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Fitopatología EFECTO IN VITRO Y EN CAMPO DE ÉSTERES METÍLICOS DE ACEITES DE HIGUERILLA, PALMA Y SOYA SOBRE Mycosphaerella fijiensis, AGENTE CAUSAL DE LA SIGATOKA NEGRA EN BANANO (Musa AAA) Ángela Madriz Guzmán1, Igor Martínez2, Mauricio Guzmán2 1/Parte de la tesis en Ingeniería en Biotecnología, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Campus Cartago, Costa Rica. 2/Dirección de Investigaciones CORBANA S.A., Apdo. 390-7210, Guápiles, Costa Rica

ABSTRACT In vitro effect and in the field of methyl esters oils from castor, palm, and soybean on Mycosphaerella fijiensis, causal agent of black Sigatoka in bananas (Musa AAA). In banana cultivation up to 300 L ha-1 year-1 of mineral oil is used for black Sigatoka control, so the search for and evaluation of renewable alternatives is considered a priority. This study evaluated in vitro activity on M. fijiensis and the biological efficacy in the field on black Sigatoka of vegetable oil methyl esters (VOME) (castor, palm and soybean) in order to reach a preliminary determination of their potential use as alternatives to mineral oil in the control of the disease. The in vitro trial included as a reference a commercial formulation of mineral oil (Spraytex® M) and a palm oil methyl ester (Agrivel® 216). Two forms of applying the products were considered: (i) incorporating them into the medium (3 % agar-water) and (ii) distributing them over the surface of the medium. The mediums were treated with a discharge of ascospores from mature lesions in diseased tissue collected in the field, and incubated in the dark at 26 ± 1o C for 48 hours. Germination tube elongation was then measured. An evaluation was made in the field of the efficacy of the VOME, as well as the Spraytex® M and Agrivel® 216 at a dose of 7 L ha-1, alone and in mixture with the bitertanol fungicide. Also included was the bitertanol fungicide in water and an absolute control. A single application was made on a 12 x 7 cm (84 cm2) rectangle on the apical end of leaf 3 of young plants of cv. Grande Naine (Musa AAA). In vitro, all the products affected ascospore germination (germination tube shortening and deformation), whether they were incorporated into the medium or distributed over the surface of the medium. The castor oil VOME was the most active, together with the mineral oil (P< 0.0001). In the field, the effect on controlling the disease was greater (P= 0.0511) with the castor oil VOME and mineral oil when they were applied without fungicide. No differences were observed between treatments when applied in a mixture with bitertanol (P= 0.8169), but the effectiveness of the bitertanol with VOME, as with the Spraytex M, was greater than the bitertanol in water (P≤ 0.0363), which in turn did not differ from the control (P= 0.9970). The improvement in disease control when the soybean and palm VOME´s were mixed with bitertanol was evident. This was not the case with the castor VOME and mineral oil, which could be due to the fact that leaf penetration of the fungicide was affected by the higher viscosity of these products; this must be studied in greater detail, however. The VOME evaluated demonstrated their potential use for black Sigatoka control; nevertheless, more research is needed in order to optimize their potential use as mineral oil alternatives.

Key words: chemical control, mineral oil, vegetable oils. RESUMEN En el cultivo de banano se utilizan hasta 300 L ha-1 año-1 de aceite mineral para el combate de la Sigatoka negra, por lo que la búsqueda y evaluación de productos alternativos renovables se considera una prioridad. En esta investigación se evaluó la actividad in vitro sobre M. fijiensis y la eficacia biológica en campo sobre

Autor para correspondencia: Mauricio Guzmán ([email protected])

