Panorama VOL. 20 / N ÚM . 4 / O CTUBRE-DICIEMBRE 2001 2000; VOL: 236-244

INMUNOLOGÍA,

Informe sobre el Curso de Inmunología y Cáncer (V Jornadas Monográficas de la Sociedad Española de Inmunología) Mª. MONTES CASADO, V. VICENTE ORTEGA*, Mª R. Á LVAREZ LÓPEZ Servicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca. *Departamento de Anatomía Patológica. Universidad de Murcia

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as V Jornadas Monográficas de la Sociedad Española de Inmunología (SEI) sobre “Inmunología y Cáncer”, han sido recuperadas gracias a la iniciativa del Dr. Jordi Vives, contando para su celebración con el apoyo del Ayuntamiento de Caravaca de la Cruz (Murcia). El programa se estructuró para ofrecer una visión de lo que la Inmunología puede ofrecer para el estudio del cáncer, tanto desde sus aportaciones como ciencia básica como en las relacionadas con el diagnóstico precoz y la aplicación de terapias capaces de activar el sistema inmunitario para la defensa frente al tumor. Tras la presentación del curso por la Dra. María Rocío Álvarez, justificando la elección temática y la estructura del curso, el Dr. Jordi Vives hizo una breve introducción a las bases de la respuesta inmunitaria frente a tumores y un análisis del contenido científico del programa, comentando las ventajas de este tipo de Jornadas Monográficas especializadas para la actualización del conocimiento de temas de interés clínico y científico. CONFERENCIA INAUGURAL Estuvo a cargo del Prof. Federico Garrido del Hospital Virgen de las Nieves de Granada y versó sobre “MHC y escape de tumores a la vigilancia inmunológica” (1). La conferencia resumió la actividad desarrollada durante 20 años en el grupo liderado por el Prof. Garrido, hoy implicada en la definición de

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estrategias diagnósticas para detectar alteraciones en tumores sólidos, que sirvan para poder decidir qué pacientes pueden ser candidatos a la inclusión en programas de inmunoterapia con péptidos. La base de estos trabajos es la determinación de la expresión en tumores de moléculas HLA quienes, como es bien conocido, tienen la doble función fisiológica de presentar péptidos antigénicos al receptor de la célula T (vía por la que pueden estimular la respuesta específica a los antígenos tumorales) y de interaccionar con receptores de inhibición presentes en las células NK y algunas células T (a través de los cuales pueden frenar estos tipos de efectores celulares). 1. Definición de fenotipos HLA alterados en tumores que facilitan el escape a la vigilancia de las células T. Entre los mecanismos responsables de la aparición de estos fenotipos, se han encontrado mutaciones en el gen de la β2-microglobulina, pérdida de heterozigosidad (LOH) o alteraciones transcripcionales (2,3). Los fenotipos comúnmente encontrados en tejidos y líneas celulares tumorales son: I) pérdida total de la expresión antígenos HLA, II) pérdida de un haplotipo HLA completo, III) pérdida de un locus de clase I (HLA-A, B o C) y IV) pérdida de expresión de alelos HLA-A. 2. Mecanismos que pueden influir en el escape tumoral a la inmunovigilancia natural ejercida por las células NK. La ausencia de HLA de clase I en un tumor sería una ventaja para la acción citotóxica de las células NK que no se frenaría por interacción con receptores de inhibición (KIR). No obstante los tumores y las metástasis escapan a la

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lisis NK-mediada. Para explicar este hecho, se ha postulado la presencia en tumores de moléculas HLA de clase I aberrantes (inducidas por ciertos virus) o de moléculas denominadas no clásicas y se espera que en un futuro próximo se pueda disponer de datos que faciliten la comprensión de la función NK en tumores clínicamente establecidos. El interés de las vacunas con péptidos tumorales viene de su utilidad en el desarrollo de inmunoterapias dirigidas a potenciar la respuesta de linfocitos T (4). Estos tratamientos tropiezan con la dificultad de la baja expresión de moléculas HLA en las células tumorales por lo que, según su propia experiencia con péptidos del gen MAGE, propone que los enfermos deben ser selectivamente estudiados eligiendo los que tengan ventajas de respuesta al tratamiento. Concluyó la exposición remarcando la necesidad de profundizar todavía más en los mecanismos responsables de las alteraciones tumorales que contribuyen a su evasión de la respuesta inmunitaria, para poder aplicar las terapias más adecuadas. Primera parte: BASES CELULARES Y MOLECULARES DE LA RESPUESTA ANTITUMORAL Esta primera parte del programa se configuró con el ánimo de revisar algunas de las más recientes aportaciones sobre la respuesta inmunitaria antitumoral. Las ponencias se agruparon en dos sesiones. Sesión I. La sesión fue moderada por los Dres. Miguel López Botet y Francisco Leyva Cobián. En primer lugar el Dr. Miguel Ángel López Nevot, ofreció una síntesis de los mecanismos de generación y reconocimiento de los antígenos tumorales y recordó que su definición inicial hacía referencia a antígenos específicos de tumor (TSTA) y asociados al tumor (TAA) y a que su estudio con anticuerpos monoclonales (AcMo) ha dado lugar al concepto de marcadores tumora les (5,6). En algunos tumores humanos, parece existir asociación con ciertos agentes virales, generando antígenos de expresión variable. Algunos se han podido identificar por métodos serológicos y otros son reconocidos por linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) específicos sobre moléculas determinadas de HLA de clase I e incluso pueden ser reconocidos por linfocitos CD4+ en el contexto de moléculas HLA de clase II. Otros conjugan respuestas celulares completas con participación de linfocitos CD4+ y CD8 +, o respuestas de tipo humoral mediadas por anticuerpos (NY-ESO, MAGE y tirosinasa). La técnica SEREX detecta antígenos no detectables con

