Melissa Cristina da Silva

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SALAMES (Staphylococcus spp., Salmonella spp., Escherichia coli e Coliformes totais) COMERCIALIZADOS CLANDESTINAMENTE NA REGIÃO DE CURITIBA/PR Relatório de Estágio Curricular apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para obtenção do título de Médico Veterinário. Professor Orientador: Profª. MSc. Jesséa de Fátima França Orientador Galvão

CURITIBA 2016

Profissional:

Dra.

Julia

Arantes

Reitor Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos

Pró-Reitora Promoção Humana Prof. Ana Margarida de Leão Taborda

Pró-Reitor Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos

Pró-reitora acadêmica Prof. Dra. Carmen Luiza da Silva

Pró-Reitor de Planejamento Sr. Afonso Celso Rangel dos Santos

Diretor de Graduação Prof. João Henrique Faryniuk

Secretário Geral Sr. Bruno Carneiro da Cunha Diniz

Coordenador do Curso de Medicina Veterinária Prof. Welington Hartmann

Supervisora de Estágio Curricular Prof. Elza Maria Galvão Ciffoni Arns

Campus Barigui Rua Sydnei A Rangel Santos, 238 CEP: 82010-330 – Curitiba – PR Fone: (41) 3331-7958

TERMO DE APROVAÇÃO

Melissa Cristina da Silva

ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE SALAMES (Staphylococcus spp., Salmonella spp., Escherichia coli e Coliformes totais) COMERCIALIZADOS CLANDESTINAMENTE NA REGIÃO DE CURITIBA/PR.

Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médico (a) Veterinário (a) pela Comissão Examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná.

Curitiba, 30 de novembro de 2016.

BANCA EXAMINADORA:

__________________________________________ Prof. MSc. Jesséa de Fátima França

__________________________________________ Prof. Dra. Anderlise Borsoi.

__________________________________________ Prof. MSc. Ana Carolina Aust.

Curitiba, 30 de novembro de 2016

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me dado forças, determinação para realizar um sonho de infância e iluminado o meu caminho para estagiar em um ambiente com pessoas que só acrescentaram coisas boas na minha vida, agradeço principalmente a minha linda família a qual amo muito e aos amigos que sempre estiveram ao meu lado me ajudando e me apoiando de alguma forma para que eu concluísse este curso o qual não foi nada fácil. Quero agradecer também a orientadora profissional e Doutora Julia Arantes Galvão pela oportunidade de estagiar em seu laboratório e passar um pouco do seu conhecimento durante este período que estive lá. A técnica em laboratório Elvira Alice Kudla pelo grande auxílio no meu projeto e pela sua enorme paciência e delicadeza. São pessoas que desejo permanecer com a amizade que construímos neste período que passamos juntas. Agradeço de coração a professora e Mestre Jesséa de Fátima França por ter aceitado me orientar neste trabalho de conclusão de curso mesmo não me conhecendo como aluna, seu enorme carinho na correção para que este trabalho saísse o mais perfeito possível e a professora Anderlise por me indicar à professora Jesséa. Agradeço a empresa LABORCLIN, por financiar uma parte da minha pesquisa, a qual foi de suma importância para os resultados obtidos. Agradeço às residentes do laboratório LABMOR, Jessica e Juliana, por cederem alguns equipamentos e materiais que não tínhamos na LACQSA e por serem meninas muito queridas e prestativas. E por fim agradeço aos meus queridos professores por estes períodos em que passamos juntos na Universidade, os quais transmitiram seus conhecimentos e experiências profissionais e pessoais, tenho particularmente alguns em especial que me apoiaram em uma fase mais difícil que passei com meu filho, vocês morarão para sempre em meu coração.

APRESENTAÇÃO

Este trabalho de conclusão de Curso, apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde, da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para a obtenção do título de Médico Veterinário, é composto pelo Relatório de Estágio, onde são descritas as atividades realizadas durante o período de 8 de agosto a 28 de outubro de 2016, no Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança de Alimentos (LACQSA), Departamento de Medicina Veterinária, da Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizada no Setor de Ciências Agrárias, na Rua dos Funcionários 1540 – Bairro Juvevê, Curitiba – Paraná, local de cumprimento do Estágio Curricular e também pela descrição de um experimento que versa sobre análise microbiológica de salames coloniais comercializados clandestinamente na região de Curitiba/PR.

RESUMO

Grande parcela da população possui o hábito de consumir salames coloniais, parte da produção desse alimento comumente ocorre em agroindústrias familiares de forma artesanal. A maioria dos produtores rurais desconhecem os padrões de higiene, produzindo desta forma, alimentos com qualidade microbiológica duvidosa o que traz riscos à saúde do consumidor. Este trabalho teve por objetivo avaliar a qualidade das condições higiênico-sanitárias de amostras de salames comercializados clandestinamente na região de Curitiba-PR. Nas análises procurouse verificar se as mesmas atendiam aos padrões estabelecidos pela ANVISA contidos na RDC 12. Para tanto, foram coletadas 21 amostras de salames provenientes do comércio de Colombo, Campina Grande do Sul e Bairro Alto. Avaliou-se características fenotípicas e bioquímicas de coliformes totais, Escherichia coli, Staphylococcus coagulase positiva e Salmonella spp. Foi encontrada neste estudo uma amostra adquirida no município de Campina Grande do Sul contendo Salmonella spp. e outra do município Colombo extrapolou o valor estabelecidos pela ANVISA para Staphylococcus coagulase positiva, sendo imprópria para consumo; para coliformes totais e Escherichia coli as 21 amostras deram negativas. Palavras-chave: infeção alimentar; microbiologia; RDC 12.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 -

LABORATÓRIO

DE

CONTROLE

DE

QUALIDADE

E

SEGURANÇA DE ALIMENTOS DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ................................................................................ 16 FIGURA 2 -

GELADEIRA E FREEZER DO LABORATÓRIO QUE ERAM ARMAZENADOS MEIOS DE CULTURA..................................... 16

FIGURA 3 -

AUTOCLAVE

E

ESTUFA

UTILIZADAS

NO

LABORATÓRIO............................................................................ 17 FIGURA 4 -

FLUXOGRAMA DOS PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS..... 20

FIGURA 5 -

DIFERENÇA DE BACTÉRIAS STAPHYLOCOCCUS SPP. TÍPICAS E ATÍPICAS................................................................... 42

FIGURA 6 -

RESULTADO POSITIVO DE TESTE DE STAPHYLOCOCCUS SPP.............................................................................................. 42

FIGURA 7 -

PLACAS CONTENDO ÁGARES XLD E MLCB........................... 43

FIGURA 8 -

COLÔNIAS CARACTERÍSTICAS DE SALMONELLA SPP......... 44

FIGURA 9 -

TESTE

DE

SOROAGLUTINAÇÃO

POSITIVA

PARA

SALMONELLA SPP..................................................................... 45

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 - SÉRIE HISTÓRICA DE SURTOS POR DTA............................. 27 GRÁFICO 2 - DISTRIBUIÇÃO DOS SURTOS DE DTA POR REGIÃO........... 27 GRÁFICO 3 - DISTRIBUIÇÃO

DE

ALIMENTOS

INCRIMINADOS

EM

SURTOS DE DTA...................................................................... 28 GRÁFICO 4 - AGENTES

ETIOLÓGICOS

RESPONSÁVEIS

PELOS

SURTOS DE DTA...................................................................... 28 GRÁFICO 5 - PRINCIPAIS SINAIS E SINTOMAS POR SURTOS DE DTA............................................................................................ 29 GRÁFICO 6 - PRINCIPAL LOCAL A OCORRÊNCIA POR SURTOS DE DTA............................................................................................ 29

LISTA DE TABELAS

TABELA 1-

RESULTADOS OBTIDOS DOS SALAMES ATRAVÉS DAS ANÁLISES REALIZADAS NESTA PESQUISA.............................. 46

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACP

Ágar Contagem Padrão

AN

Ágar Nutriente

APT

Água Peptonada Tamponada

ANVISA

Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BHI

Brain Heart Infusion

BP

Ágar Base Baird Parker

CFU

Unidade Formadoras de Colônias

DAEC

Echerichia coli difusamente aderente

DTA

Doenças Transmitidas por Alimentos

E. coli

Echerichia coli

EAggEC Echerichia coli enteroagregativa EHEC

Echerichia coli entero-hemorrágica

EIEC

Echerichia coli enteroinvasora

EPEC

Echerichia coli enteropatogênica clássica

ETEC

Echerichia coli enterotoxigênica

G

Gramas

H2O2

Água Oxigenada

H2S

Sulfito de Hidrogênio

LABMOR Laboratório de Ornitopatologia LACQSA Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança de Alimentos LIA

Ágar Lisina Ferri

MAPA

Ministério de Agricultura e Abastecimento do Paraná

mL

Mililitro

MLCB

Ágar Manitol Lisina Cristal Violeta Verde Brilhante

Ng

Nanograma

RDC

Resolução da Diretoria Colegiada

RIISPOA Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal RV

Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RVS) Broth

SINAN

Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SVS

Secretaria de Vigilância em Saúde

SS

Solução Salina

SUH

Síndrome Urêmica Hemolítica

TNase

Termonuclease

TSI

Tríplice Açucar Ferro

TT

Thetrathionate Broth Base

UFC

Unidade Formadora de Colônia

UFPR

Universidade Federal do Paraná

Un.

