REVISION (BIOLOGIA CELULAR) Acta Científica Venezolana, 55: 304-314, 2004

LA Ca2+-ATPasa DE LA MEMBRANA PLASMATICA COMO ENZIMA CLAVE EN LA HOMEOSTASIS INTRACELULAR DEL CALCIO. ESTIMULACION POR ETANOL Y OTROS EFECTORES Gustavo Benaim Laboratorio de Señalización Celular y Bioquimica de Parasitos Centro de Biociencias. Instituto de Estudios Avanzados (IDEA) y Laboratorio de Biofísica. Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Apartado 47114. Caracas, Venezuela. e-mail [email protected]

Recibido: 27/05/04; Revisado: 06/07/04; Aceptado: 23/11/04 2+

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RESUMEN: La Ca -ATPasa de la membrana plasmática (PMCA) es una enzima clave en la regulación de la concentración basal de Ca . 2+ 2+ Hemos demostrado que el etanol estimula la actividad de la Ca -ATPasa y el transporte de Ca asociado. Cuando el etanol y la calmodulina (CaM) esta presentes simultáneamente, el efecto estimulatorio es aditivo, lo cual apoya que estos efectores actúan a través de 2+ distintos mecanismos. Mediante el uso de isoformas diferentes de la Ca -ATPasa se demostró que la variante PMCA2CI resultó ser mas sensible al efecto del etanol. Es Interesante resaltar que esta es la isoforma mas predominante en cerebro, cerebelo y tejido nervioso. Por otra parte, el fosfatidiletanol se forma mediante la transfosfatidilación de ciertos fosfolípidos cuando el etanol está presente, por una reacción que es catalizada por la fosfolipasa D. Este fosfolípido se acumula en la membrana de las células de mamífero luego del consumo de alcohol. Hemos demostrado que el fosfatidiletanol también estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática. Este fosfolípido 2+ incrementa la afinidad de la enzima por Ca en mayor medida que la que se obtiene en presencia de CaM u otro fosfolípido acídico natural. Los esfingolípidos han sido reconocidos recientemente como importantes segundos mensajeros, actuando en varios sistemas en 2+ combinación con el Ca . En vista del hecho que la PMCA es estimulada por etanol, y tomando en cuenta que los esfingolípidos poseen grupos hidroxilo libres, decidimos estudiar el posible efecto de la ceramida y la esfingosina sobre esta bomba de calcio. Demostramos que 2+ la ceramida estimula a la Ca -ATPasa de una manera dosis-dependiente y de forma aditiva a la CaM y al etanol, cuando se compara con 2+ estos dos efectores añadidos separadamente. La ceramida afecta tanto la afinidad de la enzima por el Ca , como su Vmax. Mas aún, este 2+ esfingolípido también estimula el transporte de Ca en vesículas invertidas de eritrocitos. Por lo contrario, la esfingosina, la cual se ha 2+ reportado en varios sistemas que actúa de manera antagónica a la ceramida, mostró un efecto inhibitorio sobre la Ca -ATPasa. Esta inhibición también se observó en presencia de CaM. Estos resultados tomados en conjunto sugieren que la ceramida y la esfingosina actúan antagónicamente sobre la PMCA, lo cual coincide con el efecto opuesto que estos esfingolípidos poseen frecuentemente en 2+ diferentes sistemas. Palabras clave: Ca -ATPasa; calmodulina; etanol; esfingolípidos; ceramida.

THE PLASMA MEMBRANE Ca2+-ATPase AS A KEY ENZYME IN THE INTRACELLULAR CALCIUM HOMEOSTASIS. STIMULATION BY ETHANOL AND OTHER EFFECTORS 2+

