Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Martin Krönke

Molekularepidemiologische Untersuchung der Populationsstruktur von Acinetobacter baumannii mittels Multi-Lokus Sequenztypisierung

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde Der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln

vorgelegt von Maximilian Markus Fresen aus Bonn

promoviert am 08.Mai.2013

gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln Druckjahr 2013

Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg

1. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. H. Wisplinghoff 2. Berichterstatter: Professor Dr. med. O. A. Cornely

Erklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.

Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstutzungsleistungen von Herrn Privatdozent Dr. med. Hilmar Wisplinghoff und Herrn Universitätsprofessor Dr. med. Harald Seifert erhalten.

Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.

Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Köln, den 14.11.2012

Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente und Untersuchungen sind nach Anleitung von Herrn Privatdozent Dr. med. Hilmar Wisplinghoff und Frau Danuta Stefanik von mir selbst durchgeführt worden.

Danksagungen Herrn Professor Dr. med. Harald Seifert danke ich für die Überlassung des Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und aller für die Durchführung der Arbeit notwendigen Mittel.

Außerdem gilt mein Dank Herrn Privatdozent Dr. med. Hilmar Wisplinghoff, Herrn Paul Higgins, Ph. D. und der medizinisch-technischen Assistentin Frau Danuta Stefanik, die mir bei der praktischen Durchführung der Untersuchungen, sowie bei der Auswertung mit Rat und Tat geduldig zur Seite gestanden haben.

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis Seite 1.

Einleitung.......................................................................................................... ………. 003

1.1

Acinetobacter-Spezies…………………………………………………………………………. 003

1.1.1

Taxonomie……………………………………………………………………………………… 003

1.1.2

Bakteriologie……………………………………………………………………………………. 007

1.1.3

Epidemiologie…………………………………………………………………………………… 009

1.1.4

Medizinische Bedeutung……………………………………………………………………….

12

1.1.5

Antibiotikaresistenz…………………………………………………………………………….

17

1.1.6

Therapie…………………………………………………………………………………………

21

1.2

Typisierungsmethoden…………………………………………………………………………

23

1.2.1

Phänotypische Methoden……………………………………………………………………… 24

1.2.1.1 Antibiogramm……………………………………………………………………………………

24

1.2.1.2 Biotypisierung…………………………………………………………………………………..

25

1.2.1.3 Serotypisierung…………………………………………………………………………………. 25 1.2.1.4 Phagentypisierung………………………………………………………………………………. 25 1.2.1.5 Membran-Protein-Typisierung…………………………………………………………………

26

1.2.1.6 Multilocus Enzymelektrophorese (MLEE)……………………………………………………

26

1.2.2

Genotypische Methoden……………………………………………………………………….

27

1.2.2.1 Ribotypisierung…………………………………………………………………………………

27

1.2.2.2 Plasmid-Typisierung……………………………………………………………………………

28

1.2.2.3 DNA-DNA-Hybridisierung……………………………………………………………………… 28 1.2.2.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)………………………………………………………….. 29 1.2.2.5 Random amplification of polymorphic DNA (RAPD)-PCR………………………………….. 30 1.2.2.6 Repetitive extragenic palindromic PCR Fingerprinting……………………………………..

31

1.2.2.7 Amplified fragment-lenght polymorphism (AFLP)…………………………………………… 31 1.2.2.8 Infrequent restriction site PCR (IRS-PCR)…………………………………………………..

33

1.2.2.9 Multilocus Sequence Typing (MLST)…………………………………………………………

33

1.2.2.10 PCR/Electrospray Ionization Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS)………………………… 35 1.3

Typisierung von A. baumannii…………………………………………………………………

36

2.

Material und Methoden……………………………………………………………………….

38

2.1

Geräte und Materialien…………………………………………………………………………

38

2.2

Medien…………………………………………………………………………………………… 39

2.3

Primer……………………………………………………………………………………………. 39

2.4

Bakterienstämme……………………………………………………………………………….. 42

2.5

Multilocus Sequence Typing…………………………………………………………………..

42

2.5.1

DNA-Extraktion………………………………………………………………………………….

42

2.5.2

Polymerase-Ketten-Reaktion………………………………………………………………….. 43

2.5.2.1 Prinzip……………………………………………………………………………………………. 43 2.5.2.2 Durchführung……………………………………………………………………………………. 44

1

2.5.3

Agarose-Gelelektrophorese……………………………………………………………………. 45

2.5.3.1 Prinzip……………………………………………………………………………………………. 45 2.5.3.2 Herstellung des Gels und Ablauf……………………………………………………………… 46 2.5.3.3 Dokumentation………………………………………………………………………………….. 46 2.5.4

Sequenzierung………………………………………………………………………………….. 47

2.5.4.1 Prinzip……………………………………………………………………………………………. 47 2.5.4.2 Durchführung……………………………………………………………………………………. 47 2.6

Auswertung……………………………………………………………………………………… 48

2.6.1

Programme zur Auswertung…………………………………………………………………… 48

2.6.2

Durchführung…………………………………………………………………………………….. 48

2.6.3

Epidemiologische Auswertung………………………………………………………………..

3.

Ergebnisse……………………………………………………………………………………… 50

3.1

MLST-Ergebnisse………………………………………………………………………………. 50

3.2

Polymorphic Sites………………………………………………………………………………. 55

3.3

Epidemiologische Analyse mittels eBURST…………………………………………………. 69

4.

Diskussion………………………………………………………………………………………. 72

5.

Zusammenfassung……………………………………………………………………………. 77

6.

Literaturverzeichnis………………………………………………………………………….. 080

7.

Lebenslauf……………………………………………………………………………………… 102

2

49

1.

Einleitung

1.1

Acinetobacter-Spezies

1.1.1 Taxonomie Die Gattung Acinetobacter weist eine lange und komplexe taxonomische Geschichte auf. Ihr ubiquitäres Vorkommen, wie auch ihre Anspruchslosigkeit an Umgebung und Nährstoffen, sorgten dafür, dass sie schon frühzeitig von einer Vielzahl von Untersuchern isoliert, beschrieben und mit unterschiedlichen Namen versehen wurde. Bereits 1911 gelang Beijerinck, einem niederländischen Mikrobiologen aus Delft, die historische Erstbeschreibung eines Organismus, welcher heutzutage als Acinetobacter bezeichnet würde. Beijerinck nannte den aus dem Grundwasser isolierten Organismus damals

Micrococcus

calcoaceticus

[BEIJERINCK,

1911].

In

den

folgenden

Jahrzehnten wurden weitere ähnliche Organismen beschrieben und unterschiedlichen Gattungen und Spezies wie etwa Diplococcus mucosus, Alcaligenes haemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffi, Herellea vaginicola, Bacterium anitratum, Moraxella lwoffi var. glucidolytica, Neisseria winogradskyi, Achromobacter anitratus und Achromobacter mucosus zugeordnet. 1954 schlugen Brisou und Prévot den Namen Acinetobacter (vom griechischen akinetos = unbeweglich) vor um die unbeweglichen von den beweglichen Spezies der Gattung Achromobacter zu trennen [BRISOU UND PREVOT, 1954]. Zusammen mit den Gattungen Kingella, Moraxella und Neisseria bildeten sie die Familie der Neisseriaceae. Nach Einführung und Anwendung des Nachweises für Cytochrom-COxidase stellte sich heraus, dass die Gattung sowohl Oxidase-positive, wie auch Oxidase-negative Spezies enthielt, so dass die Einordnung bis 1968 im Allgemeinen nicht anerkannt wurde. Baumann et al. zeigten 1968 an Hand von 106 Oxidase-negativen Stämmen, dass all diese zu einer Gattung gehörten, eine weitere Aufteilung in Subspezies mit phänotypischen Methoden nicht möglich sei und schlugen vor, den Namen Acinetobacter den Oxidase-negativen Stämmen vorzubehalten [BAUMANN ET AL., 1968]. Ebenso konnten Baumann et al. zeigen, dass die Spezies Acinetobacter calcoaceticus bereits 1909 in Beijerincks Labor isoliert und zwei Jahre später, auf Grund der Fähigkeit auf Nährböden zu wachsen, die als einzige Kohlenstoffquelle Calciumacetat enthielten, Micrococcus calcoaceticus genannt worden war. Schließlich entschied das „Subcommittee of the Taxonomy of Moraxella and Allied Bacteria” 1971 3

dass ausschließlich Oxidase-negative Spezies der Gattung Acinetobacter zugehören. Juni veröffentlichte 1972 eine Analyse von DNA-Homologien, wie auch einen Transformations-Ansatz mit dessen Hilfe sowohl die Verwandtschaft zwischen Acinetobacter-Stämmen

untereinander

verifiziert,

als

auch

die

fehlende

Verwandtschaft zwischen Acinetobacter-Spezies und Moraxella bzw. den Oxidasepositiven Achromobacter-Spezies gezeigt werden konnten. Dieser Ansatz zur genetischen Transformation kann auch heutzutage noch genutzt werden um die Zugehörigkeit von Bakterien zum Genus Acinetobacter zu beweisen [JUNI, 1972, JUNI UND HEYM, 1980]. In einem Übersichtsartikel über die Gattungen Moraxella, Acinetobacter und Familie der Mimeae von 1973 schlug Henriksen vor, der Gattung Acinetobacter zwei Spezies zu zuordnen: Die Stämme, die in der Lage waren Säure aus Zucker zu bilden, sollten der Spezies Acinetobacter calcoaceticus zugeordnet werden; für nicht-säurebildende Stämme sollte der Speziesname Acinetobacter lwoffi lauten [HENRIKSEN, 1973]. 1980 führte die „Approved List of Bacterial Names“ unter der Gattung Acinetobacter zwei Spezies A. calcoaceticus und A. lwoffi auf [SKERMAN ET AL., 1980], während „Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology“ 1984 lediglich eine Spezies, Acinetobacter calcoaceticus, mit den beiden Phänotypen Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus und Acinetobacter calcoaceticus var. lwoffi verzeichnete [KRIEG, 1984]. Diese wurden anhand ihres Vermögens Glukose oxidativ abzubauen unterschieden. Einen großen Durchbruch erzielten Bouvet und Grimont im Jahr 1986 als sie mittels DNA-DNA-Hybridisierung 12 unterschiedliche Genospezies unterscheiden konnten, von denen sechs einen Speziesnamen erhielten, während die anderen sechs unbenannt blieben. Genospezies 2 erhielt dabei den Namen Acinetobacter baumannii [BOUVET UND GRIMONT, 1987]. 1988 isolierten Nishimura et al. aus Baumwolle und dem Erdreich die von ihnen benannte Spezies Acinetobacter radioresistens [NISHIMURA ET AL., 1988], die mit der von Bouvet und Grimont 1986 beschriebenen, damals unbenannten Genospezies 12 übereinstimmte. Tjernberg

und

Ursing

entdeckten

1989

bei

DNA-DNA-Hybridisierung

und

phänotypischen Untersuchungen in einer Sammlung von 168 Isolaten und 30 Referenzstämmen drei neue Acinetobacter-Spezies, die Genospezies 13TU, 14TU und 15TU [TJERNBERG UND URSING, 1989]. Zur gleichen Zeit beschrieben Bouvet und Jeanjean fünf weitere Genospezies, die unbenannten Genospezies 13 bis Genospezies 17 [BOUVET UND JEANJEAN, 1989]. 4

Di Cello et al. identifizierten 1997 mittels Amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) und Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) ebenfalls eine neue Spezies, Acinetobacter venetianus [DI CELLO ET AL., 1997]. Bei Untersuchung der Verwandtschaft

von

49

Acinetobacter-Isolaten

mittels

Sequenzanalyse

der

Gyraseuntereinheit B (gyrB) konnten Yamamoto et al. 1999 weitere drei damals noch nicht bekannte Acinetobacter-Spezies nachweisen [YAMAMOTO ET AL., 1999b]. Einige der unabhängig erstbeschriebenen Spezies waren jedoch gleich und hatten unterschiedliche Bezeichnungen bekommen, so dass Genospezies 9 dieselbe Spezies war wie Acinetobacter lwoffi oder die von Bouvet und Jeanjean beschriebene Genospezies 14 (14BJ) mit der von Tjernberg und Ursing gefundenen Genospezies 13 (13TU) übereinstimmte. Nemec et al. wiesen 2001 mittels DNA-DNA-Hybridisierung und Amplified fragmentlength polymorphism (AFLP) aus einer Sammlung von 52 Acinetobacter-Isolaten die beiden noch unbekannten Spezies Acinetobacter schindleri und Acinetobacter ursingii nach [NEMEC ET AL., 2001]. 2003 entdeckte dieselbe Arbeitsgruppe eine weitere bislang unbekannte Genospezies, Acinetobacter parvus [NEMEC ET AL., 2003]. Weitere sieben Genospezies wurden 2003 von Carr et al. beschrieben. Aus Belebtschlamm isolierten sie 13 Acinetobacter-Stämme aus denen die Genospezies Acinetobacter baylyi, Acinetobacter bouvetii, Acinetobacter grimontii, Acinetobacter tjernbergiae, Acinetobacter towneri, Acinetobacter tandoii und Acinetobacter gerneri mittels DNA-DNA-Hybridisierung und 16S rDNA-Sequenzierung bestimmt werden konnten [CARR ET AL., 2003]. Rodriguez-Bano et al. untersuchten 2006 eine nosokomiale Bakteriämie durch eine bislang unbekannte Acinetobacter-Spezies mit Ähnlichkeit zu Genospezies 17 [RODRIGUEZ-BANO

ET

AL.,

2006],

womit

die

Gattung

Acinetobacter

33

Genospezies, davon 17 benannte enthielt. Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der benannten Genospezies mit den entsprechenden Eigennamen. Kilic et al. beschrieben 2007 eine nosokomiale Sepsis bei fünf Patienten einer KinderIntensivstation in der Türkei. Dabei wurden sieben Isolate gewonnen und phänotypisch, wie auch genotypisch untersucht. Zwar zeigten sich Ähnlichkeiten zur Genospezies 22 (Acinetobacter ursingii), jedoch wurde aufgrund vorhandener ßHämolyse auf Schafblutagar, einem fehlenden Umsatz von Zitrat und einer Gemeinsamkeit bei der DNA-DNA-Hybridisierung von unter 70% auf eine neue Acinetobacter-Spezies

geschlossen.

Kilic 5

et

al.

schlugen

aufgrund

des

Krankheitsbildes der Intensivpatienten den Speziesnamen Acinetobacter septicus vor [KILIC ET AL., 2008]. Nemec et al. argumentierten ein Jahr später, dass es sich um keine neue Genospezies handele, sondern nur um eine Variante innerhalb der Genospezies Acinetobacter ursingii, in dem der isolierte Stamm mit 25 Acinetobacter ursingii Isolaten der Sammlung der Universität Göteburg mittels AFLP verglichen wurde [NEMEC ET AL., 2008]. Lee et al. isolierten 2008 auf der Suche nach einer Substanz gegen das TabakMosaik-Virus aus Wurzeln der Tabakpflanzen einen Organismus, den sie nach Untersuchung und Vergleich mit anderen Acinetobacter-Spezies mittels 16S-rRNAAnalyse und DNA-DNA-Hybridisierung als neue Genospezies identifizierten und vorschlugen diese Acinetobacter antiviralis zu nennen [LEE, J. S. ET AL., 2009]. Kim et al. schlugen für den von ihnen isolierten und untersuchten Organismus aus dem Waldboden am Berg Baekwoon in Südkorea den Namen Acinetobacter soli vor [KIM ET AL., 2008]. Hinzu kamen 2009 die von Nemec et al. neuen Genospezies Acinetobacter beijerinckii mit ubiquitärem Vorkommen und Acinetobacter gyllenbergii, welcher ausschließlich von Menschen isoliert werden konnte [NEMEC ET AL., 2009]. Für den von Anandham et al. 2010 aus einem Feuchtbiotop in Südkorea isolierten Stamm wurde der Name Acinetobacter brisouii vorgeschlagen [ANANDHAM ET AL., 2010]. Schließlich schlugen Nemec et al. vor den noch unbenannten Genospezies 10 den Eigennamen Acinetobacter bereziniae beziehungsweise Genospezies 11 den Namen Acinetobacter guillouiae zu geben [NEMEC ET AL., 2010]. Da sich die Genospezies 1 (A. calcoaceticus), 2 (A. baumannii), 3 (A. pittii) und 13TU (A.

nosocomialis)

mit

konventionellen

Methoden

nur

schwer

voneinander

unterscheiden lassen, fasste man sie unter der Bezeichnung „Acinetobacter calcoaceticus- A. baumanni Komplex“ (ACB) zusammen [GERNER-SMIDT ET AL., 1991, GERNER-SMIDT, 1992]. Neuere Publikationen fassen die klinisch relevanten Genospezies 2, 3 und 13 zur Acinetobacter-Gruppe zusammen [ESPINAL ET AL., 2011].

Tabelle 1 – Taxonomie der Gattung Acinetobacter Genospezies Eigenname Acinetobacter calcoaceticus Genospezies 1 Acinetobacter baumannii Genospezies 2 Acinetobacter pittii Genospezies 3 Acinetobacter haemolyticus Genospezies 4 6

Genospezies 5 Genospezies 6 Genospezies 7 Genospezies 8 Genospezies 9 Genospezies 10 Genospezies 11 Genospezies 12 Genospezies 13TU Genospezies 14TU Genospezies 15TU Genospezies 16 Genospezies 17 Genospezies 18 Genospezies 19 Genospezies 20 Genospezies 21 Genospezies 22 Genospezies 23 Genospezies 24 Genospezies 25 Genospezies 26 Genospezies 27 Genospezies 28 Genospezies 29 Genospezies 30 Genospezies 31 Genospezies 32 Genospezies 33

Acinetobacter junii Acinetobacter johnsonii Acinetobacter lwoffii Acinetobacter berezinae Acinetobacter guillouiae Acinetobacter radioresistens Acinetobacter nosocomialis

Acinetobacter venetianus

Acinetobacter ursingii / septicus Acinetobacter schindleri Acinetobacter parvus Acinetobacter baylyi Acinetobacter bouvetii Acinetobacter gerneri Acinetobacter grimontii Acinetobacter tandoii Acinetobacter tjernbergiae Acinetobacter towneri

Tabelle 1 nach [RODRIGUEZ-BANO ET AL., 2006], modifiziert nach [NEMEC ET AL., 2010] und [WISPLINGHOFF ET AL., 2012].

1.1.2 Bakteriologie Bakterien des Genus Acinetobacter sind Gram-negative, unbewegliche, aerobe Stäbchenbakterien aus der Familie der Moraxellaceae mit einem Guanin-CytosinAnteil der DNA von 39 bis 47%. Sie sind Oxidase-negativ und Katalase-positiv, die Indol- und Citratreaktion fallen negativ aus [FANG UND MADINGER, 1996]. Mikroskopisch imponieren sie typischerweise als Gram-negative kokkoide Stäbchen mit einer Größe von 1 - 1.5µm x 1.5 - 2.5µm, die meist in paariger Lagerung, selten auch in kurzen Ketten angetroffen werden können. Anspruchslos in ihrem Wachstum, können sie ihren Stoffwechsel dem Nährstoffangebot ihrer Umgebung anpassen und somit eine Vielzahl an möglichen Substraten nutzen um ihren Kohlenstoffbedarf zu decken [JUNI, 1978]. Acinetobacter-Spezies sind nicht auf eine feuchte Umgebung 7

angewiesen und lassen sich auch von trockenen Oberflächen isolieren [HIRAI, 1991]. Hier zeigen sie sich, auch im Vergleich zu anderen Bakterien wie Staphylococcus aureus, Escherichia coli oder Pseudomonas-Spezies [GETCHELL-WHITE ET AL., 1989], lange überlebensfähig [JAWAD ET AL., 1998]. Aufgrund ihrer geringen Ansprüche wachsen Acinetobacter-Spezies auf allen gewöhnlichen Nährböden, wie etwa Schafblutagar oder Trypticase-Soja-Agar, bei einem Temperaturoptimum zwischen 33 und 35°C. Jedoch sind auch Spezies mit einer weiten Temperaturtoleranz von 0 bis 45°C beschrieben worden [YAMAHIRA ET AL., 2008]. Das pH-Optimum für ein Wachstum von Acinetobacter-Spezies liegt bei pH 7,0 [BAUMANN ET AL., 1968], doch wird auch hier ein Intervall von pH 5,5 bis pH 10 toleriert [LACROIX UND CABELLI, 1982]. Makroskopisch bilden Acinetobacter-Spezies nach einer Inkubationszeit von 24h bei einer Temperatur von 30°C weißliche runde, leicht erhabene, durchscheinende, unpigmentierte Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 2 mm von weicher bis schleimiger Konsistenz. Eine Bildung von Endosporen findet bei AcinetobacterSpezies nicht statt. Mit Hilfe der charakteristischen Trias aus Unbeweglichkeit und Fehlen von Nitratreduktase, sowie Oxidase kann eine erste Identifizierung der Gattung Acinetobacter vorgenommen werden. Der positive Nachweis von Katalaseaktivität, wie auch die negative Citrat- und Indolreaktion unterstützen die Identifikation. Auf Genusebene kann eine manuelle oder auch semiautomatische Identifizierung mit kommerziellen Systemen (z.B. API 20NE, Vitek 2, Phoenix, MicroScan WalkAway) unproblematisch erfolgen. Auf Speziesebene kommt es mit den genannten Systemen hingegen kommt es häufig zu Fehlinterpretationen bei der Differenzierung zwischen den Mitgliedern des ACB-Komplexes [PELEG ET AL., 2008]. Zur Unterscheidung zwischen den aus Glukose Säurebildenden Genospezies A. calcoaceticus und A. baumannii kann deren unterschiedliches Wachstumsverhalten bei 41°C und 44°C ausgenutzt werden [JUNI, 1978]. Eine eindeutige Identifizierung auf Speziesebene erfordert im Allgemeinen den Einsatz molekularer Methoden, wie DNA-DNAHybridisierung, ARDRA oder Sequenzanalysen, für das Routinelabor sind erste Ergebnisse zur Identifizierung von Acinetobacter-Spezies mit Massenspektrometrie (MALDI-TOF) vielversprechend [ESPINAL ET AL., 2011]. Eine vergleichende Übersicht der Charakteristika ausgewählter Genus der Familien der Moraxellaceae und Neisseriaceae ist in Tabelle 2 zusammengefasst. 8

