MultiplexLine Diagnostic Kits

Multiplex VRE

Instructions for use / Gebrauchsinformation

Multiplex VRE Multiplex-PCR for the detection of multiresistant enterococci Multiplex-PCR zum Nachweis multiresistenter Enterokokken

In vitro diagnosticum

Multiplex VRE PCR-Module Multiplex VRE Hybridisation Module Enterococcus faecium Multiplex VRE Hybridisation Module Enterococcus faecialis Multiplex VRE Hybridisation Module HL Gentamycinresistence Multiplex VRE Hybridisation Module Vancomycin A Multiplex VRE Hybridisation Module Vancomycin B valid from / gültig ab:

REF AX3830 REF AX3831 REF AX3832 REF AX3833 REF AX3834 REF AX3835 June 2012 / Juni 2012

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Multiplex VRE Explanation of symbols used in labeling / Erläuterungen der Symbole auf den Etiketten English

Deutsch

IVD

For in vitro diagnostic use

In vitro Diagnostikum

LOT

Batch code Catalogue number

Lot-Nummer Bestell-Nummer

Use by

Verwendbar bis

Temperature limitation

Lagertemperatur

PRIMER

PCR primer mixture

PCR-Primer-Mix

dNTP

Nucleotide mixture

Nukleotid-Mix

CONTROL│+

PCR positive control

PCR-Positivkontrolle

PCR negative control

PCR-Negativkontrolle

Micro well strip, breakable

Mikrotiterstreifen, abbrechbar

REF

CONTROL│MTS│BR│XX

1

MTS│BR│CONTROL│+

Positive control microwell strip, breakable

MTS│BR│BLANK

Reagent control microwell strip, breakable

HYBBUF

Hybridization buffer

Positivkontroll-Mikrotiterstreifen, abbrechbar ReagenzienkontrollMikrotiterstreifen, abbrechbar Hybridisierungspuffer

STRGWASH

Stringent washing solution

Stringente Waschlösung

WASHBUF│20 X

Washing buffer, 20x concentrated

Waschpuffer, 20x konzentriert

CONJ│100 X

Conjugate, 100x concentrated

Konjugat, 100x konzentriert

SUBS│TMB

TMB substrate

TMB-Substrat

STOP│H3PO4│25%

Stop solution

Stopplösung

CONT

Contains

Inhalt, enthält

Consult instructions for use

Gebrauchsinformation beachten

Hazardous

Gefährlich

Manufacturer

Hersteller

H 314 / 290 P 280 P301+330+331 P305+351+338 P 309+311 1

Definition der Parameter siehe Tabelle S. 7 / definition of parameters see table p. 24 Hinweis auf besondere Gefahren und Sicherheitsratschläge (H- und P-Sätze) Nature of special risk and safety precautions (H- and P-codes) H290: Kann gegenüber Metallen korrosiv sein. / May be corrosive to metals. H314: Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. / Causes severe skin burns and eye damage. P280: Schutzhandschuhe/ Schutzkleidung/ Augenschutz/ Gesichtsschutz tragen. / Wear protective gloves / protective clothing / eye protection / face protection. P301 + P330 + P331: BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. / IF SWALLOWED: rinse mouth. Do NOT induce vomiting. P305 + P351 + P338: BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen, weiter spülen.) / IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing P309 + P311: Bei Exposition oder Unwohlsein: Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen. / IF exposed or if you feel unwell: Call a POISON CENTER or doctor/physician. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 2 of/von 30

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Multiplex VRE Content / Inhaltsverzeichnis: ENGLISH

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Introduction The Enterococcus genus Structure of the Multiplex VRE test system Test principle Reagents Warnings and precautions Handling notes Sample material Test procedure Brief instructions on test procedure Evaluation Interpretation of the test results Control results of the Multiplex VRE test system Troubleshooting Performance data References

4 4 5 6 7 8 8 9 10 13 13 14 14 15 15 17

DEUTSCH

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Einleitung Die Gattung Enterococcus Aufbau des Multiplex VRE Testsystems Testprinzip Reagenzien Warn- und Entsorgungshinweise Hinweise zur Handhabung Probenmaterial Testdurchführung Kurzanleitung der Testdurchführung Auswertung Hinweise zur Interpretation der Testergebnisse Kontrollergebnisse des Multiplex VRE -Testsystems Troubleshooting Leistungsdaten Literatur

18 18 19 20 21 22 22 23 24 27 27 28 28 29 29 30

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Multiplex VRE Instructions for use Multiplex-PCR for the detection of multiresistant enterococci in vitro diagnosticum 1. Introduction The Multiplex VRE PCR Module (order no. AX3830) is part of a qualitative in vitro test for the detection and reliable identification of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis as well as their genotypic resistances against the antibiotics gentamicin (high-level resistance) and vancomycin / teicoplanin. With the Multiplex Hybridisation Modules (order nos. AX3831 to AX3835), the amplification products that were generated with the Multiplex VRE PCR Module can be further differentiated and visualised through reversible hybridisation with specific oligonucleotides. 2. The Enterococcus genus Enterococci are gram-positive cocci that occur singly, in pairs and in short chains. As such they are very difficult to distinguish from streptococci and, hence, were originally assigned to this genus and classified as “Group D streptococci” in the Lancefield classification system. During the 1980’s, on the basis of phylogenetic characteristics, the separate genus Enterococcus was established to which 29 different species belong. Enterococci are able to survive in very hostile environments and, thus, are ubiquitous. The preferred habitat, however, is the intestinal tract of humans and animals. To a minor extent, these bacteria can be also isolated from the oral and pharyngeal cavities, the vaginal area and skin. Particularly two species are clinically important for humans: E. faecium and E. faecalis, which represent about 80-90 % and 5-15 % of the clinical isolates of this genus, respectively. E. gallinarum, E. casseliflavus or E. durans are more rarely represented [1,2]. Relatively little is known about the ability of enterococci to cause infections in humans. Urinary tract infections are the most noticeable clinically relevant enterococcal infection; however, endocarditis can also be caused by enterococci. Due to their intrinsic resistance to numerous antibiotics (e.g., cephalosporins, clindamycin, trimethoprim-sulphamethoxazole and low concentrations of aminoglycosides [3]), enterococci have become enormously important as causative agents of nosocomial infections during the past years. Today, they are the second most frequent cause of nosocomial urinary tract infections (22 %) and are also found in catheter-associated sepsis (11 %) and postoperative wound infections (12 %) [4]. In 1988, the first enterococci that showed resistance to the glycopeptide antibiotics vancomycin and teicoplanin were isolated in England and termed Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) [5]. As a consequence, the therapeutic possibilities were drastically limited, which is why some authors write of the beginning of a “post-antibiotic era”, no less [6]. In fact, the implications of VRE from the view of hospital hygiene is even more complicated than that for the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) since treatment possibilities for infected patients are considerably reduced by the multitude of potential intrinsic and acquired antibiotic resistances [7]. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 4 of/von 30

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Multiplex VRE With the Multiplex VRE test system, both clinically important enterococci species can be detected. In addition, the three genes responsible for antibiotic resistances can be detected with this test. A) aacA/aphD: This gene encodes a bifunctional enzyme, 2’-phosphotransferase / 6’-acetyltransferase, that is responsible for the high-level resistance (MIC > 500 µg/ml) to the aminoglycosides gentamicin, tobramycin, amikacin and kanamycin and is also widely found in staphylococci. This enzyme modifies the gentamicin molecule so that it can no longer bind to the bacterial ribosome and inhibit protein biosynthesis. There are other mechanisms that can impart resistance to gentamicin; however, the mechanism described here occurs by far the most frequently [8]. Because other bacteria also possess this gene, a definite attribution of this gene to a species can be made only by testing a pure culture. B) vanA and van B: Vancomycin is a glycopeptide antibiotic that inhibits the biosynthesis of the cell wall in enterococci in that it prevents the crosslinking of the peptidoglycan [7]. The genes vanA and vanB encode two similar ligases that modify a precursor of the cell wall so that vancomycin can no longer bind and, thus, cell wall biosynthesis can again take place. Carriers of the vanA gene show a high resistance to vancomycin (MIC ≥ 64 µg/ml) and teicoplanin (MIC ≥ 16 µg/ml) [9], while vanB carriers have lower MIC (32 to 64 µg/ml) for vancomycin and are sensitive to teicoplanin. The fact that the genetic elements (called the vanA/B gene cluster) of both resistances are transferable between different enterococci species is very worrisome [10]. Additional vancomycin resistance genotypes have been described (vanC, vanD and vanE), but are presently not of clinical importance. 3. Structure of the Multiplex VRE test system Multiplex VRE PCR module (Cat. No. AX3830): Manufacture of specific PCR amplifications products from sample material, sufficient for a maximum of ten hybridisations per PCR reaction. Multiplex VRE Hyb-modules (Cat. No. AX3831 - AX3835): Single wells with immobilized oligonucleotide probes for the specific detection of the parameters listed below (sales unit: 96 wells per probe) and reagents to conduct 96 reverse hybridisations. Sample material: PCR products formed using the Multiplex VRE PCR module. The table below lists the specific probes (Hybridisation modules) available separately for the Multiplex VRE test system.

