GLYKOLYTISCHE FERMENTE UND STOFFWECHSEL DER TUMORZELLEN

Die Esterkonzentration in dem zellfreien Ansatz ist 15-mal so hoch wie im Ansatz mit Zellen. Das entspricht etwa der Anreicherung des Chinons in den Zellen, wie früher 7 gezeigt worden war. Als Vergleichskurve ist in Abb. 3 die (^-A uf­ nahme von Zellen + Antimycin A aufgetragen (Kurve II). Die Restatmung der Zellen in Gegen­ wart von Antimycin A ist sehr gering. Kurve IV zeigt die 0 2-Aufnahme von hydrolysiertem Ester ohne Cystein, Kurve V die von Cystein allein. In beiden Fällen kommt es dabei nicht zu einer 0 2Aufnahme über die stöchiometrische Menge für ein­ malige Oxydation hinaus. Der in den Zellen ablaufende Mechanismus der wiederholten Reduktion und Oxydation des Phenanthrenchinons kann auf diese Weise gut modell­ m äßig dargestellt werden.

Methoden Z e l l m a t e r i a l : Wir verwendeten Ehrlich-Ascites-Zellen der Maus, die auf übliche Weise überimpft und nach etwa 9 Tagen entnommen wurden. Die Zellen 7

H. J. R

is s e ,

Diplomarbeit, Freiburg 1960.

325

wurden vom Serum abzentrifugiert, 2-mal mit dem glei­ chen Volumen R i n g e r - Lösung gewaschen, in R i n g e r - Lösung suspendiert und im K a f k a - Röhrchen gemessen. A n s ä t z e : Die 0 2-Aufnahme wurde manometrisch gemessen. Pro Ansatz wurden 30 mg Zellen (Frisch­ gewicht) verwendet. Im übrigen enthielten die Ansätze: R i n g e r - Phosphat-0,4% Glucose, [99 ml isotone NaCl, 1,0 ml CaCl2 (0,11-m.), 20 ml m/7,5-Phosphatpuifer p h 7,4, 0,4% Glu­ cose] , 1 ’IO-5 Mol// Chinon bzw. Hydrochinon-Ester, 1 ‘IO-5 Mol// Antimycin A (Wisconsin Alumni Res. Found.), 1 -IO“ 3 Mol// HCN. Zur Absorption des C02 wurden in die Gefäßeinsätze je 0,15 ml 2-n. NaOH gefüllt. Der Ester wurde aus der Birne eingekippt. Für die Modellversuche wurden 15-IO-5 Mol// Ester trocken in die Gefäßbirnen eingewogen. Der Haupt­ raum enthielt H20 und pro 3 ml Gesamtvolumen 0,3 ml 2-n. NaOH. Pro Ansatz wurde 1 mg Cystein • HCl zugesetzt. Der Ester wurde durch mehrmaliges Kippen in den Haupt­ raum übergespült, die Hydrolyse erfolgt im alkalischen Medium in wenigen Sekunden. Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t danken wir für die Unterstützung der Arbeit.

Der Einfluß glykolytischer Fermente auf den Stoffwechsel von Tumorzellen

IV . M itt.: Ü ber die W irkung von Fructose-1.6-diphosphatase und Codehydrasen au f A tm ung und Glykolyse von Ehrlich-Ascites-Tum orzellen Von E. H eise und M. G örlich Aus der Robert-Rössle-Klinik des Instituts für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin (Z. Naturforschg. 17

b, 325—330 [1962]; eingegangen am 18. Oktober 1961)

Durch einen aus Rinderleber angereicherten FDPasehaltigen Extrakt kann in Kombination mit DPN die Glykolyse von Ascites-Tumorzellen stärker herabgesetzt werden als mit FDPase allein. Atmung und aerobe Glykolyse werden durch DPN nicht weiter beeinflußt. Durch DPNH wird die anaerobe Glykolyse vermindert, ein FDPase-Zusatz steigert diese Hemmwirkung nicht weiter. Durch spektrophotometrische Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß Leberextrakte DPN nicht hydrieren und FDPase-Lösungen nur wenig DPNH enthalten. Die Glykolysehemmung ist der FDPase-Aktivität und nicht dem DPNH-Gehalt proportional.