Unidades

XLD

Ágar Xilose Lisina Desoxicolato

SUMÁRIO

1

INTRODUÇÃO.....................................................................................

13

2

LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTÁGIO..........................................

15

3

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.......................................................

18

4

REVISÃO DA LITERATURA...............................................................

22

4.1

SALAME...............................................................................................

22

4.2

MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS EM ALIMENTOS....................

25

4.2.1

Grupo dos Coliformes..........................................................................

31

4.2.2

Escherichia coli....................................................................................

32

4.2.3

Salmonella spp..................................................................................... 34

4.2.4

Staphylococcus coagulase positiva...................................................... 36

5

OBJETIVOS.........................................................................................

39

5.1

OBJETIVO GERAL..............................................................................

39

5.2

OBJETIVO ESPECÍFICO.....................................................................

39

6

MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 40

7

RESULTADOS E DISCUSSÕES.........................................................

46

8

CONCLUSÃO......................................................................................

49

9

CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................

50

REFERÊNCIAS.................................................................................... 51

13

1.

INTRODUÇÃO

Desde meados da década de 90 tem sido observado aumento na oferta de produtos coloniais, especialmente em feiras livres e vendas diretas ao consumidor. Também tem aumentado o número de agricultores voltados ao mercado de produtos coloniais, o que representou uma opção para complementar a renda familiar, ameaçada pelo movimento de exclusão em atividades tradicionais, principalmente na suinocultura. Embora a própria noção de produto colonial ainda esteja em construção, sua imagem está relacionada aos imigrantes europeus e aos seus descendentes, sobretudo os de origem italiana e alemã que inicialmente se instalaram na região sul do Brasil (OLIVEIRA; SCHMIDT; SCHMIDT, 2000). Entende-se por linguiça colonial ou também mais conhecida como salame colonial, “produto cárneo industrializado, elaborado exclusivamente a partir de carnes suínas, acrescentado de toucinho, ingredientes, carne moída em variável granulometria, embutida em envoltório natural, curado, que sofre processo rápido de fermentação, sendo defumado e dessecado por tempo indicado pelo processo de fabricação. Deve ter presença de "mofos" característicos, com consequência natural do seu processo tecnológico de fabricação. Trata-se de um produto curado, defumado e dessecado” de acordo com seu padrão de identidade e qualidade (BRASIL, 2000). A estabilidade microbiológica desse tipo de produto deve-se principalmente a atividade de água e pH baixos (entre 4,6 – 5,3). Os embutidos semi secos (linguiças) perdem aproximadamente 15% da umidade durante o processo de fabricação e geralmente são defumados, enquanto os embutidos secos (salames) perdem entre 25 e 50% de umidade. A temperatura de fermentação pode variar de 25°C até 43°C (BRASIL, 2000). Essas condições selecionam bactérias lácticas que provocam a acidificação do produto, inibindo diversos microrganismos indesejáveis e patogênicos nos alimentos, estendendo sua via útil, além de lhes conferir características sensoriais desejáveis (ICMSF, 1998). Em meio a vários tipos de embutidos, o salame se sobressai por não passar por tratamento térmico e por ser um produto cru, apresentando maior risco de acontecer desenvolvimento de Salmonella spp., além Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia coli, que podem levar a contaminação de alimentos, gerando doença de origem alimentar. Os microrganismos podem estar presentes

14

tanto na carne quanto em seu envoltório. A suinocultura é responsável por 5 a 30% dos casos de Salmonella spp. (SPRISIGO et al, 2008). A Escherichia coli é uma bactéria utilizada como indicadora de contaminação de origem fecal, sendo as bactérias do grupo dos coliformes termotolerantes e totais, os mais utilizados para estes fins (MAGRO; KLEIN, 2006). A contaminação de embutidos cárneos através de coliformes é causada principalmente pela falta de higienização tanto dos manipuladores quanto do local do processamento, podendo haver contaminação também dependendo da forma de como o produto será acondicionado depois de pronto (SALVATORI; BESSA; CARDOSO, 2003). Segundo Almeida, Almeida e Rodrick (1999), os embutidos cárneos fermentados, sobretudo os salames coloniais produzidos em pequena escala, geralmente são postos à venda antes de atingirem a atividade de água necessária à inibição de determinados microrganismos. Constituem, assim, perigo considerável à saúde dos consumidores. Além do intenso manuseio durante a fabricação, utilização de equipamentos com higienização deficiente, bem como o uso de condimentos contaminados, pode fazer dos produtos embutidos, ótimos veículos para microrganismos potencialmente patogênicos (SABIONI; MAIA; LEAL, 1999). O presente trabalho teve como objetivo demonstrar as condições higiênicosanitárias de salames comercializados clandestinamente na região de Curitiba-PR, através das análises de coliformes totais, Escherichia coli, Salmonella spp. e Staphylococcus spp.

15

2.

LOCAL DE REALIZAÇÃO DO ESTÁGIO

O estágio foi realizado no Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança de Alimentos (LACQSA), Departamento de Medicina Veterinária, na Universidade Federal do Paraná (UFPR), localizada no Setor de Ciências Agrárias, na Rua dos Funcionários 1540 – Bairro Juvevê, Curitiba – Paraná. O laboratório é constituído por material permanente como geladeira, autoclave, estufa de cultura bacteriológica digital, balança digital, freezer, mesa com bancos, vórtex, pia, bico de Merck, micro-ondas, armários para vidrarias e outros materiais necessários, conforme demonstrados nas Figuras 1, 2 e 3. Materiais de consumo como papel kraft, meios de cultura, caixas plásticas, colheres, garfos, facas, alças de platina, agulhas de platina, tábuas de frios, estantes para tubos, tubos de vidro com e sem tampas, pipetas, Béquers, Erlenmeyers, placas de Petri, petrifilms, bastão em L, provetas, sacos estéreis para amostras, embalagem para autoclave, jalecos, máscaras, luvas, papel alumínio, barbantes, gases e algodão hidrofóbico. O laboratório possui seis meses de atividade e foi desenvolvido para realizar análises microbiológicas e físico-química dos alimentos de origem animal, análises microbiológica de água e amostras ambientais, avaliação de fraude de alimentos incluindo o leite, aulas didáticas, controle microbiológico ambiental do hospital veterinário da universidade, recebimento de amostras externas para analises microbiológicas em alimentos, parceria com a prefeitura de São José dos Pinhais no programa da melhoria de qualidade do leite para os pequenos produtores.

16

Figura 1 - Laboratório de Controle de Qualidade e Segurança de Alimentos da Universidade Federal do Paraná, 2016.

Figura 2 – Geladeira e Freezer utilizados para o armazenamento dos meios de cultura, LACQSA, 2016.

17

Figura 3 – Autoclave e estufa utilizadas no LACQSA, 2016.

18

3.

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

O estágio foi realizado com o intuito de enriquecer conteúdos adquiridos durante a graduação e desenvolver habilidades na área de microbiologia de alimentos de origem animal. As atividades ocorreram no período de 1 de agosto a 7 de outubro de segunda à sexta-feira das 8:00 as 17:00 horas e do dia 8 a 28 de outubro de segunda à sexta-feira das 8:00 às 12:00 horas, totalizando 432 horas. Como orientadora acadêmica a professora Jesséa de Fátima França e orientadora profissional Julia Arantes Galvão. No local, além da professora trabalha uma técnica em laboratório que auxilia nos experimentos e no manuseio dos materiais de análises e equipamentos. As atividades desenvolvidas no LACQSA foram: análises microbiológicas e físico-química de alimentos de origem animal; controle microbiológico ambiental do hospital veterinário da universidade e preparo dos meios de cultura para análises quando necessário. Por ser um laboratório novo ainda não tinha muitas análises para ser realizadas. As tarefas executadas durante o período foram: higienização das vidrarias e organização do laboratório; preparo e autoclavagem de meios de cultura; esterilização de materiais contaminados; participação em um experimento de análise microbiológica de bactérias totais, Escherichia coli, coliformes totais e Salmonella spp. do leite pasteurizado e desenvolvimento de um experimento referente a análise microbiológica de salames coloniais comercializados clandestinamente na região de Curitiba. Para a higienização das vidrarias e outros materiais no laboratório, utilizouse o produto Det Limp S32 (detergente indicado para limpeza de material de laboratório), os mesmos poderiam ser deixados para pré-secagem em temperatura ambiente ou em estufa a 60º C por seis horas. Após a secagem, as mesmas foram acondicionadas em embalagens próprias e autoclavadas em temperatura de 121º C por 15 minutos, posteriormente passando por outro processo de secagem em estufa à temperatura de 100º C por uma hora, datadas e guardadas nos seus devidos locais. Os materiais contaminados eram autoclavados em temperatura de 121º C durante 40 minutos e descartados em lixo hospitalar ou no caso de vidrarias, estas eram lavadas com Det Limp S32. Tais procedimentos realizavam-se em áreas