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la Sigatoka negra, de ésteres metílicos de aceites vegetales (EMAV) de higuerilla, palma y soya, con el fin de determinar preliminarmente sus posibilidades de uso como alternativas al aceite mineral en el combate de la enfermedad. En la prueba in vitro se incluyeron como referencia una formulación comercial de aceite mineral (Spraytex® M) y un éster metílico de aceite vegetal de palma (Agrivel® 216). Se consideraron dos formas de aplicación de los productos: (i) incorporado dentro del medio (agar-agua al 3 %) y (ii) distribuido sobre la superficie del mismo; sobre ellos se realizó una descarga de ascosporas provenientes de lesiones maduras de tejido enfermo colectado en campo y se incubaron en la oscuridad a 26 ± 1 oC durante 48 horas, posteriormente se midió la longitud del tubo germinativo. En campo, se evaluó la eficacia de los EMAV, así como del Spraytex® M y del Agrivel® 216 a la dosis de 7 L ha-1, solos y en mezcla con el fungicida bitertanol. Se incluyó también el fungicida bitertanol en agua y un testigo absoluto. Se realizó una sola aplicación en un rectángulo de 12 x 7 cm (84 cm2) en el extremo apical de la hoja 3 de plantas jóvenes de del cv. Grande Naine (Musa AAA). In vitro, todos los productos afectaron la germinación de las ascosporas (acortamientos y deformaciones del tubo germinativo), tanto cuando estos se incorporaron en el medio, como cuando se distribuyeron sobre la superficie del mismo. El EMAV de higuerilla fue el más activo, junto con el aceite mineral (P< 0,0001). En campo, el efecto en control de la enfermedad fue superior (P= 0,0511) con el EMAV de higuerilla y el aceite mineral, cuando estos se aplicaron sin fungicida. No se observaron diferencias entre tratamientos cuando estos se aplicaron en mezcla con bitertanol (P= 08169), pero la efectividad del bitertanol con los EMAV, como con Spraytex M, fue superior al bitertanol en agua (P≤ 0,0363), el cual a su vez no fue diferente del testigo (P= 0,9970). Fue evidente la ganancia en control de la enfermedad cuando los EMAV de soya y palma se mezclaron con bitertanol, no así con el EMAV de higuerilla y el aceite mineral, lo cual pudo deberse a que se afectó la penetración del fungicida en la hoja, debido a la mayor viscosidad de estos productos, pero esto debe estudiarse con más detalle. Los EMAV evaluados mostraron potencial para su utilización en el combate de la Sigatoka negra, no obstante, se requiere continuar con la investigación para optimizar su posible uso como alternativas al aceite mineral.

Palabras clave: aceite mineral, aceites vegetales, combate químico. INTRODUCCIÓN Las musáceas de interés comercial, como el banano (Musa AAA) y el plátano (Musa AAB), son severamente afectadas por la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet). Las infecciones del patógeno reducen la tasa fotosintética de la planta (Hidalgo et al. 2006) y el avance de los síntomas causa necrosis en las hojas, que culmina en una defoliación severa, dando como resultado un menor llenado del racimo (Stover 1972, Carlier et al. 2000, Jiménez et al. 2007). Si su control es deficiente, se afecta la vida verde de la fruta, lo cual puede ser la principal causa de pérdidas en los mercados de destino (Marín y Romero 1992, Romero 1996, Marín et al. 2003). Para el manejo de la Sigatoka negra CORBANA 34 (61): 11-27. 2008

se combinan el uso de aceite mineral en mezcla con fungicidas y prácticas culturales. El aceite mineral se comenzó a utilizar en banano a mediados de la década de los años cincuenta, para el combate de la Sigatoka amarilla (Mycosphaerella musicola Leach), con muy buenos resultados debido a sus características fungistáticas y a que permite una mejor adherencia, penetración y dispersión de los fungicidas en las hojas (Calpouzos et al. 1959, Calpouzos et al. 1960, Riedhart 1964, Calpouzos 1966, Meredith 1970, Stover 1990, Jacques y Kuhlmann 1999). Con la aparición de la Sigatoka negra, más agresiva que su predecesora (Stover y Dickson 1976) y con el desarrollo de resistencia a los fungicidas sitio-específicos (Romero y Sutton 1997 y 1998, Wirz y Chin

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2000, Chin et al. 2001, Marín et al. 2003), se incrementó la utilización de aceite mineral a escala comercial (Guzmán y Romero 1996, Marín et al. 2003). Se ha encontrado que los aceites minerales pueden reducir la fotosíntesis (Wedding et al. 1951, Riedhart 1961, Calpouzos 1966) y causar fitotoxicidad, con detrimento en la producción y los rendimientos (Israelí et al. 1993, Romero 1995, Marín et al. 2003). Además, el aceite mineral por su origen, es un recurso no renovable, del cual se ha experimentado escasez e incremento en el costo, todo lo cual ha puesto de manifiesto la necesidad de buscar y evaluar alternativas, como los aceites de origen vegetal y sus derivados. Un aceite vegetal concentrado es un producto emulsificable del mismo, el cual contiene de 5 a 20 % p/p de un surfactante y un mínimo de un 80 % p/p del aceite vegetal (ASTM E 1519-95). Algunos de los mejores productos basados en aceites vegetales son aquellos que han sido modificados a ésteres alquílicos de cadena corta, como los aceites metilados de soya y girasol o el aceite etilado de canola (Hanzen 2000). En banano, se han realizado algunos estudios con aceites vegetales, como el aceite de soya en el combate de la Sigatoka negra (Villalta y Guzmán 2001), canola, árbol de te y aceites vegetales emulsionados en el combate de la Sigatoka amarilla (Vawdrey et al. 2002, Vawdrey et al. 2004), los que resultaron inferiores al aceite mineral. En el aceite de palma se ha visto un mayor potencial, al utilizarlo como coadyuvante de los fungicidas sistémicos y aunque este carece de efecto fungistático (Martínez y Guzmán, sin publicar), se ha logrado hasta un 85 % del