Von S 1 wurde festgestellt, daß die Glykolyse von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen durch Zusatz von Leberhomogenat erniedrigt werden kann. Diese W irkung wird auf das Vorhandensein einer DPNase in dem Leberhomogenat erklärt, die das 1 W. Hoppe-Seylers Z. physiolog. Chem. 319, a c h s e n m a ie r

S a c h s e n m a ie r ,

126 [I960].

für den Ablauf der Glykolyse erforderliche Diphosphopyridinnucleotid (DPN) spaltet und auf diese Weise den Glucoseabbau verhindert. Durch Zusatz einer überschüssigen DPN-Menge kann die Hem­ mung der Glykolyse wieder aufgehoben werden. Da­ mit ist die Richtigkeit dieser Hypothese über die Glykolysehemmung durch DPNase bewiesen. Wie

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E. HEISE UND M. GÖRLICH

326

wir bereits mitgeteilt haben 2, kann durch Fructose1.6-diphosphatase (FD Pase), die aus Rinderleber partiell angereichert wurde, die Glykolyse von Ascites-Tumorzellen ebenfalls bis zu 50% ohne Schädigung der Atmung gehemmt werden. Da die Möglichkeit besteht, daß auch unser Leberextrakt trotz partieller Reinigung noch aktive DPNase ent­ hält, die für die Glykolysehemmuiig verantwortlich sein könnte, haben wir deshalb Versuche zur Klä­ rung dieser Frage unternommen.

Materialien und Methoden Sämtliche Versuche wurden an Ascites-Tumorzellen unter anaeroben bzw. aeroben Bedingungen durchge­ führt. Die anaerobe Milchsäurebildung wurde mano­ metrisch nach Warburg 3 und außerdem chemisch nach Barker und Summerson 4 bestimmt. Gleichzeitig be­ stimmten wir den Glucoseverbrauch während des Ver­ suches nach der Methode von Garin und H o o c h 5. Als Inkubationsmedium diente ein Gemisch aus R i n g e r Lösung, Natriumbicarbonat und Glucose (RBG) in den anaeroben Versuchen, bzw. Krebs - R i n g e r - Phos­ phat-Puffer in den aeroben Versuchen. Außerdem ent­ hielt der Anhang der Gefäße 0,1 ml 20-proz. Trichlor-

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

reine AscitesZellen in RBG

essigsäure (TCE) zur Unterbrechung der Stoffwechsel­ reaktion. Der Hauptraum enthielt, je nach der Ver­ suchsanordnung, 0,2 ml DPN- bzw. TPN-Lösung und 0,3 ml FDPase-Lösung. Jede Versuchsanordnung um­ faßte, falls nicht anders vermerkt, zwei Gefäße. Die im ersten Gefäß ablaufenden Stoffwechselvorgänge wurden zur Zeit 0 durch Einkippen der TCE gestoppt; der Stoffwechsel des zweiten Gefäßes wurde nach 60 Min. Inkubation bei 38° im Thermostaten unterbrochen. Die Ascites-Tumorzellen wurden, wie bereits beschrieben 2, präpariert und in den Hauptraum der Gefäße pipet­ tiert. Bei den aeroben Versuchen enthielt der Einsatz der Gefäße 0,2 ml 20-proz. KOH zur Absorption von Kohlensäure. Bei sämtlichen Versuchen wurden FDPase-Präparate einer absoluten Aktivität von ca. 35 //Mole P 0 4-Abspaltung/Stde. ml verwendet.