Tabelle 2 - Charakteristika ausgewählter Moraxellaceae und Neisseriaceae Charakteristikum

Acinetobacter

Neisseria

Moraxella

Kingella

Gestalt

Paarige Kokken Paarige Kokken bis mittelgroße Stäbchen

Paarige Kokken Paarig bis kurze Stäbchen angeordnete Stäbchen

Oxidase

−

+

+

+

Katalase

+

+

+

−

Nitratreduktion

−

+

±

+

Metabolismus

Aktiv, mannigfaltig

Begrenzt, einfach

Begrenzt, einfach

Begrenzt, einfach

Säureproduktion aus Glukose

±

−

−

+

+ = vorhanden; − = fehlend Tabelle 2 nach [MANDELL ET AL., 2009]

1.1.3 Epidemiologie Viele Spezies der Gattung Acinetobacter weisen ein ubiquitäres Vorkommen auf. Nach der Beschreibung von Isolaten aus Wasser und dem Erdreich von Baumann im Jahre 1968 [BAUMANN, 1968], ging man von einem ubiquitärem Vorkommen von allen Spezies der Gattung aus, so auch bei der klinisch wichtigsten Spezies A. baumannii [FOURNIER UND RICHET, 2006]. Zwar konnten viele Spezies aus der Luft [ALLEN UND GREEN, 1987], aus Staub, von Tieren oder auch von Lebensmitteln, hier unter anderem aus Fisch, Geflügel, pasteurisierter Milch [GENNARI UND LOMBARDI, 1993], sowie Gemüse [BERLAU ET AL., 1999b] isoliert werden, eine systematische Analyse zur Identifizierung des natürlichen Habitats der jeweiligen Spezies wurde jedoch bis heute nicht durchgeführt, so dass ein natürliches ubiquitäres Vorkommen nicht für die gesamte Gattung anzunehmen ist. Eindeutige Aussagen über das Vorkommen und die Herkunft der einzelnen Spezies werden unter anderem auch durch die Komplexität der in der Vergangenheit oft wechselnden Taxonomie des Genus erschwert. Aktuell kann man davon ausgehen, dass die Spezies A. baumannii, A. pittii und A. nosocomialis, denen eine hohe klinische Bedeutung zukommt, als Habitat wahrscheinlich den kolonisierten Patienten im Krankenhaus haben, während die anderen Acinetobacter-Spezies ubiquitär zu finden sind [PELEG ET AL., 2008]. Viele Acinetobacter-Spezies gehören beim Menschen, wie auch bei Tieren 9

[HENRIKSEN, 1973], zur transienten Normalflora der Haut [TAPLIN UND ZAIAS, 1963, BUXTON ET AL., 1978, AL-KHOJA UND DARRELL, 1979, GUENTHNER ET AL., 1987]. Im Jahre 1997 untersuchten Seifert et al. die Kolonisierung der Haut von Patienten auf einer kardiologischen Station und verglichen sie mit einer gesunden Kontrollgruppe. Von den hospitalisierten Patienten wiesen 75%, sowie 42,5% der gesunden Probanden eine Besiedelung mit Acinetobacter-Spezies, hier besonders A. lwoffii und A. johnsonii, auf. Mit 0,5% bzw. 1% wurden die klinisch bedeutsamen A. baumannii und Genospezies 13TU wesentlich seltener isoliert [SEIFERT ET AL., 1997]. Berlau et al. untersuchten 1999 die Haut von gesunden Individuen. Wie zwei Jahre zuvor wurde in dieser Studie bei über 40% der Probanden AcinetobacterSpezies nachgewiesen, die medizinisch bedeutsamste Genospezies 2 (A. baumannii) wurde jedoch nur einmal isoliert [BERLAU ET AL., 1999a]. Auch von den Schleimhäuten des Respirationstraktes [ROSENTHAL UND TAGER, 1975, BALTIMORE ET AL., 1989], des Gastrointestinaltraktes [AYATS ET AL., 1997] und des Urogenitaltraktes lassen sich Acinetobacter-Spezies isolieren. 2010 unterstrich eine von Thom und Kollegen veröffentlichte Studie die geringe Prävalenz der Kolonisation mit A. baumannii. In einem Zeitraum von 9 Monaten wurde von 555 Patienten bei Hospitalisierung ein perirektaler Abstrich genommen und davon Kulturen angelegt. Lediglich eine (0,18%) der genommenen Kulturen war positiv für A. baumannii [THOM ET AL., 2010]. Dies lässt darauf schließen, dass eine Kolonisation mit dieser Genospezies im Krankenhaus erworben wird. Neuere Studien zur Prävalenz einzelner Acinetobacter-Spezies zeigen darüber hinaus eine erhebliche geografische Variation [WISPLINGHOFF UND SEIFERT, 2012]. Infektionen mit einem pathogenen Stamm der A. baumannii-Gruppe werden bei schwerkranken und immunsupprimierten Patienten beobachtet und sind besonders bei Patienten, die lang andauernden apparativen Behandlungen ausgesetzt sind, anzutreffen. So können Acinetobacter-Spezies von Intensivstationen [CHEN ET AL., 1991, ENOCH ET AL., 2008, RAKA ET AL., 2009, ROSENTHAL ET AL., 2010], Verbrennungsstationen [SHERERTZ UND SULLIVAN, 1985, VILLERS ET AL., 1998, CHIM ET AL., 2007, ONCUL ET AL., 2009], Dialyseeinrichtungen [ABRUTYN ET AL., 1978, SHARMA ET AL., 2003, ZUROWSKA ET AL., 2008] und neonatologischen Abteilungen [ZINGG ET AL., 2008, SALEEM ET AL., 2010, XU ET AL., 2010] isoliert werden. Rosenthal konnte in einer Untersuchung 1974 bei 45% der tracheotomierten Patienten 10

eine Kolonisierung mit Acinetobacter-Spezies nachweisen [ROSENTHAL, 1974]. Timsit et al. machten bei Patienten auf Intensivstationen den Gastrointestinaltrakt als ersten Ort der Besiedelung mit A. baumannii aus und erklärten ihn zum wichtigsten Reservoir dieses Pathogens [TIMSIT ET AL., 1993].

In

vielen

Untersuchungen

wurden

Acinetobacter-Spezies

aus

der

Krankenhausumgebung isoliert. Seifert et al. isolierten 1994 A. baumannii von einem Überwachungsmonitor, einem Medikamententisch und einem Seifenbehälter von Intensivstationen [SEIFERT ET AL., 1994a]. Auch von anderen Teilen des Krankenhausinventars

ließen

sich

Acinetobacter-Spezies

nachweisen:

Von

Luftbefeuchtern [SMITH UND MASSANARI, 1977], Beatmungsgeräten [CUNHA ET AL., 1980], Infusionslösungen [KELKAR ET AL., 1989], Steckbecken [SEIFERT ET AL.,

1994a],

Angiographiekathetern

[REYES

ET

AL.,

1980],

Handschuhen

[PATTERSON ET AL., 1991], Duodenoskopen [ALFA UND SITTER, 1991], wiederaufbereiteten Kanülen [KELKAR ET AL., 1989], Matratzen [BARBOLLA ET AL., 2008], Bettdecken [PHUMISANTIPHONG ET AL., 2009], Kopfkissen [WEERNINK ET AL., 1995, BARBOLLA ET AL., 2008], Nachttischen [MARKOGIANNAKIS ET AL., 2008, PHUMISANTIPHONG ET AL., 2009], Computern, Blutgasanalysator und Ultraschallgeräten [ENOCH ET AL., 2008], Stethoskopen [BARBOLLA ET AL., 2008], Blutdruckmanschetten [BUREAU-CHALOT ET AL., 2004], Patientenakten [TENG ET AL., 2009] und den Servicewagen des Personals [PHUMISANTIPHONG ET AL., 2009]. Vielfach wurde auch eine Distribution von Acinetobacter-Spezies über die Luft von Intensivstationen beschrieben [ALLEN UND GREEN, 1987, GERNER-SMIDT, 1987, BERNARDS ET AL., 1998, HOUANG ET AL., 2001, AUGUSTOWSKA UND DUTKIEWICZ, 2006, KERR ET AL., 2006]. De Vegas und Kollegen ermittelten auf einer neonatologischen Intensivstation in Venezuela infizierte Sondenkost als Ursache von Acinetobacter-Infektionen [DE VEGAS ET AL., 2006]. Bereits im Jahr 1963 postulierten Taplin und Zaias die Haut von Patienten und Krankenhauspersonal als primäres Erregerreservoir für nosokomiale Infektionen mit Acinetobacter-Spezies [TAPLIN UND ZAIAS, 1963]. In vielen Untersuchungen von Infektionen auf Intensivstationen wurde eine Kolonisierung der Hände des Personals die damit verbundene Übertragung von Patient zu Patient festgestellt [FRENCH ET AL., 1980, ADAMS UND MARRIE, 1982, GERNER-SMIDT, 1987, PATTERSON ET AL., 1991, BARBOLLA ET AL., 2008]. 11

Roberts und Kollegen beschrieben 2001 die Transmission eines AcinetobacterStammes von den Händen des Pflegepersonals auf die Patienten und ermittelten mittels Pulsfeld-Gelelektrophose (PFGE), dass es sich bei allen von Patienten und kontaminierten Mitarbeitern und Materialien gewonnenen Isolaten um denselben Stamm handelte [ROBERTS ET AL., 2001]. Borer et al zeigten 2005 die Übertragung von mit Acinetobacter besiedelten schnurlosen Telefonen auf die Hände des Krankenhauspersonals und anschließend auf die Patienten [BORER ET AL., 2005]. Die von Williams et al im Jahre 2010 publizierte Analyse von isolierbaren Bakterien, darunter

Acinetobacter-Spezies,

Enterococcus-Spezies,

Klebsiella-Spezies

und

Staphylococcus aureus, von Laryngoskopgriffen zeigte ebenfalls die Möglichkeit einer Übertragung zwischen Patienten beziehungsweise zwischen Krankenhauspersonal und Patienten [WILLIAMS ET AL., 2010]. Morgan et al publizierten 2010 die Ergebnisse einer prospektiven Studie zur Kontamination von multiresistentem A. baumannii und P. aeruginosa während der Routinearbeit im Krankenhaus und konnten eine Übertragung der Erreger auf die Kittel, Handschuhe und Hände des Personals feststellen. Multiresistenter A. baumannii zeigte sich in der Studie leichter übertragbar als P. aeruginosa [MORGAN ET AL., 2010]. Obwohl vielfach das Krankenhauspersonal als Ursprung von Infektionen beschrieben wurde, gibt es bislang keinen Bericht über eine dauerhafte Besiedelung von A. baumannii auf Haut oder Händen von Klinikspersonal, so dass als Hauptreservoir bei einem Ausbruch die kolonisierten Patienten selbst angenommen werden können.

1.1.4 Medizinische Bedeutung Hielt man früher die Isolation von Acinetobacter aus klinischen Material für eine Kontamination, weiß man heutzutage von der hohen klinischen Relevanz einiger Spezies und der damit verbundenen schweren und zum Teil tödlich verlaufenden nosokomialen Infektionen. Von besonderer Bedeutung sind aus medizinischer Sicht die zur Acinetobacter baumannii Gruppe zusammengefassten Genospezies 2 (A. baumannii), Genospezies 3 (A. pittii) und 13TU (A. nosocomialis). Die höchste Relevanz aus diesem Komplex besitzt, gerade im Bereich der nosokomialen Infektionen, die namensgebende Spezies A. baumannii. Bereits 1987 wurde von Bouvet und Grimont 244 von 291 (83,8%) klinischen Acinetobacter-Isolaten als Spezies A. baumannii identifiziert [BOUVET UND 12

GRIMONT, 1987]. Seifert et al. fanden 1993 in 72,9% der von 420 Patienten gewonnenen 584 Isolaten A. baumannii [SEIFERT ET AL., 1993b], während 1995 Dominguez et al. sogar in 96,8% ihrer 281 Acinetobacter-Isolate diese Spezies nachwiesen [DOMINGUEZ ET AL., 1995].

Wenngleich die Gattung Acinetobacter von größter Relevanz im Bereich der nosokomialen Infektionen ist, stellt sie in tropischen und subtropischen Regionen für ausgewählte Risikogruppen auch eine Gefahr im Bereich ambulant erworbener Infektionen dar [ANSTEY ET AL., 2002]. Studien der Arbeitsgruppen um Leung, Chen, Anstey und Wang beschreiben zwischen 1992 und 2006 insgesamt 80 Patienten in Taiwan, China und Australien von denen 51 eine ambulant erworbene Pneumonie und 29 eine Bakteriämie oder Sepsis aufwiesen [ANSTEY ET AL., 1992, CHEN ET AL., 2001, ANSTEY ET AL., 2002, WANG ET AL., 2002, CHEN ET AL., 2005, LEUNG ET AL., 2006]. Als Risikofaktoren für eine ambulant erworbene A. baumannii-Infektion wurden COPD, Diabetes mellitus und Nierenerkrankungen, dazu exzessiver Alkoholgenuss und starkes Rauchen ausgemacht. Alarmierend war die hohe Mortalität: 45 der 80 Patienten (56%) verstarben an der Infektion [FALAGAS ET AL., 2007]. Des Weiteren existieren eine Vielzahl von Kasuistiken, in denen meistens Pneumonien, seltener Meningitiden [REINDERSMA ET AL., 1993, CHANG ET AL., 2000, LOWMAN ET AL., 2008], Weichteil- und Harnwegsinfektion [CHIANG ET AL., 2003, SOLAK ET AL., 2011], sowie Endokarditiden [GRADON ET AL., 1992] mit A. baumannii beschrieben werden.

Die Prävalenz von nosokomialen Infektionen von A. baumannii auf Intensivstationen variieren zwischen 2 und 10% [HANBERGER ET AL., 1999].

Neben schweren

Grunderkrankungen, Immunsuppression, Polytraumata, apparativer Beatmung, Blasen- und intravasaler Katheter sind auch lang andauernder stationärer Aufenthalt, sowie Behandlung mit Breitspektrumantibiotika prädisponierende Risikofaktoren. Dabei konnte A. baumannii bereits als Erreger von nahezu allen Infektionen in Krankenhäusern auf der ganzen Welt, einschließlich Militäreinrichtungen, wie etwa bei „Operation Iraqi Freedom“ im Irak oder auch „Operation Enduring Freedom“ in Afghanistan beschrieben werden [JAIN UND DANZIGER, 2004, ZAPOR UND MORAN, 2005, JONES ET AL., 2006]. Häufig handelt es sich, wie im ambulant erworbenen Bereich um Atemwegsinfektionen [VANDENBROUCKE-GRAULS ET 13

AL., 1988, CEFAI ET AL., 1990, CRNICH ET AL., 2005, LEE ET AL., 2005], Harnwegsinfektionen [GLEW ET AL., 1977], Sepsis und Bakteriämie, Wund- und Weichteilinfektionen, Meningitiden sowie Endokarditiden.

Der Respirationstrakt ist bedeutsam für eine Besiedelung und am häufigsten von Infektionen mit A. baumannii betroffen [GLEW ET AL., 1977, PELEG ET AL., 2008]. Patienten, die auf eine lang andauernde apparative Beatmung angewiesen sind, entwickeln oft eine Beatmungspneumonie [CASTLE ET AL., 1978, CEFAI ET AL., 1990]. In einer Übersicht über die Entwicklung von nosokomialen Pneumonien von 1986 bis 2003 konnten Gaynes und Kollegen zwar einen gleichbleibenden Anteil von 65,9% von Gram-negativen Aerobiern als Ursache einer Pneumonie beobachten, jedoch auch den steigenden Anteil von A. baumannii von 4% 1986 auf 7% im Jahr 2003, sowie den beobachteten Resistenzen gegenüber Antibiotika [GAYNES UND EDWARDS, 2005]. Stellten Jarvis und Mortone in diesem Zeitraum (1992) den Anteil von Acinetobacter verursachten nosokomialen Pneumonien von 3% fest, was nach P. aeruginosa, S. aureus und Enterobacter-Spezies die vierthäufigste Ursache war [JARVIS UND MARTONE, 1992], ermittelten Lee et al 2005 in einer Studie mit 132 Patienten auf einer Intensivstation A. baumannii mit einem Anteil von 18,6% bereits als zweithäufigsten Erreger nach P. aeruginosa (20,3%) [LEE ET AL., 2005]. In einer retrospektiven Studie fanden Ding und Kollegen im Zeitraum von 2003 bis 2007 A. baumannii mit einem Anteil von 18,9% vor K. pneumoniae (15%), P. aeruginosa (11,3%) und S. aureus (11%), als häufigsten Erreger einer nosokomialen Pneumonie auf einer Intensivstation im Osten Chinas [DING ET AL., 2009]. Nach Baraibar et al. sind vorhergehende neurochirurgische Eingriffe, Kopftraumata, akutes progressives Lungenversagen (ARDS) und Aspiration großer Volumina Risikofatoren

für

eine

durch

A.

baumannii

bedingte

Beatmungspeumonie

[BARAIBAR ET AL., 1997].

Auch für eine weitere sehr häufige Manifestation einer Infektion mit AcinetobacterSpezies, der Harnwegsinfektion, zeigt sich die Spezies A. baumannii verantwortlich. Allgemein

mild

und

komplikationslos

im

Verlauf

sind

dennoch

Fälle

mit

Pyelonephritiden und konsekutiven Bakteriämien beschrieben worden [JOLYGUILLOU ET AL., 1990]. Bei Harnwegsinfektionen mit A. baumannii stellen vorangehende urologische Operationen und künstliche Harnableitung anerkannte 14

Risikofaktoren

dar

[GLEW

ET

AL.,

1977].

Analog

den

Infektionen

des

Respirationstraktes konnten auch bei dieser Manifestation steigende Resistenzraten des Erregers gegenüber Antibiotika beobachtet werden [JOLY-GUILLOU ET AL., 1990].

Immunsuppression, Schock, vorausgehende Operationen, künstliche Beatmung und invasive

Zugänge,

Blasenkatheter

sind

wie

zentralvenöser

Risikofaktoren

für

Katheter

(ZVK),

Magensonde

Acinetobacter-bedingte

und

Bakteriämien

[SEIFERT, 1995, SEIFERT ET AL., 1995, CISNEROS UND RODRIGUEZ-BANO, 2002, CHEN ET AL., 2005]. Analog den nosokomialen Pneumonien und Harnwegsinfektionen findet sich auch bei den Bakteriämien Erwachsenener wie auch bei Kindern, A. baumannii unter den am häufigsten isolierten Erregern. In einem Zeitraum von 11 Jahren ermittelten Raveh et al. 2003 aus insgesamt 7544 Isolaten A. baumannii als achthäufigsten Erreger (3,95%) [RAVEH ET AL., 2003]. In einer siebenjährigen Studie (1995-2002) die prospektiv 24.179 Isolate aus 52 US amerikanischen Krankenhäusern untersuchte (SCOPE-Projekt) war A. baumannii mit einem Anteil von 1,3% der zehnthäufigsten Erreger [WISPLINGHOFF ET AL., 2004]. Chazan et al beobachteten in einem Zeitraum von sechs Jahren (2001-2006) insgesamt 611 Bakteriämien von denen 33 (5,4%) durch A. baumannii ausgelöst waren [CHAZAN ET AL., 2009]. Isolierten Mamishi et al A. baumannii während eines fünfjährigen Zeitraumes (19962000) nur in 0,6% aus den 2248 auf einer Kinderintensivstation gesammelten Blutkulturen, welches dem zwölfthäufigsten Erreger entsprach [MAMISHI ET AL., 2005], ermittelten Lee et al 2009 in sechs Jahren (2001-2006) diesen als fünfthäufigsten Erreger mit einem Anteil von 6,53% der 1163 Isolate einer Kinderintensivstation nach P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans und E. coli [LEE, C. Y. ET AL., 2009].

Die Angabe der Mortalitätsrate von Acinetobacter-Bakteriämien variiert stark und bewegt sich zwischen 17 und 52% [CISNEROS UND RODRIGUEZ-BANO, 2002]. Betrug die Mortalität in einer Studie von Seifert und Baginski 1992 24% bei 31 untersuchten Patienten [SEIFERT UND BAGINSKI, 1992], wurde sie 1995 in einer anderen Studie von Seifert et al mit 44% angegeben [SEIFERT ET AL., 1995]. Chen et al bezifferten die Mortalität einer Acinetobacter-Bakteriämie auf 22,1%, zeigten 15

jedoch dazu, dass es einen deutlichen Unterschied im Überleben bezüglich der auslösenden

Ursache

ergab.

Während

Patienten

mit

katheterassoziierter

Bakteriämie eine hohe Überlebensrate von über 96% zeigte, verstarben im Kontrast dazu 39,2% der Patienten mit sekundärer Bakteriämie nach AcinetobacterPneumonie [CHEN ET AL., 2005].

