diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2009 • Volume 45 • Number 4 • 325-331

Praca poglądowa • Review Article

Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej Katarzyna Kondak Katedra i Zakład Mikrobiologii we Wrocławiu

Streszczenie Kliniczna mikrobiologia przechodzi nową erę. Metody molekularne oparte na technikach hybrydyzacji kwasów nukleinowych, PCR i innych są najnowszymi metodami stosowanymi w identyfikacji patogenów. Umożliwiają bezpośrednie wykrywanie czynnika etiologicznego w materiale klinicznym bez konieczności hodowli danego szczepu. Dodatkowo: metody te są czułe i szybkie, dlatego stanowią doskonałe narzędzie diagnostyczne przyszłości. Molecular methods in microbiological diagnostics Summary Clinical microbiology is the midst of a new era. Molecular methods based on nucleic acid hybridization, polymerase chain reaction (PCR) and other are the newest techniques of the detection or typing of infectious agents. They make direct detection of the etiologic factor in clinical material possible without the necessity of the strains isolation. Additionally: these methods are sensitive and rapid therefore they are proved to be the perfect diagnosis tools for the future Słowa kluczowe: chipy DNA, hybrydyzacja kwasów nukleinowych, metody molekularne, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) Key words: chip DNA, hybridization nucleic acid, molecular methods, polymerase chain reaction (PCR)

Wstęp Najnowocześniejszymi metodami diagnostyki chorób infekcyjnych wykorzystywanymi w laboratorium mikrobiologicznym są metody molekularne. Metody te pozwalają bezpośrednio wykryć czynnik etiologiczny w materiale klinicznym (bez konieczności hodowli danego szczepu), pozwalają także na identyfikację i typowanie mikroorganizmów, wykrywanie nowych mechanizmów oporności na leki oraz np. śledzenie ewolucji mikroorganizmów. Metody molekularne zawdzięczają swój rozwój odkryciom w latach siedemdziesiątych metod hybrydyzacji DNA. W latach osiemdziesiątych szeroko rozwinęły się techniki sekwencjonowania DNA oraz enzymatycznego powielania DNA (PCR), a w latach dziewięćdziesiątych na rynku pojawiły się już pierwsze komercyjne zestawy diagnostyczne oraz aparaty, które umożliwiają i ułatwiają diagnostykę molekularną w szpitalnych laboratoriach [12]. Najczęstszymi sekwencjami DNA używanymi do identyfikacji patogenów są geny, które kodują rybosomalny RNA (rRNA) dużej i małej podjednostki rybosomu. Ponieważ geny te występują u wszystkich organizmów z wyjątkiem wirusów, izolacja rRNA, sekwencjonowanie rRNA lub fragmentu genomu, który koduje te cząsteczki, jest jedną z najlepszych

metod klasyfikacji bakterii i organizmów wyższych. Obecnie techniki molekularne z powodzeniem uzupełniają tradycyjne metody diagnostyki mikrobiologicznej, a w przyszłości będą prawdopodobnie rutynowo stosowane w większości laboratoriów. Przegląd metod molekularnych stosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej Metody wykorzystywane do wykrywania drobnoustrojów w głównej mierze oparte są na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, która polega na komplementarnym łączeniu się ze sobą nukleotydów wg reguły Watsona-Cricka. Nukleotydy znajdujące się na obu niciach kwasu nukleinowego łączą się za pomocą wiązań wodorowych (adenina-tymina i guaninacytozyna dla DNA oraz adenina-uracyl i guanina-cytozyna dla RNA). Metody hybrydyzacyjne są to więc metody identyfikacyjne oparte na badaniu homologii fragmentów kwasu nukleinowego. Sondy genetyczne Przykładem zastosowania tych właściwości w mikrobiologii jest metoda hybrydyzacji kwasów nukleinowych z wykorzystaniem sond genetycznych – krótkich, jednoniciowych 325

Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej fragmentów DNA, o określonej sekwencji nukleotydowej, unikalnej dla danego mikroorganizmu. Sondy są całkowicie lub częściowo komplementarne do fragmentu sekwencji poszukiwanego genu. Kwas nukleinowy, który pełni rolę sondy genetycznej jest znakowany za pomocą enzymu, barwnika fluorescencyjnego radioaktywnych izotopów biotyny lub digoksygeniny. Ze względu na dużą aktywność własną i krótki czas rozpadu, z izotopów radioaktywnych najczęściej jest stosowany izotop fosforu 32P, który jest wbudowany w łańcuch nukleotydowy głównie jako dCTP. Biotyna i digoksygenina są stosowane wtedy, kiedy chce się uniknąć ryzyka związanego z użyciem izotopu radioaktywnego. Po odpowiednim przygotowaniu materiału i dodaniu znakowanej sondy genetycznej następuje hybrydyzacja sondy z komplementarną cząsteczką kwasu, a tak powstały kompleks wykrywany jest za pomocą odpowiednich metod. Metoda pośrednia służy do detekcji sygnału sond nieradioaktywnych. Wykorzystuje przeciwciała skierowane przeciwko biotynie lub digoksygeninie, które są dodatkowo sprzężone z enzymem. Najczęściej stosowanymi enzymami są: fosfataza alkaliczna (AP) i peroksydaza chrzanowa (HRP). Enzymy te katalizują reakcję przekształcenia bezbarwnego substratu w barwny produkt (reakcja barwna) lub też wywołujących emisję światła w momencie utworzenia kompleksu: sonda-badany materiał (chemiluminescencja). Metoda bezpośrednia służy do detekcji sygnału sondy radioaktywnej lub znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym. W pierwszym przypadku detekcja powoduje zaczernienie się kliszy radioaktywnej (autoradiografia), a w drugim przypadku detekcja sygnału sondy polega na odczycie przez odpowiednie czytniki intensywności fluorescencji, która pochodzi ze znakowanego fluorescencyjnie badanego DNA [26, 34]. Zdolność różnicująca takiej analizy związana jest bezpośrednio z liczbą, a także wielkością fragmentów, które zostały uwidocznione (połączyły się z sondą). Zaletami tak skonstruowanych sond jest wysoka powtarzalność otrzymanych wyników oraz możliwość poddania analizie wszystkich szczepów, które posiadają miejsca homologiczne do sekwencji sondy. Wadą zaś jest to, iż użycie sond wymaga doświadczenia technicz-

