Bakteriengenetik!

Mutation & Rekombination! Mutation: ! -  vererbte Veränderung der Nukleotidsequenz des Genoms! -  selten, führen kaum zur Veränderung eines Genoms! ! Rekombination: ! -  Gene aus 2 getrennten Genomen werden in einem DNA-! Molekül zusammengefügt! -  führt zur Entstehung neuer Genkombinationen ohne Mutation! -  häufig, bewirken grosse Veränderungen eines Genoms! ! Mutation & Rekombination führen zu Evolution! ! kein Sex bei Prokaryonten! aber: horizontaler Genfluss!

Genotyp & Phänotyp! Mutante unterscheidet sich vom Elternstamm (Wildtyp)! durch Genotyp (= Nukleotidsequenz des Genoms) und dadurch! veränderte Eigenschaften (Phänotyp) ! Genotyp: hisC! Protein: HisC-Protein! Mutationen in hisC: hisC1, hisC2, etc.! ! Phänotyp: His+ His-!

Isolierung von Mutanten! -  selektierbar: z.B. Antibiotikaresistenz! -  nicht selektierbar: z.B. Farbverlust; Isolation durch Screening! Identifizierung über Replikaplattierung!

Isolierung von Mutanten! auxotrophe Mutanten: haben spezifischen Nährstoffbedarf stammen von prototrophen Eltern ab! ! Penicillinselektion:! tötet nur wachsende Zellen! d.h. prototrophe Eltern werden getötet, auxotrophe Mutanten! reichern sich an!

Beispiele für Mutanten!

Beispiele für Mutanten!

Molekulare Basis der Mutation! Spontane Mutationen: Strahlung, Sauerstoffradikale, falsche! !Basenpaarung während der Replikation !Punktmutation= Veränderung eines Basenpaars ! ! Transition: Purin (A oder G) ersetzt durch anderes Purin, oder! Pyrimidin (C oder T) ersetzt durch anderes Pyrimidin! Transversion: Purin ersetzt durch Pyrimidin oder umgekehrt!

Basenpaar-! substitutionen ! & Effekte!

Leserasterwechsel!

Val

Val

Pro Cys

Pro Val

Val Leu

Molekulare Basis der Mutation! grosse Insertionen oder Deletionen! Translokation, Inversion! ! Reversion von Punktmutationen:! !an der gleichen Stelle = Wiederherstellung des Wildtyps! !an anderer Stelle = Suppressor-Mutation! ! Insertionen können prinzipiell auch revertieren, aber: Leseraster grosse Deletionen nicht!

Mutationsraten! Errors in DNA replication:! ! 10-7 – 10-11 per generation pro Basenpaar! ! The frequency of a mutation occuring in a given gene* ! ! 10-4 – 10-8 per generation! ! *~1000 bp! ! missense häufiger als nonsense! stille häufiger als nonsense! ! DNA-Polymerase-Fehler am häufigsten in repetitiven Sequenzen! = Mutations-Hot Spots!

Mutagenese! induzierte Mutationen durch Mutagene! (chemisch, physikalisch, biologisch)!

Mutationen bei DNA-Reparatur:! SOS-Antwort! nicht jede Mutation wird vererbt:! wenn DNA-Schäden vor der Zellteilung korrigiert werden wenn DNA-Schäden DNA-Replikation verhindern (Zelltod)! ! DNA-Schäden induzieren SOS-Antwort =! Expression von Genen zur DNA-Reparatur! ! LexA Repressor reprimiert SOS-System! DNA-Schaden aktiviert RecA Protease, die inaktiviert LexA! ! führt zu Aktivierung von DNA-Polymerasen IV & V, die DNA! reparieren, aber Fehler machen = DNA-Mutasen!

SOS-Antwort nach UV!