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otros métodos (restina X y galectina-A), variantes del procesamiento de mRNA (enfermedad de Hodgkin). Se pueden clasificar como: a) antígenos de diferenciación, pertenecientes al tejido de donde procede el tumor y en otros tejidos de forma fisiológica (Mart-1, tirosinasa, gp100 y MAGE, BAGE y GAGE); b) moléculas resultantes de mutaciones, como β-catenina, MuM-1, p53, etc., y c) antígenos que se sobreexpresan en tejidos, en los que no se expresan normalmente como α-fetoproteína, CEA, p53, MUC-1 o Her2/neu. El estudio de la cinética de interacción de las células NK con las células tumorales mediante mecanismos de conjugación efector/diana, fue presentado por la Dra. Pilar García Peñarrubia. Las células NK (linfocitos grandes granulares TCR-/CD3-, BCR-, CD16+(FcγRIIIA), CD2, CD94, KIRs, CD3ζ), representan un 15% de los linfocitos de sangre periférica y tienen actividad citotóxica frente a células tumorales o infectadas por virus. Su función requiere 4 etapas: a) conjugación efector/diana; b) activación y transducción de señales; c) lisis vía perforinas y granzimas o vía apoptótica (Fas/FasL); d) fase de separación y reciclaje. La conjugación implica diversas constantes físicas: saturabilidad, afinidad y temperatura, cuantificables por índices como αmax, βmax y la constante de disociación KD. Presentó un estudio sobre un modelo de interacción de células NK humanas con células K562 y Molt-4, usando técnicas de citotoxicidad o citometría de flujo. La constante δ para un número fijo de células diana, permite valorar la frecuencia de conjugación en función de la variabilidad de efectores citotóxicos. Los trabajos realizados en humanos por el Dr. José Antonio Brieva, mostraron que en la deficiencia humoral de un 70% de pacientes con leucemia linfoide crónica B (B-CLL), que afecta por igual a las tres inmunoglobulinas principales (IgG, IgA e IgM), está implicado un nuevo mecanismo de inhibición que señala como blanco directo de las células B de B-CLL a la diferenciación terminal de las células secretoras de inmunoglobulinas autólogas (7). Este efecto observado es proporcional al número de células B-CLL presentes en un cultivo, requiere contacto célula-célula y la interacción de CD95/CD95L (éste se expresa funcionalmente en células BCLL). Esto apoya el papel que CD95 puede jugar en el escape de tumores a la vigilancia del sistema inmunitario. El Dr. José Luis Subiza usa un modelo animal para estudiar la generación de células supresoras naturales (NS) con funciones inhibidoras de la repuesta frente a tumores. Son células que pueden considerarse como un elemento más del escape tumoral ya que tienen un efecto antiproliferativo mediado por su capacidad de producir óxido nítri-