Versuchsergebnisse 1. D e r E i n f l u ß v o n T P N a u f d i e anaerobe Glykolyse W ir untersuchten den Einfluß von 400 y TPN auf die anaerobe Glykolyse von Ascites-Zellen, den Einfluß der FDPase auf die Glykolyse und den Ein­ fluß von TPN und FDPase zusammen auf die Gly­ kolyse.

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Ascites-Zellen Ascites-Zellen in RBG in RBG +0,3 ml FDPase+ 0,3 ml FDPaseLösung Lösung +400 y TPN Abb. 1. Einfluß von Fructose-l.ö-diphosphatase und TPN auf die anaerobe Glykolyse von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen. 2 3

W. L ü h r s , E. 254 [1961],

Ascites-Zellen in RBG + 400y TPN

M. G ö r l i c h , Z. Naturforschg. 16 b, O . W a r b u r g , Uber den Stoffwechsel der Tumoren. Springer-Verlag, Berlin 1926. H e is e u .

4 S. B. B a rk e r u. 5

S. G a r in

u.

W.

J. biol. Chemistry 138. 535 [1941], J. biol. Chemistry 131,211 [1939]. ^

H . S u m m e rs o n ,

D. B. H o o c h ,

GLYKOLYTISCHE FERMENTE UND STOFFWECHSEL DER TUMORZELLEN

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Mano- Glucose­ metrie Ver­ brauch

reine AscitesZellen in RBG

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summerbrauch son

Ascites-Zellen Ascites-ZelleninRBG in RBG + 0,3 ml FDPase+ 400 y DPN Lösung Abb. 2. Einfluß von Fructose-l,6 -diphosphatase und DPN auf die anaerobe Glykolyse von

Wie aus der Abb. 1 hervorgeht, wird die W ir­ kung der FDPase durch TPN noch verstärkt. Auf reine Ascites-Tumorzellen ist TPN ohne Einfluß, jedoch wird der Glucoseverbrauch in diesem Falle durch TPN stark herabgesetzt. Die manometrischen Werte stimmen gut mit den durch chemische Bestim­ mung erhaltenen überein. Wie aus der Abb. 2 hervorgeht, wurden mit glei­ chen DPN-Konzentrationen ähnliche Resultate er­ zielt. Jedoch ist der Glucose-Verbrauch bei diesen Versuchen in Übereinstimmung mit den m anom etri­ schen und chemischen Ergebnissen. Aus diesen Versuchen geht hervor, daß der W ir­ kungsmechanismus unserer Leberextrakte ein ande­ rer ist, wie der von S angegebene. Durch DPN bzw. TPN wird die Glykolysehemmung nicht nur wieder nicht aufgehoben, sondern sogar noch verstärkt. Der unterschiedliche Einfluß von DPN und TPN auf den Glucoseverbrauch ist nur schwer zu erklären. Vermutlich spielt beim Zusatz von TPN die direkte Glucoseoxydation über den Pentosephosphatzyklus eine gewisse Rolle. Versuche hierüber sind in Vorbereitung. a c h s e n m a ie r

2. D e r E i n f l u ß v o n T P N u n d D P N a u f die A t m u n g und die a e r o b e G l y k o l y s e Die Versuchsanordnung war die gleiche wie unter 1 beschrieben. Die Versuchsergebnisse sind in der Tab. 1 zusammengefaßt.

327

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Ascites-ZelleninRBG + 0,3 ml FDPaseLösung+400 y DPN Ehrlich-Ascites-Tumorzellen.