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Multiplex VRE Hybridisation modules for the Multiplex VRE test system Symbols Specificity Well colour MTS│BR│EM Enterococcus faecium white MTS│BR│ES Enterococcus faecalis green MTS│BR│GE aacA orange MTS│BR│VA vanA burgundy MTS│BR│VB vanB (all subtypes) purple

Cat. No.: AX3831 AX3832 AX3833 AX3834 AX3835

One PCR amplification may be used to perform ten hybridisations. Thus one sample can be tested for the 5 parameters mentioned and the various VRE probes may be selected as required. 4. Test principle The Multiplex VRE PCR modules contain labelled oligonucleotide primers, which allow simultaneous, specific amplification of different enterococcal DNA regions in a single PCR reaction. In addition to an amplified fragment that is formed only in the presence of DNA from specific species of the genus Enterococcus also the genes aacA, van A and vanB (three subtypes) are formed, if these genes are present. The specific amplified fragments of the two medically relevant species of Enterococcus and of their genetic potential to express three antibiotic resistances formed in a single reaction, can be identified. For the amplification products from one PCR with the Multiplex VRE PCR modules are added heat-denatured to single-stranded, specific probes which are immobilized on the polystyrene surfaces of microtiter plates. Using a hybridisation buffer, hybridisation of complementary sequences occurs which can then be detected using the ELISA principle. After several stringent wash steps, a peroxidase (POD) conjugate is added. This binds highly specifically to the labelling of the single strand of the PCR product bound to the oligonucleotide probe. After further wash steps, TMB substrate solution is added which produces a blue colour when converted by POD. This reaction is stopped using a stop solution. A colour change to yellow is observed. Extinction of the various wells is then measured in a photometer at a wavelength of 450 nm. Positive signals indicate specific amplification of certain DNA sequences during the Multiplex VRE PCR and thus the presence of the corresponding genes in the sample to be investigated. Therefore, unambiguous determination of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis as well as the detection of three clinically relevant genes is possible.

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Multiplex VRE 5. Reagents 5.1 Contents of PCR modules: The reagents contained in one kit are sufficient for 96 determinations. Each reagent set contains: PRIMER

dNTP CONTROL│+ CONTROL│MTS│BR│CONTROL│+

Primer Mix (green cap, ready for use) Contains labelled oligonucleotide primer Nucleotide Mix (yellow cap, ready for use) Contains dATP, dCTP, dGTP, dTTP Positive control (red cap, ready for use) Negative control (blue cap, ready for use) Positive control probes, breakable (colour coding: blue)

240 µl

120 µl 125 µl 100 µl 16 wells

5.2 Contents of Hybridisation modules: The reagents contained in one kit are sufficient for 96 determinations. Each reagent set contains: MTS│BR│BLANK MTS│BR│XX HYBBUF STRGWASH WASHBUF│20 X

CONJ│100 X

SUBS│TMB STOP│H3PO4│25%

Reagent control, breakable Colour-coded wells with specific oligonucleotide probe, breakable Hybridisation buffer (ready for use) Contains standard saline citrate buffer (SSC), sodium dodecyl sulphate (SDS) and N-lauroylsarcosine Stringent washing solution (ready for use) Contains SSC and SDS Washing buffer (concentrated 20 times) Contains phosphate buffer, NaCl and detergent, preservatives: methylisothiazolone and oxypyrion Conjugate (concentrated 100 times, transparent cap) Preservatives: methylisothiazolone, dimethyaminoantipyrine and chloracetamide TMB (tetramethylbenzidine) substrate solution (ready for use) Stop solution (25 % phosphoric acid, ready for use)

16 wells 96 wells 10 ml 100 ml 12 ml

120 µl

12 ml 12 ml

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5.3 Additional reagents and accessories required Reagents • Tth-DNA polymerase (Cat. No. 104001) incl. reaction buffer • sterile, double-distilled H2O • Multiplex Lysis buffer (Cat. No. AX3950) Accessories • Heating block • PCR thermocycler • PCR reaction vessels (recommended: 0.2 ml) • Pipettes with sterile disposable tips • Incubator (50° C ± 1° C) • Microtiter plate photometer for measuring extinction at 450 nm and 620 nm 6. Warnings and precautions All reagents and materials which come into contact with potentially infectious samples must be treated with suitable disinfectant or autoclaved. Suitable disposable gloves must be worn during the entire test. The conjugate, the TMB substrate solution and the washing buffer contain preservatives. Avoid contact with the skin or mucous membranes. If this does happen, rinse affected areas with plenty of water. Phosphoric acid is an irritating substance. Avoid contact with the skin and mucous membranes. If this does happen, rinse affected areas with plenty of water. 7. Handling notes With the exception of the positive control probes (2...8° C), the reagents of the Multiplex VRE PCR modules should be stored at - 20° C after receiving them. Avoid frequent thawing and freezing of the reagents. After using for the first time, the reagents may be stored at 2...8° C to avoid thawing and freezing steps but in this case the reagents should be used within three months. The reagents of the Multiplex VRE Hyb-modules should be stored at 2...8° C. Before beginning the test, the washing buffer, TMB substrate solution, the stop solution as well as the closed snap-seal bag with the microtitre wells should be kept at room temperature (18...25° C) for at least 30 minutes. The stringent washing solution must be preheated to 50° C. Always keep the hybridisation buffer and the conjugate cool. The kits have an expiry date. Quality cannot be guaranteed after this date. To minimize the probability of nonspecific product formation, it is recommended that the amplification reactions be pipetted on ice and that DNA polymerase be the last reagent to be added. Due to the danger of contamination, suitable (non-powdered) disposable gloves and pipette tips with filter insert should be used when preparing for the test.

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Multiplex VRE 8. Sample material The sample material may consist of pure bacterial cells or isolated DNA. If cells are used as sample material, a single bacterial colony should be suspended in 300 µl Multiplex lysis buffer (Cat. No. AX3950). The lysis buffer is incubated for 10 min in a boiling water bath / thermoblock (99° C). After centrifugation (2 min at 10000 x g), 5 µl of the supernatant is used in the amplification reaction. If an enrichment bouillon is to be tested as sample material 10 - 100 µl of the overnight culture is centrifuged and the pellet washed with 1 ml Saline-EDTA Buffer (order no. AX3953). After another centrifugation (2 minutes at 10.000 x g), the supernatant is decanted and the pellet suspended in 300 µl Multiplex lysis buffer (order no. AX3950). The Lysis Buffer is incubated in a boiling water bath / heating block (99° C) for 10 minutes. After a centrifugation step (2 minutes at 10.000 x g), 5 µl of the supernatant is used for the amplification reaction. If the test is performed directly with a swab, a wet swab with transport media (e.g. Amies medium) should be squeezed out in 300 µl Multiplex lysis buffer (Cat. No. AX3950). If dry swabs without transport media are used, the swab should be squeezed out in 500 µl Multiplex lysis buffer (Cat. No. AX3950). Following, in both cases the lysis buffer is incubated for 10 min in a boiling water bath / thermoblock (99° C). After centrifugation (2 min at 10.000 x g), 5 µl of the supernatant is used in the amplification reaction. Sample type Nasal swab Throat swab Skin swab Wound swab Anal smear

DNA preparation

Simple cell lysis with lysis buffer Simple cell lysis with lysis buffer Simple cell lysis with lysis buffer Simple cell lysis with lysis buffer DNA isolation with commercial system Tracheal secretion DNA isolation with commercial system Sputum, punctate, urine DNA isolation with commercial system

Sample volume to be used 5 µl lysate supernatant 5 µl lysate supernatant 5 µl lysate supernatant 5 µl lysate supernatant 1 - 5 µl DNA eluate 1 - 5 µl DNA eluate 1 - 5 µl DNA eluate

To isolate genomic DNA from patient material such as anal smears, tracheal secretions, punctates or extremely purulent wound swabs, commercially available systems such as the following should be used: •

•

MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH) Multiplex Prep Module (Cat. No. AX3951)

Repeated freezing and thawing of isolated DNA should be avoided.