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separadas, para que não houvesse contaminação. Para o preparo ou manipulação de qualquer meio ou material do laboratório era importante observar-se as necessárias condições de assepsia, de modo a se evitar contaminações com outros microrganismos. A bancada de trabalho era sempre higienizada com álcool 70% e forrada com papel kraft. O manipulador deveria estar sempre paramentado antes das atividades utilizando jaleco, máscara, touca e luvas. Os meios de cultura preparados foram os caldos (meios líquidos que possibilitam multiplicação maior de microrganismos, os quais são distribuídos em tubos ou frascos) e agares (meios sólidos, utilizados para crescimento de colônias específicas e também com o propósito de verificar características fenotípicas das bactérias, com distribuição em tubos ou placas). Para o preparo dos meios que necessitavam ser autoclavados (água peptonada 1% (APT), ágar base baird parker (BP), ágar contagem padrão (ACP), brain heart infusion (BHI), ágar nutriente (AN), caldo rappaport-vassiliadis (RV), tríplice açúcar ferro (TSI) e ágar lisina ferri (LIA)), pesou-se a quantidade do conteúdo desidratado (mensurada por meio de cálculos) e homogeneizou-se com bastão de vidro e/ou por agitação do recipiente (Erlenmeyer) em água destilada pré-aquecida até dissolução completa. Após, o conteúdo era submetido à fervura para que não formasse grânulos, devidamente tampado com algodão hidrofóbico o que era conhecido por rolha ou “boneca”, envolto em papel Kraft, amarrado com barbante e submetido para a esterilização em autoclave por 15 minutos à uma temperatura de 121º C, com exceção do RV que era autoclavado a 115ºC por 15 minutos conforme orientação do fabricante. Resfriava-se até 45º C e vertia-se em tubos ou placas de Petri, sempre próximo do bico/chama de Merck ou mesmo em fluxo laminar. Os tubos/placas eram identificados e colocados em estufa a 37º C por 24 horas para checar a esterilidade (ausência de colônia e integridade da coloração do meio) e depois armazenados em plástico e em geladeira de 4 a 8º C por uma semana. Os meios que não necessitavam de autoclavagem caldo tetrathionato (TT), ágar xilose lisina desoxicolato (XLD), ágar mannitol lysine crystal violet brilliant green (MLCB), solução salina (SS) 0,9% adquirida comercialmente, foram preparados seguindo a descrição supracitada, vidrarias e os materiais auxiliares eram autoclavados antes do preparo.

20

Figura 4 - Fluxograma dos procedimentos laboratoriais.

Fonte: Brasil, 2003; Andrews, Jacoson, Hammack, 2007, adaptado.

21

As análises microbiológicas do centro cirúrgico do hospital veterinário da UFPR foram realizadas com o intuito de se avaliar as condições higiênico-sanitárias, através de contagem de bactérias totais, para tanto utilizou-se três placas de Petri com ágar contagem padrão (ACP) e para verificar crescimento de Stafphylococcus spp. três placas de Petri contendo ágar baird parker (BP). As análises eram feitas uma vez por semana, totalizando 10 repetições. Essas placas foram identificadas, abertas e colocadas em locais prédeterminados como: porta externa do centro cirúrgico, internamente próximo a porta de entrada e abaixo da mesa cirúrgica. O tempo de exposição equivalia-se ao tempo de duração dos procedimentos cirúrgicos, após o término as placas eram fechadas, recolhidas, levadas ao laboratório e acondicionadas na estufa à 37ºC por 48 horas, na sequência realizava-se as leituras das mesmas para verificar o desenvolvimento de bactérias totais. Para a análise de Staphylococcus spp. as placas eram levadas ao laboratório e colocadas em estufa por 48 horas. Para a confirmação da presença de Staphylococcus spp. se fazia o teste de coagulase e o teste de catalase para confirmação da presença da Staphylococcus spp. Durante o período das cirurgias foram observados os profissionais que frequentavam o centro cirúrgico, com o intuito de avaliar o comprometimento da esterilidade do ambiente, do paciente e da equipe. Os resultados foram anotados em fichas de avaliação, pôde-se destacar que os itens que conferiam maior risco eram paramentação, uso de celulares, porta do centro cirúrgico (aberta ou fechada durante os procedimentos), contaminação da equipe (coçar olhos e nariz, retirar máscara, circular para o outro centro cirúrgico durante o procedimento com a mesma paramentação e retornar novamente para cirurgia) e estrutura física das salas cirúrgicas como as mesas, tetos, paredes e piso (constatou-se presença de mofos nas paredes e teto e azulejos rachados). As análises microbiológicas demonstraram a presença de fungos, bactérias totais e Staphylococcus spp. Estas foram quantificadas, identificadas e registradas. Não foi possível acompanhar o resultado final desse experimento.

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4.

REVISÃO DA LITERATURA

A carne é um alimento de alto valor nutricional, apresenta níveis consideráveis de vitaminas e minerais, sendo o zinco e o ferro considerados os de maior importância, além de conter aminoácidos de alto valor biológico (MAGNONI; PIMENTEL, 2006), devido a essa rica composição nutritiva e alta atividade de água, é também altamente perecível pela ação de microrganismos (ORDÓÑEZ, 2007). Quando a carne é processada via tratamento químico, biológico, físico, ou pela combinação destes métodos passa a ser chamada de produto cárneo. A finalidade do desenvolvimento de um produto cárneo é prolongar a sua vida útil, anulando ou reduzindo a ação de microrganismos e enzimas, mantendo sua qualidade nutricional e organoléptica, assim como sua integridade (TERRA; FRIES; TERRA, 2004). A carne suína é uma das mais consumidas no mundo, sendo que no mercado interno sua produção teve um acréscimo de 70%, de 2.556 toneladas no ano de 2000 para 3.643 toneladas no ano de 2015 (ABPA, 2016). No Brasil, 70% da produção é consumida na forma de embutidos ou produtos industrializados (SILVEIRA; TALAMINI, 2007). Existem diferentes tipos de produtos cárneos, entre eles os salames (produtos cárneos embutidos). Para a sua produção deve-se ter extremo cuidado para não ocorrer contaminação, devendo ser conhecida a origem da matéria prima, já que se trata de um alimento a base de carnes cruas, o que propicia considerável contaminação caso haja falhas nos cuidados higiênicos durante a preparação (ALMEIDA; GONÇALVES; FRANCO, 2002).

4.1

SALAME O salame é a mistura de carne crua suína ou composta de suíno e bovino,

adicionado de toucinho, sais, agentes de cura e temperos, embutido em envoltórios naturais ou artificiais, curado, fermentado, maturado, dessecado e submetido ou não a defumação. Como ingredientes opcionais podem possuir leite em pó, açúcares, maltodextrinas, proteínas lácteas, aditivos intencionais, vinho, condimentos, aromas e especiarias (BRASIL, 2000). Existem oito tipos de salames classificados de acordo com a legislação no Brasil sendo eles o italiano, milano, hamburguês, napolitano, friolano, calabrês,

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alemão e o salaminho. Suas características de identidade e qualidade estão definidas e diferem em relação à sua origem, granulometria da carne e do toicinho, características físico-químicas, com ênfase nos condimentos. Além destes, a legislação também define as características de identidade e qualidade de linguiça colonial, popularmente conhecida como salame tipo colonial (BRASIL, 2000). São dois os fatores que diferenciam estes produtos dos demais embutidos, o baixo teor de umidade e a presença de ácido láctico, que confere um sabor característico (GRIS; BORTOLUZZI, 2002). A fermentação ocorre por consequência da desidratação assim havendo uma grande produção de ácido lático (TERRA, 1998); Segundo Garcia, Gacleazzi e Sobral (2000) durante o processamento do salame ocorrem significativas perdas de peso e de umidade e esta perda de umidade associada à presença de sais, ocasiona redução de atividade de água. Quanto menor o pH, maior é a perda de água, levando a menores valores da mesma (NASSU; GONÇALVES; BESERRA, 2002). Então a redução da atividade de água somada a queda do pH consiste em dois empecilhos que se formam durante a produção e que são importantes para conferir solidez aos embutidos fermentados (GARCIA; GACLEAZZI; SOBRAL, 2000). Toda carne utilizada para produção de salames deverá ser submetida aos processos de inspeção descritos no Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal - RIISPOA (BRASIL, 1952). Conforme Terra, Fries e Terra (2004), o salame teve a sua fabricação iniciada no Brasil com a imigração italiana, no sul do país, região onde encontraram como aliado um clima propício para a produção caseira que, com o passar do tempo, deu origem as pequenas fábricas. O Brasil é considerado um grande produtor de embutidos cárneos, sendo que cada região possui suas peculiaridades, que estão relacionadas aos tipos de condimentos que cada embutido possui e também por sua composição, ainda são utilizados pelos fabricantes diferentes períodos de maturação, presença ou não do processo de defumação. A qualidade do produto final se dá pela sua atividade de água, umidade, quantidade de lipídios e açúcares que compõem o produto, além da cor e sabor característico (GRIS; BORTOLUZZI, 2002; CACCIOPPOLI et al, 2006). Como o salame é um produto bastante consumido no país e os consumidores tornam-se cada vez mais exigentes, as indústrias produtoras buscam melhoria na qualidade e redução de custo em seus processos (TERRA; FRIES; TERRA, 2004).