terystycznej dla identyfikacji mikroorganizmu sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA). Pojedyncza nić rRNA nie wymaga już przeprowadzenia procesu denaturacji, oprócz tego (w przeciwieństwie do DNA) występuje w bardzo dużej liczbie kopii w komórce (od 1000 do 10 000), dzięki czemu sondy tak skonstruowane charakteryzują się dużo wyższą czułością niż sondy DNA. Sondy RNA (rRNA) pozwalają wykryć każdą komórkową formę życia, a ponieważ wykrywają wysoce konserwatywne obszary oraz takie, które podlegają niewielkim zmianom, umożliwiają określenie podobieństwa genetycznego między gatunkami. Sondy rRNA w oparciu o 16S i 23S RNA (ze względu na konserwatywny charakter genów) stosowane są do wykrywania gatunków należących do jednego taksonu.

nego od wykonawców, głównie wtedy, gdy sondy znakowane są pierwiastkami radioaktywnymi. Zdolność wykrywania określonych kwasów nukleinowych stała się podstawą podziału sond genetycznych na sondy DNA i RNA. Sondy DNA charakteryzują się tym, że fragmentem docelowym jest DNA, który występuje w liczbie kilku kopii w komórce. Zaletą takich sond jest wysoka czułość, ponieważ mogą one rozpoznawać konserwatywne geny dla danego mikroorganizmu, np. geny kodujące toksynę, antygen lub oporność na antybiotyki [34]. Wadą sondy DNA jest brak możliwości wykrywania pojedynczej matrycy w badanym materiale, ponieważ pojedynczy produkt hybrydyzacji nie daje wyraźnego i rzetelnego sygnału. Sondy DNA stosowane są z powodzeniem do identyfikacji M. avium, M. intracellulare i M. tuberculosis [34]. Sondy RNA charakteryzuje komplementarność do charak-

a także określić ekspresję tysięcy genów w jednym eksperymencie. Chipy DNA stwarzają możliwość szybkiej diagnostyki infekcji bakteryjnych wywołanych przez takie czynniki etiologiczne jak: C. pneumoniae, Legionella spp., H. pylori, Mycoplasma spp.[34]. Znajdują one również zastosowanie w diagnostyce wirusów: HIV, HBV, HCV [22, 33, 34]. Fukushima M. i wsp. wykorzystali metodę chipów DNA w identyfikacji M. intracellulare, M. avium i M. kansasii [14]. Bekal S. i wsp. za pomocą tej metody określali obecność genów wirulencji E. coli [4] np. fim A1, fim A2 (kodujących fimbrie) czy cdt2, cdt3 (odpowiedzialne za pozajelitowe infekcje). Wg tych samych autorów za pomocą chipów DNA możliwe jest rozróżnienie różnych wariantów homologicznego genu. Natomiast Kessler N. i wsp. ocenili metodę chipów DNA jako czułą i pozwalającą na pewną identyfikację wirusa grypy [22]. Chipy DNA oka-

326

Chipy DNA Obecnie w badaniach molekularnych stosowane są także sondy DNA upakowane na podłożu stałym z dość dużą gęstością [26, 34]. Sondy takie określane są w literaturze jako chipy DNA (ang. DNA chip), niekiedy również jako mikrowiązki DNA (ang. DNA miccroarray) lub wiązki genów (ang. gene array) [26]. Podłożami stosowanymi do produkcji chipów są: płytki szklane, krzemowe lub plastikowe [14, 22, 26, 34] o niskiej fluorescencji, a także silikon [22, 34], membrany nylonowe [22] bądź nitrocelulozowe o niewielkich wymiarach (od 1 do kilku cm²) [26, 34]; charakteryzuje je sztywna, podatna na chemiczną modyfikację powierzchnia. Na podłoża te naniesione są w regularnych odległościach mikroskopowej wielkości pola (ang. spots) zawierające różniące się od siebie sekwencją sondy DNA. Zasadą działania chipów jest odwrócenie techniki Southern blot. Wiązka sond o znanej sekwencji zakotwiczona na stałym podłożu poddawana jest działaniu nieznanych fragmentów badanego DNA, wcześniej amplifikowanego i znakowanego. W momencie powstania kompleksu: sonda-badany materiał tworzy się sygnał, który jest wykrywany za pomocą wcześniej już opisanych metod. Zaletą chipów DNA jest możliwość równoczesnego prowadzenia reakcji hybrydyzacji przez sondy DNA (każda o innej sekwencji), co pozwala ocenić obecność określonego genu,