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ABSTRACT: The plasma membrane Ca -ATPase (PMCA) is a key enzyme in the regulation of the intracellular Ca concentration. Studies 2+ 2+ from this laboratory have shown that ethanol stimulates the Ca -ATPase activity and its associated Ca -transport. When ethanol and calmodulin (CaM) were present simultaneously, the stimulatory effect was additive, supporting that these two effectors act through different 2+ mechanisms. The use of different isoforms of the Ca -ATPase showed that the variant PMCA2CI was more sensitive to the effect of ethanol. Interestingly, this is the predominant isoform in brain, cerebellum and nervous tissues. On the other hand, phosphatidylethanol is formed by transphosphatidylation of phospholipids when ethanol is present, a process catalyzed by phospholipase D. This phospholipid accumulates in the plasma membrane of mammalian cells after ethanol consumption. It was demonstrated that phosphatidylethanol also stimulates the plasma membrane calcium pump. The phospholipid increases the affinity of the enzyme for calcium to a larger extent than in the presence of calmodulin or other natural acidic phospholipids. Sphingolipids have been recently recognized as important second 2+ messengers acting, in many systems, in combination with Ca . In view of the fact that the PMCA is stimulated by ethanol, and since sphingolipids possess free hydroxyl groups, the study of the possible effect of ceramide and sphingosine on this calcium pump was 2+ undertaken. It was shown that ceramide stimulates the Ca -ATPase in a dose-dependent manner, and additively to the activation observed 2+ in the presence of CaM or ethanol, when compared to any of these effectors alone. Ceramide affects both the affinity for Ca and Vmax of 2+ the enzyme. Furthermore, this second messenger also stimulates Ca transport in inside-out plasma membrane vesicles from erythrocytes. 2+ Conversely, sphingosine, a reportedly antagonist to ceramide in many systems, showed an inhibitory effect on the Ca -ATPase activity. This inhibition was also observed on the CaM-stimulated enzyme. Taken together these results suggest that ceramide and sphingosine act antagonistically on the PMCA. This is in accordance with the frequently reported opposite effect of these sphingolipids in different systems. 2+ Key Words: Ca -ATPase, calmodulin; ethanol, sphingolipids, ceramide.

INTRODUCCION El calcio es probablemente el mas importante entre todos los mensajeros intracelulares, en los mecanismos de traducción de señales en las células eucarióticas. Su

función como mensajero está garantizada por la capacidad de la célula de mantener, en virtud de sus diferentes mecanismos homeostáticos, una concentración citoplasmática de este catión 4 órdenes de magnitud por debajo de su concentración extracelular18.

Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática Como catión bivalente es además atraído fuertemente hacia el interior de la célula en virtud de la diferencia de potencial eléctrica transmembrana negativa en el interior. Así, este ión esta separado de su potencial de equilibrio electroquímico que predice la ecuación de Nernst, unas 10.000.000 de veces, si este catión se distribuyera pasivamente a través de la membrana. Este valor se encuentra muy por encima que el de cualquier otro ión presente en la célula. Este hecho implica que la apertura de un canal de calcio en la membrana plasmática, producto de una interacción con una señal específica, conllevaría a una entrada rápida de este catión, lo cual de hecho constituye la base de su acción como segundo mensajero. En este sentido cabe preguntarse porque es el calcio, entre todos los iones disponibles en la naturaleza, el que ha sido seleccionado evolutivamente como el mas importante mensajero intracelular. Volviendo a la elevadísima diferencia con respecto a su potencial de equilibrio electroquímico, probablemente el primer problema que tuvo que afrontar la célula durante su evolución, con respecto a este catión es su muy baja solubilidad, en comparación a otros iones, aunada a su gran abundancia en el agua de mar, donde se originó la vida. De esta manera, si no fuera excluido, el calcio precipitaría en el interior celular, fundamentalmente con los abundantes fosfatos y los ácidos orgánicos, lo cual imposibilitaría los procesos que se llevan a cabo en el citoplasma. La solución fue mantener una membrana muy impermeable al calcio y simultáneamente diseñar mecanismos de transporte altamente específicos, tanto para su exclusión activa hacia el medio extracelular como para su almacenamiento en organelos específicos. Posteriormente en la evolución, dado que la célula tuvo que invertir una cantidad importante de energía en mantener este elevado gradiente electroquímico de calcio, toma ventaja de dicho gradiente, y de otras propiedades químicas de este elemento y lo transforma en el catión señal por excelencia. Aunque esto es solo un teoría, parece concebible en función de las características de este particular catión y tomando en cuenta los otros hechos mencionados en este contexto. Regulación intracelular de calcio Tomando en cuenta lo anterior no es de extrañar que la célula posea hasta 7 mecanismos diferentes para mantener la concentración citoplasmática de calcio iónico [Ca2+]i a nivel submicromolar7,18. A nivel de los organelos, están presentes en el retículo endo (sarco) plasmático y la mitocondria. El primero presenta una Ca2+-ATPasa (SERCA), o bomba de Ca2+, con alta afinidad por Ca2+, pero con baja capacidad para el transporte del mismo, mientras que la mitocondria por lo contrario, posee un uniporte electroforético energizado por el gradiente electroquímico de protones en la membrana interior mitocondria, el cual presenta una alta capacidad de transporte pero una muy baja afinidad por