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co (NO). Se han identificado como progenitores mieloides y se encuentran en medula ósea, en el bazo de animales inmunosuprimidos y con enfermedad de injerto contra el huésped, en procesos infecciosos crónicos y en enfermos con tumores avanzados o incluso en el infiltrando tumoral. Su activación requiere la cooperación de citocinas (IFNγ, TNFα y TGFβ) producidas por células T presentes en la masa tumoral. También la ciclofosfamida parece tener un papel en su activación (8). Su importancia parece debida a que pueden desarrollar dos funciones contrapuestas: a) la supresión de la respuesta inmunitaria en pacientes portadores de tumores, y b) la inhibición del crecimiento de células neoplásicas en condiciones particulares de activación. Sesión II. Actuaron como moderadores los Dres. Federico Garrido y Manuel Muro. El Dr. Miguel López-Botet comenzó haciendo un resumen de las funciones de las células NK, como primera línea defensiva en la respuesta frente a tumores. Su principal diferencia con los linfocitos B y T, es la ausencia de expresión de receptor para el antígeno y aunque diversos tipos de moléculas han sido asociadas con su capacidad citolítica (CD2, CD16, CD44,CD69, NKR-P1, NKp44, NKp46, NKp30, NKG2D, 2B4, DNAM), se desconoce la naturaleza de algunos de sus ligandos. Más reciente, es el conocimiento de su capacidad para interaccionar con moléculas MHC de clase I vía KIR, regulando la acción citotóxica y la producción de citocinas. El resultado final viene condicionado por el nivel de expresión de HLA de clase I (en los tumores) y por el de los KIR en los efectores citotóxicos. El repertorio de las moléculas de activación/inhibición varía según los distintos individuos, de ahí que quede un importante camino a recorrer para llegar a definir los mecanismos que regulan su función en la defensa antitumoral (9). Más novedosa es la descripción de otros receptores (SIGLEC) capaces de reconocer ácidos siálicos (como CD33), que presentan los clásicos dominios ITIMs citoplasmáticos y, que también tienen función en el control de la respuesta frente a tumores. En su segunda intervención, el Dr. Francisco Ruiz-Cabello, revisó las múltiples vías de evasión del sistema inmunitario para facilitar el crecimiento tumoral. El cáncer es una enfermedad genética que acumula alteraciones de los genes del crecimiento celular y de la apoptosis, y existen pruebas del proceso de inestabilidad genética que genera mutaciones tanto de los nucleótidos (MIN) como de los cromosomas (CIN). Estos cambios parecen contribuir a la selección natural de clones donde el control del ciclo celular está alterado y facilita una progresión tumoral secun daria al crecimiento incontrolado. Otros errores ocurren en el control de genes que afectan al pro-

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ceso de presentación antigénica y a la expresión aberrante de algunas citocinas, proteínas de apoptosis o reguladoras del complemento, llevando a la ausencia de respuestas inmunitarias eficientes, como ocurre en algunas infecciones virales y en los lugares de “privilegio inmunitario”. Inicialmente, cuando las células tumorales son escasas pueden ser ignoradas (ignorancia inmunitaria) y el crecimiento deriva del fracaso en la activación de los sistemas de alerta inmunológica. Esto no descarta que, en una segunda fase, se produzca activación inmunitaria que se traduzca en un proceso de “inmunoselección” de clones inmunogénicos, con capacidad de reconocer antígenos TAA, previamente ignorados. En humanos, existen tumores inmunogénicos, normalmente de fenotipo MIN que tienen mejor pronóstico, mientras que aquellos con mutaciones del gen de la β2-microglobulina, carecen de la maquinaria para la presentación eficaz de antígenos a linfocitos T, y son más agresivos. Concluyó destacando que estas mutaciones o alteraciones epigenéticas son fácilmente observables en pacientes sometidos a inmunoterapia, de ahí que su impacto sea importante en clínica. En definitiva el escape del tumor a la vigilancia puede resultar de los siguientes procesos: a) mecanismos de inmunosupresión activa, normalmente de acción paracrina (secreción de factores solubles o citocinas inhibidoras); b) inactivación de la célula tumoral como diana (pérdida de HLA y otras moléculas); c) ruptura de la vía Fas/FasL; d) fallo en la localización del tumor por las CTL específicas. La tercera ponencia programada no pudo ser ofrecida porque motivos familiares de última hora impidieron la asistencia de la ponente. La cuarta ponencia del programa, impartida por el Dr. Ralf Dressel de la Universidad de Göttingen (Alemania), destacó la importancia de las proteínas de choque térmico (HSP) en el desarrollo tumoral. Estas proteínas de stress, confieren resistencia a estímulos apoptóticos y en este aspecto, parecen contribuir a la progresión tumoral. Sin embargo, la sobreexpresión de algunos miembros de estas familias [Hsc70, Hsp70, Hsp90 y Grp94(gp96)] parecen ventajosas para inducir respuestas inmunogénicas, de ahí que se han usado en la vacunación frente a tumores, al actuar como chaperones favoreciendo el procesamiento de una buena proporción del repertorio de antígenos tumorales (10). Algunas HSP, también activan la respuesta innata, gracias a su capacidad de modular la secreción de citocinas y otras estimulan la maduración de células dendríticas o activan células NK y pueden ser reconocidas por las células NK y linfocitos Tγδ en la superficie de ciertos tumores. La ausencia de Hsp70, parece inducir apoptosis de CTLs, según experimentos

