dieses interessanten Themas,

die

fachliche

Unterstützung,

die

jederzeit

zur

Verfügung

stehende

Hilfsbereitschaft und die Korrektur meiner Dissertation danken. Paul Schockemöhle danke ich für seine Zustimmung zur Durchführung dieser Arbeit und für die großzügige finanzielle Unterstützung. Weiterhin möchte ich für die mir zur Verfügung gestellte Zeit danken, um diese Arbeit zum Abschluss bringen zu können. Allen Mitarbeitern des Gestüts Lewitz gilt mein Dank für die unkomplizierte und kooperative Zusammenarbeit. Für die Hilfe bei der praktischen Durchführung gilt mein besonderer Dank Simone Schneider und Sebastian Rieck für ihre Unterstützung. Den Mitarbeitern des Institutes für Mikrobiologie des Zentrums für Infektionsmedizin der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover danke ich für die Bearbeitung der Proben. Besonders danke ich Dr. Jutta Verspohl und Dr. Alexander Maas für die fachliche Unterstützung im Bereich der Mikrobiologie. Ich danke auch Dr. Wolfgang Reimers für die Hilfe bei der Auswertung und dem Beantworten der vielen Fragen der Statistik. Danken möchte ich auch Wiebke Block für die vielen Anregungen, die Unterstützung bei den Korrekturen und das jederzeit vorhandene Verständnis. Für das Lesen der Korrektur möchte ich Anna Lindena für die kurzfristige Hilfsbereitschaft herzlich danken. Mein herzlicher Dank gilt Kathrin Kilian, Astrid Hollberg und Sandra Wittmaack für die Unterstützung bei der Probengewinnung und für jegliche andere Art der Hilfeleistung. Der Sommer mit Euch wird mir unvergesslich in Erinnerung bleiben! Der größte Dank gilt Birgit und Wolfgang Kähn, die nach dem Verlust meiner Mutter für mich da waren, mich in Ihre Familie aufnahmen und mir mein Studium und diese Dissertation ermöglicht haben und mir weiterhin jederzeit mit Ihrer Hilfe und Unterstützung zur Seite stehen. Ich danke Euch von ganzem Herzen!

116