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Multiplex VRE 9. Test procedure 9.1 Preparing the amplification reaction The reactions are prepared using the buffer supplied by the DNA polymerase manufacturer and using the following batch: x µl Sample material (e.g. 5 µl sample lysate and 5 µl negative / positive control) 1 µl Nucleotide mix (yellow cap) 2 µl Primer mix (green cap) 5 µl 10x PCR buffer 0,2 µl Tth-DNA polymerase (1 U) to 50 µl double-distilled H2O If genomic DNA is used as sample material, the amplification reaction should be added between 1 and 100 ng DNA. Caution! Too much DNA or cell material may considerably reduce the effectiveness of a PCR and lead to false negative results. 9.2 Amplification reaction The PCR thermocycler should be programmed as follows: Cycle Once

35 times

Once

Temperature [° C] 94 94 52 72

72

Time 5 min 25 sec 25 sec 20 sec + 1 sec/cycle or 45 sec 3 min

Reaction Initial denaturation of the DNA Denaturation of the DNA Binding of the primers 3´-OH extension of the primers

Final extension

After completing the PCR, the reaction mixture should be stored at -20°C until reverse hybridisation is conducted with the Multiplex hybridisation modules. 9.3 Reverse hybridisation The desired Multiplex hybridisation modules are required to perform reverse hybridisation. The amounts mentioned below each refer to the processing of an individual microtiter plate well. The Multiplex VRE test system offers the user the option of designing the test individually to suit his needs and interests. When using several different probes at the same time, the indicated amounts must be multiplied by the number of wells needed. Examples: A sample should be tested for the presence of the relevant Enterococcus species as well as for vancomycin resistance. To do so, the EM, ES, VA and VB probes, i.e. a BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 10 of/von 30

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Multiplex VRE total of 4 probes = wells for the sample, are required and 4 probes = wells for the negative control. Furthermore 1 positive control probe and 1 reagent control probe are needed. The quantity data must be multiplied by a factor of 10. If 3 samples should be tested with the the EM, ES, VA and VB probes, the quantity data must be multiplied by a factor of 18 (3 x 4 = 12 wells for the samples, 4 wells for the negative control, 1 well for the positive control and 1 well for the reagent control). When several samples are to be hybridized with different probes, the total number of wells needed must be determined and the amounts indicated below must be multiplied by this figure. Before use, the stringent washing solution must be preheated to 50° C and the washing buffer, TMB substrate solution, stop solution and the required microtiter plates should be brought to room temperature (18...25° C).

9.3.1 Test plates In plastic frames, the different probes in their colour-coded wells may be combined with each other as required. To do this, the wells are broken away individually from the delivered strips and inserted firmly into the frame. Wells which are not required are stored again at 2...8° C in the snapseal bag together with the desiccant. One of the reagent controls contained in the Multiplex Hyb-module must be used for every test batch to determine the reagent background signal. After initial addition of 50 µl hybridisation buffer, they are processed in the same way as the samples. There must also be a positive and a negative control for each test batch. The PCR batch of the positive control is diluted in accordance with Section 9.3.2 and 50 µl of the resulting solution is inserted into a positive control well and further treated in accordance with the protocol (see below). The PCR batch of the negative control is diluted in accordance with Section 9.3.2 and 50 µl of the resulting solution is pipetted into the used specific probe wells and further treated in accordance with the protocol (see below). 9.3.2 Preparation of the PCR sample and hybridisation procedure The 50 µl reaction mix of the Multiplex VRE PCR carried out is denatured in the reaction vessel for 10 min at 95° C. It is recommended that the procedure is carried out in a thermal cycler with a heated lid. 5 µl of the PCR batch per well is then immediately added to 50 µl cool (2...8° C) hybridisation solution, is well mixed, and 50 µl of this is then quickly transferred by pipette to the corresponding well. The microtitre plate is incubated for 30 min at 50° C. To prevent high evaporation loss of the hybridisation solution, the microtitre plate should be covered. 9.3.3 Stringent washing The wells are completely emptied and washed briefly three times with 200 µl of the preheated stringent wash solution on each occasion. It should be ensured that the stringent wash solution is removed between each washing step. After the last washing step, the plate is tapped onto a paper towel to remove any last residue of fluid from the wells. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 11 of/von 30

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Multiplex VRE 9.3.4 Manufacture of the washing buffer The washing buffer concentrate is diluted 1+19 with deionized H2O. Per well, 0.05 ml concentrate and 0.95 ml deionized H2O are mixed. The wash buffer can also be manufactured in greater amounts and stored for later use for a week at room temperature. 9.3.5 Washing The wells are washed once briefly at room temperature with 200 µl washing buffer. 9.3.6 Incubation with peroxidase conjugate The conjugate solution must always be prepared afresh. Per well, 1 µl conjugate concentrate (transparent cap) is added to 100 µl washing buffer in a clean vessel and mixed well (dilution 1+100). 100 µl are pipetted into each well and the microtiter plate is incubated for 30 min at room temperature. 9.3.7 Washing The wells are emptied and each well is washed three times briefly with 200 µl washing buffer at room temperature. Please ensure that the washing solution is removed completely between the washing steps. 9.3.8 Substrate reaction The TMB substrate solution is ready for use. Pipette 100 µl per well. Incubate the microtiter plate for 15 min at room temperature away from direct sunlight. The time is calculated from pipetting of the first well. 9.3.9 Stopping the reaction To stop the reaction, pipette 100 µl of stop solution into each well. Observe the same pipetting procedure as for pipetting of the TMB substrate solution. 9.3.10 Extinction measurement Measure the extinction of the individual wells in a microtiter plate photometer at 450 nm and a reference length of 620 - 650 nm. Zero comparison is made against air. Measurement should take place within 60 minutes of stopping the reaction.

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Multiplex VRE 10. Brief instructions on test procedure Dilutions: • Washing buffer dilution • Conjugate dilution Test steps: • Denaturation • Sample dilution:

1+19 with deion. H2O 1+100 with diluted washing buffer

0.05 ml + 0.95 ml per well 1 µl + 100 µl per well

10 min at 95° C

• • • •

Hybridisation: Stringent washing: Wash step: Conjugate incubation:

PCR reaction batch Add 5 µl PCR reaction batch to 50 µl hybridisation solution 50 µl per well 200 µl per well 200 µl per well 100 µl per well

• •

Wash step: Substrate incubation:

200 µl per well 100 µl per well

• •

Stop: Photometric measurement

100 µl per well with stop solution 450 / 620 nm

30 min at 50°C ± 1° C 3 times briefly Once briefly 30 min at room temperature 3 times briefly 15 min at room temperature

11. Evaluation The test can be evaluated under the following conditions: • Extinction of reagent control ≤ 0.200 • Extinction of negative control (NCE) ≤ 0.200 • Extinction of positive control ≥ 1.500 If the positive control has a lower signal strength, there is the danger of evaluating weakly positive samples as negative. This could possibly be due to a temperature of the hybridisation step or of the stringent solution which is too high (see also Section 14). Analytical criteria with use of cellular material from a pure culture, enrichment bouillon or from DNA isolated from it: • Samples with extinction values of greater than 0.400 are treated as positive • Samples with extinction values of between 0.200 and 0.400 are borderline. They should be retested. • Samples with extinction values of less than 0.200 are treated as negative. Analytical criteria with direct use of patient material or DNA isolated from it: • Samples with extinction values of greater than 0.400 are treated as positive • Samples with extinction values of between 0.300 and 0.400 are borderline. They should be retested. • Samples with extinction values of less than 0.300 are treated as negative. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 13 of/von 30

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Multiplex VRE 12. Interpretation of the test results The Multiplex VRE system is a quick, universally applicable rapid test to detect clinically relevant enterococcal genes. Positive results of the Multiplex VRE system indicate the presence of enterococcal genes in a sample. This does not mean that the gene has actually also been expressed. However, the pathogens found in the sample investigated have the genetic potential to do so. This test system does not give any information on minimal inhibitory concentrations of the pathogen against gentamycin, vancomycin and teicoplanin. Futhermore, the gene aacA which codes for the HL-resistance against gentamycin, are found also in other bacteria, e.g. some staphylococci. At a simultaneously positive result of the parameters EM / ES and GE it is not firmed, that the gene aacA orginates from the genome of the detected enterococcus, unless a single pure culture was tested. The result of the Multiplex VRE system depends on the quantity and quality of the enterococcal DNA in the sample. The PCR of the Multiplex VRE PCR modules amplify even small numbers of copies of relevant enterococcal DNA to such amounts that positive signals can be observed. A negative Multiplex VRE test result cannot rule out the presence of enterococci in the sample material. For example, the effectiveness of the PCR may be reduced drastically by inhibitory substances in the sample material and this can in turn result in low signals. When DNA is isolated from a sample, it can sometimes be fragmented or may not be of the required purity (presence of PCR inhibitors). Therefore commercially available DNA isolation and cleaning kits, as well as amplification control (see Section 13) in cases of doubt, are recommended. If results are achieved in an evaluable test which are in the borderline zone (see Section 11), the sample is probably positive but amplification of the enterococcal DNA has been reduced by suboptimum conditions. In this case, repeating the test (with newly isolated DNA or after a concentration step) is recommended. 13. Control results of the Multiplex VRE test system When performing the positive control, an amplification product is formed which shows a positive signal with an OD450 nm > 1.5 after reverse hybridisation with the specific positive control probe. In the case of doubtful negative results, the positive control may also be used as an amplification control. By adding the positive control of the Multiplex VRE PCR modules to the PCR batch of the sample to be investigated, the presence of PCR inhibiting substances may be checked in the sample material. If the positive control probe has no signal, the PCR was inhibited in this case and no statement can be made about the presence of enterococcal DNA in the sample. Repeating the test with freshly cleaned DNA is recommended. If the positive control probe has a positive signal, there is no systemic error in the PCR and the hybridisation, and the sample to be investigated is to be classified as negative. In the case of the negative control, no amplification product and thus no hybridisation signal should be observed with any probe.