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Quando trata-se de produtos coloniais, esta imagem ainda está relacionada aos imigrantes europeus e aos seus descendentes, sobretudo os de origem italiana e alemã, que inicialmente se instalaram na Serra Gaúcha em fins do século XIX e que, no início do século XX, migraram para outras regiões constituindo as “colônias”. Na região, “colono” também é sinônimo de agricultor. Assim o produto “colonial” faz referência a certa cultura e tradição, ligada ao saber-fazer dos imigrantes europeus, ao seu modo de vida, as suas formas específicas de ocupar o território e fazer agricultura, atributos valorizados pelos consumidores. Então pelo termo “produtos coloniais” entende-se como um conjunto de produtos tradicionalmente processados no estabelecimento agrícola para o autoconsumo familiar, tais como o salames, queijos, doces e geleias, conservas de hortaliças, massas, biscoitos e açúcar mascavo. Devido a tradições culturais, é comum a produção de salame tipo colonial nos domicílios ou em indústrias familiares, onde o produto muitas vezes é manipulado manualmente sendo comercializado em feiras, supermercados e bancas de produtos coloniais localizadas ao longo de rodovias (OLIVEIRA; SCHMIDT; SCHMIDT, 2000; RITTER et al, 2003; MAGRO; KLEIN, 2006). Oliveira, Schmidt e Schmidt (2000) pesquisaram a valorização da imagem dos produtos coloniais junto aos consumidores, e essa se mostrou positiva em critérios como nutrição, saúde e honestidade. Sobre as vantagens dos produtos coloniais, a mais citada, de longe foi a de serem produtos saudáveis e naturais, vindo a seguir, as questões de preço e sabor. Os ingredientes presentes nos produtos cárneos fermentados são suficientes para dificultar o desenvolvimento de bactérias deteriorantes e da maioria dos patógenos. Porem estudos têm demonstrado que a sobrevivência de patógenos como Listeria spp., Salmonella spp. e Escherichia coli, podem ocorrer em produtos fermentados mesmo em condições desfavoráveis (LINDQVIST; LINDBLAB, 2009). A partir de 1961, culturas puras de microbiota útil passaram a ser disponibilizadas, facilitando a obtenção de salames com alta qualidade (TERRA, 1998), pois esses microrganismos ajudam na melhoria da qualidade e na obtenção de novos produtos cárneos fermentados (TERRA; FREITAS; CICHOSKI, 2007). Estas culturas puras são chamadas de cultivos iniciadores ou culturas inoculo, ou “starter” e são utilizadas para trazer mudanças metabólicas e sensoriais no alimento, geralmente acompanhadas de um efeito de preservação (BIASI et al, 2007; CAPLICE; FITZGERALD, 1999; HOLZAPFEL; GEISEN; SCHILLINGER, 1995).

25

A utilização dessas culturas tem permitido às indústrias, processos de fermentação e produtos mais seguros, confiáveis e uniformes, com menos tempo de fermentação, conseguindo produtos com melhores características nutricionais, sensoriais e microbiológicas (NASSU; GONÇALVES; BESERRA, 2002). Os microrganismos mais utilizados na fermentação de carnes pertencem aos gêneros Lactobacillus e Pediococcus, conhecidos como bactérias láticas. Além destas, também utilizam as do gênero Staphylococcus não patogênicas e Micrococcus. Algumas culturas comerciais utilizam a combinação das duas (BACUS, 1984). As características de bactérias láticas são bastonetes ou cocos Grampositivos (HALL; LEDENBACH; FLOWERS, 2001) geralmente mesofílas, podendo desenvolver-se em temperatura de 5ºC a 45ºC, com pH entre 4,0 e 4,5 (CAPLICE; FITZGERALD, 1999) e estes microrganismos são acrescentados aos produtos cárneos curados por terem capacidade de fermentar açúcares com produção de ácidos orgânicos, principalmente o ácido lático. Esse ácido influencia ativamente no sabor, coloração, fatiabilidade e no aroma do produto cárneo fermentado (DABÉS, 2000; TERRA, 1998). Impedindo o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis, como Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes (TERRA, 1998; TERRA; FRIES; TERRA, 2004). O grupo dos microrganismos flavorizantes é composto por leveduras, fungos filamentosos e pela família Micrococcaceae, sendo os gêneros Staphylococcus (Staphylococcus xylosus e Staphylococcus carnosus) e Kocuria (Kocuria varians). Estes microrganismos são adicionados aos produtos cárneos curados, pois ao seu metabolismo estão diretamente relacionados à coloração, o aroma e o sabor (TERRA; FRIES; TERRA, 2004).

4.2

MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS EM ALIMENTOS Os casos de doenças de origem alimentar (DTA) têm aumentado no mundo

e as causas são muitas e variadas. Conforme Leistner (2001), alguns fatores contribuem para o agravamento da situação como o crescimento cada vez maior da população mundial, a produção em massa de alimentos, o aumento do número de pessoas idosas em asilos e de bebês e crianças em creches. Alguns agentes causadores de doenças de origem alimentar possuem uma baixa dose mínima infectante, o que deve ser observado com rigor e especialmente no caso de indivíduos imunossu-

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primidos. Além da descoberta de novos tipos de agentes infectantes, capazes de se multiplicarem em temperaturas inferiores a 5ºC e pH abaixo de 5,0. Germano e Germano (2001) citavam que todos os anos, até 100 milhões de indivíduos adquirem doenças de origem alimentar decorrentes do consumo de alimentos e água. Há que se considerar que, de uma maneira geral, existe perda de informações epidemiológicas, assim subestimando-se o número real de casos. Estima-se que apenas de um a 10% dos casos sejam computados pelas estatísticas oficiais. Relatos nacionais e internacionais demonstram que a maioria dos casos de DTA não são notificados às autoridades sanitárias, pois muitos dos patógenos alimentares causam sintomas brandos, fazendo com que a vítima não busque auxílio médico. Em muitos países, inclusive no Brasil, os surtos notificados, geralmente, se restringem àqueles que envolvem um maior número de pessoas ou quando a duração dos sintomas é mais prolongada (GERMANO; GERMANO, 2001). Conforme os dados publicados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2016), o número de notificações vem diminuindo nos últimos anos (Gráfico 1), sendo que as regiões Sul e Sudeste notificaram 68,6% dos surtos (Gráfico 2), o que pode estar relacionado com a melhor implantação do sistema de vigilância epidemiológica nos municípios (BRASIL, 2008). Os embutidos estão registrados como 1,5% dos alimentos causadores DTA (Gráfico 3). Entretanto 90,5% dos surtos são causados por bactérias, onde a Salmonella é a principal envolvida nos surtos (Gráfico 4), sendo a diarreia um dos principais sintomas (Gráfico, 5) e as residências o local de maior ocorrência (Gráfico 6) (BRASIL, 2016).

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Gráfico 1: Série histórica de surtos por DTA. Brasil, 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

Gráfico 2: Distribuição dos surtos de DTA por região. Brasil, 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

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Gráfico 3: Distribuição de alimentos incriminados em surtos de DTA. Brasil 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

Gráfico 4: Agentes etiológicos responsáveis pelos surtos de DTA. Brasil 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

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Gráfico 5: Principais sinais e sintomas por surtos de DTA. Brasil 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

Gráfico 6: Principal local inicial a ocorrência por surtos de DTA. Brasil 2007 a 2016.

Fonte: SINAN/SVS, 2016.