K. Kondak zały się narzędziem użytecznym w klinicznej diagnostyce infekcji wywołanych wirusem HPV [20, 23], przy czym według niektórych autorów detekcja wirusa HPV była niższa w porównaniu z detekcją tego wirusa za pomocą metody PCR (opisanej w dalszej części pracy) [20]. Oprócz wykorzystania w diagnostyce, chipy DNA stosowane są także do badania ludzkiego genomu [34], wykrywania mutacji [26] i genotypowania [33]. Chipy DNA w zależności od gęstości upakowania (wielkości jaką zajmuje pojedyncza sonda DNA) dzielimy na zawierające makrozwiązki (plamki DNA o średnicy 300 mm na jedną sondę) i mikrozwiązki (plamki DNA o średnicy poniżej 200 mm na jedną sondę). W zależności od długości sond wyróżnia się dwa rodzaje macierzy (chipów): cDNA oraz oligonukleotydowe [26, 34]. Te pierwsze to naturalne odcinki cDNA o długości 500-5000 jednostek nukleotydowych, natomiast te drugie to syntetyczne oligonukleotydy (niemodyfikowane, krótkie fragmenty naturalnego DNA) długości 20-80 jednostek nukleotydowych, których 5’koniec jest związany z podłożem. Otrzymywane są na drodze syntezy chemicznej bezpośrednio na chipie (in situ) lub oddzielnie, a następnie nanoszone na podłoże i przyłączane w odpowiednich miejscach. Macierze takie dobrze zastępują elektroforezę, ponieważ charakteryzują się bardzo wysokim stopniem uporządkowania, gdyż oligonukleotydy sąsiadujące ze sobą w pionie lub poziomie mogą różnić się tylko jednym nukleotydem. Zhou W. i wsp. stwierdzają nawet, że metoda ta jest bardziej czuła od elektroforezy. Podkreślają również, że dużą zaletą macierzy oligonukleotydowych jest możliwość wielokrotnego użycia oraz umieszczenia na jednej, małej powierzchni nawet kilkuset tysięcy sekwencji, których hybrydyzację można przeprowadzić w jednym czasie [40]. Macierze oligonukleotydowe wykorzystywane są w diagnostyce mikrobiologicznej, medycznej, genetycznej i farmakogenomice [26], a także do sekwencjonowania kwasów nukleinowych, monitorowania ekspresji genów, wykrywania na szeroką skalę mutacji i polimorfizmu [33, 34]. W zakresie diagnostyki mikrobiologicznej, macierze te znajdują zastosowanie w wykrywaniu N. gonorrhoeae [34, 40] oraz w bada-

cierze PNA (ang. peptide nucleic acid), w których naturalny szkielet oligonukleotydowy zastępuje szkielet o strukturze oligopeptydu z przyłączonymi zasadami nukleinowymi (A, G, T, C) [26]. Ponieważ PNA charakteryzuje się dużym powinowactwem do sekwencji komplementarnych, swoistość reakcji hybrydyzacji jest obniżona. Zaletą tych macierzy jest jednak odporność na działanie enzymów nukleolitycznych oraz silniejszy sygnał (przy zastosowaniu krótszych sond) wynikający z większej trwałości dupleksu: sonda typu PNAnaturalna sonda DNA niż dupleksu typu: DNA-DNA czy DNA-RNA [26].

niu oporności M. tuberculosis na rifamycynę [9, 16, 30, 34]. Gilbert G. L. wykorzystał metodę detekcji DNA za pomocą macierzy oligonukleotydowych do zidentyfikowania 54 różnych szczepów Mycobacterium, używając 82 unikalnych sekwencji 16S rRNA i wszystkich znanych mutacji związanych z rifamycyno- i izoniazydoopornością. Uznał jednocześnie, że obecnie metoda ta jest stosunkowo mało czuła, dlatego chętnie stosowana tylko w przypadku charakteryzowania izolatów [16]. Z kolei Park H. i wsp. podczas identyfikacji rifamycyno- i izoniazydoopornych szczepów M. tuberculosis, ocenili czułość zastosowanych oligonukleotydowych chipów DNA na 93,0% a swoistość na 98,4%, samą metodę uznając za łatwą, szybką, użyteczną, i dokładną [30]. Podobnego zdania byli Deng J. Y. i wsp. badający rifamycyno-oporne szczepy M. tuberculosis [9]. W grupie macierzy oligonukleotydowych wyróżnia się ma-

które są komplementarne do przeciwstawnych nici DNA. Primery rozpoczynają reakcję amplifikacji pożądanego odcinka DNA poprzez reakcję hybrydyzacji z sekwencjami oskrzydlającymi (krótkie fragmenty DNA po każdej stronie przeznaczonej do powielania) [16, 34]. Sekwencje oskrzydlające nie mogą być większe niż kilka tysięcy par nukleotydów, a dobór odpowiedniej temperatury sprzyja ich dokładnemu dopasowaniu do matrycy DNA. Jeden cykl reakcji PCR składa się z trzech etapów, a każdy z nich przebiega w innej temperaturze [19]. Pierwszym z nich jest denaturacja podwójnej helisy DNA, czyli rozdysocjowanie nici DNA pod wpływem temperatury 93-96 ˚C w czasie 20-30 s [19]. Kolejnym etapem jest reakcja hybrydyzacji pojedynczej nici DNA z primerami (temperatura około 50 ˚C). Jako ostatnia przebiega reakcja elongacji (wydłużania) fragmentu DNA. Elongacja przebiega jednocześnie na obu komplementarnych niciach

