KLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY

2018-03-20 KLONOWANIE DNA  Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA  DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo)  W probówce...
9 downloads 0 Views 138KB Size
2018-03-20

KLONOWANIE DNA  Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA  DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo)  W probówce (PCR)  Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny jest WEKTOR

REKOMBINACJA DNA rekombinacja DNA to łączenie ze sobą dowolnych fragmentów DNA z wektorem i wprowadzanie ich do mikroorganizmu, w którym uzyskany hybrydowy/ zrekombinowany DNA będzie się namnażać i/ lub ulegać ekspresji.

Fragment DNA, który chcemy sklonować może być produktem reakcji amplifikacji (PCR) lub dowolnym fragmentem o znanej długości np. po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

WEKTORY Wektory są to elementy genetyczne , które mają zdolność do namnażania po wprowadzeniu do komórki biorcy (mikroorganizmu), zawierają tzw. markery selekcyjne  posiadają unikalne miejsca rozpoznawane przez enzymy selekcyjne w obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy fragment DNA, bez naruszania zdolności wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych cząsteczek  posiadają tzw. mały zakres gospodarza  nie posiadają zdolności koniugacyjnych

1

2018-03-20

WEKTORY plazmid

• • • •

Plazmidy-długość insertu do 1Kb Fagi Kosmidy- długość insertu do 45Kb Wektory wahadłowe/czółenkowe (shuttle vectors)

chromosom

ETAPY KLONOWANIA •

LIGACJA



TRANSFORMACJA



WYSIEW BAKTERII NA PODŁOŻA SELEKCYJNE



HODOWLA TRANSFORMANTÓW NA PODŁOŻU PŁYNNYM



IZOLACJA WEKTORA Z BAKTERII (MINILIZA)

LIGACJA Mieszanina ligacyjna: • bufor • wektor • produkt PCR (insert) • ligaza • H2O

proporcje wektor : insert jak 1:3

Inkubacja 1h w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C

zrekombinowany

wstawka DNA (insert)

2

2018-03-20

TRANSFORMACJA •

Wektory przedostają się do wnętrza komórki bakteryjnej przez tzw. strefy adhezji- miejsca, w których błona cytoplazmatyczna zlewa się z błoną zewnętrzną tworząc kanał



pobieranie DNA zachodzi w temperaturze ok. 0°C



obecność jonów Ca2+





równoważy ujemne ładunki jonowe fosfolipidów błony zewnętrznej



powoduje percypitację DNA na powierzchni komórek bakteryjnych



powoduje zmiany w strukturze błony komórkowej

szok cieplny (temp. 420C), lub elektryczny wspomaga proces adhezji

α-KOMPLEMENTACJA gen lacZ - koduje β -galaktozydazę, enzym rozkladajacy laktozę do glukozy i galaktozy.Transkrypcja genu lacZ możliwa jest tylko w obecności laktozy lub jej analogów, które znajdują w pożywce. zmutowany gen lacZ wytwarzający nieaktywny N-terminalny fragment βgalaktozytazy (fragment α), niezdolny do rozkładu laktozy

zmutowany gen lacZ wytwarzający nieaktywny C-terminalny fragment βgalaktozytazy (fragment ω), niezdolny do rozkładu laktozy

α

Zmutowany szczep E.coli

plazmid

ω

α

ω

Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina

α-KOMPLEMENTACJA Włączenie cząsteczki obcego DNA do plazmidu trwale blokuje gen lacZ, a więc fragment α nie jest wytwarzany i nie może zajść α-komplementacja. Ponadto do podłoża dodaje się jeszcze chromogen X-gal, który jest rozkładany przez β-galaktozydazę dając niebieskie zabarwienie kolonii.

α plazmid

Zmutowany szczep E.coli

ω insert blokujący gen lacZ

Podłoże zawierające laktozę lub jej analog; X-gal; ampicylina

3

2018-03-20

gen oporności na ampicylinę

gen lacZ synteza β-galaktozydazy, rozkład X-gal do niebieskiego produktu

insert brak β-galaktozydazy, X-gal nie rozkłada się

Hodowlę bakterii na podłożu stałym prowadzi się przez noc w temperaturze 370C.