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con la línea Y3 de mieloma de rata defectuosa en Hsp70, lo que se puede corregir pulsando Y3 con proteínas Hsp70 recombinantes. Su sobreexpresión condicionada por un sistema Tet-on en línea Ge de melanomas humanos puede inducir un aumento de la capacidad para ser lisada por CTLs. Experimentos para evaluar su papel in vivo, indican que la proteína Hsp70 liberada por células tumorales necróticas puede activar la respuesta inmunitaria innata, lo que concuerda con la idea de que las proteínas de stress facilitan la aparición de “señales de peligro” que traducen activación de la respuesta innata y adaptativa. Segunda parte: PERSPECTIVAS EN INMUNOTERAPIA EN CÁNCER Dentro del ámbito de la Inmunología, se están llevando a cabo múltiples aproximaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer, que se acercan cada vez más a una realidad en la clínica hospitalaria. Por ello, la segunda jornada del curso se concibió para ofrecer una visión actual del concepto y realidad de la inmunoterapia. La primera de estas sesiones fue moderada por los Dres. José Ramón Regueiro y Fernando Díaz Espada. En cuanto a terapia génica del cáncer, destacaron las estrategias relacionadas con la inserción de genes suicidas o de supervivencia en las células que aparecen dañadas, o de resistencia en células no dañadas. En esta línea trabaja el Dr. Juan. A. Bueren de CIEMAT, que emplea la inserción de vectores adenovirales cargados con genes suicidas frente a células tumorales contaminantes de inóculos hematopoyéticos (se ha aplicado con monocitos en el transplante autólogo de médula ósea como tratamiento de la leucemia mielomonocítica) (11). En la Anemia Fanconi se usan vectores retrovirales que restituyen la actividad del gen dañado; por ejemplo se encargan de la reparación de mutaciones en el gen Fanca. Esto puede ser extensible a otros tumores siempre que se sea capaz de localizar el gen dañado. En la línea de terapia génica experimental, la Dra. María Luisa Toribio del CBM, ofreció una estupenda disertación sobre la manipulación de precursores hematopoyéticos con vectores retrovirales. La optimización de métodos de transferencia génica en precursores CD34+ proporciona un sistema para estudiar diferentes linajes celulares normales y sus correspondientes estados neoplásicos, antes de pasar a la corrección de deficiencias genéticas en clínica. Usa cultivos híbridos sobre un sustrato de lóbulos tímicos murinos que facilita la anidación de los precursores y un vector retroviral bicistrónico cargado

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con una proteína fluorescente (GFP) y el gen de interés, normalmente un determinante de linaje (12). Lo están aplicando al estudio de genes Notch y PTα. La IL-12 es un importante potenciador de la respuesta celular e inhibidor de la angiogénesis; así pues parece un candidato perfecto para ser usado en inmunoterapia. El Dr. Ignacio M e l e ro mostró diversos ensayos sobre: a) inyección intratumoral directa de adenovirus recombinantes cargados con IL-12, b) inyección de células dendríticas transfectadas y c) combinación de células dendríticas transfectadas y terapia celular adoptiva (infusión de cultivos de CTL). La transferencia génica de la IL12 tiene la ventaja de ser menos tóxica y alcanzar mayores concentraciones intratumorales que la administración sistémica de la proteína (13). Este tipo de terapias puede causar la remisión de tumores como hepatocarcinoma, cáncer de colon metástasico o de páncreas. La Agencia Española del medicamento ha admitido el uso de la versión para humanos como producto en fase de investigación y se han planteado otros ensayos clínicos para enfermos que no son susceptibles a tratamientos convencionales. Otro de los fenómenos asociado al cáncer es el de la angiogénesis, proceso complejo en el que participan múltiples células y moléculas. Se han intentado conocer los puntos clave para diseñar agentes anti-angiogénicos de utilidad en la terapia frente al cáncer. El Dr. Luis Álvarez-Vallina expuso una técnica de detección de agentes anti-angiogénicos a gran escala, basada en el uso de una librería de fagos, y mediante la utilización de un modelo de morfogénesis vascular in vitro con fragmentos solubles de anticuerpos seleccionados. Lo ha aplicado a una línea de fibrosarcoma humano (HT1080) transfectada establemente con un gen que codifica un fragmento scFv que induce una inhibición significativa de la implantación y el crecimiento. Los Dres. María Luisa Toribio y José Antonio Brieva, moderaron la siguiente sesión sobre perspectivas de la inmunoterapia y su realidad en el ámbito clínico. Los AcMo como herramienta para el control del sistema inmunitario fueron los primeros en usarse en terapia humana. Actualmente, tal como expuso la Dra. África GonzálezFernández, siguen abriendo nuevas posibilidades para tratamientos donde no exista una terapia adecuada. Tras su descubrimiento en 1975 por el Dr. César Milstein y gracias a su elevada especificidad y obtención en grandes cantidades se vió favorecido su uso, pero se tropezaba con la dificultad de sus efectos secundarios. Los AcMo “quiméricos” o “humanizados” y, más recientemente, los humanos obtenidos en animales modificados genéticamente han mejorado dichos