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Segundo Pereira (2007) produtos cárneos como linguiças, hambúrgueres, salames e presuntos estão assiduamente associados a algum tipo de doença de origem alimentar. Para Matsubara (2005), como os animais de corte possuem sua própria microbiota natural acredita-se que há o envolvimento de carnes e produtos cárneos na ocorrência de doenças de origem alimentar contaminando as carcaças durante o abate, ou acabam sendo transferidos do ambiente contaminado para as mesmas pelo manipulador, utensílios, equipamentos ou mesmo pela água. A contaminação por microrganismos em produtos cárneos pode ocorrer desde a matéria prima até o consumo (BROMBERG, 2007). As infecções e as intoxicações alimentares em muitos casos podem ser atribuídas às práticas incorretas nas operações de processamento ou fornecimento dos alimentos, à falta de conhecimento quanto à manipulação dos mesmos e às instalações inadequadas (BROMBERG, 2007). A produção de embutidos com padrões de qualidades satisfatórios requer, a execução de fatores relacionados à qualidade sanitária da matéria prima, às condições de higiene e à tecnologia utilizada na sua fabricação, pois esta consiste na transformação das carnes in naturas em produtos alimentícios, realizando integralmente um ciclo que tem seu início na produção de carnes com qualidade (MARTINS, 2006; TERRA, 1998). A medida de controle da contaminação dos alimentos, deve ser sempre priorizada e observada a participação do manipulador, o qual representa um dos maiores fatores de importância no sistema de proteção dos alimentos às alterações, sendo o principal elo da cadeia de transmissão da contaminação microbiana dos alimentos (CURI, 2006). Produtos fermentados, como o salame, precisam de carnes de alta qualidade e a manutenção de padrões higiênicos elevados sendo pré-requisitos para sua produção com boa qualidade e segurança (OLIVEIRA; MENDONÇA, 2004), pois são considerados prontos para o consumo e não sofrem qualquer tipo de tratamento térmico prévio (TILDEN JUNIOR et al, 1996). O grupo dos aeróbios mesófilos é formado por todos os microrganismos capazes de crescer em temperaturas de 35-37° C em condições de aerobiose indicando a qualidade com que o alimento foi obtido ou processado. Sua presença em altas contagens é indicativa de procedimento higiênico inadequado na produção, no beneficiamento ou na conservação (COUTO, 2011).

31

Devido à baixa morbidade da intoxicação por Staphylococcus spp., os surtos acabam sendo subnotificados aos órgãos de Saúde Pública. As diarréias causadas pela E. coli apresentam distribuição mundial, contudo a real extensão da ocorrência não está dimensionada, principalmente devido à elevada subnotificação de casos (PEREIRA, 2006).

4.2.1

Grupo dos Coliformes São considerados microrganismos indicadores de ocorrência de contamina-

ção, quando presentes no alimento em certos níveis podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, provável presença de patógenos, deterioração do alimento, além de poder indicar deficiências higiênicas durante o processamento ou armazenamento do produto. São bactérias aeróbias ou não anaeróbias, Gram-negativas, não formadoras de esporos e fermentadoras da lactose, produzindo ácido e gás em até 48 horas a 35º C (KORNACKI; JOHNSON, 2001). Eles podem desenvolver em pH entre 4,4 e 9,0 e em temperatura que diferenciam entre -2ºC e 50ºC, entretanto, em alimentos, o crescimento é muito lento a 5ºC. Tem capacidade de crescer na presença de sais biliares, os quais inibem o crescimento de bactérias Gram-positivas (JAY, 2005). Bactérias patogênicas entéricas pode-se citar a Salmonella spp. e Shigella spp. (ALMEIDA et al, 1996), são pertencentes à família Enterobacteriaceae, podendo ser subdivididos em dois subgrupos: coliformes totais desenvolvem a 35º C/48 horas, originados do ambiente e utilizados como indicadores da qualidade higiênica dos alimentos e os coliformes termotolerantes desenvolvem a 45º C que são procedentes de uma contaminação fecal e usados como indicadores de condições sanitárias durante o processamento, produção ou armazenamento (FRANCO; LANDGRAF, 1996). As bactérias pertencentes a este grupo de 35º C são as Citrobacter. A denominação coliforme fecal foi utilizada durante muitos anos para descrever coliformes que continuam fermentando a lactose com produção de gás a 44-45,5º C (FRANCO; LANDGRAF, 1996). Escherichia coli e algumas cepas do gênero de Klebsiella e Enterobacter possuem esta característica de termotolerância, contudo somente E. coli tem como habitat primário o intestino humano e de animais. A Klebsiella e Enterobacter podem ser encontrados em outros ambientes, como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao das bactérias patogênicas de origem

32

intestinal. Portanto, não é correta a relação direta da presença de coliformes termotolerantes em alimentos e água com contaminação de origem fecal, o que levou à necessidade de modificação, na legislação brasileira, da denominação coliformes fecais para coliformes a 45º C (SILVA; CAVALLI; OLIVEIRA, 2006). Para Franco e Landgraf (1996) um microrganismo para ser considerado um bom indicador de contaminação de origem fecal deve possuir alguns requisitos como: 

Ter como habitat exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais;



Ter presença em grande quantidade nas fezes;



Apresentar-se resistente ao ambiente extra-intestinal;



Ser detectado e contado por técnicas rápidas, simples e precisas.

Conforme Smooth e Pierson (1997), através de pesquisas constataram que estes microrganismos se transformaram em uma ferramenta simples para controlar a condição higiênica dos alimentos.

4.2.2

Escherichia coli Utilizada para indicar contaminação fecal recente ou processos realizados

em condições insatisfatórias de higiene (FENG; WEAGANT; GRANT, 2002). Contagens elevadas de E. coli indicam processamento inadequado e/ou recontaminação pós-processamento, sendo as causas mais frequentes aquelas provenientes da matéria prima, equipamento sujo ou manipulação sem higiene (TILDEN JUNIOR et al, 1996). Embora a maioria das cepas de E. coli não seja considerada patogênica, estes microrganismos podem agir como patógenos oportunistas, causando infecções em hospedeiros imunodeprimidos. Também existem cepas patogênicas que quando ingeridas, causam problemas gastrointestinais em indivíduos saudáveis (FENG; WEAGANT; GRANT, 2002). Segundo Germano e Germano (2001) a E. coli não apresenta resistência a temperaturas elevadas, sendo destruída a 60º C em poucos segundos e capaz de resistir por longo tempo em temperaturas de refrigeração. O significado da sua presença em um alimento deve ser avaliada sob dois aspectos. Inicialmente por ser uma enterobactéria, que quando detectada no alimento indica que o mesmo apresenta contaminação microbiana de origem fecal e portanto, está em condições higiênicas ineficazes. Outro aspecto é que diversas linha-

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gens são comprovadamente patogênicas para o homem e os animais (FRANCO; LANDGRAF, 2005). As linhagens consideradas patogênicas são agrupadas em seis classes: E. coli enteropatogênica clássica (EPEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC) e a E. coli difusamente aderente (DAEC). Dentre as inúmeras cepas enterovirulentas, a que estabelece maior preocupação para as autoridades de saúde é a E. coli O157:H7, responsável pela forma enterohemorrágica da infecção, tendo sido identificada em 1982, associada com surtos de colite hemorrágica. Os quadros clínicos das infecções dependem das cepas e de suas patogenicidades e virulências, bem como da idade e do estado imune dos pacientes. Qualquer alimento exposto a contaminação fecal, seja através de preparo ou dos manipuladores infectados, é capaz de propagar a bactéria (GERMANO; GERMANO, 2001). Segundo Germano e Germano (2003) os microrganismos enteropatogênicos tem período médio de incubação de 36 horas (17 a 72 horas) e caracteriza-se por diarréia aquosa com grande quantidade de muco, náuseas, dores abdominais, vômitos, cefaléia e febre. Não é comum diarréia com sangue. A remissão dos sintomas dá-se, geralmente em 24 horas, mas pode ocorrer entre seis horas e três dias. Já a enterotoxigênica tem período de incubação que varia de oito a 44 horas, com média de 26 horas e os sintomas principais são diarréia aquosa, febre, cólicas abdominais, mal-estar e náuseas. Nos casos mais graves, a intensidade e o aspecto da diarréia assemelham-se à dos quadros clínicos de cólera, levando o paciente à desidratação. A duração da doença pode variar de três a 19 dias. Os entero-hemorrágicos seus primeiros sintomas ocorrem geral, quatro dias após a ingestão do alimento contaminado, mas pode variar de três até nove dias. O quadro de colite hemorrágica caracteriza-se por diarréia sanguinolenta profusa, dor abdominal intensa e vômitos, na ausência de quadro febril. A síndrome urêmica hemolítica (SUH) apresenta diarréia sanguinolenta, evoluindo para nefropatia aguda, provocando convulsões, conduzindo ao coma e morte. Os pacientes que conseguem superar a doença recuperam – se de dois a nove dias. Para as enteroinvasivas o período médio de incubação é de apenas 11 horas, embora possa variar de oito a 24 horas. Os sintomas principais são diarreia profusa ou disenteria, cólicas abdominais, febre, cefaléia e mialgia. Muco e sangue podem ser encontrados nas fezes dos pacientes. A recuperação, de modo geral é lenta e pode demorar até algumas semanas.