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Multiplex VRE 14. Troubleshooting Constantly weak signals or no signals at all (incl. positive control) • Temperature of the stringent washing solution clearly above 50° C • PCR products not (sufficiently) denatured or renatured again prior to hybridisation • Substrate not equilibrated to room temperature • Wrong amount of conjugate and/or substrate used Weak signals or no signals at all with the exception of the positive control • Quality and/or quantity of the isolated DNA do not allow effective amplification. Check PCR products in 2% agarose gel. If necessary, repeat DNA isolation and amplification, possibly use another method of DNA isolation • Insufficient thermal lysis (too short; temperature not 99° C) when using the Multiplex lysis buffer • When using cell or patient material, use the positive control to check for the presence of PCRinhibiting substances (see Section 13) or perform DNA isolation Generally high (background) signals The use of insufficiently heated stringent washing solution or an incubation temperature which is too low may lead to nonspecific signals. Specific, positive signals are potentiated to the same degree, thus maintaining the contrast between nonspecific and specific signals. If there is doubt as to the evaluability of the test run (see Section 0), repetition with the correct parameters is recommended. 15. Performance data 15.1 Verification of the sensitivity and specificity with reference strains of different bacterial species Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Strain no.

Organism Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus arlettae Staphylococcus capitis Staphylococcus caprae Staphylococcus hominis Staphylococcus simulans Staphylococcus warneri Enterococcus avium Enterococcus casseliflavus Enterococcus cecorum Enterococcus columbae Enterococcus dispar Enterococcus durans Enterococcus faecalis ssp. lique Enterococcus faecalis ssp. zymo Enterococcus faecium Enterococcus flavescens Enterococcus gallinarum

ATCC 12601 9819/0902 ATCC 14990 DSM 20263 CCM 883 BP47 LK499 CCM 3573 DM 122 DSM20322T RM130 DSM 20679 T DSM 20680 T DSM 20682 T DSM 7374 DSM 6630 T DSM 20633 DSM 20380 DSM 20371 DSM 20477 T DSM 7370 DSM 20628 T

EM +++ -

ES +++ +++ -

specific probe GE VA +++ -

VB -

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Multiplex VRE Nr. 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73

Strain no.

Organism Enterococcus hirae Enterococcus malodoratus Enterococcus mundtii Enterococcus pseudoavium Enterococcus raffinosus Enterococcus seriolicida Enterococcus solitarius Enterococcus sulfreus Enterococcus asini Enterococcus saccharolyticus Enterococcus avium Streptococcus oralis Streptococcus dysgalacticae Streptococcus pyogenes Streptococcus salivarius Streptococcus agalacticae Streptococcus pyogenes Streptococcus mutans Streptococcus sanguinis Serratia marcescens Citrobacter freundii Enterobacter amnigenus Enterobacter intermedius Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter kobei Enterobacter gergoviae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas alcaligenes Serratia liquefaciens Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum Enterococcus flavescens Enterococcus casseliflavus

Specificity: Sensitivity:

DSM 20160 DSM 20681 T DSM 4838 T DSM 5632 DSM 5633 T DSM 6783 T DSM 5634 T DSM 6905 T DSM 11492 DSM 20726 T DSM 20679 T DSMZ 20379 DSMZ 20662 DSMZ 20565 DSMZ 20560 DSMZ 6784 DSMZ 11728 DSMZ 20523 DSMZ 20567 DSMZ 30121 DSMZ 30039 DSMZ 4486 DSMZ 4581 DSMZ 30053 DSMZ 30054 DSMZ 13645 DSMZ 9245 DSMZ 301 DSMZ 681 DSMZ 4798 DSMZ 939 DSMZ 50415 DSMZ 50432 DSMZ 4487 KHH V24018 KHH V21830 UW2359 UW2378 UW2430 UW2459 UW2802 UW2806 UW2900 UW2933 UW2640 UW2740 UW701 UW702 UW703

EM +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -

ES +++ +++ -

specific probe GE VA +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -

VB +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -

100 % 100 % BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de

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Multiplex VRE 15.2 Verification of the sensitivity and specificity with clinical materials During a retrospective study at the Institut für Krankenhaushygiene, Johannes Gutenberg Universität Mainz (Dr. Wolfgang Kohnen), the diagnostic sensitivity and specificity of the Multiplex VRE – system were determined in comparison to routine bacteriology. Therefore 376 swabs were collected and screened for the parameter Vancomycin A and Vancomycin B. All positive samples were further examined with the additional parameter (highlevel-Gentamycin-resistance, E. faecium and E. faecalis). Result: Bacteriology Bacteriology positive negative Multiplex VRE positive 41 14 a Multiplex VRE negative 0 321 a) OD of one sampls was between 0.300 and 0.400; sample was defined as „borderline“. n=376

Results of testing of swab samples in comparison to “gold-standard” bacteriology sensitivity: PPV:

100 % 75 %

specificity: NPV:

96 % 100 %

16. References 1. Gordon et al. (1992) Antimicrobial susceptibility patterns of common and unusual species of enterococci causing infections in the United States. J. Clin. Microbiol. 33, 2842-2846 2. Ruoff et al (1990) Species identities of enterococci isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 28, 434-437 3. Gold et al. (1996) Antimicrobial drug resistance. N. Engl. J. Med. 335, 1445-1453 4. Gesundheitsberichterstattung des Bundes, Heft 8 (Juni 2002) „Nosokomiale Infektionen“ 5. Uttley et al. (1988) Vancomycin-resistant enterococci. Lancet i, 57-58 6. Kappelstein I. (2002) Nosokomiale Infektionen, 2. Auflage, Zuckerschwerdt Verlag GmbH, München, 406-408 7. Cetinkaya et al. (2000) Vancomycin-resistant enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 13, 686-707 8. Fluit et al. (2001) Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 14, 836871 9. Arthur et al. (1993) Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci. Antimicrob. Agents. Chemother. 37, 1563-1571 10. Quintilliani et al. (1994) Conjugal transfer of the vancomycin resistance determinant vanB between enterococci involves the movement of large genetic elements from chromosome to chromosome. FEMS Microbiol. Lett. 119, 359-364

We will gladly send you further literature on request. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 17 of/von 30

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Multiplex VRE Multiplex-PCR zum Nachweis multiresistenter Enterokokken In-vitro-Diagnostikum 1. Einleitung Das Multiplex VRE PCR-Modul (Bestell.-Nr. AX3830) ist Teil eines qualitativen in vitro Tests zum Nachweis und zur sicheren Identifizierung von Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis sowie deren genotypischen Resistenzen gegen die Antibiotika Gentamicin (High-Level-Resistenz) und Vancomycin / Teicoplanin. Mit den Multiplex Hybridisierungsmodulen (Bestell.-Nr. AX3831 bis AX3835) können per reverser Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotidsonden die Amplifikate, die mit Hilfe des Multiplex VRE PCR-Moduls gebildet wurden, weiter differenziert und visualisiert werden.