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efectos. Pueden tener diversas acciones: inductores de apoptosis tumoral, potenciadores de la respuesta inmunitaria, bloqueantes de la angiogénesis o vehiculizar drogas, toxinas, etc. La búsqueda de AcMo dirigidos contra antígenos específicos de tumor (MAGE, p53 mutado, CD20, etc.), se encuentra con la dificultad de la existencia de pocos antígenos específicos de tumor con carácter realmente inmunogénico. En el linfoma folicular de bajo grado, se puede aprovechar la expresión de inmunoglobulinas de superficie para producir anticuerpos anti-idiotipo que después se utilizan en protocolos de inmunoterapia. En España el grupo que lidera el Dr. F. Díaz de Espada, aplicó primero inmunización pasiva usando infusión de AcMo específicos de idiotipo, con el inconveniente de producir variantes idiotipo-negativas y de que aparecían recidivas. Tras esta observación, se realizó la inmunización activa, mediante una preparación inmunogénica del propio idiotipo, delegando así en el sistema inmunitario la destrucción del tumor. Han logrado inducir anticuerpos anti-idiotipo en la mayoría de individuos que, además muestran remisiones y negativizan la presencia de la translocación t(14; 18). Esto es alentador, pero se trata de un tratamiento de carácter estrictamente individual, lo que limita su desarrollo como tratamiento de elección general. Las dos siguientes ponencias trataron sobre la aplicación real de la inmunoterapia en clínica. El Dr. Alonso Romero del Hospital Virgen de la Arrixaca explicó las indicaciones de la inmunoterapia en el tratamiento del cáncer y sus múltiples modalidades (Tabla I). Las más frecuentemente usadas son:

Tabla I Tipos de inmunoterapia de uso en clínica Inmunoterapia Activa

Inespecífica

Específica Inmunoterapia Pasiva

Anticuerpos

Células (inmunoterapia adoptiva) Otros métodos

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BCG, C. Parvum, levamisol Citocinas: interferones, interleuquina-2 Vacunas tumorales Anticuerpos monoclonales o policlonales, solos o asociados a agentes tóxicos Linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)

Bloqueo o inhibición de factores de crecimiento, agentes antiangiogénicos, estimulantes de la diferenciación celular.

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Tabla II Aplicación del tratamiento con interferón α en distintos tipos de tumores Tumores sólidos

Tumores hematológicos

Sarcoma de Kaposi Carcinoma de células renales Melanoma (como adyuvante en estadios II y III) Tumores carcinoides

Leucemia de células peludas Leucemia mieloide crónica Linfomas no Hodgkin

—BCG, como tratamiento adyuvante de uroteliomas superficiales. —IFN-α, recomendado en el melanoma, cuyo efecto antitumoral se debe a su acción antiproliferativa, de modificación de antígenos de superficie, de activación de células inmunitarias y su actividad anti-angiogénica (Tabla II). —IL-2, para el tratamiento de carcinoma de células renales y de melanoma. —AcMo, se usan los dirigidos contra CD20 (Rituximab) en el tratamiento de linfomas B no Hodgkin y los dirigidos contra erbB-2 (Trastuzumab) que reconocen dicha proteína sobreexpresada en tumores epiteliales y de mama. Existen otros AcMo en fase de desarrollo clínico, como los dirigidos frente al antígeno 171A (para el tratamiento de cáncer de colon) y CDw52 (de reciente aplicación en B-CLL). —Otros tipos de inmunoterapia, incluyen las vacunas anti-tumorales y también terapias clásicas de trasplante perfeccionadas con la introducción de precursores hematopoyéticos, para el tratamiento de neoplasias hematológicas, tumores sólidos e incluso enfermedades adquiridas o genéticas (Tabla III). El Dr. Moraleda revisó un tema conectado tradicionalmente con el quehacer de los inmunólogos, el trasplante alogénico de médula ósea como ejemplo de tratamiento inmunoterapeútico. Resaltó la mejora que ha supuesto el uso de factores de crecimiento y de técnicas de aféresis para la obtención de células progenitoras de sangre periférica, junto al uso de células de sangre de cordón umbilical como otra fuente celular importante. El reto sigue siendo el control de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), que se trata de paliar mediante tratamientos dirigidos a inducir anergia en los linfocitos T (bloqueo de moléculas coestimuladoras) y con el uso de los denominados mini-trasplantes para inducir inmunotolerancia y evitar regímenes mieloablativos más agresivos. Como técnica de futuro destacó el uso de progenitores genéticamente transformados, hoy campo de investigación básica que abre perspectivas esperanzadoras.