- 13 control observado con el aceite mineral cuando ambos se han aplicado en mezcla con fungicidas (Villalta y Guzmán 2006, Martínez y Guzmán 2006, Martínez et al. 2006). Es conveniente evaluar y comparar diferentes tipos de aceites vegetales y generar más investigación que permita optimizar su posible uso como alternativa al aceite mineral. En consideración de lo anterior, se desarrolló la presente investigación. El objetivo fue evaluar el efecto de ésteres metílicos de higuerilla, palma y soya, in vitro sobre la germinación de ascosporas de M. fijiensis y en campo la eficacia biológica contra la Sigatoka negra. MATERIALES Y MÉTODOS Caracterización fisico-química de los ésteres. Se utilizó como materia prima aceite de soya (Glycine max L.), palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq) e higuerilla (Ricinus communis), los cuales fueron procesados por la empresa Energías Biodegradables de Costa Rica, S.A para la obtención de los ésteres metílicos. De cada éster obtenido, se analizó por triplicado su composición de ácidos grasos, tensión superficial, punto de ebullición, densidad y viscosidad. La composición de ácidos grasos se determinó mediante una cromatografía de gases, realizada por el Laboratorio de Servicios Analíticos (LASA) de la Universidad de Costa Rica. Se utilizó un cromatógrafo de gases Perkin Elmer Autosystem, con columna capilar HP-88, cianopropil metil aril polisiloxano de 100 m de longitud y 0,25 de diámetro interno, inyector tipo split/split less y detector tipo FID. La tensión superficial se midió

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- 14 con la ayuda de un tensiómetro (Fisher Modelo 20), a una temperatura de 24 oC, en el Laboratorio de Fisicoquímica de la Universidad de Costa Rica. Para determinar el punto de ebullición se utilizó el método micro y se realizó a una presión atmosférica de 663,06 mmHg. Para la densidad, cada muestra se pesó en balones de 25 mL, previamente tarados a una temperatura de 24 oC y posteriormente, se utilizó la siguiente fórmula: Densidad (ρ)= masa / volumen= (g ml-1). Ambas mediciones fueron realizadas en el Laboratorio de Química del Instituto Tecnológico de Costa Rica. La viscosidad fue medida utilizando el método estándar ASTM D 88, el cual emplea un Viscosímetro Saybolt Universal (VSU). La medición fue realizada a 40 y 100 oC en el Centro de Experimentación en Electromecánica del Instituto Tecnológico de Costa Rica. Evaluación de la actividad in vitro contra M. fijiensis. La evaluación se realizó en el Laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigaciones Agrícolas La Rita de CORBANA, ubicado en el distrito La Rita, cantón Pococí de la Provincia de Limón. Se evaluaron los ésteres metílicos de aceites de higuerilla, palma y soya, una formulación comercial de un éster metílico de aceite vegetal de palma (Agrivel® 216, Quivel S.A. Alajuela, Costa Rica), una de aceite mineral (Spraytex® M, Chevron) y un nonil-fenol de 7 moles (NP-7®, Bayer CropScience). Se decidió incluir este último producto, debido a que el mismo se utilizó como coadyuvante con los ésteres vegetales y el aceite mineral, para facilitar su dispersión en el medio. Se evaluaron dos formas de aplicación, en la primera de ellas, el producto a analizar se mezcló