Wundinfektionen mit Acinetobacter-Spezies kommen gehäuft bei Vorliegen der Risikofaktoren Traumata, Operations- und Verbrennungswunden vor und besonders bei Soldaten während Kampfeinsätzen und den daraus folgenden Verletzungen [CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2004, DAVIS ET AL., 2005, ZAPOR UND MORAN, 2005]. Sherertz und Sullivan fanden 1985 Acinetobacter calcoaceticus als häufigsten Erreger auf einer Verbrennungsstation und

sahen

großflächige

Verbrennungen

und

Katheterisierungen

als

Hauptrisikofaktoren an [SHERERTZ UND SULLIVAN, 1985]. Nach Entfernen der nassen Matratzen, die als Reservoir dienten, konnte der beobachtete Ausbruch eingedämmt werden. 2008 beschrieben Sebeny et al A. baumannii Infektionen bei Schuss- und Schrapnellwunden bei Soldaten im Irak. Auch hier zählten liegenden Katheter als Risikofaktor [SEBENY ET AL., 2008].

In der Literatur beschriebene Meningitisfälle, bei denen Acinetobacter-Spezies als auslösende Ursache identifiziert werden konnten, lassen auch in dieser Domäne die Dominanz

der

Spezies

A.

baumannii

erkennen.

Fast

ausschließlich

sind

schwerkranke oder immunsupprimierte Patienten betroffen. Begünstigende Faktoren sind offene Schädel-Hirn-Traumata, Liquorfisteln, neurochirurgische Operationen und invasive

Behandlungs-

und

Diagnostikmethoden,

wie

Ventrikulostomata,

Myelographien, Ventrikulographien und intrakranielle Katheter [SIEGMAN-IGRA ET AL., 1993]. Auch durch intrathekale Applikation von Chemotherapeutika, wie etwa zur Therapie von Leukämien eingesetztes Methotrexat, kann bei Kontamination eine iatrogene Acinetobacter-Meningitis ausgelöst werden, wie 1989 von Kelkar et al publiziert [KELKAR ET AL., 1989]. In der Literatur gilt A. baumannii bei 4,5% der Meningitiden bei Patienten nach neurochirurgischen Operationen [BENIFLA ET AL., 2004],

bzw.

bei

11%

bei

Patienten

mit

intraventrikulären

Kathetern

als

verantwortlicher Erreger [MAYHALL ET AL., 1984, WANG ET AL., 2005, 16

RODRIGUEZ GUARDADO ET AL., 2008]. In einer 2007 durchführten Analyse von Metan und Kollegen wurde die Mortalität einer Acinetobacter-Meningitis mit 71,4% angegeben. Eine verspätete Fremdkörperentfernung wirkte sich negativ auf das Überleben aus [METAN ET AL., 2007].

Von Acinetobacter ausgelöste Endokarditiden stellen eine Seltenheit dar und betreffen, wie andere Acinetobacter-assoziierte Infektionen immunkompromittierte Patienten oder Patienten mit Risikofaktoren, wie etwa rheumatischer Herzerkrankung oder nach Implantation einer künstlichen Herzklappe [WEINBERGER ET AL., 1987, GRADON ET AL., 1992, YU-HSIEN ET AL., 2008]. In der Literatur sind nur wenige sporadische Fälle beschrieben. Im Vergleich zu Endokarditiden, ausgelöst durch andere Erreger, zeigt die Acinetobacter-assoziierte ein mit 87,5% wesentlich höheres Überleben [RIZOS ET AL., 2007]. Auch Kinder können, wenn auch seltener, von einer Acinetobacter-assoziierten Endokarditis betroffen sein. Angeborene Herzfehler scheinen dabei das Risiko zu erhöhen [MALIK, 1995].

Andere schwere Infektionen, die von Acinetobacter ausgelöst werden können, sind Arthriditen und Osteomyelitiden [SEIBERT, 1999, GERARD ET AL., 2001, DUAN ET AL., 2010], Peritonitiden [ABRUTYN ET AL., 1978, TAIN ET AL., 1999, SHARMA ET AL., 2003], Konjunktivitiden [MILLER, 2005] und Endophtalmitiden [GOPAL ET AL., 2003].

1.1.5 Antibiotikaresistenz In ihrem Report 2009 definierte die „Infectious Diseases Society of America“ (IDSA) A. baumannii neben E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa und Enterobacter-Spezies als Mitglied der sogenannten ESKAPE-Gruppe und damit als gefährlichen Erreger in Bezug auf Resistenzen gegenüber Antibiotika und der immer wichtiger werdenden Entwicklung neuer wirksamer antimikrobieller Substanzen [BOUCHER ET AL., 2009]. Acinetobacter weist eine hohe intrinsische Resistenz gegenüber einer Reihe von häufig benutzten Antibiotika, wie etwa Aminopenicilline, Cephalosporine erster und zweiter Generation, sowie Chloramphenicol auf [SEIFERT ET AL., 1993a, SEIFERT ET AL., 2006]. Mittels Veränderungen im Genom kann sich das Resistenzspektrum erweitern (extrinsische Resistenz) und sich somit innerhalb von Dekaden ein 17

multiresistenter Erreger entwickeln [BERGOGNE-BEREZIN UND TOWNER, 1996]. Im Einzelnen sind Resistenzen gegenüber Aminopenicillinen und Ureidopenicillinen [BERGOGNE-BEREZIN, 1995, BERGOGNE-BEREZIN UND TOWNER, 1996], Cephalosporinen

[JOLY-GUILLOU

UND

BERGOGNE-BEREZIN,

1985],

Aminoglykosiden [PEACOCK ET AL., 1988, OKPARA UND MASWOSWE, 1994], Tetracyclinen [BERGOGNE-BEREZIN UND TOWNER, 1996] und Fluorchinolonen [LEVIN, 2003] beschrieben. Von besonderer Bedeutung sind auch beschriebene Resistenzen gegenüber Carbapenemen,

einer

1985

eingeführten

Gruppe

von

Breitspektrum-ß-

Laktamantibiotika, die jahrelang als wichtigstes Mittel gegen multiresistente A. baumannii eingesetzt wurde. Ausbrüche von Carbapenem-resistenten AcinetobacterStämmen wurden inzwischen weltweit beschrieben [BOU ET AL., 2000, CORBELLA ET AL., 2000, MANIKAL ET AL., 2000, BOGAERTS ET AL., 2006, KOHLENBERG ET AL., 2009, ROMANELLI ET AL., 2009], der erste im Jahre 1994 [TANKOVIC ET AL., 1994]. Dazu gibt es Regionen, in denen der Anteil an Carbapenem-resistenten Stämmen über 25% liegt [TURNER UND GREENHALGH, 2003]. Fournier und Kollegen sequenzierten 2005 vergleichend das komplette Genom des in Frankreich endemischen, multiresistenten Stammes A. baumannii AYE und des sensiblem Stammes A. baumannii SDF von menschlichen Läusen. Dabei fanden sie eine 86kb lange Resistenzinsel im Genom des Stammes AYE mit 45 Resistenzgenen. Im Vergleichsstamm SDF befand sich dagegen eine 20kb lange, von Transposons umgebene Region, die frei von Resistenzgenen war. Aufgrund der Ähnlichkeiten der Sequenzen wurde geschlossen, dass Resistenzgene von anderen Genera wie Pseudomonas, Salmonella oder Escherichia von Stamm AYE übernommen worden waren [FOURNIER ET AL., 2006].

Schwere Erkrankungen und Wunden [KOELEMAN ET AL., 1997], künstliche Beatmung, sowie ein langer Krankenhausaufenthalt begünstigen eine Infektion mit einem

multiresistenten

A.

baumannii.

Des

Weiteren

übt

der

ausgedehnte

Antibiotikagebrauch auf Intensivstationen einen hohen Selektionsdruck auf die Infektionserreger aus und unterstützt so deren Resistenzentwicklung [MANIKAL ET AL., 2000, AYGUN ET AL., 2002, ZARRILLI ET AL., 2004, KRANIOTAKI ET AL., 2006]. So sind vorausgehende Therapien mit Metronidazol [ABBO ET AL., 2005], Cephalosporinen [ROMANELLI ET AL., 2009] und Carbapenemen [ROMANELLI ET 18

AL., 2009, YE ET AL., 2010] in Studien als Risikofaktoren für den Erwerb eines multiresistenten A. baumannii beschrieben worden.

Die folgenden Tabelle 3 gibt die Resistenzentwicklung und -situation für A. baumannii gegenüber aktuell verwendeten Antibiotika wieder. Hierfür wurden die Daten von mehr als 100 teilnehmenden Zentren in Europa, Nord- und Südamerika, sowie Asien aus unterschiedlichen Überwachungsnetzwerken, wie „EARSS“, „Alexander Project“, „Intensive Care Antimicrobial Resistance Epidemiology“, „SENTRY Antimicrobial Surveillance Program“ und „MYSTIC Program“ über einen Zehnjahreszeitraum zusammengetragen [RHOMBERG UND JONES, 2009].

19

Tabelle 3: Resistenzentwicklung und -situation für A. baumannii, nach [RHOMBERG UND JONES, 2009]

Tobramycin

Ciprofloxacin

50

30

40

32,4

17,6

35,3

21,4

33,9

26,8

41,1

21,8

34,5

21,8

47,3

24,7

34,2

9,6

46,6

41,1

46,8

39,6

13,5

53,2

42

39,8

36,4

8

56,8

42

-

-

-

-

-

66,3

55,8

43

74,4

73,3

69,1

-

40,4

73,4

64,9

Levofloxacin

Gentamicin 20,6

68,1

30

64

68,1

Piperacillin/Tazobactam

-

68,6

47,9

62,8

46,6

-

37,2

57,4

59,3 46,8

48,9

-

48,8

2008

38,4

45,9

4,5

-

2007

31,8 38,2

39,7

10,8

11,4

2006

38,7 32,1

40

2,7

20,7

2005

26 26,5

35,7

14,5

11

2004

32,7

30

32,4

10,7

16,4

2003

30,4

Ceftazidim

40

8,8

17,9

2002

23,5

Ceftriaxon

10

17,6

2001

20

Imipenem

35

2000

Cefepime

Meropenem

1999

Resistenz in %, definiert nach den Kriterien des „Clinical & Laboratory Standards Institute“ (CLSI) 2008

20

1.1.6 Therapie Ein Nachweis von Acinetobacter-Spezies von Haut oder Schleimhäuten eines Patienten ohne klinisches Korrelat bedarf aufgrund der zumeist niedrigen Virulenz vieler Acinetobacter-Spezies meist keiner antibiotischen Therapie [SEIFERT, 1992]. Dagegen bedürfen nosokomial erworbene, von A. baumannii ausgelöste Infektionen antimikrobieller Therapie entsprechend der Sensibilität. Die stetige Zunahme von Resistenzen, beziehungsweise dem wachsenden Anteil multiresistenter

Stämme,

erschweren

eine

Therapie

immens.

Spezifische

Therapieoptionen umfassen Sulbactam, Carbapeneme, Aminoglykoside, Polymyxin E (Colistin) und B, Minocyclin und Tigecyclin [FISHBAIN UND PELEG, 2010].

Sulbactam zeigt von den ß-Lactamase-Inhibitoren die größte intrinsische bakterizide Aktivität gegen A. baumannii [PELEG ET AL., 2008]. In einer israelischen Studie war die Kombination aus Ampicillin mit Sulbactam die einzige signifikante Variabel in der Therapie multiresistenter Acinetobacter-Infektionen, die die Mortalität verringern konnte [SMOLYAKOV ET AL., 2003].

Carpapeneme, wie Meropenem, Imipenem und Doripenem sind aufgrund ihrer starken Bakterizidie und Stabilität gegen viele ß-Lactamasen eine bedeutsame Option in der Behandlung von Acinetobacter-Infektionen. Dabei variieren die Resistenzraten zwischen den Vertretern dieser ß-Laktamgruppe untereinander und auch abhängig von der geographischen Region [FRAENKEL ET AL., 2006, NORSKOV-LAURITSEN ET AL., 2009].

Von den Aminoglykosiden scheinen Amikacin und Tobramycin ihre Aktivität gegen A. baumannii-Isolate trotz der steigenden Resistenz gegenüber dieser Klasse behalten zu können. Aminoglykoside werden selten in Monotherapie verwendet und ihr Toxizitätsprofil (Oto- und Nephrotoxizität) mindert zusätzlich deren Einsatz gerade im Hinblick auf Langzeittherapie. In einer retrospektiven Kohortenstudie mit 32 Patienten zeigten Gounden und Kollegen die vergleichbare Aktivität von Tobramycin gegenüber Colistin in der Therapie multiresistenter Acinetobacter-Infektionen. Hierbei gab es keinen signifikanten Unterschied bei der Mortalität oder dem Anstieg des Serumkreatinins [GOUNDEN ET AL., 2009].

21

Die Klasse der Polymyxine, bestehend aus Polymyxin B und Colistin (Polymyxin E), wird von dem Gram-positiven Bakterium Bacillus polymyxa produziert und wirkt spezifisch gegen Gram-negative Organismen, in dem sie mit den Phospholipiden der äußeren Membran interagiert. Aufgrund steigender Resistenzraten hat diese alte Antibiotikaklasse erneut an Bedeutung gewonnen [FALAGAS ET AL., 2008]. Colistin ist in zwei unterschiedlichen Formulierung verfügbar: Colistinmethat-Natrium, ein Prodrug, welches intravenös appliziert oder vernebelt zur Therapie einer Pneumonie inhaliert werden kann und Colistinsulfat, welches topisch und zur Resistenztestung eingesetzt wird. Die bekannte Neuro- und Nephrotoxizität begrenzen den Einsatz von Colistin, beispielsweise bei vorgeschädigten Nieren, bei älteren Patienten oder denjenigen, die bereits andere nephrotoxische Pharmaka erhalten [BROWN ET AL., 1970, KOCH-WESER ET AL., 1970]. Für Patienten mit A. baumannii-Meningitis nach neurochirurgischem Eingriff, meist von einem multiresistenten Stamm ausgelöst [KIM ET AL., 2009], wird eine Therapie mit Carbapenenem allein oder in Kombination mit einem intrathekal oder intravenös applizierten Aminoglykosid empfohlen. Bei Resistenzen gegenüber Carbapenemen wird

dagegen

die

Kombination

aus

intravenösem

plus

intrathekalem

oder

intraventrikulärem Polymyxin oder Aminoglykosid vorgeschlagen. Dies kann auch noch mit der intravenösen Gabe von Rifampicin unterstützt werden [KIM ET AL., 2009].

Die Tetracycline Doxycyclin und Minocyclin sind beide zur intravenösen Applikation verfügbar. Obwohl Minocyclin von der amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zur Therapie von Acinetobacter-Infektionen zugelassen ist, existieren nur wenige klinische Daten zur Verwendung von Tetracyclinen zu diesem Zweck: Eine Studie konnte bei 7 von 8 Patienten mit Wundinfektion, eine andere bei 6 von 7 Patienten mit Beatmungspneumonie eine erfolgreiche Therapie mit Tetracyclinen zeigen [BISHBURG UND BISHBURG, 2009].

Tigecyclin, ein halbsynthetisches Derivat des Minocyclins, gehört der neuen Antibiotikaklasse der Gylcylcycline an und inhibiert die 30S-Untereinheit der Ribosomen. Der Vorteil von Tigecyclin beruht darauf, dass von Tetracyclinresistenzen bekannte Mechanismen, wie beispielsweise Effluxpumpen, keinen Effekt auf die neue Antibiotikaklasse haben. Neben der hohen Aktivität von Tigecyclin in vitro gibt es eine 22

Vielzahl von Studien, deren Ergebnisse jedoch oft durch die in Kombination applizierten anderen Antibiotika verschleiert werden [KELESIDIS ET AL., 2008].

Zusammenfassend gestaltet sich die Therapie von Acinetobacter-Infektionen aufgrund der steigenden Prävalenz multiresistenter Stämme, sowie der dadurch limitierten Anzahl an Therapieoptionen sehr schwierig. Eine In-vitro-Resistenztestung bei Nachweis der Genospezies des Acinetobacter baumannii-calcoaceticus Komplex ist obligat, da eine kalkulierte Therapie mit den klassischen Antibiotika nicht mehr möglich ist. Beim Einsatz neuerer Antibiotika sollten nicht nur die bekannten Nebenwirkungen bedacht, sondern auch Monotherapien vermieden werden um die Resistenzbildung zu minimieren. Gemäß Kresken und Seifert wird bei schweren Acinetobacter-Infektionen

in

Deutschland

der

Einsatz

von

Carbapenemen

(Doripenem, Meropenem, Imipenem), gegebenenfalls in Kombination mit einem Aminoglykosid oder Fluorchinolon, empfohlen. Bei Vorliegen von Resistenzen gegen die Standardantibiotika, insbesondere gegen Carbapeneme, käme auch Tigecyclin als Behandlungsoption in Betracht. Colistin hingegen sollte der Behandlung von Infektionen durch panresistente Stämme vorbehalten sein [KRESKEN UND SEIFERT, 2011].

1.2

Typisierungsmethoden

Alle Typisierungsverfahren verfolgen das Ziel Isolate von Mikroorganismen innerhalb von

Örtlichkeiten

und

Zeitspannen

einander

zuzuordnen

um

Verwandtschaftsverhältnisse zwischen ihnen aufzuzeigen mit denen man Aussagen zu Epidemiologie und Entwicklung machen kann. Besonders bei virulenten Erregern können so wichtige Erkenntnisse im Bereich der Identifizierung, Verfolgung und Unterbrechung von Ausbrüchen in Krankenhäusern gewonnen werden.

Zur Nutzung eines Merkmals zu Typisierungszwecken muss dieses neben einem steten Vorkommen innerhalb eines Stammes auch eine Vielfalt in der Ausprägung innerhalb der Spezies besitzen um eine Unterscheidung zu gewährleisten. Die Vielfalt kann auf Punktmutationen, Genverlust oder Austausch mit anderen Mikroorganismen beruhen.

Reproduzierbarkeit, Diskriminierungsfähigkeit, sowie eine einfach durchzuführende 23

Interpretation sind die wesentlichen Voraussetzungen für die Auswahl einer Typisierungsmethode. Eine ideale Methode sollte mit einfachen Techniken in kurzer Zeit eine Vielzahl von Mikroorganismen kostengünstig und valide bestimmen und somit weltweit routinemäßig zum Einsatz kommen können.

Generell lassen sich verschiedene Typisierungstechniken in phänotypische und genotypische Methoden unterteilen. Für epidemiologische Studien stellte sich meist eine Kombination aus mehreren Methoden als lohnenswert heraus [BOUVET ET AL., 1990]. Während phänotypische Typisierungsmethoden auf morphologischen und physiologischen Eigenschaften und deren Nachweis beruhen, greifen genotypische Methoden

auf

Unterschiede

im

genetischen

Code

chromosomaler

wie

extrachromosomaler Sequenzen zurück.

1.2.1 Phänotypische Typisierungsmethoden

1.2.1.1 Antibiogramm Das

Antibiogramm

wird

routinemäßig

zur

Testung

der

Sensibilität

von

Mirkoorganismen gegenüber Antibiotika angefertigt. Bei Benutzung einer festgelegten Reihe von Antibiotika kann man mittels erhaltenem Antibiogramm Aussagen zur Charakterisierung und Typisierung einiger Erreger machen. Zwar gibt es primäre, evolutionär bedingte, als auch sekundäre – innerhalb von Familie und Spezies übertragbare – Resistenzen, diese können jedoch allenfalls grob orientierend eine Einteilung eines Organismus vornehmen, da erworbene Resistenzen gegenüber Antibiotika zwischen Spezies übertragen werden und somit unterschiedliche Spezies einer Gattung das gleiche Resistenzmuster aufweisen können. Da aus dem Antibiogramm nicht ersichtlich ist, ob es sich bei Vorliegen einer Resistenz um eine Primäre oder Sekundäre handelt, können Spezies aus unterschiedlichen Gattungen dasselbe Antibiogramm aufweisen. Da unterschiedlichen Resistenzen innerhalb der Acinetobacter-Spezies

genetisch

bedingt

und

übertragbar

sind,

können

unterschiedliche Isolate eines Stammes ein unterschiedliches Resistenzmuster aufweisen, als auch unterschiedliche Stämme dasselbe Resistenzmuster zeigen [DIJKSHOORN ET AL., 1993, STRUELENS ET AL., 1993, SEIFERT ET AL., 1994b]. Dies disqualifiziert das Antibiogramm als sensitive Typisierungsmethode.

24

1.2.1.2 Biotypisierung Bei der Biotypisierung zur Differenzierung von Stämmen der gleichen Spezies bedient man

sich

Eigenschaften

wie

morphologischer

Unterschiede,

biochemischer

Reaktionen und Unempfindlichkeit gegenüber Einflüssen aus der Umwelt, wie etwa Wachstum bei extremen pH- und Temperaturwerten. Bouvet und Grimont publizierten 1987 für Acinetobacter spp. dieses System der Speziesdifferenzierung in welchem die Säureproduktion aus Glukose, Gelatinehydrolyse und die Verwertung von 14 unterschiedlichen Kohlenstoffquellen in Zusammenhang mit Wachstum der Stämme bei unterschiedlichen Temperaturen beobachtet wurden [BOUVET UND GRIMONT, 1987]. Da jedoch auch Isolate desselben Stammes unterschiedliche Reaktionen zeigen können [BOUVET ET AL., 1990], ist die Diskriminierungsfähigkeit dieser Methode sehr begrenzt. Wie das zuvor beschriebene Antibiogramm ist die Biotypisierungsmethode

aufgrund

der

geringen

Diskriminierungsfähigkeit

zur

Typisierung nicht geeignet [BERGOGNE-BEREZIN, 1994].