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Tabla III Indicaciones del trasplante de progenitores hematopoyéticos Neoplasias

Enfermedades adquiridas (no neoplásicas)

Trastornos genéticos

Otras

Hematológicas: Leucemias Linfomas Mieloma Melodisplasias

Aplasia medular

Inmunodeficiencias: I. Severa combinada S. Wiskott-Aldrich

Enfermedades autoinmunes

Tumores sólidos: Carcinoma de mama Carcinoma de ovario Carcinoma de células germinales Carcinoma de pulmón Otros

Hemoglobinuria paroxística nocturna

Anemias congénitas: Talasemias Otras hemogloginopatías A. Fanconi

Terapia génica

Alteraciones funcionales: Granulocitos Monocitos Megacariocitos

Tercera parte: APLICACIONES DE LA INMUNOLOGÍA AL ESTUDIO DEL CÁNCER El objetivo de esta parte era valorar la aplicación de la Inmunología en la filiación y diagnóstico diferencial del cáncer con fines de utilidad en la aplicación de tratamientos más selectivos. Se revisaron métodos de Inmunidad Celular y Molecular. La sesión moderada por los Dres. Nuria Matamoros y Antonio Parrado, se dedicó al estudio de métodos de diagnóstico inmunológico habituales en los Servicios de Inmunología. Especial atención se dedicó a la citometría de flujo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR y RT-PCR) y la secuenciación para el estudio molecular del cáncer. La filiación inmunológica de algunas patologías resulta difícil por el desconocimiento de marcadores específicos. En este sentido, la primera ponencia de esta sesión, ofreció una primicia del Dr. Armand Bensussan (INSERM, U448, París) sobre la obtención de líneas celulares útiles para definir moléculas características del linfoma T cutáneo. Ha sido el primero que ha logrado demostrar un carácter fenotípico diferencial de los linfocitos T CD4+ que proliferan en el linfoma cutáneo con la detección en superficie de p140 (KIR3DL2), hasta ahora restringida a células NK y NKT (14). La Dra. Ana María García Alonso, expuso una revisión práctica de la clasificación consenso de las neoplasias linfoides de la REAL/WHO y de las bases fundamentales para su inmunofenotipaje, así como una síntesis de los marcadores clave en

la monitorización clínica de estas patologías (1518). El estudio fenotípico y genético de las neoplasias, ofrece una importante mejora para una orientación diagnóstica más precisa (Tabla IV). En el diagnóstico de síndromes linfoproliferativos crónicos T con expresión periférica, el establecimiento de la clonalidad de la población expandida es primordial. Existen baterías de AcMo dirigidos frente a 19 regiones Vβ del TcR que facilitan la exploración de estos repertorios. El Dr. Alberto Orfao, mostró resultados de un estudio en el que marca simultáneamente con tres de estos anticuerpos, uno de los cuales va marcado con dos fluorocromos. Esto le ha permitido detectar expansiones de una, dos o más familias de clones tanto en células CD4+ como CD8+, comentando el valor de esta técnica en la determinación de la clonalidad T y sus ventajas sobre otras. Los métodos de Inmunología Molecular fueron resumidos por el Dr. Raúl García Lozano, aportando su experiencia sobre las aplicaciones de la PCR en el diagnóstico, seguimiento, pronóstico y determinación de enfermedad mínima residual de leucemias y linfomas. Mostró los siguientes ejemplos: —Detección de translocaciones cromosómicas. En estudios de DNA complementario, para translocaciones como BCR/ABL t(9;22) y PML/RARα t(15; 17). Estudios que parten de DNA genómico y afectan Igs o TCR, t(11; 14) bcl1/JH de los linfomas del manto y bcl2/JH t(14; 18) de linfomas foliculares. —Análisis de los reordenamientos de los genes de Igs o TCR. Para diferenciar poblaciones clonales malignas, como la cadena pesada de las Ig en la leucemia linfoide aguda B.

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Tabla IV Protocolos habituales para la caracterización de neoplasias linfoides Neoplasias

Panel de marcadores

Neoplasias crónicas B

Panel primario para B-CLL. Línea B: CD22, CD23, CD79b, FMC7, Igκ/Igl (membrana). Línea T: CD2. Marcador T y B: CD5. Opcionales: CD4, CD8, CD10, CD19, CD20. Panel secundario para B-CLL. Se utiliza cuando no se ha llegado a un diagnóstico concreto con el primario y está indicado para diagnosticar neoplasias B distintas a las B-CLL. Otros marcadores B. Los marcadores CD11c, CD25, CD38, CD103 es útil utilizarlos juntos para identificar las HCL de otros procesos parecidos como el SLVL o la variante HCL. CD138 y CD38 juntos identifican células plasmáticas asociadas con la detección de Igk/Igl citoplasmática.