Mutagenese & Carcinogenese:! Ames Test! mutagene Substanzen sind potentielle Krebserreger! Identifizierung mutagener Substanzen mit Hilfe von Bakterien! = Ames Test (Bruce Ames, UC Berkeley, 1972)! ! Inkubation eines auxotrophen Stamms mit Substanz, ! Detektion der Reversion zur Prototrophie! ! verbesserte Version: ! Mutatorstämme (sensitiver) + Leberextrakte (Konversion des Mutagens in physiologisch ! ! ! !aktive Form)! !

Ames Test: ! misst Mutagentitätspotential von Chemikalien!

Control His-auxotrophic mutant

Mutagen (His-)

of Salmonella enterica

Disc contains mutagen

Genetische Rekombination! = Austausch von Genen zwischen genetischen Elementen! ! homologe Rekombination:! Austausch zwischen homologen DNA-Sequenzen aus 2 ! verschiedenen Quellen! ! bei Bakterien: abhängig von Rec A! (homologe Proteine bei allen Prokaryoten, Archaea, auch in ! Eukaryonten)! ! Mechanismus:!

Einzelstrangbruch! ! Helicasen trennen gebrochenen Strang! !vom anderen! ! Einzelstrangbindeproteine binden! ! Stranginvasion mit Hilfe von RecA! DNA-Basenpaarung! ! Austausch homologer Regionen! Heteroduplexbildung! ! Auflösung durch Nuclease & Ligase!

bei Prokaryonten: kein Sex, d.h. homologe DNA Stränge treffen! sich durch Einführen von homologen DNA Fragmenten in eine! Zelle! Demonstration of genetic recombination using selective medium

Genetischer Austausch bei Prokaryonten! durch ! ! Transformation: freie DNA wird von der Zelle aufgenommen! !! Transduktion: DNA-Transfer durch Bacteriophagen! !! Konjugation: DNA-Transfer zwischen Zellen über direkten! ! !Zell-Zell-Kontakt!

Genetischer Austausch bei Prokaryonten:! Transformation! natürlich möglich in gram+, gram- Bacteria, einigen Archaea ! in der Natur Freisetzung von DNA durch Zelllyse & brechen des! Chromosoms!

DNA Transfer! in Bakterien!

DNA Transfer in Bakterien!

EM Prokaryoten-Chromosom!

Rekombinationsexperiment! mit Pneumococcus (F. Griffiths)!

S-cells contain a capsule = pathogen

Transformation! von Bakterien! Natürlich: Azotobacter Bacillus Streptococcus Haemophilus Neisseria Transfektion mit ΦDNA Induziert: E. coli Doppelsträngige DNA (Plasmide)

Transformation! von Bakterien!

Allgemeine! Transduktion!

E. coli P1 Pseudomonas Salmonella P22 Rhodobacter Staphylococcus Methanothermobacter

Spezielle! Transduktion! λdgal Phagen können mit Helferphagen vermehrt werden Reduktion der ΦDNA auf att, cos, ori

Spezielle! Transduktion!

Electron micrograph of a bacterial chromosome and plasmids

Plasmids

~300 different plasmids were isolated from strains of E. coli

Plasmide & ihre biologische Bedeutung! Phänotyp Antibiotika Produktion Konjugation Abbau von Octan, Campher, Naphthalin Bildung von Aceton und Butanol

Organismus Streptomyces Escherichia, Pseudomonas Rhizobium, Staphylococcus, Vibrio Pseudomonas Clostridium

Knöllchenbildung, N2-Fixierung

Rhizobium

Antibiotikaresistenz

Enterobakterien, Neisseria, Staphylococcus Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus

Resistenz gegen Schwermetalle Bacteriozine: Colicin, Nisin Virulenz Invasion der Wirtszelle Coagulase, Hämolysin, Enterotoxin Tumorgenese in Pflanzen

E. coli, Milchsäurebakterien Salmonella, Shigella, Yersinia Staphylococcus Agrobacterium

Genetic map of the F-(fertility) plasmid of E. coli Gene für konjugativen Transfer

Start of transfer

Gene für Replikation und Segregation

Tn, Is are sequences involved in the in the integration into the host chromosome leading to Hfr-strains

Gentransfer durch Konjugation!