34

4.2.3

Salmonella spp. Pertencente à família “Enterobacteriaceae”, morfologicamente são bactérias

Gram-negativas, anaeróbicas facultativas que apresentam forma em bastonetes e geralmente móveis, exceto os sorovares Pullorum e Galinarum. São catalase positivas, oxidase negativas, anaeróbias facultativas, com metabolismo respiratório e fermentativo, capazes de formar ácido e na maioria das vezes, gás a partir da glicose, com exceção de S. Typhi, S. Pullorum e S. Gallinarum (PAULA, 2002; LEVINSON, 2005; BRASIL, 2011). A maioria das salmonelas de interesse clínico não fermentam lactose, entretanto, muitas cepas podem adquirir essa característica. Apresentam ainda como características metabólicas a capacidade de descarboxilação dos aminoácidos lisina e ornitina, redução de nitrato a nitrito e utilização do citrato como única fonte de carbono, podendo ocorrer variações em função do sorovar e/ou da subespécie (BRASIL, 2011). Segundo Paula (2002) a Salmonella spp. é eliminada em grande número nas fezes, contaminando o solo e a água. O tempo de vida no meio ambiente pode ser muito longo, em particular na matéria orgânica. Pode permanecer viável no material fecal por até anos, particularmente em fezes secas. Os produtos agrícolas não processados, como hortaliças e frutas e os alimentos de origem animal, como as carnes cruas, leite e ovos são portadores frequentes de salmonelas. São responsáveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou por doenças de transmissão alimentar. Sua distribuição é mundial, sendo os alimentos os principais veículos de transmissão. São responsáveis por significantes índices de morbidade e mortalidade, tanto nos países emergentes quanto nos desenvolvidos, determinando pequenos e grandes surtos, envolvendo principalmente, o consumo de alimentos de origem animal, como ovos, aves, carnes e produtos lácteos (PAULA, 2002). Sua adaptabilidade fisiológica é demonstrada pela habilidade para multiplicar-se em valores de pH entre 7,0 e 7,5 sendo os extremos 4 e 9,5, a temperatura ideal para crescimento é de 35º C a 43º C, sendo os extremos 5º C a 46º C. Esta bactéria é sensível ao calor, não sobrevivendo a temperatura superior a 70ºC. Entretanto, a termorresistência pode incrementar-se com menor coeficiente de atividade de água. Certos processos como salmoura e defumação tem efeito limitado na sua sobrevivência, elas não toleram concentração de sal superior a 9% e o nitrito

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possui efeito inibitório de crescimento. Podem sobreviver por vários meses na salmoura com cerca de 20% de sal e em produtos de elevados teores protéicos ou de gordura e apresentam capacidade de sobrevivência de semanas a meses. A relativa resistência que esses microrganismos apresentam a dessecação, congelamento, salmoura e defumação explicam por que sobrevivem em muitas classes de alimentos. O efeito bactericida das condições ácidas varia de acordo com a natureza do ácido utilizado no processo, sendo que os ácidos acético e propiônico são mais inibitórios que os ácidos lático e cítrico (LEVINSON, 2005). As doenças de origem alimentar resultam da ingestão de alimentos possuindo número significativo de determinadas linhagens do gênero (JAY, 2005). Os microrganismos penetram por via oral, invadindo a mucosa intestinal, com disseminação para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente, o quadro diarreico é moderado, sem a presença de sangue, porém, em alguns quadros clínicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de fezes associado a tenesmo e sangue (BRASIL, 2011). As doenças provocadas por Salmonella spp. costumam ser subdivididas em três grupos: a febre tifoide causada pela Salmonella typhi, febres entéricas causadas pela Salmonella paratyphi (A, B e C) e as enterocolites, também chamadas de salmoneloses, (FRANCO; LANDGRAF, 2005). Outro aspecto levantado pelo por Franco e Landgraf (2005) referente a febre tifóide, que essa só atinge homens e sua transmissão ocorre através de água e alimentos contaminados com material fecal humano. Os sintomas são graves e incluem septicemia, febre alta, diarreia e vômito, que possuem duração de uma a oito semanas. Possui alta taxa de mortalidade (JAY, 2005). As febres entéricas são semelhantes à febre tifóide, mas os sintomas são mais brandos, geralmente ocorrendo septicemia, febre, vômito e diarreia, que possuem duração de no máximo três semanas (FRANCO; LANDGRAF, 2005). Germano e Germano (2001) mencionam que as salmoneloses caracterizamse por sintomas como diarreia, febre, dores abdominais e vômito, geralmente acompanhados por fraqueza, fadiga muscular, nervosismo e sonolência (JAY, 2005). Estes sintomas aparecem de 12 a 36 horas após o contato com o microrganismo, durando entre um e quatro dias (FRANCO; LANDGRAF, 2005; GERMANO; GERMANO, 2001). A patogenicidade e o estabelecimento dos sintomas, bem como a sua gravidade, variam de acordo com o sorotipo de Salmonella spp., idade e condições de

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saúde do hospedeiro (FRANCO; LANDGRAF, 2005; GERMANO; GERMANO, 2001) e as características do alimento envolvido (FRANCO; LANDGRAF, 2005). Profissionais que manipulam produtos de origem animal precisam saber das normas de educação e higiene no manuseio de alimentos pois eles representam os principais aspectos para minimizar o risco de transmissão alimentar (JAY, 2005). Ainda que os microrganismos sejam eliminados rapidamente do trato intestinal, mais de 5% dos pacientes tornam-se portadores assintomáticos após a cura da doença, possuindo um papel importante na sua disseminação (JAY, 2005). Com exceção dos poucos sorovares adaptados a espécie humana, não há dúvida de que o homem contrai a infecção, cuja manifestação clínica é gastroentérica, usualmente resultante do consumo de alimentos de origem animal (BRASIL, 2011). Existe uma dificuldade de adoção nas medidas de prevenção e de controle como por exemplo a correta lavagem das mãos dos manipuladores de alimentos, cuidados desde a recepção da matéria prima até o preparo e consumo do alimento, correta higienização dos utensílios e dos equipamentos e o consumo de água potável (ORDEÑEZ, 2007). 4.2.4

Staphylococcus coagulase positiva Os Staphylococcus spp. são cocos Gram-positivos, pertencentes a família

Microccaceae, imóveis, catalase positivos, aeróbios e anaeróbios facultativos. Apresentam metabolismo de carboidratos oxidativo e fermentativo, com produção de ácidos (HOLT; KRIEG; SNATH, 1994). São bactérias mesófilas, se desenvolvendo em temperatura de 7ºC a 47,8ºC. São microrganismos considerados atípicos, pois são capazes de crescer em níveis baixos de atividade de água, toleram pH entre 4,5 e 9,5, sendo o ideal entre 7,0 e 7,5. São resistentes a concentração de 10% a 20% de NaCl e a nitratos, o que torna os alimentos curados potencial veículos do patógeno (FRANCO; LANDGRAF, 2008). Bactérias do gênero Staphylococcus são ubiquitárias e impossíveis de serem totalmente eliminadas do meio ambiente. Muitas das espécies e subespécies deste gênero são potencialmente encontradas em alimentos contaminados a partir do ambiente, humanos e animais (FDA, 2012). Existem duas categorias de microrganismos empregados como culturas “starters”, utilizadas na elaboração de produtos fermentados permitindo uniformidade

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entre eles, redução do tempo de fermentação e conservação do produto. Estes microrganismos são bactérias ácido lácticas que contribuem para a qualidade e estabilidade do produto e a Staphylococcus coagulase negativa responsáveis por estabilizar a cor, prevenir a rancificação e realçar compostos aromáticos dos produtos cárneos (CIROLINI, 2010). Várias espécies já foram isoladas de embutidos fermentados. Todavia a Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus epidermidis são encontradas na pele de humanos e animais domésticos e já foram isolados de infecções urinárias de humanos. O aparecimento destas espécies nos produtos embutidos são provavelmente, oriundos da pele de suínos ou da manipulação humana durante a fabricação. A adição dessas cepas como alternativa de processamento não deve ser realizada, uma vez que Staphylococcus são patógenos oportunistas. Por isso a caracterização pelos métodos fenotípicos e moleculares de microrganismos utilizados como culturas “starters” se faz necessária para garantir a segurança do alimento e do consumidor (FIORENTINI, 2009). A gastroenterite estafilocócica ocorre pela ingestão de alimentos que contenham uma ou mais toxinas as quais são produzidas por algumas espécies e variedades deste gênero. São descritos cinco subtipos de enterotoxinas estafilocócicas (A, B, C123, D, E) e recentemente outras foram descobertas (G, H, I) (FDA, 2012). Outro aspecto levantado por FDA (2012) por acreditar que a produção de enterotoxina esteja associada com as estirpes da Staphylococcus aureus que produzem coagulase e termonuclease (TNase), muitas espécies desse gênero que não possuem essa característica são reconhecidas como produtoras de enterotoxinas. Sabe-se que pelo menos 18 espécies oferecem risco para os alimentos. Seis delas são coagulase e TNase positivas e 10 espécies não possuem estas características. As enterotoxinas são termoestáveis e produzidas entre 10ºC e 46ºC, os extremos de temperatura são dependentes dos demais parâmetros que devem estar em condições ótimas. No entanto, quanto menor for a temperatura, maior será o tempo para produção de toxina. Em condições ótimas, a enterotoxina é detectada no alimento após quatro a seis horas. A termorresistência é um fator importante na indústria de alimentos, pois na maioria dos casos, o alimento sofrerá algum tipo de tratamento térmico no processamento, o qual eliminará o microrganismo, não inativando a toxina (FRANCO; LANDGRAF, 2008).