Neoplasias agudas

Panel primario para LLA. Marcadores línea B: CD10, CD19 en membrana; CD22, CD79a en citoplasma. Marcadores línea T: CD2, CD7 en membrana; CD3 en citoplasma. Marcadores línea mieloide: CD13, CD33, CD14, CD15, CD117 en membrana; MPO en citoplasma. Marcadores de precursores: CD34, HLA DR en membrana. TdT en núcleo. Panel secundario para LLA. Si el fenotipo es B: Igκ e Igλ en membrana; IgM en citoplasma. Si es T: CD3, CD1a, CD4, CD5, CD8 en membrana. CD41, CD42, CD61 marcadores para leucemias megacarioblásticas y anti-glicoforina A para las leucemias eritroides. Marcadores opcionales: Anti-lisozima: en citoplasma, aunque no es específico se expresa preferentemente en leucemias monoblásticas y es más sensible que CD14. Monocitos expresan débilmente CD4. CD15: Característicamente, es positivo de pro-B-ALL (CD79a+19+22+10- e IgM- citoplasmática) con 11q23.

Neoplasias crónicas T

Marcadores pan-T: CD2, CD3, CD7, TCRαβ. T cooperadores/inductores: CD4. T supresores/citotóxicos: CD8. Marcadores células NK: CD11b, CD16, CD56, CD57. Marcadores células T activadas: CD25, CD38, HLA-DR.

—Estudios de quimerismo celular. Usa loci VNTR para valorar la reconstitución hematológica tras un transplante de médula ósea. La última sesión del día, moderada por los Dres. Armand Bensussan y Luis Álvarez Vallina, se circunscribió a estudios científicamente bien

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establecidos, pero que no forman parte de protocolos en los Servicios de Inmunología. La Dra. Mª Teresa Cabrera examinó las técnicas de determinación de pérdida de moléculas HLA de clase I, destacando la necesidad de minuciosidad metodológica y la exigencia de controles de los tejidos peritumorales. Los AcMo deben ser testados previamente para estudios de tejidos criostáticos del tumor, mientras que para analizar variantes moleculares, extrae DNA/RNA de tejidos tumorales obtenidos por microdisección. Propuso su aplicación para la elección de pacientes que reciben inmunoterapia, dirigida a mejorar la presentación de antígenos tumorales, dado que si se aplica a tumores que muestran pérdida de HLA de clase I, sobre todo si ésta es irreversible, resulta ineficaz (19-21). En el proceso de transformación tumoral, también participan activamente diferentes moléculas de adhesión condicionantes de apoptosis, angiogénesis, invasión tisular, etc. El Dr. Pedro Aparicio, destacó entre las más relevantes, las cadherinas, selectinas y las pertenecientes a las familias LYNK que incluyen variantes de CD44, de inmunoglobulinas y de integrinas. Estas últimas pueden modificar su expresión en la membrana para favorecer el desarrollo tumoral, facilitando el crecimiento autosuficiente, la evasión de la apoptosis, la angiogénesis u otros procesos metastásicos. Las células cancerosas comparten características similares a las denominadas células madre hematopoyéticas (stem cells), siendo interesante estudiar los factores o programas genéticos que comparten estas células. El laboratorio del Dr. Antonio Bernad ha estudiado algunos genes expresados bajo el control de la IL-6, llegando a conocer su secuencia, estructura y función (22). Se trata de una serin/treonin cinasa, que se localiza en el aparato de Golgi y se relaciona con procesos de adhesión celular y, cuando se sobreexpresa, actúa como factor de transcripción que provoca transformación en conexión con el oncogen tal-1. Esta parte del curso se cerró con la conferencia del Dr. Augusto Silva. Su interesante conferencia resumió un trabajo de muchos años sobre el papel de p53 en tumores humanos (23). Se trata de una importante proteína supresora del ciclo celular que aparece alterada en tumores. Se activa en respuesta al daño al DNA, induciendo apoptosis o transactivación génica. Aparece mutada en la célula cancerosa y es inhibida por la securina. El estudio de sus mutaciones puntuales permite relacionar cada zona de la molécula con la función. Mesa Redonda: MELANOMAS La mesa, moderada por los Dres. José Antonio Lozano y Francisco Ruiz Cabello, pro-

