2018-03-20
KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny jest WEKTOR
REKOMBINACJA DNA rekombinacja DNA to łączenie ze sobą dowolnych fragmentów DNA z wektorem i wprowadzanie ich do mikroorganizmu, w którym uzyskany hybrydowy/ zrekombinowany DNA będzie się namnażać i/ lub ulegać ekspresji.
Fragment DNA, który chcemy sklonować może być produktem reakcji amplifikacji (PCR) lub dowolnym fragmentem o znanej długości np. po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
WEKTORY Wektory są to elementy genetyczne , które mają zdolność do namnażania po wprowadzeniu do komórki biorcy (mikroorganizmu), zawierają tzw. markery selekcyjne posiadają unikalne miejsca rozpoznawane przez enzymy selekcyjne w obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy fragment DNA, bez naruszania zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych cząsteczek posiadają tzw. mały zakres gospodarza nie posiadają zdolności koniugacyjnych
1
2018-03-20
WEKTORY plazmid
• • • •
Plazmidy-długość insertu do 1Kb Fagi Kosmidy- długość insertu do 45Kb Wektory wahadłowe/czółenkowe (shuttle vectors)
chromosom
ETAPY KLONOWANIA •
LIGACJA
•
TRANSFORMACJA
•
WYSIEW BAKTERII NA PODŁOŻA SELEKCYJNE
•
HODOWLA TRANSFORMANTÓW NA PODŁOŻU PŁYNNYM
•
IZOLACJA WEKTORA Z BAKTERII (MINILIZA)
LIGACJA Mieszanina ligacyjna: • bufor • wektor • produkt PCR (insert) • ligaza • H2O
proporcje wektor : insert jak 1:3
Inkubacja 1h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C
zrekombinowany
wstawka DNA (insert)
2
2018-03-20
TRANSFORMACJA •
Wektory przedostają się do wnętrza komórki bakteryjnej przez tzw. strefy adhezji- miejsca, w których błona cytoplazmatyczna zlewa się z błoną zewnętrzną tworząc kanał
•
pobieranie DNA zachodzi w temperaturze ok. 0°C
•
obecność jonów Ca2+
•
•
równoważy ujemne ładunki jonowe fosfolipidów błony zewnętrznej
•
powoduje percypitację DNA na powierzchni komórek bakteryjnych
•
powoduje zmiany w strukturze błony komórkowej
szok cieplny (temp. 420C), lub elektryczny wspomaga proces adhezji
α-KOMPLEMENTACJA gen lacZ - koduje β -galaktozydazę, enzym rozkladajacy laktozę do glukozy i galaktozy.Transkrypcja genu lacZ możliwa jest tylko w obecności laktozy lub jej analogów, które znajdują w pożywce. zmutowany gen lacZ wytwarzający nieaktywny N-terminalny fragment βgalaktozytazy (fragment α), niezdolny do rozkładu laktozy
zmutowany gen lacZ wytwarzający nieaktywny C-terminalny fragment βgalaktozytazy (fragment ω), niezdolny do rozkładu laktozy
α
Zmutowany szczep E.coli
plazmid
ω
α
ω
Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina
α-KOMPLEMENTACJA Włączenie cząsteczki obcego DNA do plazmidu trwale blokuje gen lacZ, a więc fragment α nie jest wytwarzany i nie może zajść α-komplementacja. Ponadto do podłoża dodaje się jeszcze chromogen X-gal, który jest rozkładany przez β-galaktozydazę dając niebieskie zabarwienie kolonii.
α plazmid
Zmutowany szczep E.coli
ω insert blokujący gen lacZ
Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina
3
2018-03-20
gen oporności na ampicylinę
gen lacZ synteza β-galaktozydazy, rozkład X-gal do niebieskiego produktu
insert brak β-galaktozydazy, X-gal nie rozkłada się
Hodowlę bakterii na podłożu stałym prowadzi się przez noc w temperaturze 370C.
ROZRÓŻNIANIE TRANSFORMANTÓW RODZAJ KOLONII
AMPICYLINA
X-GAL
Bakterie bez plazmidów
-
-
Bakterie z plazmidami niezrekombinowanymi
+
niebieskie
Bakterie z plazmidami zrekombinowanymi
+
białe
WEKTORY PLAZMIDOWE Skonstruowane są z fragmentów naturalnie występujących plazmidów, odcinków DNA chromosomalnego, fagowego lub syntetycznych oligonukleotydów. Przeciętna wielkość wektora plazmidowego to 2500-3000pz
4
2018-03-20
WEKTORY PLAZMIDOWE • wektory namnażające fragmenty dwuniciowego DNA • wektory namnażające mRNA (ekspresyjne) • wektory namnażające jednoniciowy DNA (poprzez włączenie miejsc ORI z faga M13) liczba kopii na komórkę: • pBR322 i pochodne; 15-20 • pUC; 500-700 Oba typy plazmidów mają ten sam replikon i mogą współistnieć w jednej komórce bakteryjnej W obu typach plazmidów w miejscach wiązania insertu włączone zostały fragmenty syntetyczne, rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne- polilinkery
WEKTORY PLAZMIDOWE Małe rozmiary wektorów pUC sprawiają, że replikują częściej, mają większą pojemność-włączają większe inserty oraz łatwiej transformują komórki biorcy Selekcja zrekombinowanych klonów zachodzi: - poprzez wyprodukowanie β-galaktozydazy (w przypadku, gdy brak jest insertu), - poprzez zahamowanie wzrostu klonów wywołane ekspresja genu letalnego dla komórek gospodarza (w przypadku, gdy brak jest insertu)
WEKTORY FAGOWE Bakteriofag λ i pochodne • dwuniciowy, zawierający jednoniciowe, kohezyjne fragmenty cos, • zmodyfikowany poprzez wprowadzenie: polilinkerów oraz delecji (na obszarze do 25% pierwotnej długości faga), które „wypełniane są” insertem • długość ok 48Kb • łączenie z insertem na drodze substytucji- wycięcie enzymem restrykcyjnym miejsc nieistotnych dla funkcji życiowych i „wypełnienie” insertem Selekcja zrekombinowanych fagów zachodzi w trakcie „pakowania” DNA faga do kapsydu- w przypadku niewypełnionych delecji fag nie zapełnia kapsydu i ginie
5
2018-03-20
WEKTORY FAGOWE Bakteriofag M13 i pochodne • jednoniciowy, w komórce może występować do 300 kopii • po wniknięciu DNA do bakterii następuje synteza drugiej nici i replikacja formy dwuniciowej (kolistej) i w tej formie się powiela • końcowa faza infekcji to powstanie jednoniciowego DNA, który w osłonkach białkowych wydostaje się z komórki nie powodując jej lizy • długość ok 6,5Kb • łączenie z obcym DNA na drodze insercji- nacięcie enzymem restrykcyjnym miejsca z pozostawieniem lepkich końców, w które ligowany będzie insert Seklekcja zrekombinowanych fagów na postawie syntezy β-galaktozydazy
WEKTORY KOSMIDOWE • Nazwa kosmid pochodzi od wbudowanego do plazmidu fragmentu cos faga λ • Wielkość kosmidów waha się między 5 a 9Kb • Włączanie kosmidów do bakterii odbywa się na ogół poprzez infekcję fagiem λ (nie przez transformację) • w pierwszej fazie fragmenty cos odpowiadają za fragmentację insertu, tak aby zmieścił się on w kapsydzie faga • w drugiej fazie (po infekcji) fragmenty cos odpowiadają za cyrkularyzację kosmidu (kohezyjne końce cos łączą się)
6