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A quantidade mínima de enterotoxina necessária para causar sintomas nos seres humanos é de 20 ng. Este nível é atingido quando as populações excedem 100.000 (105) bactérias por grama de alimentos (FDA, 2012). Em 2011, a ANVISA estabeleceu na legislação a enumeração de somente Staphylococcus coagulase positiva tendo por objetivo substituir a exigência do controle de Staphylococcus aureus (BRASIL, 2001). Nela a determinação da capacidade de produção de termonucleases e de toxinas estafilocócicas das cepas isoladas podem ser realizadas a fim de se obter dados de interesse à saúde pública. O aparecimento dos sinais de intoxicação alimentar por Staphyfilococcus geralmente é rápido, quatro horas após a ingestão. Este período da ingestão até a manifestação dos sintomas depende da susceptibilidade do indivíduo à toxina, da quantidade de alimento com toxina ingerido e da saúde geral do indivíduo. Os sintomas mais comuns são náuseas, vômitos, cólica abdominal e prostração. Em casos mais graves pode ocorrer dor de cabeça, cãibra muscular, alterações transitórias da pressão arterial e frequência cardíaca. A recuperação geralmente ocorre em até dois dias, sendo a taxa de mortalidade muito baixa. A vítima não adquire imunidade contra novas exposições à toxina (JAY, 2005; SILVA et al, 2010). Para evitar que Staphylococcus spp., seja um perigo à saúde dos consumidores, certos aspectos devem ser observados: refrigeração adequada do alimento, manutenção em temperaturas acima de 60º C, evitar preparo com muita antecedência, cozimento adequado, higiene rigorosa, evitar contato dos manipuladores que apresentem infecções respiratórias, distúrbios gastrointestinais, lesões de pele, evitar tocar no alimento que não será submetido ao tratamento térmico, combater moscas e investir em educação sanitária (JAY, 2005). Vários trabalhos destacam os manipuladores como principais responsáveis pela contaminação dos alimentos. Alimentos que exigem manuseio considerável durante a preparação e que são mantidos a temperaturas ligeiramente elevadas após a preparação são frequentemente envolvidos em intoxicação alimentar estafilocócica (FDA, 2012). Devido à baixa severidade da intoxicação estafilocócica, os surtos acabam sendo subnotificados aos Órgãos de Saúde Pública (PEREIRA, 2006). Em 2012, conforme relato da Secretaria Estadual da Saúde do Rio Grande do Sul, 80 pessoas adoeceram com sintomas da intoxicação após consumo de linguiça defumada e salame tipo italiano (SECRETARIA ESTADUAL DA SAÚDE, 2012).

39

5.

OBJETIVOS

5.1

OBJETIVO GERAL Avaliar a qualidade das condições higiênico-sanitárias das amostras de

salames comercializados clandestinamente na região de Curitiba-PR.

5.2

OBJETIVO ESPECÍFICO Pesquisar através da avaliação de características fenotípicas e bioquímicas,

por meio da enumeração de coliformes totais, Escherichia coli e Staphylococcus coagulase positiva e pesquisar a presença de Salmonella spp. nos salames comercializados clandestinamente na região de Curitiba.

Verificar se o salame colonial comercializado clandestinamente na região atende aos padrões estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) contidos na Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 12, de janeiro de 2001.

40

6.

MATERIAL E MÉTODOS Foram adquiridas no comércio varejista local, sete amostras de salames

coloniais de três diferentes produtores, Bairro Alto (BA), Colombo (C) e Campina Grande do Sul (CGS); totalizando 21 amostras. As amostras foram adquiridas semanalmente, identificadas e armazenadas em geladeira em temperatura de 4 a 8ºC, até o momento da análise. A vidraria utilizada no experimento foi previamente esterilizada em autoclave a 121ºC por 15 minutos e secadas na estufa a 100ºC por uma hora e mantida a 60ºC por quatro horas. As soluções, reagentes, meios de cultura e materiais descartáveis foram preparados conforme suas especificações e em quantidades suficientes para o uso durante uma semana. Os meios preparados para análise foram Agar Base Baird Parker (BP), Solução Salina 0,9% (SS), água peptonada 1%, Caldo cérebro e coração (BHI), para análise de Staphylococcus spp. e para confirmação do teste de coagulase positiva utilizou-se o plasma de coelho cedido pela empresa Laborclin. Para a análise de Salmonella spp., foram utilizados os meios de cultura: água peptonada 1%, Tetrathionate Broth Base (TT), Caldo Rapapport-Vassiliadis (RV), Ágar Manitol Lisina Cristal Violeta Verde Brilhante (MLCB), Ágar de Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Ágar Lisina Ferro (LIA), Tríplice Açúcar Ferro (TSI). Para coliformes totais e Escherichia coli utilizou-se a placa petrifilm EC (3M Company). Todas as amostras foram preparadas em ambiente asséptico, com a sanificação da bancada com álcool 70%, forrada com papel kraft. Para a realização da análise, foi necessário fatiar os salames em tábua de vidro, com auxílio de facas, garfos e luvas cirúrgicas, todos estéreis. O manipulador utilizou máscara, touca e jaleco para evitar contaminação por contato. Foram retiradas de cada fatia dos salames porções dos miolos com auxílio de garfos, os mesmos foram armazenados em embalagem plástica estéril e posteriormente, pesados em balança digital. Para cada sub-amostra, as embalagens foram identificadas e os materiais utilizados substituídos por outros estéreis, isto para não ocorrer contaminação cruzada de um produto para o outro. O restante dos salames, permaneciam armazenados em geladeira a temperatura de 4 a 8ºC em sacos plásticos estéreis e identificados com a mesma numeração da sub-amostra.

41

Para contagem de Staphylococcus coagulase positiva, quantificação de coliformes totais e Escherichia coli, foram pesados 25 g de salame em embalagem plástica estéril e em seguida adicionou-se 225 mL de Água Peptonada 1% (APT). Posteriormente realizou-se a homogeneização das amostras (ANDREWS et al, 2007). À partir da suspensão, foram realizadas diluições nos tubos com tampa, utilizando-se 9 mL de solução salina a 0,9% adicionando 1mL da diluição anterior, sendo que as diluições iniciaram em 10-1 a 10-6. A partir dessas, foram pesquisados e enumerados Staphylococcus coagulase positiva, coliformes totais, Escherichia coli e pesquisou-se a presença de Salmonella spp. As análises para contagens de Staphylococcus coagulase positiva foram realizadas conforme recomendações do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2003), já para coliformes totais e E. coli foram realizados conforme instruções do fabricante (3M Company) e Salmonella, seguiu-se a metodologia de análise desenvolvida segundo Andrews et al, 2007. Para análise de Staphylococcus coagulase positiva distribuiu-se 0,1mL da amostra, com auxílio de um bastão em L, em placa de Petri com Ágar BP pipetando do mais diluído para o menos (10-6 até 10-1), sempre ao redor do bico de Merck e incubados em estufa a uma temperatura de 35-37º C por 48 horas. A ocorrência da formação de colônias nas placas de Petri, podem ser classificadas como típicas (identificadas com dois halos) e atípicas (ausência de halos) conforme demonstrado na Figura 5, onde os halos estão indicados com a seta vermelha e as que não possuem halos com a seta de cor azul. Coletou-se três colônias típicas e em mesma quantidade atípicas da placa e cada colônia foi inserida em tubos contendo BHI, todos identificados (número da amostra, T para típicas e a A para atípicas e divididas em a, b e c). Incubavam-se as amostras em estufa a temperatura de 35-37º C por 24 horas. Para confirmar a presença de Staphylococcus realizou-se o teste de coagulase, transferindo-se 0,3 mL de cada tubo de cultivo BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho com incubação a 36ºC, por seis horas após esse período observava-se a formação de coágulo e no caso da não observação incubava-se por 24 horas. A não formação de coágulo era indicativa de prova negativa (Figura 6). Para o teste de produção de catalase homogeneizou-se em lâmina uma colônia a uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2), com auxílio de uma alça de platina. A formação de bolhas indicava prova positiva.

42

Figura 5 - Diferença entre bactérias Staphyloccus spp. típicas (seta vermelha) e atípicas (seta azul).

Figura 6 - Resultado positivo de teste de Staphylococcus coagulase positivo.