Metody oparte na amplifikacji materiału genetycznego W identyfikowaniu mikroorganizmów bardzo przydatne okazały się techniki oparte na amplifikacji materiału genetycznego NAATs (ang. nucleic acid amplification tests). Należą do nich wszystkie techniki (określane w literaturze także jako testy) oparte na reakcji PCR czy LCR. Reakcja służąca amplifikacji (namnożeniu) wybranego, ściśle gatunkowo-swoistego fragmentu DNA in vitro w czasie krótszym niż kilka godzin (powielanie DNA bez klonowania) [34], nazwana została reakcją PCR (ang. polymerase chain reaction – reakcja łańcuchowa polimerazy). Za opracowanie tej techniki Karl Mullis otrzymał w 1993 Nagrodę Nobla. Początkowo przeprowadzenie reakcji amplifikacji wymagało dodawania kolejnej porcji polimerazy DNA (pochodzącej z E. coli) w każdym cyklu. Odkrycie termostabilnej polimerazy pochodzącej z bakterii T. aquaticus (żyjącej w gorących źródłach wulkanicznych) pozwala przeprowadzać reakcję amplifikacji bez otwierania próbówki. Reakcja prowadzona jest w aparatach zwanych termocyklerami charakteryzującymi się możliwością szybkich zmian temperatury. W skład standardowej mieszaniny reakcyjnej wchodzą: para primerów, matryca DNA (dwuniciowy odcinek DNA, który chcemy amplifikować), bufor, trifosforany deoksyrybonukleozydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), termostabilna polimeraza DNA (np. polimeraza Taq), jony Mg 2+ [20]. Primery (czyli startery) to odpowiednio skonstruowane pary oligonukleotydów – jednoniciowe fragmenty DNA o długości 18-24 nukleotydów,

327

Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej matrycy, zaczynając od 3’końca. Polimeraza dobudowuje kolejne nukleotydy w tempie około kilkudziesięciu na sekundę w temperaturze 72 ˚C [19]. Rozpoczęcie całego cyklu od początku wymaga ponownego ogrzania mieszaniny reakcyjnej do temperatury denaturacji. Powielanie DNA następuje w postępie geometrycznym, gdyż każdy cykl PCR pozwala na uzyskanie dwóch cząsteczek potomnych z jednej macierzystej cząsteczki DNA. Wydajność metody PCR jest zatem bardzo duża. Po około 35 cyklach liczba kopii przekracza 68 bilionów [34]. Taka ilość powstałego DNA pozwala na uwidocznienie produktów PCR z wykorzystaniem bromku etydyny, który zabarwia obecne w żelu agarozowym powstałe DNA. Zaletą techniki PCR jest możliwość wykrycia, amplifikacji i identyfikacji bardzo małych ilości materiału genetycznego. Metoda charakteryzuje się bardzo dużą swoistością i czułością. Materiałem do badań może być DNA pochodzący z każdej tkanki (a nawet z jej wycinków zatopionych w parafinie) oraz z płynu ustrojowego. Van Dyck i wsp. ocenili czułość metody PCR na około 95-96,5%, a swoistość na około 98,9-99,5% [39]. Technika PCR znajduje zastosowanie w diagnostyce mikroorganizmów nierosnących lub wolno namnażających się na podłożach sztucznych, a więc takich, które są trudne do diagnostyki za pomocą klasycznych metod hodowlanych. Metoda PCR jest wykorzystywana do wykrywania patogenów układu oddechowego, mimo takich wad jak: niezdolność rozróżniania martwych patogenów od żywych czy możliwość otrzymania wyników fałszywie pozytywnych (niektóre substancje obecne w próbce mogą połączyć się z inhibitorem amplifikacji) [39]. Przykładem wykrywanych metodą PCR mikroorganizmów jest M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare [34, 38]. W przypadku tych patogenów (głównie dwóch ostatnich) bardzo ważne jest ich rozróżnienie ze względu na odrębne leczenie. Metoda ta okazała się szczególnie użyteczna w przypadku diagnostyki M. tuberculosis, ponieważ czas otrzymania wyników metodami tradycyjnymi trwa od 1 do 2 miesięcy, a za pomocą PCR diagnostyka gruźlicy trwa zaledwie 1 dzień [16]. Metodę tę wykorzystuje się do szybkiej identyfikacji penicylinoopornych S. pneumoniae [16]. Technika ta pozwala również wykryć bezpośrednio w wymazach z gardła lub popłuczynach pęcherzykowych czynniki etiologiczne zakażeń układu oddechowego u dzieci i dorosłych, np. M. pneumoniae [10]. Pomocna jest również w identyfikacji całej rodziny Chlamydiaceae w tym: C. pneumoniae [16] oraz C. trachomatis [16, 27, 34, 47, 57]. Z udziałem techniki PCR mogą być także wykryte i zidentyfikowane takie mikroorganizmy jak: C. difficile [29], Helicobacter spp. [5], N. meningitidis [16], N. gonorrhoeae [25, 34, 39], B. pertussis [16]. Za pomocą tej techniki można także wykryć rzadkie, wcześniej rzadko identyfikowane patogeny, takie jak: R. henselae (czynnik etiologiczny angiomatozy), E. chaffeensis (czynnik etiologiczny choroby Whiple’a – ehrlichiozy) i E. ewingii [1]. Wykrycie dwóch ostatnich możliwe jest dzięki zastosowaniu starterów, które wyznaczają do amplifikacji obszar 16S RNA, występujący u wszystkich gatunków drobnoustrojów 328