1.2.1.3 Serotypisierung Die Methode der Serotypisierung differenziert Bakterien mittels Antiseren. Diese sind gegen spezifische immunogene Strukturen auf Bakterienoberflächen, wie etwa Lipopolysaccharide oder Zellmembranproteine, gerichtet, können nach Bindung an die immunogenen Strukturen mittels indirekter Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden und dienen so der Unterscheidung [DAS UND AYLIFFE, 1984]. Zwar gelang Traub 1989 mittels dieser Methode die Unterscheidung der morphologisch sehr ähnlichen Spezies A. baumannii und A. genospezies 3, er konnte jedoch auch zeigen, dass eine Typisierung von A. baumannii Isolaten mittels Serotypisierung nicht möglich ist, da 60% der untersuchten A. baumannii Isolate einer einzigen Serogruppe angehörten [TRAUB, 1989].

1.2.1.4 Phagentypisierung Die Phagentypisierung charakterisiert Isolate mittels der Fähigkeit von Bakteriophagen Bakterien zu lysieren, wenn diese einen für die Bakteriophagen passenden Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die Methode wurde 1938 von Craigie und Yen vorgeschlagen und 1940 von Lazarus verwandt um Typhus-Bazillen zu typisieren [LAZARUS, 1940]. Zwar wurden mehrere Untersuchungen mit Acinetobacter-Spezies durchgeführt, diese zeigten jedoch wenig überzeugende Ergebnisse: So waren in der 25

Analyse von Bouvet et al 1990 36% der untersuchten Stämme nicht mittels Phagentypisierung bestimmbar [BOUVET ET AL., 1990], bei Joly-Guilliou et al 34% [JOLY-GUILLOU ET AL., 1990] - in einer Studie von Giammanco et al sogar 62,3% [GIAMMANCO ET AL., 1989].

1.2.1.5 Membran-Protein-Typisierung Bei dieser Methode werden die Bestandteile der Zellwand mit Hilfe einer Gelelektrophorese aufgetrennt, so dass nach Anfärbung unterschiedliche Banden entstehen. Diese können dann miteinander verglichen und Bakterien anhand ihres Besatzes von Membranproteinen in der Zellwand unterschieden werden. Sowohl 1988 Alexander et al als auch 1993 Dijkshoorn et al verglichen die Korrelation der Ergebnisse dieser Methode mit denen anderer Methoden, wie dem Antibiogramm und der Plasmidanalyse. Hier zeigte sich für die MembranproteinTypisierung eine hauptsächliche Eignung zur Typisierung auf Speziesebene, jedoch keine ausreichende Differenzierung innerhalb einer Spezies [ALEXANDER ET AL., 1988, DIJKSHOORN ET AL., 1993]. Die Reproduzierbarkeit dieser Methode ist aufgrund der unterschiedlichen Expression der für die Membranproteine codierenden Gene der Bakterien, und der damit verbundenen Inkonstanz der Proteine, stark eingeschränkt.

1.2.1.6 Multilocus Enzymelektrophorese (MLEE) Die MLEE ist das phänotypische Gegenstück zur Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST) und deren Vorläufermethode. Sie bedient sich der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit von spezifischen bakteriellen Enzymen im elektrischen Feld der Gelelektrophorese, wobei die resultierenden Bandenmuster dann benutzt werden um die Organismen zu identifizieren. Bei Mutationen innerhalb des genetischen Codes für die untersuchten Enzyme, ändert sich nicht nur die Nukleotid-, sondern auch die Proteinsequenz und damit einhergehend das Wanderverhalten der Enzyme. Anhand dieses können somit Rückschlüsse auf die Nukleotidsequenz und anhand dessen Einteilungen in verschiedene Klone vorgenommen werden. Eine deutliche Einschränkung hierfür stellt jedoch die Notwendigkeit von mehreren Nukleotidveränderungen zur Änderung des Elektrophoreseverhaltens dar und der damit verbundene geminderte Diskriminierungsgrad [SELTMANN ET AL., 1995]. Weiterhin besteht die Möglichkeit, dass völlig unterschiedliche Mutationen, damit 26

Veränderungen der Nukleotid- und Proteinsequenzen, dieselben Migrationsverhalten zur

Folge

haben

können.

Solche

zufälligen

Vorkommnisse

schränken

die

Diskriminationsfähigkeit und Validität der Methode weiter ein. Trotz der zentralen Rolle bei der Etablierung der bakteriellen Epidemiologie, wurde aufgrund des hohen technischen Aufwandes von einer Einführung in die Routine abgesehen. Zudem machte mangelhafte Standardisierbarkeit der Methode einen Vergleich von in unterschiedlichen Laboren gewonnenen Resultaten unmöglich [URWIN UND MAIDEN, 2003].

1.2.2 Genotypische Typisierungsmethoden

1.2.2.1 Ribotypisierung Bei der Ribotypisierung bedient man sich der Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII [DIJKSHOORN ET AL., 1993] oder ClaI und SalI, welche zuvor isolierte ribosomale DNA schneiden. Nach elektrophoretischer Auftrennung kommt es nach Zugabe von DNA-Abschnitten mit bekannter Basenabfolge zu komplementärer Basenpaarbindung. Die Methode kann nicht nur zu molekularepidemiologischen Untersuchungen eingesetzt werden, sondern kann auch zur Identifizierung von Acinetobacter-Spezies eingesetzt werden. Anders als die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE, siehe unten) ermöglicht sie auch die eindeutige Unterscheidung von Genospezies innerhalb des Acinetobacter calcoaceticus - A. baumannii Komplex [GERNER-SMIDT, 1992]. Obwohl es sich bei der Ribotypisierung um eine stabile und gut reproduzierbare Methode handelt und sie mehrmals zur Typisierung von Acinetobacter-Spezies innerhalb molekularepidemiologischer Studien eingesetzt wurde [NEMEC ET AL., 2004a, GRIFFITH ET AL., 2006], ist sie sehr arbeitsintensiv und verfügt nur über eine relativ geringe Diskriminierungsfähigkeit. Mittels anderer Methoden, wie beispielsweise PFGE, lassen sich exaktere Typisierungsergebnisse erzielen [SEIFERT UND GERNER-SMIDT, 1995, SILBERT ET AL., 2004]. Die Höhe des Arbeitsaufwandes

wurde

durch

die

Einführung

automatisierter

Ribotypisierungssysteme stark verringert. Zwar konnte gezeigt werden, dass deren in relativ kurzer Zeit erzielten Resultate durchaus mit per PFGE erzielten Ergebnissen vergleichbar sind, jedoch lässt der hohe Preis der Durchführung und der Geräte selbst in der Regel einen Einsatz im Routinelabor nicht zu [BRISSE ET AL., 2000, SILBERT ET AL., 2004, RHOMBERG ET AL., 2006]. 27

1.2.2.2 Plasmid-Typisierung Bei

Acinetobacter-Spezies

sind

Resistenzen

gegenüber

Antibiotika

und

Schwermetallen oftmals von eigenen Plasmiden verliehen [GERNER-SMIDT, 1989, DESHPANDE UND CHOPADE, 1994, SEWARD ET AL., 1998, POIREL UND NORDMANN, 2006]. Plasmide sind kleine, in der Regel ringförmige, autonom replizierende, doppelsträngige DNA-Moleküle, die extrachromosomal im Zytoplasma vorliegen. Aufgrund ihrer autonomen Replikation sind eine Vielzahl von Kopien in der Bakterienzelle vorhanden und können entweder während des Vermehrungsprozesses via Zellteilung oder aber mittels Konjugation zwischen Bakterienzellen ausgetauscht werden. Die unterschiedlichen Plasmidprofile innerhalb einer Spezies lassen sich zu Typisierungszwecken nutzen. Die Plasmid-Analyse ist eine der ältesten DNA-basierten Methoden zur molekularepidemiologischen Typisierung von A. baumannii Stämmen [HARTSTEIN ET AL., 1990, SEIFERT ET AL., 1994a, NEMEC ET AL., 1999]. Die Diskriminierungsfähigkeit der Methode ist für epidemiologische Zwecke sehr eingeschränkt [MARCOS ET AL., 1995], ihre Reproduzierbarkeit jedoch sehr gut. Aufgrund der Tatsache, dass nicht alle Organismen über Plasmide verfügen und diese einfach zwischen Bakterien übertragbar sind, ist die Plasmid-Typisierung nicht universell einsetzbar und ihre Ergebnisse schwierig zu interpretieren. Die PlasmidTypisierung gehört auch zu den wenigen Methoden, die zur Untersuchung der Epidemiologie von anderen Acinetobacter-Spezies außer A. baumannii eingesetzt wurde [SEIFERT ET AL., 1994c, SEIFERT ET AL., 1994d, SEIFERT ET AL., 1997]. Mittlerweile wurde die Plasmidtypisierung für epidemiologische Studien zugunsten von anderen genotypischen Typisierungsmethoden verlassen.

1.2.2.3 DNA-DNA-Hybridisierung Ein DNA-Doppelstrang wird physiologisch mittels Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten. Bei der DNA-DNA-Hybridisierung wird die Doppelstrang-DNA zweier Organismen mittels hoher Temperatur denaturiert. Die daraufhin entstehenden Einzelstränge lagern sich bei Abkühlung erneut zusammen, sowohl in ihre ursprüngliche Konfiguration, als auch in Konfiguration mit einem Partnerstrang des jeweils anderen Organismus (Hybride). Je höher die Verwandtschaft zwischen zwei untersuchten Organismen ist, desto stärker ist die Hybridisierung. Diese kann photometrisch, mittels Radioaktivität oder Fluoreszenz gemessen werden. 28

Die Methode der DNA-DNA-Hybridisierung wurde benutzt um erste Unterteilungen von Acinetobacter in Genospezies vorzunehmen [BOUVET UND GRIMONT, 1986, TJERNBERG

UND

URSING,

1989].

Sie

ist

eine

Standard-Methode

zur

Spezieseinteilung und wird weiterhin bei der Kontrolle von Typisierungsmethoden angewandt [WIEDMANN-AL-AHMAD ET AL., 1994, YAMAMOTO ET AL., 1999a].

1.2.2.4 Pulsfeld-Gelelektrophorese Die Pulsfeld-Gelelektrophorese vermag es wie eine Gleichstrom-Gelelektrophorese DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen. Da sich in einer GleichstromElektrophorese nur kleine DNA-Stücke sehr gut auftrennen lassen und größere eine gleiche, geringe Mobilität zeigen, entwickelten Schwartz und Cantor 1984 die PFGE zur besseren Auftrennung großer DNA-Stücke [SCHWARTZ UND CANTOR, 1984]. Hierbei wird der Strom, welcher die Moleküle zum Wandern anregt, in zeitlich variierenden Impulsen abwechselnd aus unterschiedlichen Winkeln zur eigentlichen Laufrichtung appliziert. Somit orientieren sich die Moleküle im elektrischen Feld alternierend neu und bewegen sich gleichsam in Schlangenlinien vorwärts. Dies unterstützt besonders die Wanderung großer Moleküle, was eine Auftrennung von Molekülen bis zu einer Größe von 10 Mb ermöglicht. Die PFGE stellt den Goldstandard im Bereich der epidemiologischen Untersuchung von Acinetobacter-Spezies dar [SEIFERT ET AL., 2005]. Der Vorteil dieser Methode besteht in der ausgesprochen hohen Diskriminierungsfähigkeit im Vergleich mit anderen Typisierungstechniken, wie in mehreren Studien gezeigt wurde [SELTMANN ET AL., 1995, SILBERT ET AL., 2004]. Für groß angelegte longitudinale epidemiologische Untersuchungen und Populationsstudien ist die PFGE jedoch zu diskriminativ – hier können neuere Methoden wie MLST oder PCR/ESI-MS aussagekräftigere Resultate erzeugen. Leider zeigt sich die Methode sehr empfindlich und störanfällig, was von der Beeinflussung

multipler

Variablen,

wie

etwa

Agaroseanteil

des

Gels,

Pufferzusammensetzung, Temperatur, Winkel zwischen den Spannungsfeldern, Zeit, Dauer und Spannungsstärke der Impulse, ausgeht. Insgesamt handelt es sich um eine sehr arbeitsintensive Methode, bei der die Zeit bis zum Erreichen eines Resultats zwischen 48 und 96 Stunden liegt. Früher stellte die Reproduzierbarkeit der Methode ein großes Problem dar, was jedoch durch den Einsatz von standardisierten Protokollen überwunden werden konnte und einen Resultatvergleich 29

aus unterschiedlichen Laboratorien ermöglicht [SEIFERT ET AL., 2005]. Anders als andere Methoden, wie beispielsweise die Ribotypisierung, ist mittels PFGE keine Identifizierung auf Speziesebene möglich [SEIFERT UND GERNER-SMIDT, 1995].

1.2.2.5 Random amplification of polymorphic DNA (RAPD)-PCR Die RAPD-PCR ist eine modifizierte Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und wurde 1990 von Williams et al entwickelt [WILLIAMS ET AL., 1990]. Bei dieser Methode werden kurze, bis zu zehn Nukleotide lange Primer genutzt, die bei sehr niedriger Annealingtemperatur zufällig an unbekannte Sequenzabschnitte in der genomischen DNA binden. Das Muster aus den entstehenden, unterschiedlich langen DNA-Fragmenten ist – stets gleichbleibende Versuchsbedingungen vorausgesetzt – für Isolate eines Stammes immer gleich. Unterschiede im Muster werden für die Typisierung genutzt. Eine Sequenzierung der erhaltenen Fragmente ist nicht erforderlich. Carr et al zeigten in einer Typisierungsstudie von Acinetobacter-Isolaten [CARR ET AL., 2001], dass die RAPD-PCR über eine relativ hohe Diskriminierungsfähig besitzt, obwohl einige Jahre zuvor Wiedemann-Al-Ahmed et al bei der Untersuchung nichtklinischer Acinetobacter-Spezies eine hohe Variabilität sowohl zwischen, als auch innerhalb der Spezies beobachteten [WIEDMANN-AL-AHMAD ET AL., 1994]. Vergleichend betrachtet ist die Diskriminierungsfähigkeit der RAPD-PCT schwächer als die der PFGE. Wie ebendiese kann die RAPD-PCR nicht zu Speziesidentifikation eingesetzt werden. Die Methode ist schnell, kostengünstig und relativ einfach um die Verwandtschaft zwischen Acinetobacter-Stämmen zu beurteilen [GRASER ET AL., 1993], zeigt jedoch

auch

Schwächen,

was

Empfindlichkeit

bei

DNA-

&

Primerkonzentrationsschwankungen, Art der verwendeten DNA-Polymerase und Gelelektrophorese angeht [KOELEMAN ET AL., 1998]. Dies schränkt die Reproduzierbarkeit der Methode deutlich ein. Zwar wurde in einer Studie die Reproduzierbarkeit zwischen unterschiedlichen Laboren mittels der Benutzung eines hochgradig standardisierten Protokolls gezeigt [GRUNDMANN ET AL., 1997], dies konnte jedoch in Folgestudien nicht mehr bestätigt werden. Insgesamt eignet sich die RAPD-PCR

sehr

gut

für

eine

schnelle

Einschätzung

im

Rahmen

eines

epidemiologischen Ausbruchs [WISPLINGHOFF ET AL., 2000, WROBLEWSKA ET AL., 2004], ist jedoch für groß angelegte epidemiologische Studien nicht geeignet. 30

1.2.2.6 Repetetive extragenic palindromic PCR-Fingerprinting Eine andere PCR-basierte Methode stellt das Repetitive extragenic palindromic (REP)-PCR

Fingerprinting

dar,

welches

bereits

für

eine

Vielzahl

von

unterschiedlichen Bakterien – hierunter auch A. baumannii [SNELLING ET AL., 1996, BOU ET AL., 2000, HIGGINS ET AL., 2010] – verwendet worden ist. Sie beruht auf der Amplifikation von hochgradig konservierten, sich wiederholenden extragenetischen palindromischen Sequenzen, ist einfach, kostengünstig und liegt mit der Diskriminierungsfähigkeit gleichauf mit anderen PCR-basierten Methoden [SAEED ET AL., 2006, FONTANA ET AL., 2008]. Mehrere Studien zur Untersuchung der Molekularepidemiologie von A. baumannii wurden bereits dieser Methode durchgeführt, einschließlich zur Differenzierung zwischen dem multiresistenten paneuropäischen A. baumannii Klon III [VAN DESSEL ET AL., 2004] und den europäischen Klonen I und II [DIJKSHOORN ET AL., 1996, HUYS ET AL., 2005]. Higgins et al nutzten 2010 die Methode zur Identifizierung der Abstammung von acht weltweiten Carbapenem-resistenten Klonen [HIGGINS ET AL., 2010].

1.2.2.7 Amplified fragment-length polymorphism (AFLP) Bei der AFLP handelt es sich ebenfalls um eine PCR-gestützte Methode bei der aufgereinigte

DNA

mittels

zweier

Restriktionsenzyme

mit

unterschiedlicher

Schnittstellenhäufigkeit in unzählige Fragmente zerteilt wird. Entstehende Fragmente besitzen unterschiedliche lange Enden („sticky-ends“), an welche Adapter – an Schnittstellen passende, teils doppelsträngige DNA-Moleküle mit bekannter Sequenz – angebracht werden, so dass ein Produkt aus geschnittenem, unbekanntem DNAMolekül und Adapter an jedem Ende entsteht. Bei einer nun durchgeführten ersten PCR verwendet man Primer, welche aus zum Adapter komplementären Basen, addiert um ein bis zwei weitere gewählte Basen, bestehen und nur dann eine Komplettierung des DNA-Stranges zulassen, wenn die addierten Basen zum unbekannten, geschnittenen DNA-Molekül komplementär sind. Da somit nicht alle von den Restriktionsenzymen geschaffenen Fragmente amplifiziert werden, kommt es zu einer gewünschten deutlichen Verringerung der Fragmentanzahl. Diese korreliert mit der Anzahl der addierten Basen. In einer zweiten PCR, in der eine weitere Reduktion der Fragmente erfolgt, sind die Primer mittels Fluoreszenzfarbstoff oder Radioaktivität markiert und können somit, nach Auftrennung mittels Gelelektrophorese, eine 31

Detektion der Fragmente als genetischen Fingerabdruck ermöglichen. Auftretende Mutationen lassen sowohl neue Schnittstellen für Restriktionsenzme entstehen, als auch verschwinden. Von Vos et al 1995 in den Niederlanden und Belgien entwickelt [VOS ET AL., 1995], wurde sie in den darauffolgenden Jahren speziell für die Charakterisierung von Acinetobacter-Spezies eingesetzt [DIJKSHOORN ET AL., 1996, JANSSEN UND DIJKSHOORN, 1996, JANSSEN ET AL., 1997, KOELEMAN ET AL., 1998, NEMEC ET AL., 2001]. Die AFLP wurde sowohl erfolgreich im Bereich der bakteriellen Taxonomie,

als

auch

zur

Differenzierung

von

Acinetobacter-Stämmen

im

Subspeziesbereich oder in Untersuchungen zu klinischen Ausbrüchen benutzt [JANSSEN UND DIJKSHOORN, 1996, VAN DESSEL ET AL., 2004, WROBLEWSKA ET AL., 2004, DOBREWSKI ET AL., 2006, KULAH ET AL., 2010]. Auch die Studien zur Existenz von klonalen A. baumannii in Europa, den Klonen I, II und III basierten auf AFLP-Daten [NEMEC ET AL., 2004a, NEMEC ET AL., 2004b, VAN DESSEL ET AL., 2004]. Insgesamt handelt es sich bei der AFLP um eine relativ robuste und sehr sensitive Methode, deren Ergebnisse mit den mittels PFGE erzielten Resultaten große Ähnlichkeit aufweisen, obwohl ein detaillierter direkter Vergleich nie durchgeführt wurde [D'AGATA ET AL., 2001, SILBERT ET AL., 2004, VAN DESSEL ET AL., 2004]. Für gewöhnlich erfolgt die Durchführung der AFLP halb-automatisch mittels LaserDetektion der produzierten Fragmente. Aufgrund des hohen, komplexen Aufwands und der hohen Kosten, ist die Methode nur in wenigen Laboren durchführbar und nicht für Routineuntersuchungen geeignet. Zwar sind Vergleiche von AFLPErgebnissen zwischen unterschiedlichen Experimenten oder Laboren prinzipiell möglich, es muss jedoch ein hohes Maß an Standardisierung, wie beispielsweise die Verwendung derselben Sequenzierungsplattform, vorausgesetzt sein um eine ausreichende Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Mittels eines geschaffenen Protokolls zur Standardisierung der Methode wurde 2000 eine Datenbank für AFLPResultate geschaffen. Dennoch bleibt die Interpretation der entstehenden AFLPBandenmuster, trotz Verfügbarkeit und Einsatz von computergestützten Analysen, herausfordernd und erfordert große Erfahrung.

32

1.2.2.8 Infrequent Restriction Site PCR (IRS-PCR) Die Methode der IRS-PCR ist der AFLP sehr ähnlich. Wie die AFLP bedient sie sich des Schneidens der zu untersuchenden DNA, des Anbringens von bekannten Oligonukleotid-Adaptern,

selektiver

Amplifikation

mittels

PCR

und

dem

anschließenden Auftrennen der markierten Fragmente mittels Gelelektrophorese. Von Mazurek et al 1996 beschrieben, teilen die bei der IRS-PCR eingesetzten Restriktionsenzyme die DNA nur sehr selten („infrequent“), was in weniger Fragmenten und somit weniger Zeit bis zum Ergebnis resultiert [MAZUREK ET AL., 1996]. Yoo et al wandten die Methode erfolgreich zur Untersuchung eines Acinetobacter-Ausbruchs

an

[YOO

ET

AL.,

1999].

Neben

der

hohen

Diskriminierungsfähigkeit der Methode – es zeigte sich eine hohe Übereinstimmung mit Ergebnissen, welche via Field-Inversion Gelelektrophorese (FIGE), eine Variante der PFGE, generiert worden waren – wurde besonders Schnelligkeit der Methode hervorgehoben.