2. Die Gattung Enterococcus Enterokokken sind gram-positive Kokken, die in einfachen, paarweisen und kurzen Ketten auftreten. Als solche sind sie morphologisch nur schwer von echten Streptokokken zu unterscheiden und wurden deshalb ursprünglich zu dieser Gattung gezählt und im LancefieldSchema als „Gruppe D-Streptokokken“ klassifiziert. In den 80er Jahren wurde aufgrund phylogenetischer Merkmale eine eigene Gattung Enterococcus gebildet, der 29 verschiedene Spezies angehören. Enterokokken können in extrem lebensfeindlichen Milieus überleben und sind deshalb auch ubiquitär verbreitet. Bevorzugter Lebensraum ist aber der Intestinaltrakt von Mensch und Tier. In geringeren Umfang kann man sie auch aus Mund- und Rachenraum, dem Vaginalbereich und der Haut isolieren. Klinische Bedeutung für den Menschen haben vor allem zwei Spezies: E. faecium und E. faecalis, die rund 80-90 % bzw. 5-15 % aller klinischen Isolate dieser Gattung darstellen. Seltener findet man Vertreter von E. gallinarum, E. casseliflavus oder E. durans. (1,2) Über die Fähigkeit der Enterokokken, Infektionen beim Menschen auszulösen, ist relativ wenig bekannt. Infektionen des Harntrakts sind die auffälligsten klinisch relevanten Infektionen, aber auch Endokarditiden können Enterokokken als Ursache haben. Aufgrund intrinsischer Resistenzen gegenüber zahlreichen Antibiotika (z.B. Cephalosporine, Clindamycin, TrimethoprimSulfamethoxazol und niedrigen Konzentrationen von Aminoglykosiden (3)) haben Enterokokken als Erreger von nosokomialen Infektionen in den letzten Jahren enorm an Bedeutung gewonnen. Sie stehen heute in der Häufigkeit als Ursache von nosokomialen Harnwegsinfektionen an zweiter Stelle (22 %) und sind auch häufig bei katheter-assoziierter Sepsis (11 %) und post-operativen Wundinfektionen (12 %) zu finden (4). 1988 wurden in England die ersten Enterokokken isoliert, die eine Resistenz gegen die Glykopeptidantibiotika Vancomycin und Teicoplanin zeigten (sog. Vancomycin-Resistente Enterokokken (VRE) (5). Somit wurden die therapeutischen Möglichkeiten entscheidend eingeschränkt, weshalb manche Autoren sogar vom Beginn einer „post-antibiotischen Ära“ sprechen (6). Tatsächlich ist die krankenhaushygienische Bedeutung von VRE noch komplizierter als bei methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA), da die Behandlungsmöglichkeiten für infizierte Patienten durch die Vielzahl der möglichen intrinsischen und erworbenen Antibiotikaresistenzen erheblich reduziert werden (7). BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 18 of/von 30

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Multiplex VRE Mit vorliegendem Testsystem können die beiden klinisch bedeutsamsten Enterokokken-arten nachgewiesen werden. Zusätzlich können mit diesem Test drei für Antibiotikaresistenzen verantwortliche Gene detektiert werden: A) aacA/aphD: Dieses Gen kodiert für ein bifunktionelles Enzym (2´-Phosphotransferase-6´-Acetyltransferase), welches für eine High-Level-Resistenz (MHK >500 µg/ml) gegen das Aminoglykosid Gentamicin (sowie Tobramycin, Amikacin und Kanamycin) verantwortlich und auch bei Staphylokokken weit verbreitet ist. Dieses Enzym modifiziert das Gentamicinmolekül, so dass es nicht an das bakterielle Ribosom binden und die Proteinbiosynthese inhibieren kann. Es gibt noch weitere Mechanismen, die eine Resistenz gegen Gentamicin vermitteln; der beschriebene ist jedoch mit Abstand der häufigste (8). Da jedoch auch andere Bakterien dieses Gen tragen, kann eine eindeutige Zuordnung des Gens nur durch Testung einer Reinkultur erfolgen. B) vanA und van B: Vancomycin ist ein Glykopeptid-Antibiotikum, das die Zellwandbiosynthese der Enterokokken inhibiert, indem es die Querverknüpfung des Peptidoglykans verhindert (7). Die Gene vanA und vanB kodieren für zwei sich ähnelnde Ligasen, die eine Vorstufe der Zellwand so modifizieren, dass das Vancomycin nicht mehr binden und somit die Zellwandbiosynthese wieder erfolgen kann. Träger des vanA-Gens zeigen eine hohe Resistenz gegen Vancomycin (MHK ≥ 64 µg/ml) und Teicoplanin (MHK ≥ 16 µg/ml) (9), während vanB-Träger niedrigere MHKs (32 bis 64 µg/ml) gegen Vancomycin besitzen und gegen Teicoplanin empfindlich sind. Besorgniserregend ist die Tatsache, dass die genetischen Elemente der beiden Resistenztypen (die sogenannten vanA/BGencluster) zwischen verschiedenen Enterokokkenarten transferierbar sind (10). Weitere Vancomycinresistenz-Genotypen sind beschrieben (vanC, van D und vanE), aber zur Zeit noch nicht von großer klinischer Bedeutung. 3.

Aufbau des Multiplex VRE Testsystems

Multiplex VRE PCR-Modul (Best.-Nr. AX3830): Herstellung spezifischer PCR-Amplifikate aus Probenmaterial, ausreichend für maximal zehn Hybridisierungen pro PCR-Reaktion. Multiplex VRE Hybridisierungs-Module (Best.-Nr. AX3831 - AX3835): Einzelkavitäten mit immobilisierten Oligonukleotidsonden zum spezifischen Nachweis der unten angegebenen Parameter (VE 96 Stück pro Sonde) und Reagenzien zur Durchführung von 96 reversen Hybridisierungen; Probenmaterial: PCR-Amplifikate, die mittels des Multiplex VRE PCR-Moduls gebildet wurden. In u.a. Tabelle sind die für das Multiplex VRE Testsystem separat erhältlichen spezifischen Sonden (Hybridisierungsmodule) aufgeführt.

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Multiplex VRE Hybridisierungsmodule für das Multiplex VRE Testsystem Name Spezifität Kavitätenfarbe

Best.-Nr. :

MTS│BR│EM

Enterococcus faecium

weiss

AX3831

MTS│BR│ES

Enterococcus faecalis

grün

AX3832

MTS│BR│GE

aacA

orange

AX3833

MTS│BR│VA

vanA

burgund

AX3834

MTS│BR│VB

vanB (alle Subtypen)

violett

AX3835

Mit einem PCR-Amplifikat können zehn Hybridisierungen durchgeführt werden. Damit kann eine Probe auf jeden der fünf genannten Parameter getestet und die verschiedenen EnteroResistSonden je nach Fragestellung ausgewählt werden. 4. Testprinzip Das Multiplex VRE PCR-Modul enthält markierte Oligonukleotidprimer, die die simultane, spezifische Amplifikation verschiedener enterokokkaler DNS-Bereiche in einer einzigen PCRReaktion ermöglichen. Neben einem Amplifikat, welches nur in Anwesenheit von DNS bestimmter Spezies der Gattung Enterococcus gebildet wird, zeigt das System zudem das Vorhandensein der Gene aacA, vanA und vanB (alle drei Subtypen) an. Somit können in einer einzigen Reaktion die beiden klinisch bedeutsamsten Enterokokkenarten nachgewiesen und das genetische Potential dieser Keime zur Expression von drei Antibiotikaresistenzen detektiert werden. Amplifikate aus einer PCR mit dem Multiplex VRE PCR-Modul werden hitzedenaturiert zu einzelsträngigen, spezifischen Sonden gegeben, die an der Polystyrol-oberfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert sind. Unter Verwendung eines Hybridisierungspuffers findet eine Hybridisierung komplementärer Sequenzen statt, die nachfolgend mittels ELISA-Prinzip detektiert werden kann. Dazu wird nach mehreren stringenten Waschschritten ein Peroxidase(POD)Konjugat zugegeben. Dieses bindet hochspezifisch an die Markierung des an die Oligonukleotidsonde gebundenen Einzelstrangs des PCR-Produkts. Nach neuerlichen Waschschritten wird TMB-Substratlösung zugesetzt, das nach Umsetzung durch die POD eine blaue Farbe erzeugt. Diese Reaktion wird mit Hilfe einer Stopplösung beendet. Dabei ist ein Farbumschlag nach Gelb zu beobachten. Die Extinktion der verschiedenen Kavitäten wird nun in einem Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Positive Signale zeigen die spezifische Amplifikation bestimmter DNS-Bereiche während der Multiplex VRE PCR an und damit das Vorhandensein der dementsprechenden Gene in der zu untersuchenden Probe. Somit sind ein eindeutiger Nachweis von Enterococcus faecium und Enterococcus faecalis sowie der Nachweis dreier resistenz-bestimmender Gene möglich.

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Multiplex VRE 5.