i zawierający sekwencje charakterystyczne dla każdego z nich. Technika PCR pozwala także identyfikować we wczesnym stadium choroby (zanim jeszcze wystąpią objawy ze strony układu nerwowego) trudny do diagnostyki patogen: B. burgdorferi obecny w płynie mózgowo-rdzeniowym oraz w moczu [27]. Znajduje ona również zastosowanie w identyfikacji grzybów z rodzaju Candida np. C. glabrata [6] oraz patogenów wirusowych: HBV, HCV, Cytomegalowirusów, Herpeswirusów czy Enterowirusów [34]. Odmianą techniki PCR, która umożliwia równoczesne zastosowanie kilku par gatunkowo specyficznych starterów, prowadząc do amplifikacji kilku odcinków DNA w tym samym czasie jest Multiplex PCR (czyli amplifikacja równoczesna). Dzięki tak dobranym starterom skraca się czas potrzebny do przebadania większych fragmentów DNA. Ginevra C. i wsp. identyfikowali za pomocą tej metody takie mikroorganizmy jak: C. pneumoniae, M. pneumoniae i Legionella spp., oceniając metodę jako czułą, swoistą oraz szybką (całkowity czas zidentyfikowania wszystkich trzech mikroorganizmów wynosił: 6,5 h) [17]. Kamiya i wsp. twierdzą, że jest to dobra metoda do identyfikacji grzybów Candida spp. [21]. Natomiast Mason W. i współpracownicy stwierdzili, że szczepy oksacylinooporne Staphylococcus spp. nie są identyfikowane tą metodą [28]. W przeciwieństwie do techniki PCR, która charakteryzuje się niezdolnością rozróżniania martwych patogenów od żywych, jest jej odmiana, która umożliwia zidentyfikowanie drobnoustroju w formie aktywnej (czyli replikującej się) – dzięki czemu można wykazać formę aktywną bądź latentną (utajoną) zakażenia. Oprócz tego metoda ta znajduje zastosowanie w diagnostyce drobnoustrojów, których materiałem genetycznym jest RNA (wirusy). Technika ta polega na przeprowadzeniu procesu odwrotnej transkrypcji (przepisanie mRNA na cDNA) przed właściwą reakcją PCR i nosi nazwę RT-PCR (ang. reverse transcription PCR) [8]. Po przepisaniu mRNA na cDNA (na matrycy RNA powstaje dwuniciowy DNA) ma miejsce amplifikacja cDNA podczas reakcji PCR. Otrzymane produkty poddawane są elektroforezie w żelu akrylamidowym. Kolejnym etapem jest poszukiwanie różnic między próbką kontrolną a badaną. Następnie przeprowadzana jest reamplifikacja i sekwencjonowanie prążków w celu porównania ich z już istniejącymi bazami sekwencji genetycznych znanych już genów. Technika ta nosi nazwę pokazu różnicowego (ang. differential display) i znalazła szerokie zastosowanie – głównie w diagnostyce odzwierzęcych chorób człowieka, np. w wykrywaniu E. chaffeensis [13]. De Paula i wsp. dodatkowo podkreślają, że metoda RTPCR jest szybka, czuła i prosta [8]. Dzięki rozwojowi molekularnych sond hybrydyzacyjnych, takich jak: TaqMan czy Molecular Beacons (produkowane przez firmę Rohe Molecular Systems), umożliwiony został monitoring amplifikacji kwasów nukleinowych w czasie rzeczywistym w warunkach klinicznych [34]. Do tego celu wykorzystuje się sondy znakowane barwnikami fluorescencyjnymi [33], które hybrydyzują z sekwencjami wewnętrznymi