43

Para a análise de coliformes totais e Escherichia coli, à partir da mesma diluição, distribuía-se 1mL em placas petrifilm pipetando do mais diluído para o menos (10-6 até 10-1). A incubação em estufa era de 35-37º C por 24 a 48 horas. Após este período realizava-se as leituras e as identificações das bactérias. Para contagem de Salmonella spp. utilizou-se o mesmo procedimento, distribuiu-se 25 g de amostra e adicionou-se 225 mL de água peptonada a 1% em saco de amostra estéril, homogeneizou-se e colocou-se na estufa para incubação a uma temperatura de 35-37º C por 24 horas para pré-enriquecimento. No enriquecimento seletivo, pipetou-se da mistura pré-enriquecida 1 mL e transferiu-se para tubos de ensaio contendo 10 mL de Tretrationato (TT) e 0,1 mL no tubo de caldo Rappaport-Vassiliadis (RV), sendo três tubos de TT e três tubos de RV, levando-os para a estufa a 42º C por 18 a 24 horas para incubar. Para o plaqueamento seletivo, os caldos de enriquecimento foram estriados na superfície das placas de Petri XLD e MLCB, com auxílio de alça de platina. As placas de Ágar (XLD e MLCB) foram divididas em duas partes e identificadas como TT e RV (Figura 7). Em seguida transferia-se para estufa a uma temperatura de 3537º C por 24 horas para que fossem incubadas.

Figura 7 - Placas contendo ágares XLD e MLCB.

44

Para a identificação bioquímica (RV e TT) se observasse o desenvolvimento de Salmonella spp. as colônias características observadas em ágar XLD apresentavam coloração vermelha e com centros pretos e no ágar MLCB coloração roxas-enegrecidas (Figura 8). Caso verificasse a presença do microrganismo, coletava-se de três a cinco colônias e transferia-se cada colônia para um tubo de TSI e outro de LIA, sempre identificando os tubos com o tipo de amostra e seus números respectivos, sendo os mesmos incubados a 35ºC por 24 horas.

Figura 8 - Colônias características de Salmonella spp.

45

Caso apresentasse aspecto característico deveria ser feito o teste de soroaglutinação (Figura 9) que consiste em um soro polivalente específico para Salmonella spp.. Neste caso, colocava-se com auxílio de alça de platina uma colônia e tranferia-a para uma lâmina adicionando uma gota deste soro, realizando suaves movimentos circulares por dois minutos ou até aglutinar.

Figura 9 - Teste de soroaglutinação positiva para Salmonella spp.

46

7.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 21 amostras analisadas para coliformes totais e E. coli, todas apresentaram resultado inferior a 1,0x101 UFC/g de salame. Para a pesquisa e quantificação de Staphylococcus spp., 19 amostras apresentaram resultado inferior a 1,0 x 102 UFC/g de salame, uma amostra adquirida no município de Campina Grande do Sul apresentou 5,0 x 103 UFC/g de salame e outra adquirida no município de Colombo apresentou 4,3 x 107 UFC/g de salame. Das 21 amostras avaliadas, 20 apresentaram ausência de desenvolvimento para Salmonella spp. e uma amostra adquirida no município de Campina Grande do Sul, revelou resultado positivo para a bactéria pesquisada. Tabela 1 – Resultados obtidos dos salames através das análises realizadas nesta pesquisa.

Regiões de

Número de

Curitiba

amostras

Colombo

Bairro Alto

Campina Grande do Sul

Coliformes totais

21

----

----

---

Coliformes

21

1,0x101

1,0x101

1,0x101

2

4,3 x 107

termotolerantes Staphylococcus

5,0 x 103

coagulase positiva Salmonella spp.

1

+

Não há parâmetro estabelecido pela Legislação Nacional (BRASIL, 2001) para contagem de coliformes totais em amostras de salame, já para coliformes termotolerantes o limite máximo é de 1,0x103. Para Staphylococcus coagulase positiva, o limite máximo tolerado é de 5,0x103 e para pesquisa de Salmonella spp. o resultado deve ser ausência em 25g. Diferente dos resultados observados por Silva et al. (2006) no qual houve a presença de coliformes termotolerantes em diferentes tipos de alimentos, de 56 amostras de linguiça analisadas, 26 apresentavam presença de coliformes termotolerantes, sendo que em 20 destas havia presença de E.coli, mas apenas 13 amostras apresentavam contagem acima dos limites estabelecidos pela legislação vigente ANVISA e todas essas 13 amostras apresentavam E. coli. Marques et al. (2006) rela-

47

tou que coletara 40 amostras para verificar presença de coliformes termotolerantes nas quais obteve um resultado de 14 amostras que se encontravam fora dos padrões vigentes estabelecidos pela ANVISA. A contagem de coliformes totais é importante para estimar a condição higiênica da preparação dos alimentos, bem como as condições da matéria prima (JAY, 2005). Os salames avaliados apresentaram resultados que revelam excelentes condições de preparo e matéria prima no tocante a contaminantes ambientais, assim como todas as amostras avaliadas apresentaram resultados dentro dos padrões estabelecidos pela Legislação para contagem de E. coli que é considerada o real indicador sanitário no grupo dos coliformes termotolerantes (JAY, 2005), já para Staphylococcus coagulase positiva houve uma amostra que ultrapassou os limites estabelecidos e outra apresentou-se no limite máximo para consumo, as outras 19 análises apresentaram resultados abaixo dos limites estabelecidos, ainda com relação à Salmonella spp. uma das amostras apresentou-se imprópria ao consumo humano. Biasi et al. (2007), Nassu, Gonçalves e Beserra (2002), referem que a atividade metabólica das bactérias láticas tornou-se essencial para o controle do crescimento espontâneo de microrganismos patogênicos e/ou a deterioração bacteriana, os valores encontrados para a contagem de Staphylococcus spp. coagulase positiva na presente pesquisa levam a suposição de que a atividade inibitória das bactérias láticas tenha sido 100% efetiva nas 19 amostras. Dalla Santa (2008), Perazzoli e Gelinski (2006) relataram que nas amostras de salames coloniais, como não há adição de cultura “starter”, a fermentação se dá através da microbiota de crescimento espontâneo da matéria prima, ocasionando um menor controle de microrganismos patogênicos e/ou de deterioração bacteriana. Consequentemente esperava-se contagens maiores de Staphylococcus spp. coagulase positiva nas amostras deste estudo. Os resultados foram semelhantes aos observados por Pereira (2006) quando analisou salames industrializados relatando a presença de Staphylococcus spp. em uma amostra. Ao contrário de Dalla Santa (2008) com salames coloniais que encontrou ausência em 100% das amostras analisadas. Segundo Gottardo et al. (2011) das 60 amostras de embutidos cárneos fermentados artesanais analisados na região oeste do estado do Paraná, foram obtidas contagens de coliformes a 45°C acima do padrão da legislação brasileira em 18,3% das amostras e de Staphylococcus coagulase positiva em 16,7%, indicando

48

que as condições gerais de higiene e manipulação desses produtos não foram satisfatórias. Seis amostras apresentaram contagem superiores a 10 5UFC/g o que poderia

representar

risco

à

saúde

do

consumidor

caso

a

cepa

fosse

enterotoxigênica. Em 8,3% das amostras foi detectada a presença de Salmonella spp., o que tornaria esses produtos impróprios para consumo. Em contradição a esta pesquisa, Andreoli (2009) relatou que de 75 amostras analisadas, 58 apresentaram-se fora do padrão estabelecido na legislação (BRASIL, 2001), cinco amostras fatiadas na indústria e uma amostra fatiada no varejo apresentaram contaminação compatível com produção de enterotoxina, passíveis de causar danos à saúde do consumidor. A contaminação por Salmonella spp. e Staphylococcus spp. podem ser minimizadas por meio de um controle regular de qualidade de matérias-primas, ingredientes e insumos e com a implantação e implementação das boas práticas de fabricação contemplando os processos e pessoas envolvidas na produção, distribuição e comercialização destes produtos (SILVA; GANDRA, 2004).

49

8.

CONCLUSÃO

Embora os resultados referentes a coliformes totais e E. coli terem se revelado dentro dos limites aceitáveis pela legislação, há risco sanitário ao ingerir salames produzidos clandestinamente na região de Curitiba ao se considerar as amostras avaliadas neste estudo, onde duas amostras estavam em desacordo com a legislação. É recomendada a intensificação das ações de inspeção e vigilância sanitária na região a fim de coibir que tais práticas continuem a ocorrer, colocando em risco a saúde da população consumidora.

A adaptação dos pequenos

produtores às legislações vigentes é necessária, desde a regularização quanto ao registro, aquisição de matérias primas, insumos, embalagens oriundos de empresas regularizadas, passando pelos treinamentos e desenvolvimento de manuais de boas práticas de fabricação, rotulagem e comercialização dentro do período de validade para que possam oferecer um produto seguro ao consumidor. É importante que mais estudos sejam realizados nesse campo de trabalho, já que o consumo se dá por ampla parcela da comunidade.

50

9.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este estágio foi de suma importância para que eu aprendesse em prática como o médico veterinário atua em laboratório de Controle de Qualidade e Segurança de Alimentos de Origem Animal. Para minha vida profissional houve um acréscimo significativo, pois eu ainda não tinha esta experiência em currículo e no qual fiquei encantada com esta área, pretendendo seguir carreira. Para minha vida pessoal foi de extrema importância, pois convivi com profissionais de alta qualidade; são pessoas muito queridas, prestativas e de uma simplicidade admirável. Só tenho a agradecer a todos que convivi neste período e que gostaria de continuar com a amizade.

51

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