305 este catión7,18. Ambos presentan también mecanismos de salida de Ca2+. La mitocondria excluye al catión gracias a un intercambiador Na+/Ca2+, (o en algunos casos H+/Ca2+), el cual es electroneutro, mientras que la salida de calcio del retículo endo(sarco)plasmático se logra a través de canales altamente regulados: Un canal de rianodina, mucho mas abundante en el sarcoplasmático, y un canal de sensible a IP3 mas importante en el retículo endoplasmático15, en el cual se induce la liberación cuando se produce este mensajero por la acción de la diferentes fosfolipasas C sobre el fosfatidilinositol (4,5) bisfosfato, lo cual conlleva a también a la liberación del diacilglicerol, otro fundamental segundo mensajero, que a su vez estimula la proteína quinasa C, con importantes implicaciones en los mecanismos de señalización celular15. También se ha identificado otra Ca2+-ATPasa diferente a las anteriores (PMR1), la cual está presente en el sistema de golgi y en vesículas secretoras de insulina en las células β del páncreas29. Sin embargo, en estas últimas células su función parece estar mas asociada a la secreción de la hormona29 que a la regulación intracelular del Ca2+. Los mecanismos presentes en diferentes organelos están limitados por la capacidad de éstos como compartimientos, por lo que a largo plazo, son los mecanismos ubicados en la membrana plasmática los responsables de la alta asimetría en la distribución del calcio entre el interior y el exterior celular7. Existe varios tipos de canales muy bien regulados a través diversos moduladores que permiten la entrada de Ca2+ siguiendo su gradiente de potencial electroquímico, tanto dependientes de ligandos como dependientes de voltaje, cuya descripción no está en los alcances de esta revisión. Entre los mecanismos de exclusión, existe un intercambiador Na+/Ca2+, el cual extruye Ca2+ del interior celular utilizando como energía la disipación del gradiente electroquímico de Na+ existente entre el citoplasma y el exterior celular25. Este intercambiador presenta una estequiometría de 3Na+ /Ca2+, siendo muy importante en células excitables donde los cambios en la concentración basal del Ca2+ pueden ser bastante elevados25. De acuerdo a esto, su afinidad por el Ca2+ es relativamente baja, en comparación con su capacidad relativa de transporte, la cual es alta. Por otra parte, la Ca2+-ATPasa (o bomba de calcio) de la membrana plasmática presenta una relativamente baja capacidad de transporte pero una alta afinidad por el Ca2+, compatible con la concentración citoplasmática de este catión cuando la célula esta en reposo7,20. A diferencia de el intercambiador Na+/Ca2+, esta enzima es extremadamente ubicua, habiéndose identificado en todas las células eucariotas estudiadas hasta el presente, desde mamíferos hasta plantas, y desde hongos hasta parásitos12. La visión en conjunto de todos estos diferentes mecanismos permiten concluir que su presencia simultanea en una célula no es redundante, ya que cada mecanismo presenta ubicación espacial, afinidad y capacidad diferente, lo que garantiza que en conjunto son capaces de mantener la homeostasis intracelular de

306 Ca2+ tanto en reposo, como luego de una señal que eleve subitamente su concentración.

La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática Desde el punto de vista estructural y funcional, la Ca2+ATPasa de la membrana plasmática (definida geneticamente como PMCA) es diferente a la Ca2+ATPasa presente en el retículo endo(sarco)plasmático (SERCA), ya que su peso molecular es de 138.000 Da16, mientras que la del retículo está entre 109.000 y 115.000 Da18. Ambas proteínas han sido secuenciadas, encontrándose muy poca homología secuencial. De hecho, las únicas secuencias comunes entre ambas proteínas son las correspondientes al sitio de fosforilación por el ATP y el sitio de unión de nucleótidos. Estos dos sitios son característicos de todas las bombas iónicas del tipo ¨P¨, así definidas por la formación de un intermediario fosforilado (un aspartil-fosfato) durante su ciclo catalítico18. La estequiometría de estas dos bombas iónicas también es distinta. La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática transporta un átomo de Ca2+ por cada molécula de ATP que hidroliza, mientras que la enzima del retículo transporta 2 átomos por molécula de ATP18. Otra diferencia fundamental lo constituye el hecho de que la enzima de la membrana plasmática puede perder hasta el 40 % de su masa y todavía ser capaz de transportar calcio de una manera ATPdependiente2,17. De hecho, en experimentos mediante proteólisis parcial de la proteína y reconstitución en liposomas, hemos demostrado que un fragmento de 81.000 Da. es capaz de mantener la función de hidrólisis de ATP y el transporte de Ca2+ asociado2. Este hecho sugiere que alrededor del 40 % de la masa de la enzima esta comprometida en su regulación17, a diferencia de la bomba del retículo la cual es muy pobremente regulada. Es interesante mencionar que aunque la Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática es altamente ubicua entre los organismos eucariotes como se mencionó anteriormente, existen diferencias interesantes entre estas bombas de calcio en distintos organismos. Por ejemplo, la Ca2+-ATPasa del parásito patógeno Trypanosoma brucei, causante de la enfermedad del sueño, aunque tiene un peso molecular aparente similar a la enzima homóloga de humanos y comparte otras características con ésta8, es inhibida por la pentamidina, droga de uso generalizado en la cura de la dolencia antes mencionada, mientras que esta droga no tiene ningún efecto sobre la Ca2+-ATPasa de humanos8. Lo mismo puede decirse del efecto de cristal violeta (o violeta de genciana) sobre esta enzima en Trypanosoma cruzi 26. Estos estudios apuntan hacia la búsqueda de diferencias entre esta enzima en distintos tripanosomatidios, con respecto a la estructura homóloga de mamíferos, con el objeto de establecer diferencias relevantes desde el punto de vista terapéutico, en el desarrollo de drogas contra las enfermedades causadas por estos parásitos12.