Genetic map of the conjugative resistance plasmid R100

Transferfunktionen

Ori des konjugativen Transfers

conjugation transpostion

Wirte: Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Proteus, Shigella

Contact between two bacteria via a pilus

F-

F+

Following the contact via a pilus, there is retraction of the pilus within the donor cell

Plasmidtransfer durch Konjugation!

Plasmidtransfer ! durch Konjugation!

TABLE 9.3 Some phenotypes conferred by plasmids in prokaryotes Phenotype classa

Organismsb

Antibiotic production Conjugation

Streptomyces Escherichia, Pseudomonas, Rhizobium, Staphylococcus, Streptococcus, Sulfolobus, Vibrio

Physiological functions Degradation of octane, camphor, naphthalene, Degradation of herbicides Formation of acetone and butanol Lactose, sucrose or urea utilization and nitrogen fixation Nodulation and symbiotic nitrogen fixation Pigment production Resistance Antibiotic resistance Resistance to cadmium, cobalt, mercury, nickel, and / or zink Bacteriocin resistance (and production) Virulence Host cell invasion Coagulase, hemolysin, enterotoxin Enterotoxin, K antigen Tumorigenicity in plants

Pseudomonas Alcaligenes Clostridium Enteric bacteria Rhizobium Erwinia, Staphylococcus Campylobacter, Enteric bacteria, Neisseria, Staphylococcus Acidocella, Alcaligenes, Listeria, Pseudomonas, Staphylococcus Bacillus, Enteric bacteria, Lactococcus, Propionibacterium Samonella, Shigella, Yersinia Staphylococcus Escherichia Agrobacterium

F-Plasmid-Integration ins Chromosom!

Hfr

Hfr-strain: Beginn der Übertragung auf den Empfänger

Replication occurs during transfer. F-plasmid >3 % of the E. coli chromosome.

Übertragung chromosomaler DNA durch Konjugation

Bildung verschiedener Hfr-Stämme durch Insertion des F-Plasmids an spezifischen Stellen

Experiment for the detection of conjugation

Rate of formation of recombinants by interrupted mating

Circular linkage map of the chromosome of E. coli K-12 Genes of the maltose regulon

84.3 min

Integragation of Lambda Copy of IS3 element 4.639.221 bp 4288 ORFs without F-Plasmid and λ

88% ORFs, ~1% of the genome codes for tRNAs und rRNAs, 0,5% repet. sequences, and ~10% are regulatory sequences such as promoter, operator, oris etc. 10 different IS-elements. By convention 0 min and 0 kbp are at the thr locus.

Komplementations-Analyse

Komplementations-Analyse

Maps of the transposable elements IS2 and Tn5 Transposase 1327 bp

5,7 kbp

Nonsensemutation im Transposasegen Resistance genes Kanamycin, Streptomycin and Bleomycin. Tn5 is used for the generation of Tn-mutants in E. coli and other Gram-negative bacteria.

Transposon Mutagenese

TABLE 9.4

Transposable elements

Prokaryote

Eukaryote

Insertion sequence: IS Transposon: Tn

Yeast: sigma Yeast: Ty Fruit fly: copia, P Maize: Ac Retrovirus: Rous sarcoma, human immunodeficiency virus (HIV)

Virus: Mu

Gene disruption using cassette mutagenesis

Genklonierung

Der Vektor kann ein Plasmid sein, oder ein virales Genom.

Locusspezifische Mutagenese

Locusspezifische Mutagenese

Genfusionen

Plasmid pUC19

Klonieren mit pUC19

Klonieren mit pUC19

Klonierungswirte

Klonieren mit E. coli Phage lambda

Klonieren mit E. coli Phage lambda EcoRI

~20 kb

Klonieren mit E. coli Phage M13

Klonieren grosser DNA Fragmente: Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) bis zu 300 kb Inserts

Klonieren grosser DNA Fragmente: Yeast Artificial Chromosomes (YAC) bis zu 800 kb Inserts

Klonieren grosser DNA Fragmente: Yeast Artificial Chromosomes (YAC)

bis zu 800 kb Inserts