K. Kondak powielanego fragmentu oraz startery, które hybrydyzują z sekwencjami zewnętrznymi powielanego fragmentu. Molekular Beacons jest oligonukleotydową sondą o kształcie spinki do włosów, która zawiera fluorofory i jest mocno zasocjowana z wygaszaczem (ang. quencher), który absorbuje fotony [33, 34]. W obecności komplementarnego łańcucha DNA struktura spinki do włosów sondy rozwija się (powodując zwiększenie odległości między sondą fluoroforową a sondą wygaszającą) i wtedy emitowana jest fluorescencja, która może być zmierzona, określając ilość powstałego DNA w danej chwili [13, 33, 34]. Technika, która wykorzystuje takie sondy jest odmianą łańcuchowej reakcji polimeryzacji PCR i nosi nazwę Real-Time PCR. Metoda Real-Time PCR znajduje szerokie zastosowanie w identyfikacji enterokrwotocznych szczepów E. coli [24], Salmonella, Listeria [24], Mycobacterium (w tym M. bovis, M. tuberculosis) [36], Campylobacter spp. [24], C. difficile [29], F. tularensis [35], L. pneumophila [3], N. gonorrhoeae [15] oraz wszystkich koagulazo-negatywnych Staphylococcus [9, 10]. Z wykorzystaniem tej techniki dokonano identyfikacji wirusów: HIV, HCV, HBV [25]; grzybów z rodzaju Candida np. C. glabrata, C. dubliniensis, C. kefyr, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis [24] oraz innych grzybów np. Cryptococcus spp. [22], Aspergillus spp. [22, 33]. Real-Time PCR pozwala również na diagnostykę wirusów grypy A i B [37], mikroorganizmów i wirusów weterynaryjnych (oraz wirusów takich jak: FIV, CSFV, FCV) [24], a także badanie oporności na antybiotyki, np. P. aeruginosa [11]. Edwards K. J. i wsp. podkreślają zalety metody Real-Time PCR takie jak: zredukowane ryzyko zanieczyszczenia próbki (ponieważ nie ma konieczności otwierania lightcyklera po amplifikacji) oraz konieczność przeprowadzenia np. jedynie trzech reakcji PCR do scharakteryzowania 15 szczepów CNS [10]. Dieter Klein wymienia dodatkowo takie zalety metody jak: wysoka precyzja, wysoka reproduktywność, wysoka wrażliwość techniczna, szeroki zakres kwantyfikacji, otrzymywanie gotowego wyniku (nie trzeba dokonywać dalszej analizy). Uważa, że ograniczeniami metody są: wzrost ekspotencjalny produktu PCR, wzrost liczby otrzymywanych wariantów wraz z kolejnym cyklem PCR, zwiększające się ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych, pokrywanie się spektrum emisji oraz to, że równoczesnych reakcji może być tylko cztery [24]. Podobnego zdania byli Greiner O. i wsp., którzy stwierdzili, że technika ta jest dużo szybsza i precyzyjniejsza niż konwencjonalne procedury identyfikacji mikroorganizmów (do 24 godzin można otrzymać gotowy wynik, materiałem analizowanym może być bezpośrednio badana próbka materiału klinicznego), a swoistość metody wynosi ok. 90-96% (w temperaturze optymalnej dla primerów, czyli 65ºC). Autorzy stwierdzili, iż metoda ta zwiększa możliwość detekcji genów pochodzących ze szczepów S. pneumoniae, które były przedmiotem badań ich pracy [18]. Zaś GeraatsPeters C.W.M. i wsp. na postawie identyfikacji N. gonorrhoeae, również ocenili tę technikę jako czułą i swoistą [15].

Skrócenie czasu potrzebnego do przebadania większych fragmentów DNA umożliwia odmiana techniki Real-Time PCR zwana Multiplex Real-Time PCR (czyli amplifikacja równoczesna). Technika ta umożliwia zastosowanie kilku par starterów równocześnie, prowadząc w ten sposób do amplifikacji kilku odcinków DNA (w czasie rzeczywistym) w jednej probówce [7]. Za pomocą tej metody Courtney J.W. i wsp. identyfikowali takie mikroorganizmy jak: B. burgdorferi i A. phagocytophilum [7]. Według nich swoistość techniki Multiplex Real-Time PCR jest bardzo duża w stosunku do testowanych przez nich gatunków Borrelia (B. burgdorferi, B. bissettii, B. andersoni, B. parkeri), a także A. phagocytophilum. Zaś DNA pochodzący z takich szczepów jak: A. marginale, R. rickettsii, R. prowazekii, E. coli, E. canis, E. chaffeensis, N. sennetsu oraz B. henselae nie udało się amplifikować za pomocą tej metody. Autorzy stwierdzają, że technika ta jest szybka, czuła i swoista, a jej wadą są: wspomniany wcześniej wzrost ekspotencjalny produktu PCR czy liczby otrzymywanych wariantów (wraz z kolejnym cyklem PCR), zwiększające się ryzyko otrzymania wyników fałszywie negatywnych oraz pokrywanie się spektrum emisji [7]. Qin X. i wsp. [31] porównali metodę Real-Time PCR w identyfikacji P. aeruginosa i innych gram ujemnych pałeczek niefermentujących do metody testów biochemicznych. W zależności od użytego primera odsetek wyników pozytywnych wahał się w granicach: 92-100%. Wyniki fałszywie pozytywne zdarzały się w pojedynczych przypadkach i tylko przy użyciu określonego primera. Autorzy ocenili czułość metody na 98,4%, a swoistość na 98,9%. Ponieważ gram ujemne pałeczki niefermentujące są trudne do identyfikacji ze względu na swoją fenotypową różnorodność, metoda Multiplex Real-Time PCR, okazała się bardzo dobrym narzędziem wykorzystywanym w identyfikacji tych mikroorganizmów. Autorzy podkreślają dodatkowo takie zalety techniki jak: tańszy koszt wykonania od tradycyjnych testów biochemicznych, możliwość pełnej automatyzacji diagnostyki oraz dużo krótszy czas wykonania (mniej niż 3 h) w porównaniu z czasem potrzebnym na otrzymanie wyników testów biochemicznych (18-48 h w zależności od potrzebnego czasu inkubacji). Techniką bardzo podobną do PCR, ale wykorzystującą nie dwie, a cztery pary starterów [39] jest reakcja LCR (ang. Ligase Chain Reactions lub Ligase Chain Reaction Amplification – reakcja łańcuchowa ligazy). Startery przyłączają się do czterech komplementarnych sekwencji matrycowego DNA (dwa startery na jednej nici DNA). Obszar powstały między parą komplementarnych starterów na jednej i drugiej nici DNA łączy enzym zwany ligazą. W ten sposób podczas jednego cyklu otrzymuje się dwa zligowane produkty, które stanowią matrycę w następnych cyklach reakcji. Metoda LCR znajduje zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej, zwłaszcza w sytuacji, gdy czynnikiem etiologicznym są: C. trachomatis [39], M. tuberculosis [24, 32] czy N. gonorrhoeae [2]. Bachmann L.H. i wsp. stwierdzili, że technika LCR charakteryzuje się dużą czułością i swoisto329