Benaim Regulación de la Ca2+-ATPasa por la calmodulina La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática es estimulada por la calmodulina (CaM), una proteína de 16.700 bien conservada evolutivamente y cuya ubicuidad en las células eucarióticas es paralela a la de bomba de calcio. De hecho, se podría postular que ambas proteínas han coevolucionado en los eucariotes con el fin de garantizar el funcionamiento del Ca2+ como señal. Así, cuando el calcio se eleva intracelularmente, producto de la apertura de un canal voltaje-dependiente o ligando-dependiente, este catión se une a la CaM la cual cambia su conformación y modifica la actividad de las enzimas “blanco”, lo cual a su vez desencadena la reacción de la célula ante la señal. Posteriormente, el complejo Ca2+-CaM, estimula a la bomba de calcio de la membrana plasmática, conllevando a la disminución de la concentración del Ca2+ citoplasmático a su nivel de reposo, preparando así a la célula para responder a una nueva señal7,18. La CaM presenta 4 sitios de unión para el calcio los cuales son altamente cooperativos. La unión del calcio a la proteína incrementa su contenido de αhélice, concomitantemente con su hidrofobicidad14. La conformación de la proteína depende estrictamente de cuantos átomos de calcio estén enlazados, lo cual la transforma en un “sensor” de la concentración citoplasmática de Ca2+. De esta manera puede reconocer diferentes enzimas de acuerdo a la concentración de Ca2+ intracelular presente en un momento dado. También se ha postulado que la apocalmodulina (proteína en ausencia de Ca2+), es capaz de reconocer ciertas enzimas blanco14. La estructura de la CaM ha sido conservada evolutivamente entre los diferentes eucariotas6,14. Sin embargo, la CaM de los tripanosomatidios presenta como excepción 17 sustituciones aminoacídicas con respecto a la proteína de humanos14. Mas recientemente, se ha demostrado que la CaM fosforilada por diferentes proteínas-quinasas cambia su función con respecto a ciertas proteínas blanco13,14, lo cual incrementa mas aún su plasticidad como molécula reguladora. Todas estas características le permiten a la CaM un espectro de acción muy amplio, en los mecanismos de traducción de señales. Con respecto a la Ca2+-ATPasa, la CaM incrementa tanto su Vmax como su afinidad por el calcio y por el ATP4,7,20. La proteólisis parcial de la enzima mediante tripsina1,2 o calpaína35 simula el efecto de la CaM, lo cual ha permitido elaborar un modelo mediante el cual la CaM removería una compuerta auto-inhibitoria de la enzima permitiendo así un mayor acceso de los sustratos (Ca2+ y ATP) al sitio activo1,2,7,17. La actividad de la enzima también puede ser incrementada mediante su auto-agregación, lo cual permite sugerir que la enzima podría presentar una transición de monómero a dímero23. Los solventes orgánicos como el dimetilsulfóxido y los poli-alcoholes (etilenglicol, glicerol) también simulan el efecto estimulatorio de la CaM3,4, lo cual sugiere que también actúan removiendo la mencionada compuerta autoinhibitoria7 (Figura 1).

Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática

307

Estimulación por CaM

Proteólisis controlada CaM

Ca 2+ -ATPasa

Dominio autoinhibitorio

Solvente orgánico

Estimulación por solventes orgánicos 2+ Figura 1. Modelo de interacción de la Ca -ATPasa de la membrana plasmática con la calmodulina y con solventes orgánicos como el DMSO. Ver explicación en el texto (Redibujado de Benaim, G. 1993, con autorización).