1.2.2.9 Multilocus Sequence Typing (MLST) Die Multilocus Sequenztypisierung (MLST) ist eine weitere PCR basierte Methode, die 1998 von Maiden et al für die Untersuchung von Neisseria meningitidis entwickelt wurde [MAIDEN ET AL., 1998]. Sie basiert auf der Idee der MLEE (siehe oben). Anstatt über die Analyse der Enzyme der zu untersuchenden Isolate eine Typisierung vorzunehmen, untersucht die MLST direkt einzelne Nuklidsequenzen von einer begrenzten Anzahl sogenannter Housekeeping-Gene. Inzwischen wurden von einer Vielzahl von Erregern MLST-Schemata entwickelt, darunter bekannte Bakterien und Pilze, wie S. pneumoniae [ENRIGHT UND SPRATT, 1998], S. aureus [ENRIGHT ET AL., 2000], S. pyogenes [ENRIGHT ET AL., 2001], C. jejuni [DINGLE ET AL., 2001], C. albicans [BOUGNOUX ET AL., 2002], E. faecium [HOMAN ET AL., 2002], Streptococcus suis [KING ET AL., 2002], Bordetella pertussis [VAN LOO ET AL., 2002], Salmonella spp. [KOTETISHVILI ET AL., 2002], S. agalactiae [JONES ET AL., 2003], Burkholderia pseudomallei [GODOY ET AL., 2003], V. cholerae [KOTETISHVILI ET AL., 2003], E. coli [NOLLER ET AL., 2003], H. influenzae [MEATS ET AL., 2003], Listeria monocytogenes [SALCEDO ET AL., 2003], S. epidermidis [WANG ET AL., 2003], H. pylori [WIRTH ET AL., 2004], P. aeruginosa [CURRAN ET AL., 2004], B. cepacia [BALDWIN ET AL., 2005] und C. difficile [GRIFFITHS ET AL., 2010]. Bereits 2005 entwickelte die Arbeitsgruppe um Bartual in 33

Zusammenarbeit mit unserem Labor ein Schema für A. baumannii [BARTUAL ET AL., 2005]. Dieses Schema diente auch als Vorlage für diese Untersuchung zur Typisierung klinischer Acinetobacter-Isolate aus den vereinigten Staaten.

Die MLST nutzt die PCR-basierte Amplifikation und konsekutive Sequenzierung von 400-500 kb langen internen Fragmenten von in der Regel sieben sogenannter „Housekeeping“ Gene. Hierbei handelt es sich um Gene, die aufgrund ihrer essentiellen Funktion bei Stoffwechselvorgängen in jedem Isolat der untersuchten Gattung vorhanden sind und in Folge dessen einem niedrigen Selektionsdruck unterliegen. Weisen so analysierte Stämme dasselbe Sequenzprofil bei der Sequenzierung der sieben Housekeeping Gene auf, gehören sie einem gemeinsamen Sequenztyp (ST) an. Alle Isolate, die entweder den gleichen Sequenztyp haben, oder sich in lediglich in der Sequenz eines Gens unterscheiden – sogenannte „Single variants“ – gehören zu einem Klon. Alle STs, die mindestens vier gemeinsame Loci teilen, werden zu einem klonalen

Komplex

(Clonal

complex)

zusammengefasst.

Um

die

weiteren

Verwandtschaftverhältnisse zu analysieren, bedient man sich dem BURST (Based upon related sequence types) Algorithmus. Dieser sucht zuerst Gruppen verwandter Genotypen

der

untersuchten

Population,

versucht

anschließend

die

zugrundeliegenden Sequenztypen jeder Gruppe zu identifizieren und versucht diese schließlich miteinander in Beziehung zu setzen. Zu besseren grafischen Darstellung der

mittels

Algorithmus

berechneten

Daten

wurde

2004

in

Form

des

Computerprogrammes eBURST von Feil et al entwickelt [FEIL ET AL., 2004]. Seit Februar 2006 ist die Version 3.0 aktuell (http://eburst.mlst.net/). Ähnlich der MLEE kann die MLST zwischen einer hohen Anzahl an Genotypen unterscheiden, benutzt hierzu jedoch genetische Variationen, die sich sehr langsam entwickeln. So sind mittels MLST selbst geringe Veränderungen im genetischen Code, wie etwa Punktmutationen in der Sequenzierung erkennbar, welche in der Gelelektrophorese der MLEE keine Änderung im Laufverhalten des codierten Produktes zeigen würde. Dieser Umstand erhöht die Diskriminierungsfähigkeit der MLST

gegenüber

ihrer

Vorgängertechnik

immens.

Die

Verbindung

aus

diskriminatorischer Stärke und klonaler Stabilität schaffen eine hohe Effektivität im Bereich der globalen epidemiologischen Untersuchungen [ENRIGHT UND SPRATT, 1998]. Die gegebene objektive Vergleichsmöglichkeit der Sequenzierung von festgelegten Genen, schafft eine sehr hohe Reproduzierbarkeit [URWIN UND 34

MAIDEN, 2003]. Die besondere Stärke der MLST gegenüber anderen Typisierungsmethoden liegt jedoch eindeutig in ihrer Portabilität. Erstmals wurde durch die Schaffung einer globalen, internetbasierten Datenbank (http://ww.mlst.net) die Möglichkeit gegeben, Daten von weltweiten Isolaten abzurufen, Sequenzen zu vergleichen und eigene Daten hinzuzufügen [CHAN ET AL., 2001]. Dies ermöglichte die Durchführung globaler epidemiologischer Studien. Die ursprüngliche Datenbank von N. meningitidis (http://pubmlst.org/neisseria) enthielt 2003 die Daten von fast 4000 Isolaten aus über 60 Ländern, welche in einem Zeitraum von 80 Jahren gesammelt wurden [URWIN UND MAIDEN, 2003]. Ebendiese Datenbank enthält im Januar 2012 fast 19.000 Isolate und über 9000 Sequenztypen. Aktuelle Daten der Isolate von A. baumannii unter http://pubmlst.org/abaumannii zu finden. Im August 2012 enthält die Datenbank zu A. baumannii 630 Isolate und über 400

Sequenztypen.

Stetiges

Anwachsen

des

Datenumfangs

ermöglichen

epidemiologische Studien in weltweitem Ausmaß. Die Nachteile der Methode bestehen besonders im hohen Arbeits- und Zeitaufwand, sowie den Kosten, welche die MLST für Routineuntersuchungen disqualifiziert.

1.2.2.10 PCR/Electrospray Ionization Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS) Die PCR/Electrospray Ionization Mass Spectrometry (PCR/ESI-MS) benutzt wie die MLST eine Multilocus-PCR, benötigt jedoch keine Sequenzierung der untersuchten Housekeeping-Gene. Bei der verwendeten Elektrosprayionisation (ESI) wird die Analytlösung – in diesem Fall das zu untersuchende amplifizierte Gen - durch eine Metallkapillare geleitet, an deren Spitze eine Spannung angelegt ist. Durch die Spannung kommt es zur Bildung eines elektrischen Feldes zwischen der Kapillare und einer Gegenelektrode. Das elektrische Feld durchdringt die Analytlösung und die in ihr befindlichen Ionen bewegen sich elektrophoretisch auf die Gegenelektrode zu. Hierbei bildet sich an der Spitze der Kapillare ein Überschuss gleichartig geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und über die Bildung eines Taylor-Kegels als feines Aerosol aus der Metallkapillare austreten. Die dabei entstehenden Ionen werden anschließend im Massenspektrometer (MS) analysiert [BUDZIKIEWICZ, 1998]. Im Jahr 2006 veröffentlichten Ecker et al ein Schema unter Verwendung von sechs Housekeeping-Genen (adk, efp, fumC, mutY, ppa und trpE) zur Untersuchung der Populationsstruktur von 267 A. baumannii-Isolaten mittels PCR/ESI-MS [ECKER ET 35

AL., 2006]. Hierbei zeigte sich nicht nur die Möglichkeit der Typisierung und der Identifizierung von A. baumannii (inklusiver Abgrenzung gegenüber Acinetobacter Genospezies 3 und Acinetobacter Genospezies 13TU), sondern auch die Geschwindigkeit der Methode: Erste Ergebnisse lagen bereits nach vier Stunden vor. Vor kurzem konnten Schuetz et al bei der Untersuchung eines AcinetobacterAusbruchs auf eine Verbrennungsintensivstation zeigen, dass Resultate, welche mittels PFGE und PCR/ESI-MS erzeugt wurden, stark miteinander korrelierten [SCHUETZ ET AL., 2012].

1.3

Typisierung von A. baumannii

Aufgrund

der Zunahme

der klinischen

Bedeutung als

Infektionserreger im

nosokomialen Bereich in den letzten Jahrzehnten, folgte ein gesteigertes Interesse an der Epidemiologie dieser Gattung und besonders der Spezies A. baumannii. Mit unterschiedlichen phänotypischen und genotypischen Methoden wurde bereits versucht,

Ausbreitung

und

Transmissionswege

von

Infektionsausbrüchen

zu

analysieren und zu verstehen.

Zur Identifizierung der exakten Spezies wurden genotypische Methoden wie Ribotypisierung [GERNER-SMIDT, 1992, SEIFERT UND GERNER-SMIDT, 1995, BRISSE ET AL., 2000], Plasmid-Typisierung [SEIFERT ET AL., 1994a] und AFLP [DIJKSHOORN ET AL., 1996, JANSSEN UND DIJKSHOORN, 1996, KOELEMAN ET AL., 1998] eingesetzt, die auch eine Identifizierung auf Subspezies-Ebene zulassen. Andere Methoden, wie etwa die Pulsfeld-Gelelektrophorese, lassen zwar einen genomischen

Vergleich

zwischen

einzelnen

Isolaten

zu,

jedoch

keinerlei

speziesspezifischen Informationen [SEIFERT UND GERNER-SMIDT, 1995] [BOU ET AL., 2000]. Trotz ihrer geringeren Diskriminierungsfähigkeit und Reproduzierbarkeit, wie etwa bei der RAPD-PCR, sind PCR-basierte Methoden einfacher und kostengünstiger durchzuführen [GRUNDMANN ET AL., 1997, KOELEMAN ET AL., 1998].

Die MLST ist eine robuste und sehr gut reproduzierbare Methode, welche bei vielen unterschiedlichen Bakteriengattungen Einblicke in die Populationsstruktur erlaubt. Die darüber hinaus gute Portierbarkeit und Verfügbarkeit einer internetbasierten Datenbank, vergrößert das Wissen über die Populationsstrukturen stetig. Als 36

Referenz gilt für die MLST bei Acinetobacter weiterhin das 2005 von Bartual et al entwickelte Schema mit den Housekeeping-Genen gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi und rpoD [BARTUAL ET AL., 2005]. Ursprünglich waren zehn metabolische Gene ausgewählt und sequenziert worden von denen schließlich sieben für die Typisierung ausgesucht wurden. Die gewählten Gene produzierten bei Sequenzierung nur ein einziges Amplifikat und die Anzahl der unterschiedlichen Gene wurde als ausreichend diskriminativ angesehen. Abbildung 1 zeigt schematisch die Anordnung der ausgewählten Gene auf der Acinetobacter DNA ADP1. Unterstrichene Gene flossen das verwendete MLST-Schema ein. Das MLST-Schema basiert auf den Sequenzen von Fragmenten der sieben Housekeeping-Gene: Citrat-Synthase (gltA), DNA-Gyrase Untereinheit B (gyrB), Glukose Dehydrogenase B (gdhB), Homologer Rekombinationsfaktor A (recA), 60kDa Chaperon (cpn60), Glukose-6-Phosphatisomerase (gpi), sowie der RNA Polymerase-Faktor Sigma-70 (rpoD). Die Etablierung wurde damals mit 40 klinischen Acinetobacter-Isolaten aus spanischen, deutschen und anderen europäischen Krankenhäusern, sowie einigen Referenzstämmen vorgenommen, heute enthält die Datenbank 561 Sequenzen und 385 Profilen (http://pubmlst.org/abaumannii/). Ein weiteres MLST-Schema wurde von Diancourt et al 2010 publiziert. Dieses benutzt neben den aus dem Schema von Bartual et al bekannten Housekeeping-Genen gltA, cpn60 und recA, die vier Gene fusA, pyrG, rplB und rpoB [DIANCOURT ET AL., 2010]. In dieser Arbeit wurden insgesamt 173 klinische A. baumannii-Isolate aus 52 Krankenhäusern

der

vereinigten

Staaten

mittels

MLST

typisiert

und

ihre

Epidemiologie analysiert. Die Isolate waren im Rahmen des prospektiven „Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiologic Importance“ (SCOPE) Projektes gesammelt worden.

37

2

Material und Methoden

2.1

Geräte und Materialien

Die in dieser Arbeit verwendeten Materialien und Geräte sind in Tabelle 4 aufgeführt. Gerät / Material Brutschrank

Bezeichnung

Firma

B6200

Ort

Heraeus

Hanau

Pharmacia

Uppsala,

Biotech

Schweden

Sartorius

Göttingen

Bio-Rad

Hercules, USA

Schott

Mainz

Eppendorf

Wesseling

Sarstedt

Nümbrecht

Ikamag Rec-G

Janke & Kunkel

Staufen

PCR-Platten

96-well PCR-Platte

MWG-Biotech

Ebersberg

PCR-Tubes

MicroAmp

Applied

Foster City, USA

Elektrophoresekammern

Präzisionswaage Gel-

GelDok 2000

Glaskolben / -flaschen Heizblöcke

Thermomixer Comfort

Impfschlingen MagnetrührerHeizplatten

Biosystems pH-Meter

PH 526 MultiCal

WTW

Weilheim

Pipetten

Labsystems

Eppendorf

0,5ml, 1,0ml und 1,5ml

Sarstedt

Nümbrecht

Brand

Wertheim

heipha Dr. Müller

Eppelheim

Amersham

Piscataway, USA

Reaktionsgefäße Reaktionsgefäßständer

Plastibrand

Schafsblutagarplatten Spannungsquelle

EPS 3500

Biosciences Inc. Thermocycler

GeneAmp 9600

Perkin Elmer

Waltham, USA

Schüttler

Vortex-Genie 2

Scientific

New York, USA

Industries Zentrifugen

Biofuge pico

Heraeus

Mini-Centrifuge C- National Labnet 1200

38

Hanau Woodbridge, USA

2.2

Medien

Agarose-Gel-Elektrophorese Agarose SeaKem ME Agarose (Cambrex, USA) Ethidiumbromid Gel-Loading-Solution -

0,05% Bromphenolblau

-

40% Saccharose

-

0,1M EDTA

-

0,5% SDS

PCR / Sequenzierung HPLC-Wasser DNA 100bp-Ladder Katalog-Nr. N3231S (New England Biolabs, Ipswich, USA) Master Mix Taq PCR Master Mix Kit Art.-Nr. 1054464 (Qiagen, Hilden) Primer siehe 3 Puffer 10%iger TBE-Puffer -

108g Tris (45mM)

-

55g Borsäure

-

7,44g EDTA (1mM)

-

1000ml destilliertes Wasser

1%iger TBE-Puffer pH 8,3

2.3

Primer

Die in dieser Arbeit verwendeten Primer sind in Tabelle 5 aufgeführt und umfassen 1725 Basenpaare. Alle Primer entstammen der Arbeit von Bartual et al. 2005. Für rpoD wurde ein alternativer Primer gewählt, da dieser ein besseres Amplifikat zeigte.

Alle Oligonukleotidprimer wurden von der Firma Operon Biotechnologies Inc. Köln synthetisiert und wurden mit HPLC-Wasser auf eine Konzentration von 100mM verdünnt. Von dieser Basislösung wurden 50µl in separate Eppendorfgefäße pipettiert und auf die Arbeitskonzentration von 50mM verdünnt. Nach Verbrauch der Lösung in Arbeitskonzentration konnte neue aus der Basislösung hergestellt werden, was eine Verunreinigung der Basislösung minimierte. Ebenso konnte die Anzahl der 39

Tauvorgänge vermindert werden, da alle Primerlösungen im Gefrierschrank bei -20C gelagert wurden.

Abbildung 1: Lokalisierung der zum MLST-Schema benutzten Gene

40

Tabelle 5 – MLST Primer

gltA

Lokus

Glukose Dehydrogenase B (vorwärts)

DNA-Gyrase Untereinheit B (rückwärts)

DNA-Gyrase Untereinheit B (vorwärts)

Citrat-Synthase (rückwärts)

Citrat-Synthase (vorwärts)

Produkt

5’-GTTGAGTTGGCGTATGTTGTGC-3’

5’-GCTACTTTTATGCAACAGAGCC-3’

5’-GCTGGGTCTTTTTCCTGACA-3’

5’-TGAAGGCGGCTTATCTGAGT-3’

5’-GCAGAGATACCAGCAGAGATACACG-3’

5’-AATTTACAGTGGCACATTAGGTCCC-3’

Sequenz

gdhB

5’-ACTGTACTTGCTCAAGC-3’

alternativer Primer gewählt, da dieser ein besseres Amplifikat zeigte.

Größe [bp] 680

560

775

Chaperon 60 kDa (vorwärts)

5’-TTCAGCGATGATAAGAAGTGG-3’

425

Chaperon 60 kDa (rückwärts)

5’-AATACCGTGGTGCTACGGG-3’

41

gyrB

Glukose Dehydrogenase B (rückwärts)

5’-CCTGAATCTTCYGGTAAAAC-3’

Glukose-6-Phosphat Isomerase (vorwärts)

5’-AACTTGATTTTCAGGAGC-3’

492

479

Glukose-6-Phosphat Isomerase (rückwärts)

5’-TGTTAACCCGTGAAGGTGAA-3’

630

508

RNA Polymerasefaktor Sigma-70 (vorwärts)

5’-CTGAAATCAAGGCTCACTTGG-3’

Homologer Rekombinationsfaktor A (rückwärts) 5’-GTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC-3’

Homologer Rekombinationsfaktor A (vorwärts)

recA

cpn60

gpi

rpoD

RNA Polymerasefaktor Sigma-70 (rückwärts)

Alle Primer entstammen der Arbeit von Bartual et al. 2005. Für rpoD wurde ein

2.4

Bakterienstämme

Die untersuchten Acinetobacter-Stämme waren im Rahmen des SCOPE-Projekt (Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance) einer prospektiven landesweiten Multizenterstudie zu nosokomialen Sepsis-Erregern in den USA gesammelt worden [WISPLINGHOFF ET AL., 2004], in einem siebenjährigen Zeitraum

von 1995 bis 2002 isoliert und bei -80 C eingefroren

worden. Alle Isolate, die in dieser Arbeit typisiert wurden, stammten aus Krankenhäusern in den vereinigten Staaten.

Die Speziesidentifikation der verwendeten Isolate ist im Rahmen andere Projekte mit Hilfe

des

Transformationsassays

von

Juni

(Gattungsebene)

und

des

Identifikationsschemas von Bouvet und Grimont (Speziesebene) bestätigt worden. Anschließend wurden die Ergebnisse mittels ARDRA validiert.

2.5

Multilocus Sequence Typing (MLST)

Bei der MLST werden Sequenzen einzelner Gene unterschiedlicher Stämme miteinander verglichen. Hierzu muss die DNA der Bakterien extrahiert werden um anschließend amplifizieren

die zu

entsprechenden können.

Die

Gene

mittels

amplifizierten

ihrer

Fragmente

spezifischen der

Gene

Primer werden

anschließend sequenziert und können über die Datenbank im Internet unter http://pubmlst.org mit bereits vorhandenen Sequenzen verglichen werden.

Neue

Sequenztypen werden der Datenbank hinzugefügt. Das Protokoll der MLST entstammt aus der Arbeit von Bartual et al. aus dem Jahr 2005. Die benutzten Primer sind in Tabelle 5 angegeben.

2.5.1 DNA-Extraktion Die Bakterienstämme wurden nach dem Auftauen 2x auf Schafsblutagar subkultivert (Bebrütung je 18-24 Stunden bei 36+-1°C). Von der zweiten Subkultur wurden 2-3 morphologisch ähnliche Kolonien mit einer sterilen 1-Mikroliter-Einmalöse in 100µl HPLC-Wasser in einem 1,5ml Eppendorfgefäß in Suspension gebracht. Diese wurde dann 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 95 °C in einem Thermoblock erhitzt. Dies führte zur Zerstörung der Bakterienstruktur, sowie zum Freilegen der benötigten DNA. Danach wurde das Eppendorfgefäß zum Abkühlen für zwei Minuten auf Eis 42

gelegt und anschließend eine Minute bei 13000 Umdrehungen/Min zentrifugiert. Der dadurch auftretende Überstand (ca. 70µl) wurde vorsichtig abpippetiert, so dass die Pipettenspitze nicht die festen Bestandteile am Boden des Eppendorfgefäßes berührte, und als DNA für die MLST benutzt werden. Das abgesetzte Material stellte die überbleibenden Reste der Bakterienkulturen, wie Zellwand und Organellen dar und wurde verworfen. Die gewonnene DNA im Überstand wurde bei -20 °C zur weiteren Verwendung eingefroren.