Molekularne metody diagnostyki mikrobiologicznej ścią w diagnostyce N. gonorrhoeae (materiałem do badania była próbka moczu) [2]. Podobnego zdania byli Koumans E. H. i współpracownicy, którzy stwierdzają dodatkowo, że metoda LCR w diagnostyce zakażeń wywołanych przez C. trachomatis i N. gonorrhoeae charakteryzuje się większą czułością niż np. metoda hodowlana [25]. Podobnego zdania byli Van Dyck E. i wsp., którzy ocenili czułość metody LCR na około 88,9 %, a swoistość na około 99,1 % [39] oraz Rajo M.C. i wsp. [32], którzy ocenili czułość i swoistość tej metody odpowiednio na 55,5% i 100%. Podsumowanie Metody biologii molekularnej oparte na technikach hybrydyzacyjnych i reakcji PCR są narzędziem nowej ery do wykrywania i identyfikacji mikroorganizmów. Są one szczególnie przydatne wtedy, gdy detekcja i identyfikacja patogenów metodami tradycyjnymi są utrudnione lub wręcz niemożliwe. Metody biologii molekularnej uznane są w środowisku naukowym za czułe, szybkie i wiarygodne. Wiarygodność identyfikacji opartej o analizę genomu wynika z komplementarności zasad azotowych, a więc podstawowej budowy kwasu nukleinowego. Dobrana sekwencja nukleotydowa sondy lub starterów wybranych do analizy może być swoista dla rodzaju, gatunku, a nawet określonego szczepu, a możliwość identyfikacji powstałych produktów poprzez detekcję kompleksu: sonda-materiał badany, rozdział elektroforetyczny produktów PCR czy analiza obrazu sprawia, że techniki te są coraz szerzej stosowane. Dynamiczny rozwój metod biologii molekularnej znajduje coraz szersze zastosowanie w laboratorium mikrobiologicznym. Piśmiennictwo

1. Arens MQ, Liddell AM, Buening G i wsp. Detection of Ehrlichia spp. in the Blood of Wild White-Tailed Deer in Missouri by PCR Assay and Serologic Analysis. J Clin Microbiol 2003; 41: 12631265. 2. Bachmann LH, Desmond RA, Stephens J i wsp. Duration of Persistence of Gonococcal DNA Detected by Ligase Chain Reaction in Men and Women following Recommended Therapy for Uncomplicated Gonorrhea. J Clin Microbiol 2002; 40: 35963601. 3. Baskova L, Landlinger Ch, Preuner S i wsp. The Pan-AC assay: a single-reaction real-time PCR test for quantitative detection of a broad range of Aspergillus and Candida species. J Med Microbiol 2007; 56: 1167-1173. 4. Bekal S, Brousseau R, Masson L i wsp. Rapid Identyfication of Escherichia coli Pathotypes by Virulence Gene Detection with DNA Microarrays. J Clin Microbiol, 2003; 41: 2113-2125. 5. Choi YK, Han JH, Joo HS. Identification of Novel Helicobacter Species in Pig Stomachs by PCR and Partial Sequencing. J Clin Microbiol 2001; 39: 3311-3315. 6. Correia A, Sampaio P, Almeida J i wsp. Study of Molecular Epidemiology of Candidiasis in Portugal by PCR Fingerprinting of Candida Clinical Isolates. J Clin Microbiol 2004; 42: 58995903. 7. Courtney JW, Kostelnik LM, Zeidner NS i wsp. Multiplex RealTime PCR for detection Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burdorferi. J Clin Microbiol 2004; 42: 3164-3168. 8. De Paula S, Fonseca BA. Dengue: a review of the laboratory tests a clinician must know to achieve a correct diagnosis. Braz