Regulación de la Ca2+-ATPasa por otros efectores

Estimulación por etanol y por fosfatidiletanol

La Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática también puede ser estimulada por fosfolípidos acídicos y ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga18. De hecho, se ha postulado que la proporción de fosfatidilserina presente en la cara interna de la membrana plasmática es suficiente para estimular al 50% de la actividad de la enzima. El efecto de los fosfolípidos acídicos es más notable sobre la afinidad de la enzima por el Ca2+, la cual se incrementa por encima del valor alcanzado cuando es estimulada por la CaM18. También puede ser estimulada mediante fosforilación por diferentes proteínas quinasas, como por la proteína-quinasa A19 y por la proteínaquinasa C36. Respecto a la estimulación por la proteína quinasa C, esta ocurre el mismo sitio de unión de la CaM, por lo que ambos efectores actúan sobre la bomba de calcio de una manera excluyente, por lo que sus efectos sobre la enzima no son aditivos. De esta manera, cuando la enzima ha sido fosforilada por la proteína quinasa C, no puede unir CaM. De acuerdo con esto, cuando la enzima tiene enlazada a la CaM, el sitio de fosforilación por la quinasa esta protegido por la interacción36. Los iones monovalentes, como el Na+ y el K+, también regulan la actividad de la Ca2+-ATPasa31,32.

A pesar de que el alcohol se ha consumido por todas las civilizaciones desde que se conoce la historia del hombre, aún se desconoce el mecanismo mediante el cual ejerce su efecto farmacológico. Menos se sabe de las razones que convierten a un individuo en alcohólico y a otros no. Tampoco se sabe mucho acerca de los mecanismos de transmisión de señales que en última instancia definen el estado de ánimo de los seres humanos. Sin embargo, existen evidencias recientes que señalan al calcio como responsable de alguno de estos fenómenos. Así, se ha reportado en estudios realizados por un grupo de psiquiatras en pacientes maníacodepresivos, que durante la fase maníaca, la concentración de calcio intracelular es menor que durante la fase depresiva. Inclusive, el tratamiento con litio en individuos bipolares, revierte a los pacientes a una distribución normal de las concentraciones de calcio intracelular. No es difícil concebir que, como el calcio regula la liberación de neurotransmisores, una perturbación en los mecanismos homeostáticos responsables del mantenimiento de las concentraciones básales intracelulares de este catión, podría ser responsable de algunas de estas manifestaciones clínicas. En este particular, hemos obtenido evidencias de que el etanol y otros alcoholes alifáticos de cadena corta

308

Benaim

estimulan la Ca2+-ATPasa de eritrocitos humanos, tanto en su forma purificada como sobre la enzima in situ10. El transporte de calcio en vesículas invertidas de eritrocitos humanos también es estimulado por el etanol de una manera dosis-dependiente, lo cual permite inferir que etanol podía estimular esta actividad in vivo10. El mecanismo de acción de este alcohol es distinto al de la CaM, ya que su efecto es aditivo con el modulador proteico natural, tanto con respecto a la velocidad máxima de la enzima, como sobre su afinidad por el Ca2+ y ATP10. El efecto del etanol sobre la Ca2+-ATPasa es totalmente revertido al lavar las membranas mediante centrifugación en un medio sin alcohol, lo cual sugiere que el efecto inducido por el etanol sobre la Ca2+ATPasa en condiciones farmacológicas, puede ser revertido una vez que el alcohol haya sido eliminado22. Por otra parte, siguiendo con este mismo estudio, se demostró que el efecto del etanol no se confina a la Ca2+-ATPasa de eritrocitos, sino que es capaz de

estimular también a la enzima homóloga de Leishmania mexicana9, lo cual sugiere que este efecto podría ser mas general, ya que la Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática es una enzima, que además de ser ubicua en células eucarióticas5,6, está bastante conservada evolutivamente11,17. Otros resultados de nuestro laboratorio han demostrado que el fosfatidiletanol es capaz de estimular la actividad de la Ca2+-ATPasa a niveles mayores que otros fosfolípidos naturales34, tanto en la enzima purificada de eritrocitos humanos como sobre la enzima in situ22 (Figura 2). También hemos demostrado que este efecto es extrapolable al transporte de Ca2+, en vesículas invertidas de eritrocitos humanos34. Este efecto es interesante, ya que este fosfolípido se acumula en la membrana cuando el etanol esta presente, mediante un proceso de transfosfatidilación mediado por la fosfolipasa D28, en el cual el alcohol sustituye al agua, formándose un fosfatidilalcohol en lugar de ácido fosfatídico.

Actividad Específica (nmolesPi/mg.min)

40

30

20

10

0

0

100

200

300

400

500

Concentración de fosfatidiletanol, (µg/ml) 2+ Figura 2. Efecto de concentraciones crecientes de fosfatidiletanol sobre la actividad de la Ca -ATPasa de fragmentos de membrana. 2+ La concentración de Ca libre utilizado fue 10 µM. Control (U); 5% (v/v) etanol (S). Tomado de Cervino y Benaim, 2002, con autorización).

Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática La acumulación de fosfatidiletanol se ha reportado que ocurre luego de una ingesta alcohólica, presentando una tasa de degradación muy lenta28. De hecho, se ha postulado que parte del efecto del etanol en humanos puede ser atribuido a la acumulación en la membrana de fosfatidiletanol28. Los hallazgos anteriores nos han permitido postular que la combinación del etanol con el fosfatidiletanol formado a partir de éste, podría tener un efecto sinergístico sobre la activación de la Ca2+-ATPasa y el consecuente transporte de calcio. Este efecto se observa mas sobre la afinidad de la enzima por el Ca2+ , lo cual permite especular que cuando la enzima se encuentra estimulada por ambos efectores, podría disminuir la concentración basal del catión por debajo a la que se alcanza en presencia de por ejemplo, CaM. De esta manera, esto podría conllevar a que a la célula le sería mas difícil alcanzar un nivel umbral en la [Ca2+]i luego de una señal adecuada, respondiendo mas tardíamente, con los consecuentes posibles efectos que esto podría ocasionar en los mecanismos de transmisión de señales. Más recientemente hemos encontrado que el efecto del etanol es diferente entre las distintas isoformas de la enzima presentes en humanos21. Así, hemos observado que el etanol tiene un efecto diferencial sobre cuatro isoformas diferentes de la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática (PMCA1CI, PMCA2CI, PMCA4CI y PMCA4CII)21. Estas isoformas son producto de 3 genes diferentes y difieren en cuanto a estructura y en algunas de sus propiedades20. Asimismo, estas isoformas se encuentran expresada de manera diferencial en los distintos tejidos33. Las isoformas PMCA1CI y PMCA4CII se encuentran expresadas en las membranas de todas las células eucariotas estudiadas hasta el momento, la isoforma PMCA4CI se encuentra principalmente en tejidos musculares tales como corazón y estomago, mientras que la isoforma PMCA2CI se encuentra expresada principalmente en células nerviosas, cerebro y cerebelo20,33. Para realizar este estudio, las 4 isoformas fueron expresadas mediante un sistema de sobre-expresión a través de baculovirus. Para ello, baculovirus recombinantes conteniendo el cDNA para cada una de las isoformas fueron utilizados para infectar una línea celular de insectos (Sf9). Posterior a la expresión, las proteínas de interés fueron caracterizadas tanto desde el punto de vista bioquímico como funcional21. Las 4 isoformas resultaron ser estimuladas por el etanol en una forma dosis-dependiente, observándose igualmente en todas ellas un efecto aditivo del alcohol sobre la estimulación obtenida por la CaM. Sin embargo, existieron diferencias significativas entre las mismas en cuanto a la concentración del alcohol a la cual se alcanzó el máximo efecto estimulatorio (Figura 3). En este sentido, ha sido muy interesante observar que la isoforma mas sensible al etanol es la PMCA2CI21, la cual como se mencionó está ubicada fundamentalmente en cerebro, cerebelo y tejido nervioso33. La dosis de etanol con la cual se alcanza el máximo de estimulación en esta isoforma está precisamente en el rango