Wie aus der Tab. 1 hervorgeht, ist keine signifi­ kante Beeinflussung der Glykolyse durch DPN und TPN festzustellen. Ebenso wird die durch FDPaseZusatz erniedrigte Glykolyse durch DPN oder TPN nur wenig beeinflußt. Die Atmung wird durch FDPase und TPN bzw. DPN nur wenig erniedrigt. Diese Versuchsergebnisse führten zu der Verm u­ tung, daß durch gleichzeitigen Zusatz von FDPase und TPN bzw. DPN unter anaeroben Bedingungen die hydrierten Nucleotide entstehen, die die Glyko­ lyse hemmen könnten. Unter aeroben Bedingungen könnten dagegen keine hydrierten Nucleotide auftreten und somit auch keine Hemmung der Glyko­ lyse beobachtet werden. Es war also zu erwarten, daß unsere FDPasehaltigen Leberextrakte in der Lage sind, DPN bzw. TPN zu hydrieren. Um diese Frage zu klären, haben wir folgende Versuche unter­ nommen: 3. D e r E i n f l u ß v o n D P N H a u f d i e anaerobe Glykolyse Die Versuchsanordnung war die gleiche wie unter 1 beschrieben. Es wurden 400 y DPN pro Versuchsansatz verwendet. Die Versuchsergebnisse sind in der Abb. 3 zusammengefaßt. Wie aus der Abb. 3 hervorgeht, wird die an­ aerobe Glykolyse durch DPNH stark herabgesetzt. Die durch FDPase hervorgerufene Glykolysehem­ mung wird durch DPNH-Zusatz noch verstärkt, je­

E. HEISE UND M. GÖRLICH

328

Einfluß von FDPase u. DPN bzw. TPN auf die Atmung v. Ascites-Zellen Versuchs­ bedingungen

reine Asciteszellen

Ascites in KRPhG 0,2 ml 20-proz. KOH Atmung in Qo2

-

31= -

9,8 8,9 10,4 7,8 9,2 ± 0,9

Asciteszellen + 400 y TPN bzw. DPN

M

- 8,8 - 8,6 - 9 ,9 _g g = - s’,9 ± 0,5

Asciteszel. + 0,3 ml FDPase-Lösung

M =

- 8,6 - 6,8 - 8,5 - 7,6 - 7,9 ± 0,7

Asciteszel. + 0,3 ml FDPase-Lösg. + 400 y TPN bzw. DPN

M =

- 8,4 - 7 ,4 - 7,9 - 7,7 - 7,9 ± 0,3

Einfluß von FDPase u. DPN bzw. TPN auf die aerobe Glykolyse v. Ascites-Zellen Versuchs­ bedingungen

reine Asciteszellen

Ascites in KRPhG Glucoseverbr. in n Molen Ascites in KRPhG Milchsäurebildung in /j. Molen Glucose

M

3.65 4,29 2.65 = 3,53 ± 0,59

M =

3,67 3,90 3,79 ± 0,12

Asciteszellen + 400 y TPN bzw. DPN

M =

M

3,90 3,10 3,50 ± 0,4

3,34 3 69 = 3,50 ± 0,19

Asciteszel. + 0,3 ml FDPase-Lösung

Asciteszel. + 0,3 ml FDPase-Lösg. + 400 y TPN bzw. DPN

2,88

2,26

M

1,93 = 2,40 ± 0,48

M

1,30 1,40 = 1,35 ± 0,05

2,68

M =

M

2,47 ± 0,21

2,65 2 18 = 2*41 ± 0,24

Tab. 1. Einfluß von FDPase und DPN bzw. TPN auf die Atmung und aerobe Glykolyse von Ascites-Zellen.

doch ist der Grad der Glykolysehemmung durch und DPNH vor. Alle Bestimmungswerte für die FD P ase+ DPNH genau so groß wie die Verhinde­ Milchsäurebildung stimmen gut überein, wie auch rung der Glucosespaltung durch DPNH allein. Es aus der Abb. 3 ersichtlich. Diese Versuche sprechen liegt folglich kein additives Verhalten von FDPase einesteils dafür, daß die durch gemeinsame Inkuba12,0 11,0 10,0

= Fehlerbreite

§9,0

1«, ^

7.0

•I 5,0

2,0 1.0

Mano- Glucose- Barker raetrie Ver- Summer­ brauch son

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Mano- Glucose­ metrie Ver­ brauch

