MARIA CURIE-SKŁODOWSKA UNIVERSITY INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY Department of Virology and Immunology Akademicka 19, 20-033 Lublin, Poland Fax: 81 537 59 59, tel 81 537 59 40

Ocena przeciwwirusowej i immunomodulacyjnej aktywności trójterpenów izolowanych z kory brzozy (Betula alba) i jemioły (Viscum album) Część I Trójterpeny pentacykliczne są to związki posiadające 30-węglowy szkielet złożony z 4 pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. Występują one w wielu roślinach i posiadają aktywność przeciwzapalną, przeciwwirusową i przeciwnowotworową (7,16,17,18,21) Ich przeciwwirusowe działanie skierowane jest w stosunku do wirusów, których genom zbudowany jest z RNA jak i DNA, i które należą do różnych rodzin (systematyka wirusów). Na przykład, hamują one replikację wirusa ospy wietrznej i półpaśca, zapalenia wątroby typu A, opryszki, krowianki, adenowirusa typu 5, reowirusów, wirusa poliomyelitis, wirusa Semliki Forest (2,3,4,5,13,14,15). Szczególnie interesujące jest to, że betulina i kwas betulinowy izolowane z kory brzóz Betula alba oraz ich pochodne są aktywne przeciw wirusowi HIV (ludzkiego niedoboru odporności), rodzina Retroviridae (1,8,9,10,11,20). Bardzo interesujący jest fakt, że pochodne betuliny i kwasu betulinowego hamują wiele etapów replikacji tego wirusa w komórkach ludzkich. Są więc inhibitorami enzymu wirusa - odwrotnej transkryptazy, hamują dojrzewanie cząstek wirusa i jego uwalnianie z zakażonej komórki. Skąpe doniesienia na temat przeciwwirusowej aktywności tych substancji w stosunku do innych patogennych dla człowieka i zwierząt wirusów zostały w naszych badaniach poszerzone o ich działanie na wirusy należące do rodziny Picornaviride (wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego) i Rhabdoviride (wirus pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła). Należy podkreślić, że do tej ostatniej rodziny należy także wirus wścieklizny. Do naszych doświadczeń zostały użyte trójterpeny: betulina i kwas oleanolowy izolowane z kory Betula alba i oczyszczone przez inż. Stanisława Pielę z firmy "Sylveco", Jasionka, oraz kwas betulinowy firmy Sigma. Jak wykazały badania identyfikacyjne i porównawcze laboratorium Chemii Organicznej Politechniki Rzeszowskiej betulina przygotowana przez inż. Pielę jest preparatem bardzo wysokiej

czystości. Potwierdziliśmy to porównując preparat betuliny "Sylveco" ze standardem betuliny (Sigma) w chromatografii cienkowarstwowej (TLC) na płytkach Kieselgel 60 (Merck) stosując jako eluent chloroform/octan etylu (10:1). Preparat "Sylveco" i wzorzec wykazywały identyczne Rf (retention factor) i nie stwierdzono plamek żadnych innych substancji po wywołaniu płytek jodem. Natomiast kwas oleanolowy "Sylveco" zawierał pewne zanieczyszczenia betuliną, co stwierdzono w w/w laboratorium Politechniki Rzeszowskiej i co potwierdziły nasze analizy TLC. Jako wirusów testujących użyto: wirus pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (Versicular stomatitis virus - VSV) i wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (Encephalomyocarditis virus EMCV). Fibroblasty skóry ludzkiej (HSF) były stosowane jako komórki do mierzenia efektów cytotoksyczności wpływu badanych substancji na replikację wirusów. Wirusobójcza aktywność betuliny, kwasu betulinowego i kwasu oleanolowego polegająca na bezpośrednim niszczeniu wirusów była niewielka, np. 26 mg/ml betuliny inaktywowało 50% cząsteczek wirusa VSV. Powodem małej aktywności wirusobójczej badanych substancji była prawdopodobnie ich słaba rozpuszczalność w wodzie, powodująca wytrącanie się trójterpenów w płynie hodowlanym. Natomiast w innym doświadczeniu stwierdzono, że wszystkie trzy badane trójterpeny hamowały replikację obydwu wirusów obniżając ich miano o 50% (EC50) przy stężeniach substancji poniżej 1,3 mg/ml. Ze względu na stosunkowo niską toksyczność (CC50 -stężenie niszczące 50% komórek skóry ludzkiej) i wysoką aktywność przeciwwirusową, indeks terapeutyczny (TI), czyli stosunek CC50/ED50 miał wartość powyżej 18. Stawia to betulinę, kwas betulinowy i kwas oleanolowy w rzędzie potencjalnych substancji o aktywności przeciw wirusom VSV i EMCV.