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pició un foro de interesante y enriquecedora discusión científica. El Dr. Vicente Vicente Ortega, dio una visión clínico-patológica de este cáncer e ilustró su exposición con magníficas microfotografías sobre la morfología de células de melanoma. Múltiples lesiones pueden conducir a errores diagnósticos, de ahí la importancia de un buen examen anatomo-patológico. Actualmente se admiten cuatro signos macroscópicos de alarma de transformación maligna: A (asimetría), B (bordes irregulares), C (coloración heterogénea), D ( d i á m e t ro >6mm), mientras que al microscopio, se caracteriza por invasión de la epidermis y la dermis por melanocitos atípicos. Las técnicas han evolucionado desde las tinciones con plata hasta el uso de AcMo (Nki-c3), dando lugar hasta 11 f o rmas clínico-patológicas, siendo las más extendidas el léntigo maligno melanoma, el melanoma de extensión superficial, el nodular y el lentiginoso acral. Se clasifican, siguiendo las propuestas de Clark (cinco niveles) y sobre todo la más objetiva de Breslow sobre el nivel de invasión de los melanocitos desde la epidermis hasta el tejido celular subcutáneo. Las células de melanoma están íntimamente relacionadas con alteraciones en su ciclo celular. El Dr. Miguel Ángel López Nevot, señaló que las mutaciones en p53 frecuentes en tumores de origen epitelial no afectan al melanoma, donde la delección o metilación de la proteína p16, se asocia con una mayor agresividad en melanomas (24). También se ha asociado a la biología de este tumor, un aumento de expresión de la ciclina D o de CDK-4 (25,26). Como complemento, el Dr. José Carlos García Borrón destacó los avances en procesos bioquímicos asociados al melanoma. La síntesis de melaninas, con la participación de enzimas como tirosinasa, Tyrp 1, 2, origina pigmentos de color oscuro y elevada capacidad fotoprotectora (eume laninas) y de color más claro con carácter fotosensibilizador (feomelaninas) que se regulan por citocinas (TGFβ, TNFα) y hormonas (αMSH). Una actividad tirosinasa alta, aumenta los pigmentos eumelánicos frente a los feomelánicos y protege la epidermis de la radiación solar. La tirosinasa se induce por activación transcripcional debida a la unión de αMSH con su receptor MC1R, un receptor que se acopla a proteínas G. La frecuencia de mutaciones en MC1R está elevada en líneas de melanoma humano y traduce una pérdida de función, constituyendo un factor de riesgo para el melanoma cuya penetrancia aumenta cuando se asocia con mutaciones en p16 (27). Las células de melanoma tienen la capacidad de producir IL-10, citocina cuyos niveles están sujetos a polimorfismos a nivel de su promotor. La Dra. Rebeca Alonso, presentó resultados de

Mª MONTES CASADO ET AL.

un estudio sobre este polimorfismo en pacientes con melanoma, encontrando una mayor supervivencia en pacientes con genotipos de productores altos o intermedios, apoyando la teoría del beneficio de IL-10 en los pacientes de melanoma. Actualmente, existen trabajos sobre inmunoterapia de melanomas. Un ejemplo fue el presentado por el Dr. Daniel Benítez del Hospital Clinic i Provincial de Barcelona. Usa células de melanoma atenuadas obtenidas a partir de diez líneas celulares para la vacunación terapeútica polivalente y, células dendríticas autólogas cargadas con antígenos heterólogos obtenidos de un lisado células de melanoma. Ambas metodologías presentan ausencia de toxicidad y se obtiene un aumento de la supervivencia con algunas regresiones parciales. El curso finalizó con una breve intervención del Dr. Antonio López Bermejo, actual Presidente de la Fundación Española para la Lucha contra la Leucemia (FELL), sobre los trasplantes de médula ósea en España y las ventajas que ofrecen los Registros de Donantes Voluntarios no emparentados. Los responsables de la FELL han realizado una magnífica labor que ha situado a Murcia con la mayor tasa de donantes altruistas para este tipo de trasplantes.

AGRADECIMIENTOS Todos los ponentes deberían considerarse coautores del presente trabajo. Los autores agradecen, la confianza del Dr. J. Vives al encargarles la organización de las Jornadas y a los ponentes su colaboración altruista para dar un al alto nivel científico al curso. Igualmente agradecen a D. Domingo Aranda (Alcalde de Caravaca) la acogida y apoyo prestado a estas Jornadas, al Consejero de Sanidad de la Comunidad Autónoma de Murcia (D. Francisco Marqués) por el reconocimiento permanente a nuestro trabajo, a la fundación HEFAME, a Caja Murcia y a las empresas colaboradoras por su ayuda económica.

CORRESPONDENCIA: Mª Rocío Álvarez López Servicio de Inmunología Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca Ctra. Madrid-Cartagena. 30120 El Palmar (Murcia) Tel.: 968 369692 - Fax 968 369876 E-mail: [email protected] y [email protected]

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INFORME SOBRE EL CURSO DE INMUNOLOGÍA Y CÁNCER

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