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con el medio y en la segunda se dispersó sobre la superficie del mismo. Se utilizó un diseño de bloques completos al azar, bajo un arreglo factorial de 6 * 2 (6 productos y dos formas de aplicación), para un total de 12 tratamientos, más un testigo absoluto. Se utilizaron 5 repeticiones, cada repetición consistió de un plato de Petri de vidrio (100 * 15 mm). Se preparó un medio de cultivo agaragua al 3 %, el cual fue esterilizado en una autoclave (Rexall Industries Co., mod. IS-5A) por 20 minutos a 121 oC y 157 kPa de presión. Cuando el producto se mezcló con el medio se realizó el siguiente procedimiento: a cada plato de Petri se le añadió el producto (50 μl), seguido del emulsificante (15 μl, NP-7®), se mezcló con un asa de vidrio y se distribuyó por la superficie del plato. Seguidamente se agregaron 15 mL de agar-agua al 3 % en estado líquido (45 oC) y se agitó con el asa hasta obtener una mezcla uniforme, la cual se dejó en reposo por 15 minutos para que solidificara. Cuando el producto se distribuyó sobre la superficie del medio se utilizaron las mismas cantidades de los componentes. A cada plato de Petri se le añadió el agar-agua al 3 %, una vez solidificado el mismo, se agregó el producto y el emulsificante y estos se distribuyeron sobre la superficie del medio con un asa de vidrio, hasta formar una película continua. Con los medios preparados se procedió a realizar la descarga de ascosporas. Previamente se recolectó material con lesiones maduras de Sigatoka negra de plantas con racimo provenientes de fincas comerciales. Una vez en el laboratorio, dicho material fue seleccionado y se extrajeron, con un sacabocados de 2 cm

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de diámetro, discos de las lesiones con mayor concentración de pseudotecios, vista la hoja por el haz. Una vez recortados los discos, se pegaron cuatro de ellos (con el haz expuesto) con grapas metálicas sobre trozos de papel bond de 10 * 12 cm (120 cm2). Los trozos de papel, con el material vegetal con lesiones de Sigatoka negra adherido, se sumergieron en agua desionizada por 8 minutos, para la hidratación de los pseudotecios y así promover la liberación de ascosporas sobre los medios. Transcurridos los 8 minutos, se extrajeron las lesiones de Sigatoka negra y se les eliminó el exceso de agua con una toalla de papel absorbente. Luego de inmediato se colocaron en las tapas de los platos de Petri, durante 30 minutos, para que las ascosporas descargaran sobre los medios. En la parte externa del fondo del plato se señalaron las zonas donde se obtuvo la descarga de las ascosporas, esto para facilitar la localización de las mismas al momento de hacer las lecturas con el microscopio. Transcurridos los 30 minutos, se retiró el papel con el tejido vegetal, las placas se taparon y se sellaron con plástico adhesivo. Posteriormente, se incubaron por 48 horas a 26 - 27 o C a oscuridad en una incubadora (REVCO®, Mod. BOD 30 A14). Transcurrido el período de incubación, se realizó la lectura utilizando un microscopio de luz (Olympus® BX40). Cada plato de Petri fue revisado cuidadosamente y se observaron la forma de las ascosporas y de los tubos germinativos de las mismas. Con la ayuda de una escala en micrómetros ubicada en el lente del microscopio, se procedió a la medición de la longitud del tubo germinativo de 10 ascosporas por plato, para un total de 50 esporas por tratamiento.

- 15 Se realizó un Análisis de Varianza para estimar el efecto del tratamiento, la forma de aplicación y la interacción entre ambos. Las comparaciones entre tratamientos, dentro de cada forma de aplicación (sobre o incorporado en el medio), se realizaron por pruebas de Diferencia Mínima Significativa (DMS, P= 0,05). Por un contraste se comparó la actividad de cada tratamiento según la forma de aplicación en el medio. Todos los análisis se realizaron en el programa estadístico SAS (Statistical Analysis System, ver. 9.1 para Windows). Evaluación en campo de la eficacia biológica contra la Sigatoka negra. El experimento se realizó también en el Centro de Investigaciones Agrícolas La Rita, a 111 msnm, 10,27o de latitud norte y 83,78o de longitud oeste. Se inició en el mes de abril y finalizó en el mes de junio de 2007, período durante el cual se registraron 495,7 mm de lluvia, 86,1 % de humedad relativa promedio y una temperatura promedio de 24,8 oC, con mínimas y máximas promedio de 21,0 y 30,2 oC, respectivamente. Se evaluaron los ésteres metílicos de higuerilla, palma y soya, así como el Agrivel 216 y el Spraytex M, todos a las dosis de 7,0 L ha-1, solos y en mezcla con el fungicida bitertanol (Baycor® 30 DC, Bayer CropScience, 0,5 L ha-1). Se incluyó además, el fungicida bitertanol en agua y un testigo absoluto, para un total de 12 tratamientos, los cuales se distribuyeron en un diseño de bloques completos al azar, con 8 repeticiones. Cada repetición fue una planta del cultivar Grande Naine (Musa AAA) de aproximadamente 4 meses de edad, las cuales fueron obtenidas por cultivo in vitro de ápices. Las plantas