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Ascites-Zellen in RBG Ascites-Zellen in RBG Ascites-Zellen + 0,3 ml FDPase-Lö+ 0,3 ml FDPasein RBG sung + 400 y DPNH Lösung + 400 y DPNH Abb. 3. Einfluß von Fructose-l,6 -diphosphatase und DPNH auf die anaerobe Glykolyse von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen. reine AscitesZellen in RBG

GLYKOLYTISCHE FERMENTE UND STOFFWECHSEL DER TUMORZELLEN Inhalt d. Küvette [ml]

Zeit [min]

Xi

Inhalt d. Küvette [ml]

Zeit [min]

2,9 K rebs-Ringer-Phosphat 0,1 FDPase-Lösg.

0 10 30 60 0 30 60 90 0 30 60 90

0,130 0,133 0,131 0,134 0.050 0,054 0,032 0,052 0,150 0,155 0,093 0,126

2,8 Krebs-Ringer-Phosphat 0,1 FDPase-Lösg. 0,1 DPN (2 mg/ml)

0 10

2,7 RBG 0,3 Ascites 2,4 RBG 0,3 FDPase-Lösg. 0,3 Ascites

329 E

0,150 0,182 0,162 0,153 0,053 0,061 0,049 0,071 0,159 0,163 0,130 0,169

30 60

2,5 RBG 0,2 DPN 0,3 Ascites

0

30 60 90

2,2 RBG 0,3 FDPase-Lösg. 0,2 DPN 0,3 Ascites

0

30 60 90

Tab. 2. DPNH-Messung bei 360 m^ im Hilger-Uvispek, Spaltbreite 0,2; 10-mm-Küvette. Gefäßinhalt [ml] 2,7 RBG 2,7 RBG 2,7 RBG 2,5 RBG 2,5 RBG

+ 0,3 Ascites 0,3 Ascites 4- 0,3 Ascites + 0,3 Ascites + 0,2 DPN -j- 0,3 Ascites + 0,2 DPN 2,4 RBG -f 0,3 Ascites -f0,3 FDPase-Lösung 2,4 RBG + 0,3 Ascites + 0,3 FDPase-Lösung -j-

FDPase-Aktiv. E Glykolyse fj, Mole 360 mju, Q ^/m g-Stde. P 0 4/ml-Stde. 10-mm-Küvette

Inkubat.-Zeit [min]

0,028 0,026 0,038 0,125 0,049

30 60 90 30 60

+ +

30 60 30 60

- 39 - 34 - 10 - 9

_ —

— — 17,5 17,5 5,4 5,4

0,056 0,061 0,124

0,121

96 104

100 102 102

61

66

90 91

Änderung d. Glykolyse [%] _

— — 2 2

Tab. 3. Beziehung zwischen FDPase-Aktivität bzw. DPNH-Gehalt und Hemmung der anaeroben Glykolyse von Ascites-Zellen.

Die Versuchsergebnisse sind in Tab. 2 enthalten. Es ist ersichtlich, daß eine Hydrierung von DPN nur in sehr geringem Maße erfolgt. Auch bei Zugabe von Ascites-Zellen ändern sich diese Verhältnisse nicht. W ir haben deshalb untersucht, ob eine Paralleli­ tät zwischen Glykolysehemmung und Aktivität der FDPase bzw. zwischen DPNH-Gehalt des Fermentes 4. S p e k t r o p h o t o m e t r i s c h e und Glykolysehemmung besteht. Messungen In der Tab. 3 sind Versuchsergebnisse zusam­ Es wurde die durch DPNH bei 360 m/* auftre­ mengestellt, die zeigen, daß die Glykolysehemmung tende Absorptionsbande im Hilger Uvispek von Lö­ nicht oder nur in geringem Maße vom DPNH-Ge­ sungen gemessen, die halt des Fermentes, sehr deutlich jedoch von der 1. 2,9 ml Krebs - R i n g e r-Phosphat-Puffer + Aktivität des Fermentes abhängt. Zur Inaktivierung 0,1 ml FDPase-Lösung und der FDPase durchströmten wir die Fermentlösung 2. 2,8 ml Krebs - R i n g e r - Phosphat-Puffer + mit Sauerstoff. Bei Versuchen mit Ascites-Tumor­ 0,1 ml FDPase-Lösung + 0,1 ml DPN-Lösung zellen und anschließender DPNH-Messung erfolgte (2m gD P N /m l) enthielten. die Unterbrechung des Stoffwechsels nicht durch tion von Ascites-Tumorzellen mit FDPase und DPN auftretende Glykolysehemmung durch DPNH eben­ falls hervorgerufen werden kann. Andererseits m uß­ ten dann additive Hemmungen von FDPase + DPN zu erwarten sein. Dies ist jedoch nicht der Fall. Um dieser Frage genauer nachgehen zu können, haben wir folgende Versuche durchgeführt:

