UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
Marcadores Mol...
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE FITOTECNIA E FITOSSANITARISMO
AF 060- Biotecnologia Vegetal
Marcadores Moleculares
Profa. Renata Faier Calegario
INTRODUÇÃO Marcadores Características que permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes
Morfológicas, Bioquímicas ou Moleculares
(BORÉM, 1997).
Aplicações: diversas áreas do conhecimento
Melhoramento
Genética mendeliana
Genética de populações
Marcadores Genéticos
Genética molecular
Organização do genoma Sequenciamento
Transferência gênica
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Fenótipo Características visíveis de um indivíduo Sofre influência: • Genótipo • Fatores ambientais
Genótipo Constituição genética de um organismo => o conjunto de genes
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Haplóide: Constituído por uma cópia de cada cromossomo Diplóide: Constituído por duas cópias de cada cromossomo Alelo: Genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos
Local ocupado pelo gene no cromossomo
Haplóide
Diplóide
ALGUNS CONCEITOS BÁSICOS Homozigotos: Célula diplóide com alelos idênticos de um gene em ambos os cromossomos homólogos Heterozigotos: Célula diplóide com alelos diferentes de um gene em ambos os cromossomos homólogos
DOMINÂNCIA
Gene Recessivo (a)
Gene Dominante (A)
• Só manifesta o fenótipo quando em homozigose (aa)
• Manifesta o mesmo fenótipo em homozigose (AA) e heterozigose (Aa)
• Presente em dose dupla (dois alelos iguais)
MARCADORES “ DOMINANTES”
A1 A1 A1= alelo dominante Presença de bandas
A1 A2
A2 A2 2 alelos recessivos no mesmo loco: Ausência de banda – só amplifica locus com alelos dominantes
Mesmo padrão de bandas: Homozigose e Heterozigose
=> exclusão de um dos alelos na expressão gênica do heterozigoto
MARCADORES “ CO-DOMINANTES”
Genes no mesmo locus A1 A1
A1 A2
A2 A2
Padrão de bandas diferentes: Homozigose e Heterozigose => Expressão de ambos os alelos no heterozigoto
TIPOS DE MARCADORES Marcadores Morfológicos Características fenotípicas do organismo Ex. Nanismo, deficiência de clorofila, cor de pétala
Marcadores Bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex. isoenzimas e proteínas
Marcadores Moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA Ex. alteração em bases nitrogenadas - Várias técnicas
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DE UM MARCADOR
Reprodutibilidade Amplamente distribuído através do genoma Poder de discriminação Ausência de influências ambientais Barato Fácil de mensurar
MARCADORES MOLECULARES Marcadores genéticos que exploram a variabilidade do DNA Características polimórficas herdáveis que refletem diferenças na sequência de DNA ao nível de nucleotídeos Qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA
Polimorfismo detectado na sequência de DNA => Variabilidade
APLICAÇÕES Diversidade genética de organismos Proteção de cultivares - demonstrar que a cultivar é diferente de qualquer outra variedade da mesma espécie Análise da pureza genética de semente Mapeamento de genes e características (associação do marcador com os genes de interesse) Seleção de genitores Retrocruzamento assistido...
MARCADORES MOLECULARES Vantagens • Não sofre influência do ambiente • Neutros em relação a efeitos fenotípicos • N° ilimitado de marcadores e de polimorfismo • Identificação de genótipos em estágios iniciais da planta • Acelera o processo de seleção e recombinação desejáveis Desvantagens • Necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos
TÉCNICAS E FERRAMENTAS DE BIOMOL Levou à descrição de várias classes de marcadores moleculares Enzimas de Restrição Eletroforese
PCR
DNA ligase
CAS COLA R
S CA AR L CO
DNA ligase
CLASSES DE MARCADORES MOLECULARES A partir 1980...
=> Varia de acordo com a técnica usada para identifica-lo
RFLP
RAPD, Microssatélites AFLP
Restrição e Hibridização de sequências DNA PCR PCR + restrição...
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfirmo no tamanho do fragmentos de restrição
Utiliza o DNA genômico digerido com enzima de restrição Examina diferenças no tamanho dos fragmentos de DNA Polimorfismo: é resultado de mutação pontual, inserção, deleção Requer conhecimento sequência
RFLP Planta, fungo, organismos...