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- 16 fueron fertilizadas cada dos semanas con la fórmula 18-5-15-6-0,2-7,3 (N-P2O5-K2OMgO-B-S) a una dosis de 60 g planta-1. El aceite mineral y los ésteres metílicos de aceites vegetales se prepararon en emulsión a un volumen total de 300 L ha-1 y para emulsificar los ésteres y el aceite mineral se utilizó NP-7® al 1 % de la dosis del aceite y los ésteres evaluada (7,0 L ha-1). Para la mezcla de los componentes se utilizó un agitador magnético (Sybron®, mod. Nuova II) y se siguió un orden específico. Para los ésteres y el aceite mineral solos el orden de mezcla fue el siguiente: aceite + emulsificante + agitación 2 minutos + 50 % del agua + agitación 2 minutos + resto del agua; para los ésteres y el aceite mineral en mezcla con bitertanol: aceite + emulsificante + agitación 2 minutos + 50 % del agua + agitación 2 minutos + fungicida + agitación 2 minutos + resto del agua y para el fungicida bitertanol en agua: 100 % del agua + emulsificante + agitación 2 minutos + fungicida + agitación 2 minutos. En este último caso, la dosis del emulsificante fue la misma que se utilizó en los restantes tratamientos (0,23 ml de NP-7 por litro de mezcla). Se utilizó la técnica de “hoja simple” en la que cada tratamiento fue aplicado una vez, en un rectángulo de 12 * 7 cm (84 cm2) en el extremo apical del semilimbo izquierdo de la hoja 3 (vista la hoja de la base hacia el ápice). Este rectángulo fue definido con un marcador indeleble y al momento de la aplicación se colocó un molde de cartón, con el área rectangular recortada en el centro, para evitar aplicar fuera de la misma (Fig. 1). Para la aplicación se utilizó un aerógrafo de mezcla externa (Badger® Air-Brush modelo 350TM), previamente calibrado para el área de aplicación. La

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dosis aplicada se estimó considerando los 300 litros en la superficie de una hectárea (10.000 m2 = 1,0 * 108 cm2), lo que equivale a 0,252 ml en los 84 cm2 de la hoja. Se contabilizaron los días entre la aplicación y la aparición del estadio 6 (Fouré 1985) y la severidad de la enfermedad, definida como el porcentaje de área foliar necrosada por el patógeno. Las evaluaciones se realizaron dos veces por semana, en un área de 10 * 5 cm en la parte central del rectángulo demarcado en la hoja (Fig. 1) y finalizaron cuando tres repeticiones del testigo absoluto alcanzaron un 100 % de necrosis. Para reducir el error experimental, previo al análisis estadístico se eliminaron los valores extremos (el mayor y el menor) de las repeticiones de cada tratamiento y en cada variable. Para efectos de comparaciones estadísticas se hicieron dos grupos de tratamientos: los que se aplicaron solos y los que se aplicaron en mezcla con bitertanol. Las comparaciones entre tratamientos de cada grupo se realizaron por pruebas de Diferencia Mínima Significativa (DMS, P= 0,05). Por medio de contrastes ortogonales se compararon el testigo absoluto y el bitertanol en agua, entre si, con los ésteres vegetales y el aceite mineral. Todos los análisis se realizaron en el programa estadístico SAS (Statistical Analysis System, ver. 9.1 para Windows). RESULTADOS Caracterización fisico-química de los ésteres metílicos. Los EMAV de palma y de soya mostraron valores muy similares en todos los parámetros físicos analizados (viscosidad, tensión superficial, punto de ebullición y densidad), no así el de