330

GLYKOLYTISCHE FERMENTE UND STOFFWECHSEL DER TUMORZELLEN 13.0

12.0 = Fehlerbreite

nii,o

, 1QP I 9,0

•Sä

5: 5i 56.0 ^ 5,0

■ ^i 1.0 3.0 2.0

10 Mano- Glucose­ metrie Verbraudi

Mano- Glucose­ metrie Ver­ brauch

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summer­ brauch son

Ascites-Zellen Ascites-Zellen in RBG in RBG + 0,3 ml FDPase+ 400 y Nicotin­ säureamid Lösung Abb. 4. Einfluß von Fructose-1.6-diphosphatase und Nicotinsäureamid auf die von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen. reine AscitesZellen in RBG

Mano- Glucose- Barker metrie Ver- Summerbrauch son

Ascites-Zellen in RBG + 0,3 ml FDPaseLösung + 400 y Nicotinsäureamid anaerobe Glykolyse

TCE, sondern durch Eintauchen des Gefäßes in ko­ wurden dahingehend bestätigt, daß die Glykolyse­ chendes W asser und anschließendes Abzentrifugie­ hemmung weder auf einer Zersetzung von DPN ren des ausgefallenen Proteinniederschlages. durch eventuell im Leberextrakt vorhandene DPNase, noch auf dem Vorhandensein von DPNH 5. V e r s u c h e m i t N i k o t i n s ä u r e a m i d im Leberextrakt beruht. Auch eine Hydrierung von Nikotinsäureamid wird von verschiedenen Auto­ DPN zu DPNH mittels FDPase bzw. Leberextrakt ren 6 als Dehydrierungsfaktor in Stoffwechselversu­ ist unwahrscheinlich. Allerdings ist es nur schwer chen benutzt. Es war deshalb von Interesse, Nikotin­ zu erklären, weshalb DPN mit Leberextrakt zusam­ säureamid an Stelle von DPN in ähnlichen Ver­ men eine stärkere Glykolysehemmung hervorruft suchen, wie unter 1 beschrieben, zu verwenden. Die als FDPase allein. Eine Dephosphorylierung von Versuchsergebnisse sind in Abb. 4 zusammengefaßt. FDP zur Fructose-6-phosphat, wodurch eine Um­ Es zeigte sich, daß durch Nikotinsäureamid kei­ kehrung des Glucoseabbaues erfolgt, ist ohne Be­ nerlei Beeinflussung des Stoffwechsels zu erreichen teiligung von W asserstoffakzeptoren möglich. Da­ für spricht letzten Endes auch die Unwirksamkeit war. von Nikotinsäureamid. DPN und TPN wirken folg­ Diskussion lich spezifisch. W eitere Untersuchungen über die Unsere Vorstellungen über die Wirkungsweise Klärung des Mechanismus der DPN-W irkungen er­ von FDPase auf die Glykolyse von Ascites-Zellen scheinen uns notwendig. 6 H . H o lzer

u.

H .-J . B o l tz e ,

Z. Krebsforsch. 64,

113 [1 9 6 1 ].