2.5.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

2.5.2.1 Prinzip Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR=Polymerase-Chain-Reaction) handelt es sich um ein Verfahren mit dem DNA in definierten Zyklen exponentiell vervielfältigt werden kann. Man nutzt dazu die Fähigkeit der DNA-Polymerase des thermostabilen Bakteriums Thermophilus aquaticus (Taq), auch bei hohen Temperaturen, die zunächst ermöglicht werden müssen um ein Auftrennen der DNA-Stränge voneinander zu erreichen, nicht zu zerfallen und Einzelstrang-DNA mit Nukleotiden wieder bei abgesenkten Temperaturen zu komplettieren. Im ersten Schritt bei 94°C denaturieren die beiden komplementären DNA-Stränge. In einem zweiten Schritt wird die Temperatur auf 50-55°C abgesenkt, so dass sich nun die Oligonukleotidprimer an die DNA-Einzelstränge anlagern. Hierbei gilt: Je niedriger die Temperatur zum Anlagern der Oligonukleotidprimer gewählt wird, desto einfacher, aber auch unspezifischer binden die Primer an die Einzelstränge der DNA. Die 3’Enden der Einzelstränge liegen sich beim Anlagern der Primer gegenüber. Wird nun in einem dritten Schritt die Temperatur auf 72°C angehoben, lagert sich die DNAPolymerase an die Oligonukleotidprimer und fügt an den 3’-Enden die im Überfluss befindlichen Nukleotide an. Diese drei Schritte lassen sich nun viele Male in gleicher Reihenfolge wiederholen, bis man die gewünschte Menge an DNA erreicht hat, wobei sich bei jedem Zyklus die Menge theoretisch verdoppelt. Tatsächlich jedoch wird die theoretische Menge nicht erreicht, wodurch mehr Zyklen benötigt werden um die gewünschte Anzahl an Kopien zu erhalten.

43

Da die PCR eine empfindliche Methode darstellt, können verschiedene Faktoren auf das

Ergebnis

der

Methode

Einfluss

nehmen.

So

können

zu

schnelle

Temperaturwechsel, zu hohe oder niedrige Temperaturen eine unvollständige Denaturierung

der

DNA-Doppelstränge

erwirken

oder

eine

schlechte

bzw.

zahlenmäßig zu geringe Primerbindung nach sich ziehen. Auch nur geringe Kontaminationen mit fremder DNA führen zu falsch-positiven Ergebnissen, da auch diese mit den Oligonukleotidprimern und der DNA-Polymerase nach dem beschriebenen Schema reagieren können.

2.5.2.2 Durchführung Für jeden Stamm wurde pro Housekeeping-Gen je ein 0,2 ml PCR-Gefäß bereitgestellt und die dazugehörige Menge Qiagen Master Mix (Qiagen, Hilden), der Primer des jeweilig zu untersuchenden Housekeeping-Gens und RNase-freies (Qiagen, Hilden) Wasser zugeführt. Die Primer lagen in einer Konzentration von 100 pmol/µl vor und wurden, ein Anteil forward-Primer, ein Anteil reverse-Primer mit 8 Teilen Wasser auf eine Konzentration von 10 pMol/µl vedünnt. Die einzelnen Bestandteile, die für die PCR benötigt wurden, befanden sich bis zur Benutzung bei -20°C im Eisfach und wurden bis zu ihrem Einsatz auf Eis gekühlt um ein vorzeitiges Einsetzen der katalytischen Funktionen der Enzyme zu verhindern. Für jedes Housekeeping-Gen wurde ein eigener Mastermix hergestellt, der die benötigten PCR-Bestandteile enthielt und dem vor dem Ablauf der PCR die jeweilige zu amplifizierende DNA hinzugefügt werden konnte. So erhielten alle Stämme bei der Amplifikation ihres jeweiligen Housekeeping-Gens die gleichen Bedingungen, so dass die

Wahrscheinlichkeit

unterschiedlicher

Ergebnisse

auf

Grund

von

Konzentrationsdifferenzen minimiert werden konnte.

Bei der MLST-PCR ergaben sich pro Ansatz folgende Mengen und Konzentrationen: •

25µl PCR Master Mix (Qiagen, Hilden)

•

23µl RNase-freies Aqua bidest (Operon, Köln)

•

1µl Primer (10 pmol/µl)

•

1µl DNA

Als PCR-Cycler kam das GeneAmp 9600 System der Firma Perkin-Elmer (Waltham, 44

Massachusetts, USA) zum Einsatz. Alle Proben durchliefen mit diesem System dasselbe Programm, welches in der Tabelle 6 eingesehen werden kann.

Tabelle 6 - PCR-Programm

1x |1 Zyklus |

30x

1x

Zeit

Temperatur

5 Minuten

95 C

Denaturierung

1 Minute

94 C

Denaturierung

1 Minute

52 C

Anlage der Primer

2 Minuten

72 C

Komplettierung der DNA-Stränge

2 Minuten

72 C

Komplettierung letzter Stränge

unbegrenzt

4C

Kühlung bis zur Herausnahme

Zum Schluss wurden die Proben auf 4°C abgekühlt und bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese

2.5.3.1 Prinzip Bei der Agarosegelelektrophorese handelt es sich um ein Verfahren um Proteine oder Nukleinsäuremoleküle der Größe nach aufzutrennen, oder auch sie an Hand ihrer Größe zu identifizieren. Man bedient sich hierbei eines aus dem Polysaccharid Agarose und dem TBE-Puffer hergestellten Gels. TBE ist das Akronym für die Reagenzien

aus

denen

der

Puffer

besteht:

TRIS,

Borsäure

und

Ethylendiamintetraacetet (EDTA). Wird Agarose in dem TBE-Puffer aufgekocht, bildet sich in dem beim Abkühlen entstehenden Gel ein Netzwerk aus Agarosepolymeren, das, je nach Höhe der Agarosekonzentration, weit- oder engmaschiger sein kann. Ein elektrisches Feld an den Enden des Gels zieht die negativ geladenen Nukleinsäuremoleküle durch die Gelmatrix, wobei sich kleinere oder kurzkettigere Moleküle schneller durch die Matrix bewegen können als große, längerkettige und so eine Auftrennung der Größe nach ermöglicht wird. Da man den Ablauf der Gelelektrophorese nicht mit bloßem Auge erkennen kann, wird den DNA-Proben ein Farbmarker hinzugefügt, der ebenfalls im elektrischen Feld wandert und somit die zurückgelegte Strecke anzeigen kann. 45

Um die gewanderten Nukleinsäuremoleküle sichtbar machen zu können, bedient man sich der Eigenschaft des Reagenz Ethidiumbromid an DNA gebunden im UVLicht seine Absorptionsspektrum zu ändern [LE PECQ UND PAOLETTI, 1966]. Ethidiumbromid gehört zu den Farbstoffen vom sogenannten Phenanthridin-Typ und interkaliert in die DNA. Somit leuchten die mit Hilfe des elektrischen Feldes im Gel gewanderten Nukleinsäurefragmente im UV-Licht fluoreszierend auf und können an Hand eines ebenfalls im Gel gelaufenen Molekulargewichtsmarkers ihrer Größe nach identifiziert werden.

2.5.3.2 Herstellung des Gels und Ablauf Für ein 1.5%iges Agarosegel wurden 1.5g Agarose abgewogen und mit 100ml 1%igem TBE-Puffer pH 8.3 gemischt. Dies wurde auf einer Ceranheizplatte vom Typ Ikamag Rec-G der Firma IKA GmbH & CO. KG (Staufen) zum Kochen gebracht, bis die Agarose sich vollständig gelöst hatte. Ein 3cm langes Rührfischchen, welches bei 500U/min rotierte, verhinderte das vorzeitige Setzen des Gels. Sobald das Gel soweit abgekühlt war, bis kein Dampf mehr entwich, wurden 7µl Ethidiumbromid hinzupippetiert und das Gel zum Erstarren in die Geleletrophoresekammer der Firma Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) gegossen. Zwei in das Gel gehängte 20erKämme hielten insgesamt 40 Fächer im Gel frei um nach dem Aushärten die Proben hineinzugeben. Das Gel wurde nun für 45 Minuten zum Aushärten in der Elektrophoresekammer belassen. Die Wartezeit wurde genutzt um je 8µl der amplifizierten Gene mit je 4µl des Farbmarkers Gel-Loading Solution zu versetzen. Das fertig ausgehärtete Gel wurde nun in eine mit 1%igem TBE-Puffer pH 8.3 gefüllte

zweite

Elektrophoresekammer

übertragen

und

der

100bp-

Molekulargewichtsmarker, sowie die mit Farbmarker vorbereiteten Proben in die, nach Entfernen der Kämme im Gel entstandenen, Taschen pipettiert. Das elektrische Feld zum Wandern der Proben wurde mit der EPS600 Electrophoresis Power Supply 2300 der Firma Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) erzeugt, die einen Gleichstrom von 100V bei 150mA lieferte. Nach einer Wanderungszeit von einer Stunde wurde die Elektrophorese gestoppt.

2.5.3.3 Dokumentation Das Gel wurde im Bio-Rad GelDoc System (Bio-Rad, Hercules, California, USA) mit 46

UV-Licht durchleuchtet. Der an das System angeschlossene PC konnte mit dem Programm BioRad Quantity One 4.1.1 Build 003 (Bio-Rad, Hercules, California, USA) das Bild der im GelDoc angebrachten Kamera aufnehmen, zur besseren Sichtbarkeit modifizieren und ausdrucken. Eine Probe galt als positiv, wenn nur eine, dünne fluoreszierende Bande zu sehen war, deren Größe der zu Erwartenden in der Tabelle 5 entsprach. Die positiven amplifizierten Proben konnten zum Sequenzieren zur Firma Qiagen nach Hilden geschickt werden. War keine Bande zu sehen, galt die Probe als negativ und eine Wiederholung der PCR des jeweiligen Gens war vorzunehmen. Dies galt ebenfalls, waren unterschiedlich weit gewanderte Banden in einer Laufstrecke zu sehen, was auf eine Kontamination der Probe oder Bindung an unerwünschte Sequenzen der DNA hindeutete.

2.5.4 Sequenzierung

2.5.4.1 Prinzip Bei der DNA-Sequenzierung geht es um die Entschlüsselung der Abfolge der Nukleotide in dem zu untersuchenden DNA-Strang. Hierbei bedient man sich der enzymatisch vermittelten Methode nach Sanger. Diese Methode nutzt, wie die oben beschriebene

PCR,

die

Fähigkeit

der

DNA-Polymerase,

Einzelstränge

zu

komplettieren. In einem Ansatz mit dem zu untersuchenden Strang, sowie Polymerase, Primer und Nukleotiden, werden einige Basen, von jedem Typ (ddCTP, ddGTP, ddATP, ddTTP) als Didesoxynukleotid hinzugefügt. Diese Basen sind mit einem, je Typ, unterschiedlichem Fluoreszenzfarbstoff markiert und besitzen keine Bindungsfähigkeit an ihrem 3’OH-Ende. Ein Einbau führt somit zu einem Kettenabbruch, wodurch in Folge dessen unterschiedliche lande DNA-Stränge entstehen, an deren Ende ein fluoreszierendes Didesoxynukleotid steht. Mittels Kapillarelektrophorese können die unterschiedlich langen Stränge aufgetrennt, mit einem Laser zum Fluoreszieren gebracht und anschließend mittels eines Detektors ausgewertet werden. Die unterschiedlichen Farben geben die Position der zugehörigen Base im Strang an.

2.5.4.2 Durchführung Die erhaltenen und mittels Agarosegelelektrophorese überprüften Amplifikate wurden 47

aufgereinigt und stammweise in Mikrotiterplatten im 96-well-Format überführt. Zusammen mit den verwendeten

Primern

wurden

diese

anschließend

zur

Sequenzierung versandt. Die Sequenzierung der PCR-Produkte wurde als Auftragsleistung von der Firma Qiagen Genomic Services, Hilden durchgeführt, die die Ergebnisse als Vorwärts- und Rückwärts-Sequenz im .ab1-Format übersandte. Die im PC mittels ContigExpress lesbaren Chromatogramme wurden auf Korrektheit überprüft und auf die richtige Länge zugeschnitten. Hierzu wurde ein bekanntes Allel des untersuchten Gens von der Homepage http://pubmlst.org/abaumannii/ als Vorlage benutzt. Konnten die Sequenzen aufgrund von Kürze oder Ungenauigkeiten nicht ausgewertet werden, wurden PCR, Gelelektrophorese und Sequenzierung wiederholt.

2.6

Auswertung

2.6.1 Programme zur Auswertung Zur Auswertung der MLST-Daten kamen die folgenden Computerprogramme zur Anwendung: •

Vector NTI Suite 10.3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

•

Contig Express (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

•

eBURST 3.0 (http://eburst.mlst.net)

•

Sequence Output 2.0.1 (http://www.mlst.net/misc/seqout.asp)

•

MEGA 2.1 (http://megasoftware.net)

2.6.2 Durchführung Die Analyse wurde mit dem Programm „Contig Express“ aus der Vector NTI Suite Version 10.3 der Firma Invitrogen (Carlsbad, California, USA) vorgenommen. Die geladenen Forward- und Reverse-Sequenzen wurden in das Programm eingelesen und mit einem bekannten Allel des zu untersuchenden Gens aus der MLSTDatenbank (http://pubmlst.org/abaumannii) verglichen. Das Allel aus der Datenbank diente in diesem Schritt lediglich dazu die korrekte Länge des sequenzierten Gens zu ermitteln und überzählige Basen aus der Analysesequenz zu entfernen. Anschließend wurden die Sequenzen auf Fehler überprüft und die schließlich entstandene Konsensussequenz in einer Tabelle gespeichert. Die fertigen Konsensussequenzen 48

konnten mit den bekannten Allelen der Datenbank verglichen werden um die entsprechenden Allelnummern zu ermitteln. War die ermittelte Sequenz noch nicht in der Datenbank vorhanden wurde eine neue Allelnummer vergeben. Schließlich erhielt jeder analysierte Stamm anhand seines Allels der sieben Genloci ein bestimmtes Allelprofil, den Sequenztyp. Die ermittelten Sequenzen eines jeden Isolates wurden mit den Sequenzen aller in der Datenbank befindlichen Stämme verglichen. Hierbei vergab man neuen Sequenzen fortlaufende Nummern. Selbst bei geringen Unterschieden, wie etwa einem einzelnen Nukleotid, wurden entsprechend der Vorgaben für MLST eine neue Allelnummer vergeben und der Datenbank hinzugefügt. Die Anzahl der unterschiedlichen Nukleotide zwischen zwei betrachteten Sequenzen ist aus der Nummerierung ebenso wenig ersichtlich, wie deren Position innerhalb der Sequenz. Mittels der Computerprogramme eBURST, Sequence Output und MEGA wurden sowohl die Sequenztypen, als auch ihre Korrelation untereinander untersucht und dargestellt.

2.6.3 Epidemiologische Auswertung Die mittels MLST erhobenen Daten wurden mit Hilfe des Programms eBURST, welches 2004 speziell für die Auswertung von MLST-Daten geschrieben wurde [FEIL ET AL., 2004], analysiert und so die Korrelation zwischen allen ermittelten Acinetobacter-Sequenztypen bestimmt. Zuerst wurde die direkte Beziehung der Sequenztypen herausgestellt, bei welcher, gemäß Definition des clonal complex, eine Übereinstimmung von mindestens sechs von sieben Allelen vorliegen muss. Anschließend erfolgte die Analyse der Populationsstruktur mittels einer offenen Definition – hierbei sind keinerlei Übereinstimmungen vorausgesetzt – um eine zusammenhänge

Darstellung

aller

49

Sequenztypen

zu

erhalten.

3

Ergebnisse

3.1

MLST-Ergebnisse

Nach Erhalt der Allelsequenzen aller sieben Housekeeping-Gene wurden diese mit den bereits bekannten Sequenzen der Datenbank (http://www.mlst.net) verglichen und aus den Allelnummern der Sequenztyp (ST) gebildet. Tabelle 7 zeigt die ermittelten Allelnummern und ST. Tabelle 7 – Allelnummern und Sequenztypen IMMIH SCOPE Nr. Nr.

Allel-Profil gltA

gyrB

gdhB

recA

cpn60

gpi

rpoD

ST

2

877

10

12

1

33

4

9

5

308

3

2746

1

12

3

2

2

3

3

98

9

4348

1

82

112

1

1

135

66

303

10

7456

28

38

45

1

16

4

2

331

13

63

35

63

113

1

1

71

6

336

14

3607

1

17

6

1

4

56

6

283

15

7182

10

12

4

11

4

9

5

109

18

140

1

17

3

2

2

56

3

223

19

811

1

17

3

2

2

56

3

223

22

1762

1

83

114

1

1

136

67

304

23

3202

28

38

115

1

16

40

2

332

24

3393

48

48

58

42

36

54

41

342

25

5253

1

17

3

2

2

56

3

223

26

8264

1

17

3

2

2

56

3

223

29

10147

10

12

4

11

4

9

5

109

30

10201

1

17

6

1

47

56

6

284

31

10304

1

15

2

28

1

104

32

276

32

10324

1

15

2

28

1

52

32

110

33

16902

1

17

3

2

2

99

3

281

38

638

1

15

2

28

1

104

32

276

39

708

1

1

116

60

1

132

50

269

40

1250

29

41

48

11

1

137

6

333

41

3576

1

17

6

1

4

56

6

283

50

42

3593

1

12

65

45

4

122

26

273

43

6358

1

12

65

45

4

4

26

272

44

293

28

38

45

1

16

4

2

331

46

4380

1

17

117

11

28

11

32

287

47

4520

2

21

12

32

26

63

5

196

49

5291

1

15

62

31

4

72

45

279

50

7365

2

21

12

32

26

63

5

196

51

7707

28

38

45

1

16

4

2

331

52

10050

28

38

45

1

16

4

2

331

58

9005

1

34

40

26

22

1

5

288

62

3464

28

38

45

1

16

4

2

331

67

3259

21

84

64

11

4

9

5

320

69

8496

1

12

118

11

4

10

3

275

71

4734

21

85

12

12

26

56

68

321

74

8059

1

17

2

12

1

138

69

280

75

8060

1

17

2

12

1

138

69

280

83

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1

54

62

31

4

50

45

295

85

20506

1

17

3

2

2

56

3

223

88

17036

1

17

3

2

2

56

3

223

89

18767

1

17

3

2

2

56

3

223

90

18763

1

17

3

2

2

116

3

282

91

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1

17

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2

2

116

3

282

92

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52

94

11

1

117

26

294

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17

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2

2

56

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223

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17

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2

2

116

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282

100

6743

15

72

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12

4

64

6

317

101A

19171

15

72

95

12

4

64

6

317

104

8399

1

17

3

2

2

99

3

281

108

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1

1

12

32

1

9

6

266

111

18740

1

17

3

2

2

56

3

223

113

21701

1

12

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2

2

3

3

98

117

16926

1

17

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2

2

56

3

223

118B

19234

1

15

13

12

4

12

2

20

51

119

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37

53

67

6

42

64

7

337

123

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17

3

2

2

56

3

223

127

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10

12

1

33

4

72

5

309

128

19171

15

17

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4

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6

316

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19128

28

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1

16

4

2

330

131

20954

1

38

3

2

2

56

3

290

132

17059

1

72

3

2

2

56

3

298

139

17461

1

46

96

54

4

18

59

291

143

20364

1

1

12

32

1

9

6

266

151

40293

1

15

3

31

4

1

4

277

152

34843

1

15

3

31

4

1

4

277

154

41391

1

12

40

26

22

117

5

271

155

34795

1

17

3

2

2

56

3

223

156

35071

1

52

67

46

1

18

30

293

157

35163

10

12

1

33

4

9

5

308

158

35198

10

12

1

33

4

9

5

308

161

34016

1

17

3

2

2

56

3

223

162

34036

10

12

1

33

4

9

5

308

163

34040

1

17

3

2

2

56

3

223

164

34043

10

12

1

33

4

9

5

308

165

34073

10

12

1

33

4

98

5

310

166

23121

1

17

3

2

2

99

3

281

168

35298

1

17

3

2

2

99

3

281

171

34215

1

17

3

2

2

56

3

223

173

34275

1

46

96

54

4

18

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291

174

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1

46

100

12

36

71

6

292

175

35369

44

73

4

11

44

121

4

339

176

35369

44

73

4

11

44

121

4

339

178

35456

11

29

14

21

13

119

15

313

179

35402

1

46

100

12

36

71

6

292

180

35402

1

46

100

12

36

71

6

292

183

35761

1

12

65

45

4

122

26

273

184

35568

1

17

101

2

2

56

3

286

52

186

35789

1

17

65

45

4

55

26

285

187

35789

1

17

65

45

4

55

26

285

188

35502

18

12

80

12

1

123

3

318

190

35522

1

17

3

2

2

56

3

223

191

34387

1

1

66

12

33

117

41

267

193

34561

28

38

45

1

16

4

2

331

194

34366

1

74

6

1

4

125

6

299

195

34500

1

74

6

1

4

125

6

299

196

34526

1

12

103

6

29

126

32

274

198

43549

1

17

3

2

2

56

3

223

199

43576

1

17

3

2

2

56

3

223

206

45605

1

17

3

2

2

56

3

223

207

45607

21

49

104

11

1

128

30

319

208

45674

1

17

3

2

2

56

3

223

211

49202

1

1

66

12

33

129

41

268

213

49237

1

74

6

1

4

125

6

299

214

49257

1

54

70

11

4

69

45

296

221

45169

1

17

3

2

2

56

3

223

231

45359

1

17

3

2

2

56

3

223

239

29744

33

17

12

49

1

54

4

335

240

45749

33

17

12

49

1

54

4

335

243

27790

1

12

3

2

2

3

3

98

244

27818

1

12

3

2

2

3

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246

33490

1

17

3

2

2

56

3

223

248

21673

32

12

67

11

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11

5

334

250

24237

1

12

3

2

2

3

3

98

251

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1

76

106

46

1

131

5

300

255

28889

1

15

12

6

28

59

63

278

257

40509

45

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70

2

4

56

64

340

258

40520

45

77

70

2

4

56

64

340

264

36961

1

52

94

11

1

117

26

294

266

3273

1

78

70

43

1

71

6

341

267

29237

1

12

3

2

2

3

3

98

53

268

32597

3

60

41

11

16

9

5

307

269

32452

3

60

41

11

16

9

5

307

270

27433

23

35

3

27

23

55

7

322

274

28377

2

21

12

32

26

63

5

196

275

41297

1

17

3

2

2

56

3

223

276

42913

1

17

3

2

2

56

3

223

277

42974

1

17

3

2

2

56

3

223

279

42945

1

35

64

37

4

132

30

289

280

43008

24

58

107

2

4

54

6

323

281

43008

24

58

107

2

4

54

6

323

282

43088

2

79

108

59

1

9

6

306

287

37565

2

1

12

1

4

67

6

305

288

38575

2

1

12

1

4

67

6

305

290

29428

1

64

109

1

23

12

26

297

291

38338

10

12

4

11

4

9

5

109

292

38338

10

12

4

11

4

9

5

109

293

38392

46

12

110

1

16

133

50

341

295

44544

46

12

110

1

16

133

50

341

296

44565

1

12

3

2

2

3

3

98

300

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1

12

3

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10

12

1

55

4

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41168

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17

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30818

10

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1

9

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44

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4

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314

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1

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11

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18

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315

32976

1

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11

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18

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43

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317

32989

1

17

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2

2

56

3

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320

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1

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3

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4

1

4

277

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1

15

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31

4

1

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277

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39503

1

12

3

2

2

3

3

98

54

3.2

Polymorphic sites

In einem Vergleich der Allele zeigten sich in allen der untersuchten sieben Housekeeping-Genen Polymorphismen. Diese Sequenzunterschiede sind in allen, während der Untersuchung aufgetretenen Allelen in der Abbildung 2 genweise aufgelistet.