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higuerilla, el cual destacó por ser más denso (0,932 respecto a 0,877 y 0,884 g mL-1 en palma y soya) y viscoso (1,79 * 10-5 respecto a 5,84 * 10-6 m2 s-1 a 40 °C en palma y soya). La viscosidad del EMAV de higuerilla fue similar al aceite mineral (1,50 * 10-5 m2 s-1) (Cuadros 1 y 2), aunque este último, de acuerdo con la información del fabricante, es menos denso (0,860 g ml-1). El linoleico (C:18:2) fue el ácido graso más abundante, tanto en el EMAV de soya (51,0 %), como en el de higuerilla (41,7 %). En el EMAV de palma, el ácido graso predominante fue el oleico (C:18:1, 43,1 %), seguido por el palmítico (C:16:0, 41,6 %); por el contrario, el esteárico (C:18:0), el mirístico (C:14:0) y gadoleico (C:20:1) fueron los ácidos que se encontraron en menores proporciones (0-9,2 %) en los diferentes EMAV (Cuadro 3). Evaluación de la actividad in vitro contra M. fijiensis. Comparativamente con el testigo, los ésteres metílicos de aceites vegetales (EMAV, incluida la formulación

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comercial Agrivel® 216) y el aceite mineral mostraron efectos inhibitorios sobre el crecimiento del tubo germinativo de las ascosporas de M. fijiensis (P< 0,0001). Se encontró interacción (P= 0,0173) entre el tratamiento y la forma de aplicación (incorporado o sobre la superficie del medio), por tal razón, las comparaciones entre tratamientos se realizaron considerando por separado la forma de aplicación. La forma de aplicación no afectó la actividad de los EMAV de higuerilla, palma y soya (P≥ 0,2572), pero sí la de los productos Agrivel 216 (P≤ 0,0001), Spraytex M (P=0,0438) y NP-7 (P≤ 0,0001). El Agrivel 216 fue más efectivo al ser dispersado en la superficie del medio, mientras que el Spraytex M y el emulsificante NP-7 fueron más activos al ser incorporados en el medio. El efecto de inhibición osciló entre 11,6 % (Agrivel 216) y un 56,5 % (higuerilla) cuando se incorporaron en el medio y entre un 10,9 % (soya) y un 54,2 %

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(higuerilla) cuando se aplicaron sobre la superficie del mismo. En ambas formas de aplicación, el éster de higuerilla y el los restantes tratamientos. También el emulsificante afectó el desarrollo del tubo y estos resultaron más cortos (19,8 y 16,3 % de inhibición, incorporado y sobre la Tanto los EMAV, como los productos comerciales, provocaron deformaciones en las ascosporas y en los tubos germi-

biológica contra la Sigatoka negra. La prueba DMS no indicó diferencias en la variable días para la aparición del estadio 6 entre los tratamientos (ésteres y aceite mineral), tanto cuando estos se aplicaron solos (P= 0,4162), como cuando se aplicaron en mezcla con bitertanol (P= absoluto, los EMAV y el aceite mineral retardaron entre 0,7 y 4,4 días la aparición del estadio 6, pero de acuerdo con los contrastes esta diferencia no llegó a ser

abultamientos e hinchamientos en sus cé-

EMAV y el aceite mineral en mezcla con bitertanol retardaron entre 2,3 y 4,1 días la aparición del estadio 6, pero la diferencia

o emergiendo de posiciones anormales.

0,0422, Cuadro 5).

Evaluación en campo de la eficacia

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- 20 zó el 100 % de necrosis 27 días después de la aplicación de los tratamientos, mientras que en ese mismo momento los tratamientos sin fungicida alcanzaron entre 70 y 100 % (Fig. 2a) y en mezcla con fungicida entre 52 y 73 % de necrosis (Fig. 2b). Al comparar los EMAV y el aceite mineral entre si (prueba DMS), la severidad fue menor (P= 0,0511) en los tratamientos de higuerilla y Spraytex M, cuando estos se aplicaron sin fungicida. En mezcla con bitertanol, todos los tratamientos fueron igualmente efectivos (P= 0,8169). De acuerdo con los contrastes, el Spraytex M sin fungicida redujo la severidad de la enfermedad respecto al testigo (P= 0,0297), no así los EMAV sin fungicida (P= 0,1478). En mezcla con bitertanol, tanto el Spraytex M (P= 0,0363) como los EMAV (P= 0,0015), redujeron la severidad de la enfermedad respecto al bitertanol en agua. Entre el Spraytex M y los EMAV no se observaron diferencias (P= 0,6512, Cuadro 6). En la figura 3 se muestra el grado de severidad promedio de la enfermedad en los tratamientos 21 días después de la aplicación. DISCUSIÓN Caracterización fisicoquímica de los ésteres metílicos de aceite de higuerilla, palma y soya. La literatura menciona que el ácido graso más frecuente en la estructura del aceite de higuerilla es el ácido ricinoleico con aproximadamente un 87 %, seguido del ácido oleico con aproximadamente 7 %, el ácido linoleico con 3 %, 1 % de ácido esteárico (todos con 18 carbonos) y 2 % de ácido palmítico (Windholz 1983, Irwin 1992, McKeon et al. 2000). Según los resultados de la cromatografía, el ácido ricinoleico no estu-