ROZRÓŻNIANIE TRANSFORMANTÓW RODZAJ KOLONII

AMPICYLINA

X-GAL

Bakterie bez plazmidów

-

-

Bakterie z plazmidami niezrekombinowanymi

+

niebieskie

Bakterie z plazmidami zrekombinowanymi

+

białe

WEKTORY PLAZMIDOWE Skonstruowane są z fragmentów naturalnie występujących plazmidów, odcinków DNA chromosomalnego, fagowego lub syntetycznych oligonukleotydów. Przeciętna wielkość wektora plazmidowego to 2500-3000pz

4

2018-03-20

WEKTORY PLAZMIDOWE • wektory namnażające fragmenty dwuniciowego DNA • wektory namnażające mRNA (ekspresyjne) • wektory namnażające jednoniciowy DNA (poprzez włączenie miejsc ORI z faga M13) liczba kopii na komórkę: • pBR322 i pochodne; 15-20 • pUC; 500-700  Oba typy plazmidów mają ten sam replikon i mogą współistnieć w jednej komórce bakteryjnej  W obu typach plazmidów w miejscach wiązania insertu włączone zostały fragmenty syntetyczne, rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne- polilinkery

WEKTORY PLAZMIDOWE  Małe rozmiary wektorów pUC sprawiają, że replikują częściej, mają większą pojemność-włączają większe inserty oraz łatwiej transformują komórki biorcy  Selekcja zrekombinowanych klonów zachodzi: - poprzez wyprodukowanie β-galaktozydazy (w przypadku, gdy brak jest insertu), - poprzez zahamowanie wzrostu klonów wywołane ekspresja genu letalnego dla komórek gospodarza (w przypadku, gdy brak jest insertu)

WEKTORY FAGOWE  Bakteriofag λ i pochodne • dwuniciowy, zawierający jednoniciowe, kohezyjne fragmenty cos, • zmodyfikowany poprzez wprowadzenie: polilinkerów oraz delecji (na obszarze do 25% pierwotnej długości faga), które „wypełniane są” insertem • długość ok 48Kb • łączenie z insertem na drodze substytucji- wycięcie enzymem restrykcyjnym miejsc nieistotnych dla funkcji życiowych i „wypełnienie” insertem  Selekcja zrekombinowanych fagów zachodzi w trakcie „pakowania” DNA faga do kapsydu- w przypadku niewypełnionych delecji fag nie zapełnia kapsydu i ginie

5

2018-03-20

WEKTORY FAGOWE  Bakteriofag M13 i pochodne • jednoniciowy, w komórce może występować do 300 kopii • po wniknięciu DNA do bakterii następuje synteza drugiej nici i replikacja formy dwuniciowej (kolistej) i w tej formie się powiela • końcowa faza infekcji to powstanie jednoniciowego DNA, który w osłonkach białkowych wydostaje się z komórki nie powodując jej lizy • długość ok 6,5Kb • łączenie z obcym DNA na drodze insercji- nacięcie enzymem restrykcyjnym miejsca z pozostawieniem lepkich końców, w które ligowany będzie insert  Seklekcja zrekombinowanych fagów na postawie syntezy β-galaktozydazy

WEKTORY KOSMIDOWE • Nazwa kosmid pochodzi od wbudowanego do plazmidu fragmentu cos faga λ • Wielkość kosmidów waha się między 5 a 9Kb • Włączanie kosmidów do bakterii odbywa się na ogół poprzez infekcję fagiem λ (nie przez transformację) • w pierwszej fazie fragmenty cos odpowiadają za fragmentację insertu, tak aby zmieścił się on w kapsydzie faga • w drugiej fazie (po infekcji) fragmenty cos odpowiadają za cyrkularyzację kosmidu (kohezyjne końce cos łączą się)

6

Suggest Documents