Hibridização Southern Blot
RFLP - METODOLOGIA 1 . DNA tratado com enzimas de restrição = Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos: Eletroforese (gel agarose) 3. Transferência DNA para a membrana e Hibridização com sonda 4. Visualização dos fragmentos na membrana
Southern blot
sondas marcadas (32P) ou Fluorescência 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas A escolha de sonda/enzima de restrição = direcionada
ANÁLISE DOS RESULTADOS
RFLP: Identificação de Fitoplasma em Tomate + T
+
T
+
T
+ T
+
T
+
T
pb 1353 1078 872 603 310 281 271 234 194
Fragmentos que hibridizarem com a sonda
+ → Grupo 16 SrIII
118
Fonte: Mello et al., 2007.
Brássica: diferentes padrões de bandas em F2 = diferença genética => representam um loco RFLP = pode ser usado como marcador genético Eletroforese do DNA cortado com enzima de restrição
Gel revelado com EtBr => UV Visualização de arraste contínuo de fragmentos de DNA
Homozigotos p/ os alelos A1: 3, 5, 6, 7, 8, 9 Homozigotos p/ os alelos A2: 1, 2,4
RFLP Vantagens Reprodutibilidade Marcadores co-dominantes Simples Desvantagens Trabalhoso Caro Uso de sondas radioativas
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA Fragmentos de DNA amplificados por PCR Método mais rápido para detecção de polimorfismos DNA genômico amplificado por PCR Uso de um único primer aleatório (8-10 bases): função de R e F Não requer conhecimento da sequência Marcador dominante
RAPD - METODOLOGIA 1 . DNA é amplificado via PCR com primer aleatório => Gera fragmentos pequenos 2. Separação dos fragmentos por eletroforese 5. Análise dos resultados presença/ausência de bandas diferenças em padrão de bandas reflete diferenças genéticas
RAPD - METODOLOGIA A
A
B
B
PRIMERS ALEATÓRIOS
DNA
Primer se anela em vários pontos do DNA (desconhecidos) Quando se anela em direções opostas = Amplificação Anelamento em pequenas distâncias
Vários Fragmentos
RAPD - Feijoeiro Resistentes à raça 65 1200 pb 1000 pb 550 pb marcador ligado à Co-1
Co-1 = gene que confere resistência à raça 65 de C. lindemuthianum Fonte: Moura, 2005
RAPD Vantagens • Rápido e simples - não envolve hibridização • Baixo custo • Sem uso de radioisótopos • Não precisa conhecimento prévio da sequência de DNA
Desvantagens • Marcador dominante • Problemas de reprodutibilidade: produtos amplificados não são conhecidos • Problemas de interpretação: co-migração - mesma banda: mesmo fragmento? Pode ser outro! - uma banda: um fragmento? Pode ser dois!
Fonte: IPGRI
MICROSSATÉLITES • Pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos, repetidas em tandem (em sequência) presentes no genoma eucarioto Mononucleotídeos TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC Dinucleotídeos
TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC
Trinucleotídeos
TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC
Tetranucleotídeos TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC
• Amplificadas por PCR • Marcador Co-dominante • Classe de marcador com maior grau de polimorfismo • Requer conhecimento prévio da sequência
Onde são encontrados ??? Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocôndrias Cloroplastos
MICROSSATÉLITES: METODOLOGIA 1 . Digestão DNA – Enzimas de Restrição 2. Seleção dos Fragmentos (tamanho) e clonagem em vetor 3. Transformação da bactéria e seleção das colônias por hibridização (sondas marcadas com sequências repetidas) 4. Sequenciamento dos clones 5. Desenho dos primers
MICROSSATÉLITES Marcador Co-dominante M
homozigoto
Gel de poliacrilamida => Perceber diferenças de nucleotídeos
heterozigoto
DETECÇÃO DE LOCUS SSR Simple Sequence Repeats = Microssatélites Homozigoto
Heterozigoto
Homozigoto CACACA
(CA)3
GTGTGT CACACA GTGTGT
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
(CA)3
MICROSSATÉLITES
cada “ilha” microssatélite constitui um locus, multialélico
Cada fragmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus
MICROSSATÉLITES
Marcador multialélico
Alelos diferentes da mesma repetição (mesmo locus) Marcador Molecular com maior conteúdo de informação de polimorfismo
MICROSSATÉLITES Vantagens • Reprodutibilidade • Requer pequena quantidade de DNA • Baixo custo • Grande poder de resolução • Alto nível polimorfismo – útil para germoplasmas aparentados e de baixa variabilidade
Desvantagens • Necessidade de serem desenvolvidos para cada espécie (primers aleatórios) • Trabalhoso • Porém: uma vez desenvolvido é fácil • Caro
Atributos Nível de Polimorfismo Estabilidade ambiental Número de locos Expressão genética Número de alelos por loco Distribuição no genoma Acessibilidade tecnológica Aplicabilidade no melhoramento