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vo presente en la muestra de aceite de higuerilla evaluado en esta investigación. Por el contrario, ácidos como el linoleico y el oleico se presentaron en proporciones mayores a las indicadas en la literatura. Lo anterior pudo deberse al proceso de transesterificación realizado durante la formulación, o bien, por el método de extracción del aceite por parte del fabricante. En vista de que el proceso de transesterificación utilizado es propiedad confidencial del fabricante, solo se puede especular acerca de las causas que pudieron afectar al ácido ricinoleico. En general, este procedimiento se puede realizar en medio ácido, básico e incluso neutro. Si se realizó en medio ácido, o si se utilizó ácido en alguna etapa del procedimiento para neutralizar, esto pudo favorecer la deshidratación del ácido ricinoleico, perdiendo así su grupo OH y formando un doble enlace (March 1985), convirtiéndose en ácido linoleico, el cual estuvo presente en un 41,7 %. En cuanto al ácido oleico, este ácido graso estuvo presente en un 33,7 % cuando la literatura lo registra en aproximadamente 7 %. Este pudo formarse a partir del ácido linoleico, por algún proceso de hidrogenación durante la fabricación (Dra. F. Roa, Escuela de Química ITCR. Com. Pers.). Los resultados obtenidos en el cromatograma para los ésteres metílicos de palma y de soya se apegan a lo descrito en la literatura y solo se observaron diferencias mínimas en el contenido de algunos de los ácidos grasos (May 1994, Chowdhury et al. 2007, Gee 2007). Los EMAV de higuerilla, palma y soya, no resultaron ser muy diferentes en su tensión superficial, ni en el punto de ebullición, sin embargo; hubo

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diferencias en cuanto a la densidad y la viscosidad, siendo el EMAV de higuerilla el más denso y viscoso. Estas características marcaron diferencia a la hora de realizar las mezclas y la aplicación en campo, ya que el EMAV de higuerilla presentó una apariencia mucho más aceitosa que el resto y fue más difícil de mezclar con el fungicida y el agua, a pesar de utilizarse emulsificante. Evaluación de la actividad in vitro contra M. fijiensis de los ésteres metílicos vegetales y del aceite mineral. Todos los tratamientos inhibieron en alguna medida el crecimiento del tubo germinativo de las ascosporas de M. fijiensis, no obstante, el EMAV de higuerilla y el aceite mineral mostraron ser más efectivos. Se han llevado a cabo diversos estudios del efecto de los ácidos grasos sobre algunos patógenos de importancia para el ser humano (Bergsson et al. 2001) y para la agricultura (Walters et al. 2004) y se ha observado que los ácidos grasos saturados de cadena media, los ácidos insaturados de cadena larga y algunos monoglicéridos ejercen un control efectivo sobre ellos. Con respecto a patógenos de importancia agronómica, se ha observado que el ácido linoleico, el cual estuvo presente en un 41,7 % en el EMAV de higuerilla, 51 % en el de soya y un 10,4 % en el de palma, es capaz de reducir significativamente el crecimiento miceliar de Rhizoctonia solani, Phytium ultimum, Pyrenophora avenae y Crinipellis perniciosa; con un máximo de inhibición de 74 % sobre R. solani (Walters et al. 2004). Jiménez (1995), encontró que las sales potásicas de los ácidos grasos laurico, mirístico, oleico, linoleico, palmítico (16:0) y