Reagenzien

5.1

Packungsinhalt PCR-Modul:

Die Reagenzien einer Packung reichen für 96 Bestimmungen. Jeder Reagenziensatz enthält: Primer-Mix PRIMER (Grüne Verschlusskappe, gebrauchsfertig) Enthält markierte Oligonukleotidprimer Nukleotid-Mix dNTP (Gelbe Verschlusskappe, gebrauchsfertig) enthält dATP, dCTP, dGTP, dTTP Positivkontrolle CONTROL│+ (Rote Verschlusskappe, gebrauchsfertig) Negativkontrolle CONTROL│(Blaue Verschlusskappe, gebrauchsfertig) Positivkontrollsonden, abbrechbar MTS│BR│CONTROL│+ (Farbkodierung: blau)

240 µl

120 µl 125 µl 100 µl 16 Kavitäten

5.2 Packungsinhalt der Hybridisierungs-Module: Die Reagenzien einer Packung reichen für 96 Bestimmungen. Jeder Reagenziensatz enthält: MTS│BR│BLANK MTS│BR│XX HYBBUF STRGWASH WASHBUF│20 X

CONJ│100 X

SUBS│TMB STOP│H3PO4│25%

16 Kavitäten 96 Kavitäten

Reagenzienkontrolle, abbrechbar Farbcodierte Mikrotiterstreifen mit spezifischer Oligonukleotid-Sonde, abbrechbar Hybridisierungspuffer (gebrauchsfertig) Enthält Standard-Saline-Citrat-Puffer (SSC), Natriumdodecylsulfat (SDS) und N-Lauryl-Sarkosin Stringente Waschlösung (gebrauchsfertig) Enthält SSC und SDS Waschpuffer (20x konzentriert) Enthält Phosphat-Puffer, NaCl u. Detergens, Konservierungsstoffe: Methylisothiazolon u. Oxypyrion Konjugat (100x konzentriert, transparente Verschlusskappe) Konservierungsstoffe: Methylisothiazolon, Dimethyaminoantipyrine u. Chloracetamid TMB(Tetramethylbenzidin)-Substratlösung (gebrauchsfertig) Stopplösung (25 %ige Phosphorsäure, gebrauchsfertig)

10 ml 100 ml 12 ml

120 µl

12 ml 12 ml

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Multiplex VRE 5.3

Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör

Reagenzien • Tth-DNA polymerase (Cat. No. 104001) incl. reaction buffer • steriles H2Odd (Aqua bidest) • Multiplex® Lyse-Puffer (Best.-Nr. AX3950) Zubehör • Thermoblock • PCR-Thermocycler • PCR-Reaktionsgefäße (empfohlen: 0,2 ml) • Pipetten mit sterilen Einmalspitzen • Inkubationsschrank (50° C ± 1° C) • Mikrotiterplatten-Photometer für Extinktionsmessung bei 450 nm und 620 nm 6.

Warn- und Entsorgungshinweise Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in Kontakt kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder autoklaviert werden. Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmal-Handschuhe getragen werden. Das Konjugat, die TMB-Substratlösung und der Waschpuffer enthalten Konservierungsstoffe. Eine Berührung mit Haut oder Schleimhäuten ist zu vermeiden. Sollte es dennoch dazu kommen, betroffene Stellen mit reichlich Wasser spülen. Phosphorsäure ist reizend. Kontakt mit Haut und Schleimhäuten unbedingt vermeiden. Sollte es dennoch dazu kommen, betroffene Stellen mit reichlich Wasser spülen.

7. Hinweise zur Handhabung Die Reagenzien des Multiplex VRE PCR-Moduls sollten mit Ausnahme der Positivkontrollsonden (2...8° C) nach Erhalt bei -20° C gelagert werden. Häufiges Auftauen und Einfrieren der Reagenzien ist zu vermeiden. Nach erstmaligem Gebrauch ist eine Lagerung bei 2...8° C zur Vermeidung von Auftau- und Einfrierschritten möglich, die Reagenzien sollten dann aber innerhalb von 3 Monaten aufgebraucht werden. Die Reagenzien der Multiplex VRE Hyb-Module sollten bei 2...8° C gelagert werden. Vor Testbeginn sind Waschpuffer, TMB-Substratlösung, Stopplösung sowie der verschlossene Druckverschlußbeutel mit der darin enthaltenen Mikrotiterplatte des Mulltiplex HybridisierungsModuls für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (18°…25° C) zu temperieren. Die stringente Waschlösung muss auf 50° C vorgewärmt werden. Hybridisierungslösung und Konjugat stets kühl halten. Die Packungen tragen ein Verfalldatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden kann. Um die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Produktbildung zu minimieren, empfiehlt es sich die Amplifizierungsreaktionen auf Eis zu pipettieren und die DNA-Polymerase als letztes Reagenz hinzuzufügen. Während der gesamten Testvorbereitung sollten zwecks Kontaminationsgefahr BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 22 of/von 30

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Multiplex VRE geeignete (ungepuderte) Einmal-Handschuhe getragen und Pipettenspitzen mit Filtereinsatz verwendet werden. 8. Probenmaterial Das Probenmaterial kann aus reinen Bakterienzellen oder daraus isolierter DNS bestehen. Werden als Probenmaterial Zellen verwendet, ist eine einzelne Bakterienkolonie in 300 µl Multiplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. AX3950) zu suspendieren. Der Lyse-Puffer wird für 10 Min im kochenden Wasserbad / Thermoblock (99° C) inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (2 Min bei 10000 x g) werden 5 µl des Überstandes in die Amplifizierungsreaktion eingesetzt. Sollen beimpfte Flüssigmedien als Probenmaterial verwendet werden, so sind 10 – 100 µl des Flüssigmediums mit 1 ml Saline-EDTA-Puffer (Best.-Nr. AX3953) zu mischen und folgend abzuzentrifugieren (2 Min bei 10.000 x g). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 300 µl Mutliplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. AX3950) resuspendiert. Der Lyse-Puffer wird für 10 Min im kochenden Wasserbad / Thermoblock (99° C) inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (2 Min bei 10.000 x g) werden 5 µl des Überstandes in die Amplifizierungsreaktion eingesetzt. Sollen mit diesem System direkt Abstrichtupfer getestet werden, so ist der Tupfer in 300 µl Multiplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. AX3950) auszudrücken, sofern es sich um einen Tupfer mit Transport-Medium (z.B. Amies-Medium) handelt. Ein trockener Tupfer ohne Transportmedium ist in 500 µl Multiplex Lyse-Puffer (Best.-Nr. AX3950) auszudrücken. In beiden Fällen wird der Lyse-Puffer für 10 Min im kochenden Wasserbad / Thermoblock (99° C) inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (2 Min bei 10.000 x g) werden 5 µl des Überstandes in die Amplifizierungsreaktion eingesetzt. Probenart Nasenabstrich Rachenabstrich Hautabstrich Wundabstrich (Peri-)Analabstrich Trachealsekret Sputum, Punktat, Urin

DNS-Präparation Einfache Zellyse mit Lysepuffer Einfache Zellyse mit Lysepuffer Einfache Zellyse mit Lysepuffer Einfache Zellyse mit Lysepuffer DNS-Isolierung mit kommerz. System DNS-Isolierung mit kommerz. System DNS-Isolierung mit kommerz. System

Einzusetzendes Probenvolumen 5 µl Lysat-Überstand 5 µl Lysat-Überstand 5 µl Lysat-Überstand 5 µl Lysat-Überstand 1 - 5 µl DNS-Eluat 1 - 5 µl DNS-Eluat 1 - 5 µl DNS-Eluat

Für die Isolierung genomischer DNS aus Patientenmaterial wie Analabstrichen, Trachealsekreten, Punktaten oder extrem eitrigen Wundabstrichen sollten kommerziell erhältliche Systeme verwendet werden, z.B.: •

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MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH) Multiplex Prep Modul (Best.-Nr. AX3951)

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von isolierter DNS sollte vermieden werden. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 23 of/von 30

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Multiplex VRE 9. Testdurchführung 9.1 Vorbereitung der Amplifizierungsreaktion Die Reaktionen werden unter Verwendung der vom DNA-Polymerase-Hersteller mitgelieferten Puffer nach folgendem Ansatz vorbereitet: x µl Probenmaterial (z.B. 5 µl Probenlysat bzw. 5 µl Negativ- und Positivkontrolle) 1 µl Nukleotid-Mix (Gelbe Verschlusskappe) 2 µl Primer-Mix (Grüne Verschlusskappe) 5 µl 10x PCR-Puffer 0,2 µl Tth-DNA-Polymerase (1 U) ad 50µl H2Odd Wenn als Probenmaterial genomische DNS verwendet wird, ist der Amplifizierungs-reaktion zwischen 1 und 100 ng DNS zuzugeben. Achtung! Zuviel DNS oder Zellmaterial kann die Effizienz einer PCR beträchtlich verringern und zu falsch negativen Resultaten führen! 9.2

Durchführung der Amplifizierungsreaktion

Programmierung des PCR-Thermocyclers mit folgendem Programm: Zyklus

35x

Temperatur [°C] 94 94 52 72

1x

72

1x

Zeit 5 Min 25 Sek 25 Sek 20 Sek + 1 Sek/Zyklus oder 45 Sek 3 Min

Reaktion Anfangsdenaturierung der DNS Denaturierung der DNS Bindung der Primer 3´-OH Elongation der Primer

Finale Elongation

Das Reaktionsgemisch sollte nach Beendigung der PCR bis zur Durchführung der reversen Hybridisierung mit den Hybridisierungs-Modulen bei -20° C gelagert werden. 9.3. Durchführung der reversen Hybridisierung Zur Durchführung der reversen Hybridisierung werden die jeweils gewünschten Multiplex VRE Hybridisierungs-Module benötigt. Die unten genannten Mengenangaben beziehen sich jeweils auf die Bearbeitung einer einzelnen Mikrotiterplattenkavität. Das Multiplex VRE -Testsystem gibt dem Anwender die Möglichkeit den Test nach seinen Bedürfnissen und Interessen individuell zu gestalten. Bei der Verwendung von mehreren verschiedenen Sonden gleichzeitig müssen die angegebenen Mengen jeweils mit der Anzahl der verwendeten Kavitäten multipliziert werden.