330

J Infect Dis 2004; 8: 390-398. 9. Deng JY, Zhang XE, Lu HB i wsp. Multiplex Detection of Mutations in Clinical Isolates of Rifampin – Resistant Mycobacterium tuberculosis by Short Oligonucleotide Ligation Assay on DNA Chips. J Clin Microbiol 2004; 42: 4850-4852. 10. Edwards KJ, Kaufmann ME, Saunders NA. Rapid and Accurate Identification of Coagulase-Negative Staphylococci by Real-Time PCR. J Clin Microbiol 2001; 39: 3047-3051. 11. Edwards KJ, Saunders NA. Real-time PCR used to measure stress-induced changes in the expression of the genes of the alginate pathway of Pseudomonas aeruginosa. J Appl Microbiol 2001; 91: 29-37. 12. Farkas DH. Molecular diagnostic: the best is yet to come. Trends Mol Med 2006; 8: 245. 13. Felek S, Unver A, Stich RW i wsp. Sensitive Detection of Ehrlichia chaffeensis in Cell Culture, Blood, and Tick Specimens by Reverse Transcription PCR. J Clin Microbiol, 2001; 39: 460463. 14. Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H i wsp. Detection and identyfikation of Mycobacterium Species Isolates by DNA Microarray. J Clin Microbiol 2003; 41: 2605-2615. 15. Geraats-Peters CWM, Hermans MHA i wsp. Specific and Sensitive Detection of Neisseria gonorrhoeae in Clinical Specimens by Real-Time PCR. J Clin Microbiol, 2005; 43: 5653-5659. 16. Gilbert GL. Molecular diagnostics in infectious diseases and public health microbiology: cottage industry to postgenomics. Trends Mol Med 2002; 8: 280-287. 17. Ginevra C, Barranger C, Ros A, i wsp. Development and Evaluation of Chlamylege, a New Commercial Test Allowing Simultaneous Detection and Identification of Legionella, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma pneumoniae in Clinical Respiratory Specimens by Multiplex PCR. J Clin Microbiol 2005; 43: 3247-3254. 18. Greiner O., Day PJR, Bosshard PP i wsp. Quantitative Detection of Streptococcus pneumoniae in Nasopharyngeal Secretions by Real-Time PCR. J Clin Microbiol 2001; 39: 3129-3134. 19. Hartley JC, Kaye S, Stevenson S i wsp. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species. J Clin Microbiol 2001; 39: 3072-3079. 20. Jeong Oh T, Jim Kim C, Kyung Woo S i wsp. Development and Clinical Evaluation of a Highly Sensitive DNA Microarray for Detection and Genotyping of Human Papillomaviruses. J Clin Microbiol 2004; 42(7): 3272-3280. 21. Kamiya A, Kikuchi A, Tomita Y i wsp. Epidemiological study of Candida species in cutaneous candidiasis based on PCR using a primer mix specific for the DNA topoisomerase II gene. J Dermatol Sci 2005; 37: 21-28. 22. Kessler N, Ferraris O, Palmer K i wsp. Use of the DNA FlowThru Chip, a Three-Dimensional Biochip, for Typing and Subtyping of Influenza Viruses. J Clin Microbiol 2004; 42: 2173-2185. 23. Klaassen CHW, Prinsen CFM, De Valk HA, i wsp. DNA microarray Format for Detection and Subtyping of Human Papillomavirus. J Clin Microbiol 2004; 42: 2152-2160. 24. Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations. Trends Mol Med 2002; 8: 257-260. 25. Koumans EH, Black CM, Markowitz LE i wsp. Comparison of Methods for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Using Commercially Available Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium. J Clin Microbiol 2003; 41: 1507-1511. 26. Leśnikowski ZJ, Paradowska E, Przepiórkiewicz M i wsp. DNA chips and theirs applications. Postępy Mikrobiol 2002; 41: 1318. 27. Lin T, Oliver JH, Gao L i wsp. Genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu lato in the Southern United States based on Restriction Fragment Length Polymorphism and sequence analysis. J Clin Microbiol 2001; 39: 2500-2507.

K. Kondak 28. Mason W, Blevins JS, Beenken K i wsp. Multiplex PCR Protocol for the Diagnosis of Staphylococcal Infection. J Clin Microbiol 2001; 39: 3332-3338. 29. Moncrief JS, Zheng L, Nevill LM i wsp. Genetic Characterization of Toxin A-Negative, Toxin B-Positive Clostridium difficile Isolates by PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 3072-3075. 30. Park H, Chang CL i wsp. Comparison of a Conventional Antimicrobial Susceptibility Assay to an Oligonucleotide Chip System for Detection of Drug Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates. J Clin Microbiol 2006; 44: 1619-1624. 31. Qin X, Emerson J, Stapp J i wsp. Use of Real-Time PCR with Multiple Targets To Identify Pseudomonas aeruginosa and Other Nonfermenting Gram-Negative Bacilli from Patients with Cystic Fibrosis. J Clin Microbiol 2003; 41: 4312-4317. 32. Rajo MC, Molino MLPD, Lado Lado FL i wsp. Rapid Diagnosis of Tuberculous Meningitis by Ligase Chain Reaction Amplification. Scand J Infect Dis 2002; 34: 14-16. 33. Raoult D, Fournier PE, Drancourt M. What does the future hold for clinical microbiology? Nat Rev 2004; 2: 151-159. 34. Robertson BH, Nicholson JK. New microbiology tools for public health and their implications. Annu Rev Public Health 2005; 26: 281-302. 35. Splettststoesser WD, Tomaso H, Al Dahouk S, i wsp. Diagnostic procedures in tularaemia with special focus on molecular and immunological techniques. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 2005; 52: 249-262. 36. Taylor MJ, Hughes MS, Skuce RA i wsp. Detection of Mycobacterium bovis in bovine clinical specimens using realm-time flu-

orescence and fluorescence energy transfer probe rapid-cycle PCR. J Clinic Micro 2001; 39: 1272-1278. 37. Templeton KE, Scheltinga SA, Beersma ME i wsp. Rapid and sensitive method using multiplex real-time PCR for diagnosis of infections by influenza A and influenza B viruses respiratory syncytial virus, and parainfluenza viruses 1, 2, 3 and 4. J Clin Microbiol 2004; 42: 1564-1569. 38. Torrea G, Sechi LA i wsp. PCR-based detection of the Mycobacterium tuberculosis complex in urine of HIV-infected and uninfected pulmonary and extrapulosis patients in Burkina Faso. J Med Microbiol 2005; 54: 39-44. 39. Van Dyck E, Ieven M, Pattyn S i wsp. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by Enzyme Immunoassay, Culture, and Three Nucleic Acid Amplification Tests. J Clin Microbio 2001; 39: 1751-1756. 40. Zhou W, Du W, Cao H, Zhao J i wsp. Detection of gryA and pacC Mutations Associated with Ciprofloxacin Resistance in Neisseria gonorrhoeae by Use of Oligonucleotide Biochip Technology. J Clin Microbiol 2004; 42: 5819-5824. Adres Autorów: Katedra i Zakład Mikrobiologii we Wrocławiu ul. Chałubińskiego 4 50-368 Wrocław (Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-09-15) (Praca przekazana do opublikowania: 2009-12-04)

331