309 farmacológico27, fácilmente adquirible en la sangre luego del consumo excesivo de alcohol. Estos resultados nos permiten sugerir que el efecto del etanol en humanos podría deberse a la estimulación del transporte de calcio a nivel de estos tejidos, con la consecuente disminución en la concentración citoplasmática de este catión. Esto tendría consecuencias en la liberación de ciertos neurotransmisores, ya que es bien conocido que este fenómeno esta regulado por los niveles de calcio en las células de estos tejidos. Como se mencionó anteriormente, se ha encontrado en estudios con pacientes maníaco-depresivos, una correlación entre la concentración de calcio citoplasmático y el estado anímico. Específicamente, durante la crisis maníaca, los pacientes presentaron una menor concentración de Ca2+ citoplasmático en los eritrocitos, que durante la crisis depresiva. El estado de animo durante la crisis maníaca se asemeja al inducido por la intoxicación etílica, en cuanto a la manifestación de un cuadro eufórico. Aún cuando esta relación es hasta el presente especulativa, es perfectamente factible, y merece ser investigada con detalle en el futuro. En otro orden de ideas, recientemente también hemos adelantado con respecto a la identificación del sitio de interacción de la bomba de calcio con el etanol. Durante el estudio del efecto del etanol sobre las diferentes isoformas de la Ca2+-ATPasa, pudimos observar que dos de las isoformas, las cuales son productos de un mismo gen, las isoformas PMCA4CI y PMCA4CII, se comportaron de manera diferencial con el etanol21. Estas isoformas únicamente difieren en cuanto a la secuencia en la porción C-terminal de la proteína. Estos hallazgos sugieren que esta región de la enzima pudiera ser importante para el mecanismo de acción del etanol. Con el objeto de verificar esta posibilidad, estudiamos el efecto del etanol sobre dos formas truncadas de la enzima originadas a partir de la isoforma PMCA4CII. Una de las formas truncadas carece de los 44 aminoácidos hacia la región C-terminal (PMCA∆44), mientras que la otra forma presenta una truncación de 139 aminoácidos (PMCA4∆139) hacia esta misma región. Estas formas truncadas fueron expresadas mediante el mismo sistema descrito anteriormente21. Cuando se ensayó el efecto del etanol sobre la actividad enzimática de la isoforma PMCA4∆44 se observó que el etanol estimuló a esta proteína de manera similar al efecto observado sobre la isoforma nativa PMCA4CII. Por el contrario, cuando se determinó el efecto del etanol sobre la forma truncada PMCA4∆139 el etanol no tuvo ningún efecto sobre la actividad de la enzima21. Estos resultados demuestran que la región relevante en la Ca2+-ATPasa para el efecto del etanol está ubicada entre estos 95 aminoácidos diferentes entre las dos formas truncadas. Estos estudios merecen ser continuados con el objeto de caracterizar la secuencia de aminoácidos responsable del efecto del etanol en esta enzima.

Actividad Ca2+-ATPasa, (%)

Benaim

Actividad Ca2+-ATPasa, (%)

310

400

300

200

100

PMCA1CI 0 0

1

2

3

4

5

6

400

300

200

100

PMCA4CII 0 0

2

400

300

200

100

PMCA2CI 0 0

1

2

3

4

6

8

10

12

Et-OH, % (v/v) Actividad Ca2+-ATPasa, (%)

Actividad Ca2+-ATPasa, (%)

Et-OH, % (v/v)

4

5

6

Et-OH, % (v/v)

400

300

200

100

PMCA4CI 0 0

2

4

6

8

10

12

Et-OH, % (v/v)

2+ Figura 3. Efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de las distintas isoformas expresadas de la Ca -ATPasa. La concentración de 2+ Ca libre fue 10 µM. (A) isoforma PMCA1CI, (B) isoforma PMCA2CI, (C) isoforma PMCA4CI y (D) isoforma PMCA4CII. (○) representa la curva de control y (●) en presencia de 5 µg/ml CaM. El 100 % de actividad para la isoforma PMCA1CI corresponde a una actividad específica de 1.40 nmolPi/mg.min, para la isoforma PMCA2CI es de 4.36 nmolPi/mg.min, para la PMCA4CI es de 6.19 nmolPi/mg.min y para la PMCA4CII es de 7.95 nmolPi/mg.min. (Tomado de Cervino y col. 1998, con autorización).

Regulación de la Ca2+-ATPasa por otros lípidos naturales El efecto del etanol sobre la actividad hidrolítica de ATP y sobre el transporte de calcio asociado es mayor que el reportado hasta el presente mediante el uso de otros efectores naturales o artificiales10,34, lo cual índica que la bomba de calcio de la membrana plasmática debe ser estimulada fisiológicamente mediante otros mecanismos desconocidos hasta el presente. En este sentido nos propusimos identificar la posible existencia de estos efectores naturales. Entre los candidatos que decidimos estudiar, tomando en cuenta sus características físico-químicas y su estructura molecular (compuestos anfifílicos con grupos "hidroxilo" libres) se encuentran los esfingolípidos. Estos compuestos cuya función era bastante oscura en el pasado (de ahí su nombre), han sido reconocidos recientemente como un importante grupo de segundos mensajeros, involucrados en procesos celulares tan relevantes como la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular

programada, mejor conocida como apoptosis30. La ceramida se forma a partir de la esfingomielina por acción de una esfingomielinasa, y a su vez es transformada en esfingosina por una ceramidasa. Ambos esfingolípidos presentan dos grupos “hidroxilo” libres (Figura 4) y a su vez, ambos son susceptibles de ser fosforilados a través de quinasas específicas, las cuales los transforman en ceramida-1-P y esfingosina-1-P, los cuales constituyen a su vez otro grupo de señales con funciones diferentes a sus precursores30. A pesar de la importancia que han revestido recientemente este nuevo grupo de señales, poco se sabe respecto a su mecanismo de acción, y menos aún respecto a su relación con otros mensajeros, en particular con el Ca2+. Utilizando como sistema de estudio a la Ca2+-ATPasa purificada de eritrocitos humanos, demostramos que la ceramida tiene un notable efecto estimulatorio sobre la actividad de esta enzima24. Este efecto es aditivo al obtenido en presencia de CaM, y curiosamente también al obtenido en presencia de etanol, lo cual indica que