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Multiplex VRE Beispiel:

Eine Probe soll auf Anwesenheit der relevanten Enterokokken-Spezies sowie auf Vancomycin-Resistenzen getestet werden. Dazu werden die Sonden EM, ES, VA und VB, also insgesamt 4 Sonden = Kavitäten und 4 Sonden = Kavitäten für die Negativkontrolle benötigt. Außerdem werden 1 Positivkontrollkavität und 1 Reagenzienkontrollkavität benötigt. Die Mengenangaben müssen also mit dem Faktor 10 multipliziert werden. Wenn 3 Proben mit den Sonden EM, ES, VA und VB getestet werden sollen, müssen die Mengenangaben mit dem Faktor 18 multipliziert werden (3 x 4 = 12 Kavitäten für die Proben, 4 Kavitäten für die Negativkontrolle, 1 Positivkontrollkavität und 1 Reagenzienkontrollkavität).

Im Falle, dass mehrere Proben mit unterschiedlichen Sonden hybridisiert werden sollen, muss die Gesamtzahl der verwendeten Kavitäten ermittelt und die unten angegebenen Mengenangaben mit dieser Zahl multipliziert werden. Vor Gebrauch müssen die Stringente Waschlösung auf 50° C vorgewärmt bzw. Waschpuffer, TMB-Substratlösung, Stopplösung und die benötigten Mikrotiterplatten auf Raumtemperatur (18…25° C) gebracht werden. 9.3.1 Testplattenzusammenstellung Im Kunststoffrahmen können die verschiedenen Sonden in ihren farbkodierten Kavitäten je nach Fragestellung miteinander kombiniert werden. Dazu werden die Kavitäten einzeln von den gelieferten Streifen abgebrochen und fest in den Rahmen gesteckt. Die nicht benötigten Kavitäten werden wieder im Druckverschlussbeutel zusammen mit dem Trockenmittel bei 2…8° C gelagert. Für jeden Testansatz muss eine der im Multiplex Hybridisierungs-Modul enthaltenen Reagenzienkontrollen zur Ermittlung des Reagenzienhintergrundsignals mit verwendet werden. Sie werden nach anfänglicher Zugabe von 50 µl Hybridisierungspuffer in gleicher Weise wie die Proben prozessiert. Zusätzlich muss für jeden Testansatz eine Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. Der PCR-Ansatz der Positivkontrolle wird entsprechend Punkt 9.3.2 verdünnt und 50 µl der entstandenen Lösung in eine Positivkontrollkavität gegeben und laut Protokoll (siehe unten) weiter behandelt. Der PCR-Ansatz der Negativkontrolle wird entsprechend Punkt 9.3.2 verdünnt und je 50 µl der entstandenen Lösung in die verwendeten spezifischen Sondenkavitäten pipettiert und laut Protokoll (siehe unten) weiter behandelt. 9.3.2 Vorbereitung der PCR-Probe und Durchführung der Hybridisierung Der 50 µl-Reaktions-Mix der durchgeführten Multiplex VRE PCR wird im Reaktionsgefäß für 10 Min bei 95° C denaturiert. Es wird die Durchführung in einem Thermocycler mit Deckelheizung empfohlen. Es werden umgehend pro Kavität 5 µl des PCR-Ansatzes zu 50 µl kühler (2…8° C) Hybridisierungslösung gegeben, gut gemischt und davon 50 µl rasch in die entsprechende Kavität pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird 30 Min bei 50° C inkubiert. Zur Vermeidung eines hohen Verdunstungsverlusts an Hybridsierungslösung sollte die Mikrotiterplatte abgedeckt werden.

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Multiplex VRE 9.3.3 Stringentes Waschen Die Kavitäten werden vollständig geleert und dreimal kurz mit je 200 µl der vorgewärmten Stringenten Waschlösung gewaschen. Es ist darauf zu achten, dass die Stringente Waschlösung zwischen den Waschschritten vollständig entfernt wird. Nach Beenden des letzten Waschschrittes Platte auf einem Papiertuch ausschlagen, um letzte Flüssigkeitsreste aus den Kavitäten zu entfernen. 9.3.4 Herstellung des Waschpuffers Das Waschpufferkonzentrat wird 1+19 mit H2Odeion. verdünnt. Pro Kavität werden 0,05 ml Konzentrat und 0,95 ml H2Odeion. gemischt. Der Waschpuffer kann auch in größerer Menge hergestellt und für eine spätere Verwendung eine Woche bei Raumtemperatur gelagert werden. 9.3.5 Waschen Die Kavitäten werden einmal kurz bei Raumtemperatur mit 200 µl Waschpuffer gewaschen. 9.3.6 Inkubation mit Peroxidase-Konjugat Die Konjugatlösung muss stets frisch zubereitet werden. Pro Kavität werden 1 µl Konjugat-Konzentrat (Durchsichtige Verschlusskappe) mit 100 µl Waschpuffer in einem sauberen Gefäß versetzt und gut gemischt (Verdünnung 1+100). Es werden 100 µl pro Kavität zupipettiert und die Mikrotiterplatte für 30 Min bei Raumtemperatur inkubiert. 9.3.7 Waschen Die Kavitäten werden geleert und dreimal kurz mit je 200 µl Waschpuffer bei Raumtemperatur gewaschen. Es ist darauf zu achten, dass die Waschlösung zwischen den Waschschritten vollständig entfernt wird. 9.3.8 Substratreaktion Die TMB-Substratlösung ist gebrauchsfertig. Es werden 100 µl pro Kavität pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird 15 Min bei Raumtemperatur unter Schutz vor direkter Sonneneinstrahlung inkubiert. Die Zeit wird ab Pipettieren der ersten Kavität gerechnet. 9.3.9 Abstoppen der Reaktion Zum Abstoppen der Reaktion werden 100 µl Stopplösung pro Kavität zupipettiert. Dabei ist dasselbe Pipettierschema wie beim Pipettieren der TMB-Substratlösung einzuhalten. 9.3.10 Messung der Extinktion Die Extinktion der einzelnen Kavitäten werden in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 450 nm und einer Referenzenlänge von 620 - 650 nm gemessen. Der Nullabgleich erfolgt gegen Luft. Die Messung sollte innerhalb von 60 Minuten nach Abstoppen der Reaktion erfolgen.

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Multiplex VRE 10. Kurzanleitung der Testdurchführung Verdünnungen: • Waschpufferverdünnung • Konjugatverdünnung

Testschritte: • Denaturierung • Probenverdünnung:

11.

• • • • • • •

Hybridisierung: Stringentes Waschen: Waschschritt: Konjugatinkubation: Waschschritt: Substratinkubation: Abstoppen:

•

Photometrieren

1+19 mit H2O deion. 1+100 mit verdünntem Waschpuffer

0,05 ml + 0,95 ml pro Kavität 1 µl + 100 µl pro Kavität

PCR-Reaktionsansatz 5 µl PCR-Reaktionsansatz zu 50 µl Hybridisierungslösung geben 50 µl pro Kavität 200 µl pro Kavität 200 µl pro Kavität 100 µl pro Kavität 200 µl pro Kavität 100 µl pro Kavität 100 µl pro Kavität mit Stopplösung 450/620 nm

10 Min bei 95° C

30 Min bei 50° C ± 1° C 3 x kurz 1 x kurz 30 Min bei Raumtemperatur 3 x kurz 15 Min bei Raumtemperatur

Auswertung Der Test ist unter folgenden Bedingungen auswertbar: • Extinktion Reagenzienkontrolle ≤ 0,200 • Extinktion Negativkontrolle (ENK) ≤ 0,200 • Extinktion Positivkontrolle ≥ 1,500 Bei geringeren Signalstärken der Positivkontrolle besteht die Gefahr, schwach-positive Proben als negativ zu bewerten. Dies könnte eventuell auf einer zu hohen Hybridisierungstemperatur oder auf einer zu hohen Temperatur der Stringenten Waschlösung beruhen (siehe auch 14). Auswerteschema bei Verwendung von Zellmaterial aus einer Reinkultur oder Anreicherungskultur oder daraus isolierter DNS: • Proben mit Extinktionswerten größer 0,400 sind als positiv zu bewerten • Proben mit Extinktionswerten zwischen 0,200 und 0,400 sind grenzwertig. Sie sollten erneut getestet werden. • Proben mit Extinktionswerten kleiner 0,200 sind als negativ zu bewerten. Auswerteschema bei direkter Verwendung von Patientenmaterial oder daraus isolierter DNS: • Proben mit Extinktionswerten größer als 0,400 sind als positiv zu bewerten • Proben mit Extinktionswerten zwischen 0,300 und 0,400 sind grenzwertig; sie sollten erneut getestet werden. • Proben mit Extinktionswerten kleiner 0,300 sind als negativ zu bewerten. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 27 of/von 30

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Multiplex VRE 12.