Abbildung 2: Polymorphic Sites der untersuchten A. baumannii Isolate gltA

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

11111111111111111111222222222222223333333333333333333344444444444444444 122344457789902333355566777788889013355667778890011223344555666778900112233444555688 445325810540650258904612156703795464758140395813628143957017356124918170938149368803 TTTGCATCTATGCGCTTATCTACTAGTTGCGGTTTCCTTCTACTAACTCCCTCCCCATTGTTGCTGCATTTGCCTTCACGAATA ..............................................T.......T............................. .......................................................................A............ ......................................................T................A......T..... .CGATTCT...A.AT.....CC.......TA......C..AG.AT.TG...ATT.T...A..A.AAT.CA.A....T.T..G.. .CGATTCT...A.AT.....CC........A......C..AG.AT.TG...ATT.T...A..A.AAT.CA.A...CT.T..G.. ..G.TGCT...ATA.CCGC.CT.C.ACAA..C.CC.....A.....TG..T...TG..C..C..AA.TCA.A............ .CGATTCT...ATA......CC..G....TA.ACC..C..A...T.TG.T.AT.TT..CAC.A.A.T.CA.A.T.CTGTCGG.. CCGATTCTC.CATAT.....CC.......TA.ACC.....A.T.T.TG...AT..T..CAC.A.A.T.CA.A...CTGT..G.. ......................................................T.......................T..... ...................T.............CC..CA......T.G...........................C........ ..........................................................................C......... .........G............................................T............................. .............A........................................T....A........................ ..............................................................................T..... .............................................................................G...... .....................G.................................................A............ .................................CC..CA......T.G...........................C........ ...........................................................................C........ ..........................................................CAC.A.A.T.CA.A...CTGT..G.T ......................................................T............................. .............A........................................T.......................T..... .....................G.............................................................. .........................................................G.......................... ........................................................................T........... ...................T.............CC..CA......T.G.................................... ...................T.............CC..CA......T.G........G.CAC.A.A.T.CA.A...CTGT....T ...................T.............CC..CA......T.G.......................A............ ...................T.............CC..CA......T.G........G......G..............T..... ...................T.............CC..CA......T...................................... ..................................................................................C. ...................T...C.........CC..CA......T.G...........................C........ .......T...........T...C.........CC..CA......T.G....................C......C........ ...................T.............C.T.CA......T.G...........................C........ .........G........................................................................C. ....................................................T.T............................. ..................................................T................................. ...................T...........T.CC..CA......T.G...........................C........ ....................................T..T..............T............................. .............................T...................................................... .....................................................T.............................. .............................T........................T............................. .CGATTCT..CATA......CCA.G....TA.ACC.....A...T.TGT..AT..T..CAC.A.A.T.CACA...CTGT....T ...........................................................A........................ .....................G..........................T......................A............

55

56

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

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Allel 41 ............C.....................................................................................

Allel 40 .................................................C.......G...............A........................

Allel 39 .A....G.....CA.T...T.TG....C...C...TT...G..C.T..TC.T....A.T..GT.C.A.T....A....A...TC......TAC..G..

Allel 38 ...CAAG.....CA.T...T.TG........C...TT...G..C.T..TC.T....A.C..GT.C.A......AC...A...TC......TAC..G..

Allel 37 ..........T................................................C.............A........................

Allel 36 ......................G....................................C......................................

Allel 35 ............................................................C...........G.........................

Allel 34 ...............T..........................................................................TAC..G..

Allel 33 .C.G.A.G.TATCAA.AT.TATGACGC.T...AG.ATC.A.CG.A..ATCTT...CATTT..T.C.A..CCT.T-..T..TA.CCG....TAC..G..

Allel 32 .....................................C.....................C.............A................TAC..G..

Allel 31 .A.......................................................G................................TAC..G..

Allel 30 ..........T................................................C.............A................TAC..G..

Allel 29 .C........T..............................................G...............A................TAC..G..

cpn60

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41

111111111112222222222222222223333333333333333333344 11223334567778899001123456790011122233566778890001222334455556679901 478450364391581739251765465154703935827314262513692147082523470330356 ATACGCCTATTTTAATCATAAATTTTAACAACTCGCAGTTTTCGTAAATTATGCCTTAAGCCTTTTTAT ................................A.................................... ................................A.T.....C..............C...T......... ...............................T......................T.............. ...T..TC..AAA.T.TGCG.T...CG.T..T...TG...AA.AC......C..T.CG....C...A.. ...T..TC..AAA..C.GCG.T...CG.T.GT....G......A..G.......T.CG....C...AG. ....C..........................T......................T.............. .C.T..TCGAAAA.T..GCG.TA..CG....T.......CACG...G.G.GC..T.C.G.G.....G.. ......TCG.AAA....GC..TAC.CG.T..T.....T.....T..G....CA.T.C......C..A.. ...T..TCG.AAA....GC..TAC.CG.T..T......C....TC.G....CA...CG....C...A.. ....................................................................C ...............................T......................T.............A ...T.........G......TT...CG......T.........A.TGG....................A .............................R.Y....................R........T....... ...T.........G......TT...CG......T.........A.TGG..................... ..............C...................................................... ......................................................T.............. ...............................T..................................... .............R....................................................... ...T..TC..AAA..C.GCG.T...CG.T..T.T..G......AC.G..A.CA...CG....C.-.... ..............C.................................................-.... ...T.........G......TT...CG......T.........A.TGG................-.... ................................................................-.... ...T.TTC..AAA..C.GCG.T...CG.T..T....G.......C.G....CA...CG....C.-.... ................................A...............................-.... ..G..............................................................C... .................................................................C... .....................................................T............... .............G......TT...CG......T.........A.TGG..................... .............................G.T.............................T....... .............G......GT...CG......T.........A.TGG..................... ..............G............G...T......................T.............. .............G......TT..CCG......T.........A.TGG..................... ...............................T......................T......T....... ..G.................................................................. .............................G.T....................A........T....... ...........................G...T......................T.............. ..........A....................T......................T.............. ...T..TC..AAA.T.TGCG.T...CG.T..T....G......AC......CA...CG....C...AG. G...............................A.................................... ...............................T..................T...T..............

63

64

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

gpi

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

1111111111111111111111111111111111111222222222222222222222222222333 122344555666777888899990000111122223333444556666778888899999011112223344455566677888999000 2378817358147369278147801232578147803690258146062589140136915689823562581303625814769289147034 GTGCAAGTGATTCAGGCTGTTTTAGCTAAAAATGCTCTACCTTGTTCCAACTGCACGTGAGATTACTCAATTCTCAAAAATTGAATAAGTCCTG .....G.CT......TA..C.AC.TGC....CCA.GT.........T...T.......A.A...........................A.T... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A.T... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A...........T..................... ..............................................................................G............... .....G.CT......TA..C.AC.TGC..T.TCC..T.........T....CA......TA................TG........CA.T... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T....C....T...T.......A.A................................. .....C....GAT..AA.AC.A.GTG.......C.A......A.A.TT.G.CCG...CA..C....G.G..CT.T.C..T...G.A...CAA.. ..............A............................................................................... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T....CA.......A................................. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T....C....T...T........................................... .....G..A.......................CA.AT......A..............................................TT.. .....C....GAT..AA..C.A.GTG.......A.A....TCA...TT.G.CCG..A.T.......G.GG..T.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. .....G..A..................................A.................................................. ..........GAT..AA..C.A.GTG.......A.A....TCA...TT.G.CCG..A.T.......G.GG..T.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. .....C......T...A..C.A.............A......AAA.TT.T...G...CT.......G....CT.T.C..T.A.G.A...CAGA. .....G.CT......TA..C.A.........TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A.T... .....G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A.T... .....G.CT......TA..C.AC........TCA..T....C....T...T.......A.A................................. ........A.......................CA.AT......A..............................................TT.. .....G.CT......T...C.AC.........C...T.........T....CA.......A.................G.........A.T... .....G.CT..C..CAA..C.AC.TGC...GTCA..TC.....T..TT.....T..........G.......................A..... .......C....T..TA..C.AC.....T..TCA.AT.........T.....A.....A.A.........................G....... ...............TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A................................. .....GACT.....ACA..CCAC.TGC................A......T.................GC..T....G.T.AA........G.. .....G.C.......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T...T.............................A.......A..G.. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T...T.........A.................G.........A.T... ........T......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T....CA.......A................................. ......ACT.....ACA..CCAC.TGC................A......T.................GC..T....G.T.AA........G.. .....TAC..GGT..TA..C.A..T.G......A.A..T.TCAAA.T..GA..T....A.A.......GG..T....T...A...A...CAAA. .....CAC..GAT.CTA..C.A..T.G......A.A..T.TCAAA.T.GG.CCG..A.A.........G..CT.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. .....CAC.G..T...A..C.A.GTG.......A.A......AAA.TT.G.CCG...CA.......G.G..CT.T.C..T.A.G.A...CAGA. .....G.CT..C..CAA..C.AC.TGC....TCA..TC........TT.....T..........G.........T................T.. ..T..CAC..GAT.CTA..C.A..CG.......A.A..TT.CAAA.T.GG.CCG..A.A....A.............................. ..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA..T....C....T...T........................................... ..T...........A............................................................................... ..TG..........A...............................................................................

65

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77

..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T.....A.......A...........T..................... ..TGGG.C....T..TA..C.AC........TCA.AT.........T.....A.....A.A.........................G....... ..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T...T.........A.................G.........A.T... ..TG.CAC..GAT.CTA..C.A..CG.......A.A..TT...................................................... ..T..CAC..GAT.CTA..C.A..CG.......A.A..TT.CA.ACT..G.CCG..A.A....A.G.TG..C.AT....T.............. ..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A.T... ..TG.G.AT.....ATA..C.AC........TCA.AT.........T........................CT.T.C........G..A.A... ..TG.CAC..GAT..TA..C.A..CG.......A.A..T.TCAAA.T.GGA..T....A.A.G.....G..CT.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. ..TG.CAC..GAT..TAC.C.C...........A.A..T.TCAAA.T.............A..........CT.T..........GG.ACAGG. ..T..TAC..GGT..TA..C.A..CG.......A.A..TTTCAAA.T..GA..T....A.........GG..T....T...A.......CAAA. ..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T.....A.......A.........C.T..................... ..AG.GACT..C...TA..C.AC........TCA..T.........T......T........C.........T.................TG.. ..T..CACT......TA..C.AC........TCA.AT.........T........................CT.T.C........G..A.A... ...G.TAC..GGTG.TA..C.A..CG.......A.A..T.TCAAA.T..GA..T....A.A.......G..CT.T.C..T.A.GGGG.ACAGGA .....G.C.......TA..C.ACT........CA.AT.........T......T......A..........C................A..... ..TG.CACT......TA..C.AC........TCA.AT.........T........................CT.T.C........G..A.A... ..TG.G.CT......TA..C.AC........TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A..... ..T..TAC..GGT..TA..C.A..CG.......A.A..TTTCAAA.T..GA..T....A.........GG..T....T...A...A...CAAA. ..T..C....GAT..AA..C.A.G.T.......A.A....TCA...TT.G.CCG..A.T.......G.GG..T.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. ..TG.G.CT..C..CAA..C.AC........TCA..TC........TT.....T..........G.........T................T.. CG...G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A...........................A..... .....G.CT.....ATA..C.AC.TGC....TCA.AT.G.......T...T.......A.A................................. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A...........................A..... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T......T........C.........T..................G.. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........TT.......................CT.T.C........G..A.A... .....TA...GGT..TA..C.A..T.G......A.A..T.TCAAA.T..GA..T....A.A.......GG..T....T...A...A...CAAA. .....C....GAT..AA..C.A.GTG.......A.A....T.A...TT.G.CCG..A.A.......G.GG..T.TG.T...A...A...CAAA. .....CAC..GAT..TA..C.A..T.G......A.A..T.TCAAA.T.GGA..T....A.A.G.....G..CT.T.C..T.A.G.GG.ACAGG. CG...G.CT......TA..C.AC.TG....GTCA..T.........T...T...G...A.......G.G........T..........A..G.. .....G.CT...T.CTA..C.AC.TGC....TCA..T....C....T...T.................GC..T....G.T.AA........... .....G.CT.....ATA..C.AC.TGC....TCA..T....C....T...T.................GC..T....G.T.AA........... .....G.CT...T..TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T...T.........A.................G.........A.T... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T....CA..T....A.................G.........A.T... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T......T..................T..........G.......G.. .....C....GAT..AA..C.A.GTG.......A.A....T.A...TT.G.CCG..A.A.......G.GG..T.T..T...A...A...CAAA. .....G.AT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.............A................................. .....G.CT......TA..C.AC.TGC.....CA.GT.........T...T.......A.A...........................A.T... .....CAC.G..T..AA..C.A.GTG.......A.A......AAA.TT.G.CCG...CA.......G.G..CT.T.C..T.A.G.A...CAGA. .....G.CT.....ATA..C.AC.TGC....TCA.AT.....C...T.....A.......A...........T..................... .....G.A.......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.............A.................................

66

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93

.....G.AT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T........................CT.T.C........G..A.A... C....C....GAT..AA..C.A.GTG.......A.A....T.A...TT.G.CCG..A.A.......G.GG..T.TG.T...A...A...CAAA. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A.........................G....... .....G.....................................A.................................................. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.......A.........C.T..................... ....GG.C....T..TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T.....A.....A.A.........................G....... .....G.CT...T.CTA..C.AC.TGC....TCAT.T....C....T...T.................GC..T....G.T.AA........... ....GG.CT......TA..C.GC.TGCG..GTCA.GT.........T.........A.....G.......................C...T.C. .....TAC..GGTG.TA..C.A..T.G......A.A..T.TCAAA.T..GA..T....A.A.......G..CT.T.C..T.A.GGGG.ACAGGA .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T.....A.......A...................A.......A..... .....G.....................................A...............................................T.. .....GACT..C...TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T......T........C.........T.................TG.. .....G.AT.....ATA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T........................CT.T.C........G..A.A... .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA.AT.........T....CA.......A.................G.........A..... .....G..A.......................CA.AT......A...............................................T.. .....G.CT......TA..C.AC.TGC....TCA..T.........T......T..................T..................G..

67

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

rpoD

111111111111111222222222222222333333333333333333333333334444444444444444455 11234445566677888899001133455667789023345566688899011112234444455556666677880011223444556667900 18969330372845739256818032509537493560291210625816758506790240346923580247869253658479258173698328 GGCATTATTACCTGCCTTTTACATTTTTGGAAAGAGATTTATTTCATAGATTACTTGCACCTCCTAAATACCTGTATATTATCTACATTATCTATACC ...........................C...................................................................... ........................C......................................................................... ...........................C....................................................................T. ...G...........T...........A...........C.C.C.............G.T................C.C.........CGC.C..G.T ..T...................................C.........................................................Y. ..YR...........Y.......................C.C.C.............G.T................C.C.........CGC.C..G.T ..T.....C..T.......CCT.....A.A..TA.C.....C....AGA.C.TAA....TT...AG.........T..CATCT.TTCA......C... ................................................................................................TT ................................................................................................Y. ............................................T..............T...................................... ...................................................G...C.......................................... ...........................C....................................................................TT ........................C...............................................G.......................T. ..........T................C.........C..........................................................TT ...........................C............................A......................................... .......C...................C............................A......................................... ...............TACCCCT.C..AAAA..TA.C.....CC..G..A.C.TAA..TGTTCT.AGG....TAAGT.GCA...CTTTC.G....C... ......T.................C.G....................................................................... ...........................C......C............................................................... CC.......C..............C......................................................................... C........C..GC.............C...................................................................... ...........................C...............................T...................................... ..............ATACCCCT....AAAA..TA.C.....CC..G..A.C.TAA..TGTTCT.AGG..C.TAAGT.GCA...CTTTA.G...GC.T. ..............................C.T................................................................. ........................C.G.................T..............T...................................... ...........................CA..................................................................... ...............T.CCCCT.....A...........C.C.C.............G.T..................C.........CGC.C..G.T ...............T.CCCCT.....A.............CCC.....G.......G.T..................C.........CGC.C..G.T ...........................C............................................G.......................T. .....A.....................C...................................................................... ........................C.G.............................................G.......................T. ...............T.CCCCT.....A.............C.C.....G.......G.T..................C.........CGC.C..G.T ...............T.CCCCT...C.A...........C.C.C.............G.T..................C.........CGC.C..G.T ......................C....C...................................................................... ...GG......................A...........CTC.C.............G.T................C.C.........CGC.C..G.T ................................................................................................T.

68

Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel Allel

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

...........................C............................A.............T........................... ...............T.CCCCT.....A...........C.C.C.....G.......G.T..................C.........CGC.C..G.T ...............T.CCCCT.....A...........C.C.C.............G.T...T..............C.........CGC.C..G.T ...............T.CCCCT.....A...T.......C.C.C.............G.T..................C.........CGCAC..G.T ........................C.G.........T...................................G.......................T. ...........T....................................................................................TT ...................................................G.............................................. ..............ATACCCCT.C..AAAA..TA.......CC..G..A.C.TAA..TGTTCT.AGTGA..TAAGT.GCA...CTTTC.G....C... ........................C.G..A..............T..............T...................................... ............................................................T..................................... ........................C.GC...................................................................... ...........................C...............................T....................................TT

4.3

Epidemiologische Analyse mittels eBURST

Für die eBURST-Analyse wurden alle erhaltenen Sequenztypen mit dem jeweils entsprechenden Allelprofil in eBURST 3.0 eingegeben und berechnet. Es zeigten sich zehn Clonal Complexes, sowie 49 Einzelstämme ohne Beziehung zueinander. Auf die untersuchten Stämme bezogen, zeigt dies eine große Diversität innerhalb der Population. In Tabelle 8 sind eBURST-Ergebnisse der analysierten A. baumannii Isolate aufgeführt. Tabelle 8: Ergebnisse der eBURST-Analyse der Stämme dieser Untersuchung

ST

CC

FRQ

SLV

DLV

Durchschn. Distanz

223 282 281 298 290 286

1 1 1 1 1 1

28 3 4 1 1 1

5 2 2 2 2 1

0 3 3 3 3 4

1.0 1.6 1.6 1.6 1.6 1.8

310 309 308

2 2 2

1 1 5

2 2 2

0 0 0

1.0 1.0 1.0

284 283

3 3

1 2

1 1

0 0

1.0 1.0

317 316

4 4

2 1

1 1

0 0

1.0 1.0

276 110

5 5

2 1

1 1

0 0

1.0 1.0

273 272

6 6

2 1

1 1

0 0

1.0 1.0

270 98

7 7

1 9

1 1

0 0

1.0 1.0

268 267

8 8

1 1

1 1

0 0

1.0 1.0

109 95

9 9

4 1

1 1

0 0

1.0 1.0

331 330

10 10

6 1

1 1

0 0

1.0 1.0

ST: Sequenztyp CC: Clonal Complex

SLV: Single Locus variant (Abweichung in einem von 7 Genen) DLV: Double Locus variant (Abweichung in zwei von 7 Genen)

69

FRQ: Frequenz

Singletons: 323 322 321 320 289 288 287 285 280 319 318 313 311 279 278 277 275 274 271 307 306 305 304 303 302 301 300 269 266 20 342 341 340 339 337 336 335 334 333 332 299 297 296 295 294 293 292 291 196 Abbildung 3: Populationsstruktur von A. baumannii gemäß eBURST-Analyse

Abbildung 4: Populationsstruktur von A. baumannii gemäß eBURST-Analyse mit SLV und DLV

70

Abbildung 5: Populationsstruktur mit allen bekannten STs (Stand 27.Feb.2012)

Abbildung 6: Populationsstruktur mit allen STs mit SLVs und DLVs (Stand 27.Feb.2012)

71

Abbildung 7: Zentrum der Populationsstruktur, entsprechend „CC92“ (Stand 27.Feb.2012)