- 23 esteárico (18:0), causaron en conjunto, una disminución significativa en la germinación de los conidios de Colletotrichum capsici y una reducción en el crecimiento de los tubos germinativos de Fusarium spp. Sin embargo, in vivo, solamente observó una tendencia en la disminución de las lesiones causadas en el fruto de papaya por parte de Colletotrichum gloeosporioides, aunque esta disminución no fue significativa. Bigi et al. (2004), en un estudio donde evaluaron extractos de higuerilla, encontraron que los ácidos grasos eran los compuestos responsables de la actividad antifúngica sobre Leucoagaricus gongylophorus, el cual es el hongo simbionte de las hormigas cortadoras. Los resultados de la presente investigación son congruentes con los de previas investigaciones, en la que algunos ácidos grasos poseen actividad in vitro sobre diferentes microorganismos. Evaluación en campo de la eficacia biológica contra la Sigatoka negra de los ésteres metílicos de aceite de higuerilla, palma y soya y un aceite mineral. En cuanto a la severidad de la Sigatoka negra, los tratamientos de higuerilla y aceite mineral fueron los que mostraron mejores resultados al ser aplicados sin fungicida, lo que deja en evidencia el efecto fungistático que ejercen estos productos sobre el desarrollo de la enfermedad. Para el caso del aceite mineral, este efecto ha sido bien documentado (Calpouzos et al. 1959, Riedhart 1961, Guzmán y Romero 1996, Northover y Schneider 1996, Marín et al. 2003,), no así para los aceites vegetales, a los cuales se les ha señalado como carentes de este efecto, no obstante, la mayoría de estudios se han realizado con aceites derivados de la palma y de la soya

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- 24 (Vawdrey et al. 2004, Martínez y Guzmán 2006, Martínez et al. 2006). No obstante lo anterior, de acuerdo con los resultados de los análisis practicados a los ésteres en esta investigación, la composición en cuanto a ácidos grasos fue muy similar entre el EMAV de higuerilla y el de soya, pero su comportamiento biológico muy diferente, lo que hace pensar en la existencia de otros factores, físicos o químicos, involucrados en la mayor actividad del EMAV de higuerilla que requieren ser más estudiados. Diversos autores (Calpouzos et al. 1959, Marín y Romero 1992, Guzmán y Romero 1996, Northover y Schneider 1996, Marín et al. 2003, Martínez et al. 2006, Villalta y Guzmán 2002 y 2006) han señalado los beneficios del uso del aceite agrícola (de origen mineral o vegetal) en los programas de combate de la Sigatoka negra y otras enfermedades. Una de las razones es el efecto sinérgico que este producto ejerce al ser mezclado con los fungicidas. Con los resultados de este estudio se confirma este efecto, ya que comparativamente con el tratamiento de fungicida en agua, todos mostraron inhibición en el desarrollo de los síntomas de la Sigatoka negra. La excepción a lo anterior fue el éster metílico de aceite de higuerilla, con el cual no se observó un aumento en la efectividad al adicionarle el fungicida bitertanol. Este efecto puede estar relacionado con la viscosidad del éster (17,92 cSt), que pudo haber afectado la penetración del fungicida en la hoja, evitando que este ejerciera su acción. Lo anterior aunado a la conocida limitada capacidad de penetración del bitertanol en la hoja de banano (Pontzen 1998).

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Sin embargo, esta característica de mayor viscosidad podría ser en parte la responsable de la buena actividad biológica del EMAV de higuerilla observada al aplicarse el producto solo, ya que permitiría una mayor permanencia y acumulación en la hoja, similar a lo que ocurre con el aceite mineral (Marín y Romero 1992, Guzmán y Romero 1996, Bigi et al. 2004). Calpouzos et al. (1961) señalan que la viscosidad influye en la efectividad y la fitotoxicidad del aceite mineral. Los autores observaron que la efectividad de aceites parafínicos y nafténicos sobre la Sigatoka amarilla incrementó con la viscosidad hasta valores de 75-85 SUS (14,4-16,9 cSt), por encima de esos valores, solo se incrementó la fitotoxicidad sobre la planta. Jacques y Kuhlmann (1999) por su parte, consideran que la viscosidad no debe ser usada para estimar comportamiento o seguridad de un determinado aceite mineral de uso hortícola, ya que este es el resultado promedio de una mezcla de moléculas en el producto. De acuerdo con los mismos autores, las plantas e insectos no responden a las propiedades de flujo del fluido, sino al tipo de moléculas y al número de carbonos. Los resultados de esta investigación confirman el potencial que existe en los aceites vegetales, en sus ésteres o en los ácidos grasos que los componen, como fungicidas o coadyuvantes, para el combate de enfermedades en los cultivos. Sin embargo, cada fuente debe ser evaluada cuidadosamente por separado y en el caso particular del aceite de higuerilla, se debe prestar especial atención a su formulación y composición, ya que se conoce la presencia de potentes alergénicos en el

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