Hinweise zur Interpretation der Testergebnisse Mit dem Multiplex VRE -System liegt ein schneller, universell einsetzbarer Schnelltest für den Nachweis medizinisch relevanter, enterokokkaler Gene vor. Positive Ergebnisse des Multiplex VRE -Systems weisen das Vorhandensein enterokokkaler Gene in einer Probe nach. Dies bedeutet nicht, dass die Gene auch tatsächlich exprimiert werden. Die in der untersuchten Probe gefundenen Keime besitzen aber das genetische Potential dazu. Es lassen sich aufgrund dieses Testsystems z. B. auch keine Aussagen über minimale Hemmkonzentrationen der Erreger gegenüber Gentamicin und Vancomycin bzw. Teicoplanin machen. Zudem ist das Gen aacA, welches für die HL-Resistenz gegen Gentamicin verantwortlich ist, auch bei anderen Bakterien, wie z.B. diversen Staphylokokken zu finden. Bei einem gleichzeitigen positiven Resultat der Parameter EM / ES und GE ist es nicht gesichert, dass das Gen aacA tatsächlich dem Genom der nachgewiesenen Enterokokke entstammt, ausser es wurde eine einzelne Reinkultur getestet. Das Ergebnis des Multiplex VRE -Systems ist abhängig von der Quantität und Qualität der in der Probe befindlichen enterokokkalen DNS. Durch die PCR des Multiplex VRE PCR-Moduls werden schon geringe Kopienzahlen von relevanter Enterokokken-DNS in solchen Mengen amplifiziert, dass positive Signale zu beobachten sind. Ein negatives Multiplex VRE -Testresultat kann die Präsenz von Enterokokken im Probenmaterial nicht ausschließen. Die Effizienz der PCR kann z.B. durch inhibitorische Stoffe im Probenmaterial drastisch reduziert werden und dies kann wiederum geringe Signale zur Folge haben. Wird DNS aus einer Probe isoliert, kann u. U. die DNS fragmentiert sein oder nicht in der benötigten Reinheit (Anwesenheit von PCR-Inhibitoren) vorliegen. Die Verwendung kommerziell erhältlicher DNS-Isolierungs- und Reinigungskits sowie im Zweifelsfalle die Durchführung der Amplifikationskontrolle werden deshalb empfohlen. Werden in einem auswertbaren Test Resultate im grenzwertigen Bereich (siehe 11) erzielt, so ist es wahrscheinlich, dass die Probe positiv ist, aber die Amplifikation der enterokokkalen DNS durch nicht optimale Bedingungen gemindert wurde. In diesem Fall wird eine Wiederholung des Tests (mit neu isolierter DNS oder nach einem Anreicherungsschritt) empfohlen.

13.

Kontrollergebnisse des Multiplex VRE -Testsystems Bei der Durchführung der Positivkontrolle wird ein Amplifikationsprodukt gebildet, das nach Durchführung der reversen Hybridisierung mit der spezifischen Positivkontrollsonde ein positives Signal mit einer OD450 nm > 1,5 zeigt. Die Positivkontrolle ist im Falle von zweifelhaften negativen Ergebnissen auch als Amplifikationskontrolle einsetzbar. Durch Zugabe der Positivkontrolle des Multiplex VRE PCRModuls zum PCR-Ansatz der zu untersuchenden Probe kann das Vorhandensein von die PCR inhibierenden Stoffen im Probenmaterial überprüft werden. Zeigt die Positivkontrollsonde kein Signal, so wurde in diesem Fall die PCR inhibiert und es ist keine Aussage über das Vorhandensein von Enterokokken-DNS in der Probe möglich. Eine Wiederholung mit frisch gereinigter DNS wird empfohlen. Zeigt die Positivkontrollsonde ein positives Signal, so liegt kein systemischer Fehler in der PCR und der Hybridisierung vor, die zu untersuchende Probe ist als negativ einzustufen. BIORON Diagnostics GmbH – Rheinhorststr.18 – 67071 Ludwigshafen (Germany) Phone: +49 621 545 900 70 Fax: +49 621 545 900 68 E-Mail: [email protected] Homepage: www.bioron.de Rev04062012 Page/Seite 28 of/von 30

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Multiplex VRE Im Fall der Negativkontrolle sollte kein Amplifikationsprodukt und somit kein Hybridisierungssignal mit irgendeiner Sonde zu beobachten sein. 14.

Troubleshooting Durchweg schwache oder gar keine Signale (inkl. Positivkontrolle) • Temperatur der Stringenten Waschlösung deutlich über 50° C • PCR-Produkte vor Hybridisierung nicht (ausreichend) denaturiert bzw. wieder renaturieren lassen • Substrat nicht auf Raumtemperatur äquilibriert • Falsche Mengen an Konjugat und/oder Substrat eingesetzt Schwache oder gar keine Signale mit Ausnahme der Positivkontrolle • Qualität und/oder Quantität der isolierten DNS lassen keine effiziente Amplifikation zu. PCRProdukte in einem 2 %igem Agarosegel überprüfen. Gegebenenfalls DNS-Isolierung und – Amplifizierung wiederholen, evtl. andere DNS-Isolierungsmethode verwenden • Bei Verwendung des Multiplex® Lysepuffers ungenügende thermische Lyse (zu kurz; Temperatur nicht 99° C) • Bei Verwendung von Zell- bzw. Patientenmaterial mit Hilfe der Positivkontrolle die Anwesenheit von PCR-inhibierenden Stoffen überprüfen (siehe 13) oder DNS-Isolierung durchführen Allgemein hohe (Hintergrund)-Signale • Die Verwendung von nicht ausreichend erwärmter Stringenter Waschlösung bzw. zu niedrige Temperatur des Inkubators kann zu unspezifischen Signalen führen. Spezifische, positive Signale werden im gleichen Maße verstärkt, so dass der Kontrast zwischen unspezifischen und spezifischen Signalen erhalten bleibt. Bei Zweifel an der Auswertbarkeit des Testlaufs (siehe 0) wird eine Wiederholung unter Verwendung der korrekten Durchführungsparameter empfohlen.

15.

Leistungsdaten Überprüfung der Sensitivität und Spezifität mit Referenzstämmen verschiedener Bakterienspezies Siehe Seite 15 Ergebnis bei Testung von Reinkulturen: Spezifität: 100 % Sensitivität: 100 % 15.2 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität mit klinischem Material Im Rahmen einer retrospektiven Studie wurden am Institut für Krankenhaushygiene, Johannes Gutenberg Universität Mainz (Dr. Wolfgang Kohnen) die diagnostischen Spezifität und Sensitivität des Multiplex VRE – Systems bei direkter Verwendung von Patientenmaterial im Vergleich zu mikrobiologischen Gold-Standard-Methoden ermittelt;

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Multiplex VRE Dazu wurden 376 Tupfer gesammelt und auf die Parameter Vancomycin A und Vancomycin B gescreent. Alle positiven Proben wurden auf weitere Parameter (High-level-Gentamicin-Resistenz und die Spezieszugehörigkeiten E. faecium und E. faecalis) untersucht. Ergebnis: Mikrobiologische Untersuchung positiv

N=376

Mikrobiologische Untersuchung negativ

Multiplex VRE 41 14 a positiv Multiplex VRE 0 321 negativ a) die OD einer dieser Proben lag zwischen 0,300 und 0,400 und wird als grenzwertig definiert. Daraus ergaben sich folgende Leistungsdaten im Vergleich zum mikrobiologischen GoldStandard: Sensitivität: 100 % PPV: 75 % 16.

Spezifität: 96 % NPV: 100 %

Literatur

Siehe S. 18

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