4

Diskussion

In den vergangenen Jahrzehnten haben Acinetobacter-Spezies als nosokomiale Krankheitserreger weltweit zunehmend an Bedeutung gewonnen [VAN LOOVEREN UND GOOSSENS, 2004, DIJKSHOORN ET AL., 2007, PELEG ET AL., 2008]. Unter den drei klinisch relevantesten Genospezies A. baumannii, A. pittii (vormals Genospezies 3) und A. nosocomialis (vormals Genospezies 13TU), gilt das größte Interesse A. baumannii als bedeutendster nosokomialer Erreger aus dieser Gruppe. Besonders

bei

immunkompromittierten

Patienten

auf

Verbrennungs-

und

Intensivstationen, sowie Säuglings-Intensivstationen sind eine Vielzahl von Infektionen durch A. baumannii mit teils sehr hoher Letalität beschrieben worden. Ein zusätzliches Problem stellt die rapide steigende Anzahl an Resistenzen gegenüber Antibiotika dar, welche eine Kenntnis der Epidemiologie dieses Erregers unumgänglich macht. Eine bekannte Tendenz zur nosokomialen Verbreitung von A. baumannii unterstreicht die wachsende

Bedeutung

von

Daten

zur

(molekularen)

Epidemiologie

und

Populationsstruktur. Eine aktuelle Literatursuche in der Datenbanken der National Institutes of Health (NIH) nach den Termini „Acinetobacter“ in Verbindung mit „Epidemiologie“ ergibt über 1500 Einträge. Fügt man den Speziesnamen „baumannii“ als klinisch relevanteste Spezies 72

hinzu, reduziert sich diese Anzahl auf etwa 900 Beiträge, davon stammen über 800 aus diesem Jahrhundert. Einige frühere Studien zeigten eine große genetische Heterogenität der untersuchten A. baumannii-Isolate [SEIFERT UND GERNER-SMIDT, 1995, WISPLINGHOFF ET AL., 2000], andere Publikationen fanden bestimmte epidemische Stämme bei Analysen von Ausbrüchen in unterschiedlichen Krankenhäusern und auch Ländern, ohne dass ein direkter epidemiologischer Zusammenhang aufgezeigt werden konnte [VILA ET AL., 1999, MANIKAL ET AL., 2000, LANDMAN ET AL., 2002, NEMEC ET AL., 2004a, TURTON ET AL., 2004, VAN DESSEL ET AL., 2004, ECKER ET AL., 2006]. Neuere populationsgenetische Untersuchungen hingegen konnten epidemiologische Zusammenhänge im Sinne einer europäischen, wie auch globalen Verbreitung einzelner A. baumannii Stämme demonstrieren [WISPLINGHOFF UND SEIFERT, 2012]. Higgins et al identifizierten 2010 mittels rep-PCR aus 492 Imipenem-resistenten A. baumannii-Isolaten acht Klone, welche in verschiedenen Ländern auf mehreren Kontinenten nachzuweisen waren und als „world wide clones“ bezeichnet wurden [HIGGINS ET AL., 2010]. Die Vorteile des MLST liegen in der sehr großen Reproduzierbarkeit und der Portabilität. Benötigte Materialien zur ST-Bestimmung können zwischen Laboren weltweit ausgetauscht werden. Standardisierte Protokolle und Primersequenzen sind elektronisch weltweit einsehbar. Durch den Aufbau einer zentralen Internet-basierten Datenbank, wurde die Möglichkeit geschaffen, mittels MLST gewonnene Daten neben einer lokalen Analyse, zu weltweiten Untersuchungen zu benutzen und sie mit denen bekannter epidemischer Stämme zu vergleichen. Die MLST ist eine automatisierte Methode, welche die Vorteile von Sequenzierungstechnik mit Bioinformatik verbindet und sie für die Analyse longitudinaler epidemiologische Untersuchungen und Populationsstudien qualifizieren. Nachteile ergeben sich aus dem Kostenfaktor und der, im Vergleich mit PFGE geringeren Diskriminationsfähigkeit.

Die oben genannten Beispiele zeigen, dass mittels MLST regionale, wie globale Untersuchungen zur Erkennung epidemischer, virulenter und multiresistenter Stämme ermöglicht werden. Bereits bei der Typisierung von S. aureus gelang es, den Transmissionsweg eines virulenten Stammes vom Ersterkrankten über andere Individuen des Krankenhauses, hinaus bis in dessen Umgebung nachzuvollziehen. Ein 73

so erhaltenes Wissen über die Ausbreitung eines Erregers ist für die Identifikation des Primarius, die Eindämmung, Beseitigung, Kontrolle und schließlich auch Prävention von (weiteren) Ausbrüchen essentiell. Im Jahre 2005 entwickelten Bartual et al in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Harald Seifert des Institutes für klinische Mikrobiologie der Uniklinik Köln ein MLST-Schema zur Untersuchung von A. baumannii-Isolaten [BARTUAL ET AL., 2005]. Hierzu wurden die Sequenzen der sieben Housekeeping-Gene „Citrat-Synthase A“ (gltA), „DNA-Gyrase Untereinheit B“ (gyrB), „Glucose-dehydrogenase“ (gdhB), „homologer Rekombinationsfaktor A“ (recA), „60kDa-Chaperon“ (cpn60), „Glucose-6phosphat-Isomerase“ (gpi) und „RNA-Polymerase σ70 Faktor“ (rpoD) gewählt und verglichen. Zur Evaluation des Schemas wurden insgesamt 42 Acinetobacter baumannii-Isolate von Ausbrüchen in Deutschland, Spanien und anderen europäischen Ländern typisiert. Es konnten 21 unterschiedliche Allelprofile gefunden werden, welche in der zentralen

Datenbank

(http://pubmlst.org/abaumannii/submission.shtml)

hinterlegt

wurden. Des Weiteren zeigte sich eine hohe Übereinstimmung zwischen den gewonnenen MLST-Daten und den bereits zuvor bekannten AFLP- und PFGE-Daten der untersuchten Isolate. Dies bewies, dass das entwickelte Schema der Methode zur Analyse der molekularen Epidemiologie von A. baumannii verwendet werden konnte.

Im Jahr 2008 wurde das etablierte Schema erstmals für eine größere Anzahl von klinischen, wie auch sporadischen, A. baumannii-Isolaten benutzt. Wisplinghoff et al untersuchten 53 Isolate von Ausbrüchen in den USA, Belgien, Dänemark, Deutschland und dem vereinigten Königreich, sowie einen Referenz-Stamm von A. baumannii, sowie 20 klinische Isolate von A. nosocomialis (ehemals Genospezies 13TU) und verglichen

die

erhaltenen

Daten

des

MLST

mit

PFGE-

und

RAPD-PCR

[WISPLINGHOFF ET AL., 2008]. Hier konnten 50 Sequenztypen unterschieden und in die bestehende Datenbank überführt werden. Auch die Untersuchung der Isolate von A. nosocomialis war mittels MLST-Schema unmodifiziert möglich und erbrachte 20 Sequenztypen. Wie in der Arbeit von Bartual et al zeigte sich in dieser Arbeit eine hohe Übereinstimmung der mittels MLST gewonnenen Daten mit denen, welche zuvor mittels PFGE und RAPD-PCR generiert wurden.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden 173 A. baumannii Isolate aus 52 74

Krankenhäusern der Vereinigten Staaten von Amerika mittels MLST typisiert. Von diesen waren 155 für weitere Analysen benutzbar – 18 Isolate stellten sich in weiteren Untersuchungen als A. nosocomialis heraus und wurden nicht berücksichtigt. Mit Hilfe des modifizierten MLST-Schemas – der ursprüngliche Primer von rpoD wurde ersetzt – gelang es bei allen untersuchten Stämmen ein Amplifikat des jeweiligen zu sequenzierenden Gens zu erhalten. Insgesamt konnten in der vorliegenden Arbeit 72 Sequenztypen nachgewiesen werden – 67 STs (266 bis 323 und 330 bis 342) waren zuvor unbekannt und konnten in die zentrale Datenbank überführt werden.

Betrachtet man die mittels eBURST erstellte Populationsstruktur, der in dieser Arbeit analysierten Stämme (siehe Abbildung 3), so fällt ein zentraler klonaler Komplex um den Sequenztyp 223 auf. Unter Berücksichtigung von Single und Double Locus Variances (SLVs / DLVs) zeigen sich weiterreichende Verbindungen zu den ST 270 und 98. Ein weiterer klonaler Komplex zeigt sich um die Sequenztypen 109 und 95 mit DLVs zu den STs 308 bis 310. Vergleicht man die beschriebenen, in dieser Arbeit aufgetretenen klonalen Komplexe mit der aktuell bekannten Populationsstruktur (siehe Abbildungen 5 und 6), erkennt man, dass der Cluster um ST223 ein Mitglied des klonalen Komplexes 92 ist (CC92). Bei diesem im Zentrum liegenden ST92 (ehemals ST22) handelt es sich um den Gründer (Founder) des umfangreichsten klonalen Komplex von A. baumannii. Higgins et al untersuchten im Jahr 2010 A. baumannii Isolate aus 139 Zentren in insgesamt 32 Ländern mittels REP-PCR und fanden 8 unterschiedliche Cluster, deren Merkmale in unterschiedlichen Ländern weltweit auftraten. Sie schlugen die Bezeichnung der weltweiten Klone (world-wide clones) 1 bis 8 vor [HIGGINS ET AL., 2010]. Im Vergleich mit den MLST-Daten zeigte sich eine Übereinstimmung des klonalen Komplexes 92 (CC92) mit dem zuvor beschriebenen weltweiten Klon 2 (WW2). Eine weitere Übereinstimmung ergab sich bei den in dieser Untersuchung aufgetretenen ST109 und ST95 – beide Mitglied des klonalen Komplexes 109 (vergleiche Abbildungen 5 und 6) und dem weltweiten Klon 1 (WW1). Weitere Übereinstimmungen konnten bei ST266 und dem WW3, sowie ST196 und dem WW6 gefunden werden. Die in dieser Arbeit aufgetretenen ST276 und ST110 gehören zum CC276 (vergleiche Abbildungen 5 und 6), welche sich mit den REP-PCR-Daten des weltweiten Klons 7 (WW7) decken [HIGGINS ET AL., 2012].

75

Mitglieder des CC92 wurden in der Vergangenheit, wie auch in aktuellen Publikationen, weltweit beschrieben und stellen aufgrund ihrer Antibiotikaresistenz große therapeutische Probleme dar: Hamouda et al untersuchten 2010 mittels MLST und PFGE eine vielfältige Sammlung von nicht-verwandten A. baumannii Isolaten. Es gelang ein Nachweis von ST92 und ST98, beide aus dem aktuellen CC92, bei Isolaten aus Freiburg (Deutschland), Nottingham (Großbritannien), Taiwan und Prag (Tschechien). Insgesamt traten 24 STs auf, 19 davon waren bis dahin unbekannt [HAMOUDA ET AL., 2010]. Ebenfalls 2010 beschrieben Fu et al. in einer Untersuchung von 152 Carbapenemresistenten A. baumannii Isolaten in 16 chinesischen Städten ein Vorkommen von 86,8% (132/152) des ST92 und verwandten Single-Locus-Varianten (ehemals ST22). Dieser konnte in allen 16 Städten nachgewiesen werden und besaß fast immer nachweisbare Carbapenemase-Gene [FU ET AL., 2010]. Im selben Jahr untersuchten Park et al die molekulare Epidemiologie und Resistenzlage von 96 Acinetobacter-Isolaten aus 10 koreanischen Städten. Auch in dieser Untersuchung konnte ST92 nachgewiesen werden und zeigte im Vergleich zu anderen ST höhere Resistenzraten gegenüber Carbapenemen, sowie anderen Antibiotika [PARK ET AL., 2010]. Auch in Australien konnte ST92 nachgewiesen werden [RUNNEGAR ET AL., 2010]. In einer Untersuchung von Kouyama aus dem Jahr 2011 zu Carbapenem-resistenten A. baumannii in Japan gehörten 13 von 14 (92,9%) der Carbapenem-resistenten Isolate ST208 oder der Single-Locus-Variante ST219 an [KOUYAMA ET AL., 2012]. Zwar gehören beide STs dem CC92 an, der Gründer ST92 konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Ähnliches konnte auch in der Untersuchung von Adams-Haduch et al von 2011 beobachtet werden: Zwischen 2008 und 2009 waren A. baumannii Isolate aus mehreren US-amerikanischen Krankenhäusern gesammelt und untersucht worden. Die häufigsten vorkommenden STs, ST122 und ST208, gehörten zum CC92 und konnten in allen untersuchten Krankenhäusern nachgewiesen werden, nicht jedoch ST92 selbst. Es fanden sich ebenfalls Isolate, welche den pan-europäischen Klonen I und III zugeordnet werden konnten [ADAMS-HADUCH ET AL., 2011]. Dieses Ergebnis deckt sich mit der hier durchgeführten Untersuchung. Zwar konnte ST92 selbst nicht nachgewiesen werden, jedoch handelt es sich bei dem am häufigsten (28x) aufgetretenen ST223 um ein Mitglied des CC92. Auch andere verwandte STs wie ST281, ST282, STS286, ST290 und ST298 gehören diesem klonalen Komplex an. 76

In der Zusammenschau konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass es sich bei dem MLST um eine robuste Methode handelt, welche zuverlässig detaillierte Einblicke in die Populationsstruktur von A. baumannii geben kann. Dies konnte bereits mittels Vergleichen mit PFGE, AFLP [BARTUAL ET AL., 2005], sowie REP-PCR belegt werden. Aufgrund der Portabilität können Forscher weltweit an der Entschlüsselung der Populationsstruktur und Analyse von Ausbrüchen arbeiten. Im Laufe der Zeit wurden ständig neue Sequenztypen ermittelt, in die zentrale Datenbank überführt und gewährten neue Erkenntnisse zur Populationsstruktur. War man initial bei Entwicklung und Etablierung des MLST-Schemas durch Bartual et al. aufgrund der geringen Anzahl an untersuchten Stämmen und daraus resultierenden Summe an Sequenztypen nicht in der Lage konkrete Aussagen zur Populationsstruktur zu machen, ist es nun aufgrund der wachsenden Anzahl an untersuchten Isolaten möglich, die Klonalität von A. baumannii zu erkennen (siehe Abbildung 6). Auch diese Arbeit zur Analyse klinischer A. baumannii-Isolate aus 52 Krankenhäusern in den USA hat einen wesentlichen Teil dazu beigetragen, weitere Sequenztypen in die Datenbank zu überführen und die Populationsstruktur aufzudecken.

5

Zusammenfassung

Acinetobacter-Spezies

haben

in

den

vergangenen

Dekaden

als

Erreger

nosokomialer Infektionen weltweit an Bedeutung gewonnen. Unter den klinisch relevanten Spezies A. baumannii, A. pittii und A. nosocomialis, kommt A. baumannii die größte Bedeutung zu. Gerade bei chronisch oder Schwerkranken wie beispielsweise Kindern oder Patienten auf Intensivstationen mit schwerem SchädelHirn-Trauma oder Verbrennungen tritt A. baumannii als Erreger von Atem- und Harnwegsinfektionen, Bakteriämien und Sepsis, Wundinfektionen, Meningitiden, Endokarditiden

und

anderen

beschriebenen

Manifestationen

Infektionserkrankungen mit

einer

hohen

auf.

Oftmals

Morbidität

und

sind

die

Mortalität

vergesellschaftet. Die zunehmende Multi- und Panresistenz von A. baumannii, sowie die Tendenz zur epidemischen Ausbreitung untermauern die weltweite zunehmende klinische Bedeutung dieser Spezies als Erreger nosokomialer Infektionen. Aufgrund dieser Tatsachen wird nicht nur die klinische Versorgung von Patienten, sondern auch die Eindämmung von Infektionsausbrüchen mit diesem Erreger zunehmend 77

schwieriger und machen Kenntnisse über die Epidemiologie und Populationsstruktur von A. baumannii essentiell. Die Multilocus Sequenztypisierung (MLST) ist eine robuste und gut diskriminative Methode, welche es dank hoher Reproduzierbarkeit und des portablen Formates einer

sequenzbasierten

Typisierungsmethode

ermöglicht,

standardisierte

Typisierungsdaten von Mikroorganismen über eine zentrale Internet-basierte Datenbank zu verbreiten und zu vergleichen. Sie vereint als automatisierte Methode die

Vorteile

von

Sequenzierungstechnik

mit

Bioinformatik

und

ermöglicht

longitudinale epidemiologische Untersuchungen und Populationsstudien in riesigem Ausmaß. Nach Etablierung des Schemas für A. baumannii mit 42 Stämmen, in denen sich 21 Allelprofile (STs) und eine gute Korrelation mit Daten aus Pulsfeldgelektrophosere (PFGE) und Advanced fragment length polymorphism (AFLP) zeigten, wurde das Schema 2008 auf 53

A. baumannii-Isolate angewandt. Es zeigten sich 50

unterschiedliche Allelprofilen, sowie die Möglichkeit das Schema auch auf A. nosocomialis-Isolate unmodifiziert anzuwenden. In dieser Arbeit wurde die MLST verwandt um 173 Acinetobacter-Isolate aus 52 Krankenhäusern der USA zu typisieren. Diese entstammten einer siebenjährigen Studie (1995-2002) die prospektiv 24.179 Isolate untersuchte (SCOPE-Projekt). Insgesamt stellten sich 155 als A. baumannii heraus – 18 als A. nosocomialis identifizierte wurden nicht berücksichtigt. Mittels PCR unter Verwendung spezifischer Primer wurde von jedem Isolat die Fragmente der sieben Housekeeping-Gene amplifiziert. Die gewonnenen Amplifikate wurden mit Hilfe der Gelelektrophorese nachgewiesen und anschließend sequenziert. Die

erhaltenen

Sequenztypen

wurden

anschließend

mittels

eBURST

epidemiologisch ausgewertet. Da eine Amplifikation mit dem publizierten rpoD-Primer nur erschwert möglich war, wurde ein alternativer Primer entwickelt, welcher eindeutige Amplifikate zeigte. Anschließend war es bei allen Isolaten möglich, die zugehörigen DNA-Fragmente zu amplifizieren und zu sequenzieren. Insgesamt wurden in der vorliegenden Studie 72 unterschiedliche Sequenztypen entdeckt. Hiervon waren 67 bisher nicht bekannt und konnten neu beschrieben werden. Bei der eBURST-Analyse aller untersuchten Isolate zeigte sich eine hohe Diversizität: So konnten zehn Clonal Complexes, sowie 49 Einzelstämme ohne 78

Beziehung zueinander identifiziert werden. Betrachtet man die entdeckten Isolate im Kontext mit weiteren bekannten Sequenztypen, sowie deren geografische Verteilung, wird deutlich, dass in dieser Studie aufgetretene Sequenztypen und Clonal Complexes eng mit größeren Clonal Complexes verwandt oder auch Bestandteil dieser sind. So bildet der größte in dieser Studie aufgetretene Clonal Complex einen Teil des Clonal Complex um Founder ST92, welcher dem in der Literatur beschriebenen world-wide-clone 2 (WW2) entspricht. Unter Berücksichtigung von Single-

und

Double-Locus-Variances

zeigt

sich

eine

Klonalität

in

der

Populationsstruktur von A. baumannii. Abschließend konnte gezeigt werden, dass mit MLST eine geeignete Methode für epidemiologische Analysen von A. baumannii vorliegt und die Populationsstruktur dieser Spezies näher analysiert, sowie eine Klonalität angenommen werden kann. Weitere Untersuchungen mit einer größeren Anzahl von Isolaten werden diesen Umstand klären.

79

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Lebenslauf

Maximilian Markus Fresen, geboren am 06.Dez.1981 in Bonn; als Sohn der Eheleute Dipl. oec. troph. Angelika Maria Fresen (geb. Ströhmeier) und Maximilian Josef Johannes Fresen, M.A. phil.

Staatsangehörigkeit: deutsch Bildungsgang 1988 – 1992

Katholische Grundschule St. Michael, Wermelskirchen

1992 – 05/2001

Städtisches Gymnasium Wermelskirchen mit Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife 1. Abschnitt des Studiums der Humanmedizin an der Universität zu Köln mit Ablegen der ärztlichen Vorprüfung 2. Abschnitt des Studiums der Humanmedizin an der Universität zu Köln Mit Famulaturen bei/in den Bereichen: Dr. med. A. Grapow – Praxis Allgemeinmedizin, Dortmund Dr. med. P. Wagner – Innere Medizin, Krankenhaus Wermelskirchen Dr. med. G. Tzanov – Gynäkologie & Geburtshilfe, KH Wermelskirchen Spezialambulanz Infektiologie, Haus 16a – UniKlinik Köln Praktisches Jahr an der UniKlinik Köln mit Wahlfach Anästhesie Ablegen des schriftlichen und mündlichen Staatsexamens Humanmedizin

04/2003 – 04/2005 04/2005 – 02/2008

02/2008 – 02/2009 04/2009 – 06/2009

Beschäftigungsverhältnisse zur Studienfinanzierung 05/2004 – 05/2008

06/2008 – 08/2008

Studentische Hilfskraft des klinischen Studienzentrums Infektiologie I (Schwerpunkt HIV) (Leitung: Prof. Dr. G. Fätkenheuer) der Klinik I für Innere Medizin (Direktor: Prof. Dr. M. Hallek) (Onkologie, Hämatologie, Infektiologie, Immunologie, Hämostaseologie und Internistische Intensivmedizin) der UniKlinik Köln Studentische Hilfskraft der Klinik I für Innere Medizin (Direktor: Prof. Dr. M. Hallek) AG klinische KMT-Forschung (Leitung: Prof. Dr. K. Hübel) UniKlinik Köln

Beruflicher Werdegang Seit 09/2009

Assistenzarzt und wissenschaftlicher Mitarbeiter der Klinik I für Innere Medizin (Direktor: Prof. Dr. M. Hallek) (Onkologie, Hämatologie, Infektiologie, Immunologie, Hämostaseologie und Internistische Intensivmedizin) der UniKlinik Köln

Köln, den 14.11.2012

Maximilian M. Fresen

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