Tabela 1. Wirusobójcza aktywność betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i oleanolowego (Oa) w stosunku do wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy gębowej bydła (VSV) I wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV) EC50 mg/ml Substancja

VSV

EMCV

B

26.8

39.5

Ba

26.8

87.4

Oa

31.7

32.4

Zawiesinę wirusa inkubowano z różnymi stężeniami badanych substancji przez 1 godzinę w 37 oC. Stężenie, które powodowało spadek miana wirusa o 50% uznano za dawkę EC50. Tabela 2. Cytotoksyczne i przeciwwirusowe działanie betuliny (B), kwasu betulinowego (Ba) i kwasu oleanolowego (Oa).

Substancja

CC50(mg/ml)a

VSV EC50

EMCV TIc

EC50 (mg/ml)

TI

(mg/ml)b

a

B

30

1.2

25

1.26

23.8

Ba

20

1.0

20

1.1

18.1

Oa

25

1.0

25

1.26

19.8

Stężenie toksyczne dla 50% komórek HSF

bStężenie c Indeks

hamujące replikację wirusa w 50%

terapeutyczny CC50/ EC50

Część II Wspomniana powyżej przeciwzapalna aktywność trójterpenów wynika z ich zdolności do wiązania się i hamowania aktywności wielu enzymów komórkowych. Betulina i kwas betulinowy są inhibitorami fosfolipazy A, enzymu, który uwalnia z lipidów błony komórkowej kwas arachidonowy. Kwas arachidonowy jest substratem dla dwu typów enzymów: cyklooksygenaz i lipooksygenaz syntetyzujących prostaglandyny i leukotrieny, uczestniczące w procesie zapalnym. Zarówno oksygenazy jak i lipooksygenazy są hamowane przez kwas ursolowy i oleanolowy. Oba kwasy hamują także aktywność elastazy i serynowych proteaz, które odpowiedzialne są za destrukcję tkanki w procesie zapalnym. Do tych przeciwzapanych aktywności trójterpenów dochodzą jeszcze ich zdolności do hamowania cytokin prozapalnych w tym czynnika martwicy nowotworów (TNF) i interleukiny 1 (IL-1). Jednak doniesienia piśmienictwa są sprzeczne. Niektóre z nich mówią, ze trójterpeny mogą wzmacniać

produkcję

niektórych

cytokin

(1,2,4,5,6,7,9,10),

czyli

mogą

działać

immunomodulacyjnie. Cytokiny są to białka, które służą komórkom uczestniczącym, np. w procesie zapalnym do "porozumiewania" się między sobą. Ich wytwarzanie może być "markerem" toczącego się stanu zapalnego. Oprócz cytokin prozapanych są cytokiny hamujące, wygaszające stan zapalny, np. interleukina 10 (IL-10) Stosując nowoczesne metody immunoenzymatyczne (ELISA), które pozwalają na ocenę nawet niewielkich

zmian

w

ilości

wytworzonych

przez

komórki cytokin,

można wykazać

immunomodulacyjną aktywność badanych substancji. W naszych badaniach przeprowadzonych in vitro, zastosowaliśmy model "stanu zapalnego" składający się z komórek krwi człowieka oraz mitogenu fitohemaglutyniny jako induktora cytokin. Stwierdziliśmy, że kwas betulinowy osłabia w komórkach krwi produkcję substancji o charakterze prozapalnym - IFN-g a wzmacnia wytwarzanie IL-10. Ma więc podwójne przeciwzapalne działanie - nie tylko wygasza produkcję prostaglandyn i leukotrienów jak wykazano w innych badaniach (1), ale także wygasza produkcję cytokin prozapalnych takich jak IFN-g, stymulując wytwarzanie przeciwzapalnych cytokin (IL-10). Betulina nie wykazuje takiego działania, gdyż w naszych doświadczeniach stymulowała wytwarzanie TNF-a, czyli cytokiny prozapalnej. Przypuszczamy, że łączne stosowanie betuliny i kwasu betulinowego może dawać najlepszy immunomodulacyjny efekt terapeutyczny . Prace firmy "Sylveco" idące w kierunku izolacji i oczyszczania aktywnych biologicznie substancji naturalnych, zawartych między innymi w korze brzozy, wychodzą naprzeciw potrzebom

współczesnej preparatyki farmaceutycznej coraz częściej bazującej na preparatach otrzymywanych z różnych części roślin. Tabela 3. Cytokiny indukowane przez betulinę i kwas betulinowy w hodowli komórek krwi ludzkiej Substancja mg/ml-1

Cytokina TNF-a

IFN-g

IL-10

1.18ą1.0

1.36ą0.4

0

10

7.56ą5.7*

1.0ą0.4

0

5

5.4ą4.7

1.2ą0.7

0

10

1.42ą0.5

1.4ą0.5

0

5

1.04ą1.0

1.7ą0.8

0

Betulina

Kwas betulinowy

ˇStatystycznie istotna różnica w porównaniu z kontrolą przy p