Ca2+-ATPasa de la membrana plasmática

311

actúan a través de mecanismos distintos (Figura 5). El efecto observado se manifiesta también en un incremento significativo en la afinidad de la enzima por el Ca2+. En este estudio también ensayamos el efecto de este esfingolípido sobre la expresión funcional de la Ca2+-ATPasa, el transporte de Ca2+, encontrando que es capaz de estimular la acumulación del catión en vesículas invertidas de eritrocitos humanos24, también de una manera aditiva a la CaM (Figura 6). La esfingosina,

a diferencia de la ceramida, tiene un marcado efecto inhibitorio sobre la actividad de la Ca2+-ATPasa, tanto en presencia como en ausencia de CaM, compatible con el frecuente efecto antagónico que estos dos esfingolípidos presentan entre si en diferentes sistemas30. Por otra parte, ni la ceramida-1-P, ni la esfingosina-1-P mostraron tener efecto sobre la actividad de esta enzima24. Estos estudios permiten enlazar a la Ca2+ -ATPasa con los esfingolípidos en la red de transmisión de señales.

OH

+

CH2OPO3-CH2CH2N(CH3)3

NH O

Esfingomielina esfingomielinasa

Ceramida OH

CH2OH

NH

ceramida quinasa

Ceramida-1-fosfato OH

CH2OPO3-H2

NH O

O

ceramidasa

Esfingosina OH

CH2OH

+NH3

esfingosina quinasa

Esfingosina-1-fosfato OH

CH2OPO3-H2

+NH3

Figura 4. Diagrama de la ruta de síntesis y degradación de los esfingolípidos. Las enzimas principales involucradas están señaladas.

Benaim

Actividad Ca2+-ATPasa (µmoles Pi/mg.min)

312

6

4

2

0 0

10 20 30 40 Concentración de ceramida, (µM)

50

2+ Figura 5. Efecto de concentraciones crecientes de ceramida sobre la actividad de la Ca -ATPasa purificada de eritrocitos humanos. La 2+ concentración de Ca libre utilizado fue 10 µM. Control (○); Calmodulina (●).5% (v/v) etanol (U); 5% (v/v) etanol mas calmodulina (S). Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The Biochemical Society

ATP ATP Ceramida Ceramide

CaM CaM

CaCl 2 2.5 µM

seg 100 sec

A23187 A-23187

2+ 2+ Figura 6. Transporte de Ca inducido por ceramida en vesículas de eritrocitos humanos. El transporte de Ca se determinó mediante Arsenazo III en un espectrofotómetro de doble longitud de onda (675-685 nm) en vesículas invertidas de eritrocitos humanos. El transporte de Ca2+ se evidencia como una disminución en la señal debida a la disminución del Ca2+ extravesicular, luego de su captura a 2+ través de la bomba. La adición del ionóforo de Ca A-23187 conlleva a la liberación del catión, lo cual demuestra que había sido acumulado en las vesículas. (S). Modificada con permiso de C. Colina, V. Cervino y G. Benaim, (2002) Biochem. J. 362: 247-251. The Biochemical Society.

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Como continuación de este estudio, mas recientemente hemos obtenido resultados que apoyan que el diacilglicerol, otro lípido con un grupo “hidroxilo” libre, también es capaz de estimular la Ca2+-ATPasa, incluso a niveles superiores a los alcanzados por otros efectores naturales, reproduciendo parcialmente el efecto del etanol sobre esta enzima37. Como se mencionó anteriormente, el diacilglicerol es un importante segundo mensajero que se forma mediante la activación de receptores por ciertas hormonas y neurotransmisores, lo cual conlleva a la hidrólisis del precursor fosfatidilinositol 4,5, -bisfosfato15 y a la producción simultanea del promotor de la liberación de

Ca2+ del retículo endoplasmático, el inositol-(1,4,5) trisfosfato. Los resultados obtenidos hasta el presente indican que el efecto del diacilglicerol sobre la actividad de la enzima es aditivo respecto a la estimulación por la CaM y por la proteína quinasa C, lo cual constituiría una vía alterna de regulación de la Ca2+-ATPasa. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el FONACIT (Proyecto S1-1999000058 y Proyecto de Grupo G2001000637) y por el C.D.C.H-U.C.V. PI-03-33-4798/00.

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