AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE LA MICROFLORA LEVADURIFORME DE INTERÉS AGROINDUSTRIAL PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL ASOCIADA A BOROJÓ (Borojoa patinoi) Y LULO (Solanum topiro).

JUAN MANUEL SANCLEMENTE

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA – CALI INGENIERIA AGROINDUSTRIAL FACULTAD DE INGENIERIA Santiago de Cali 2015

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE LA MICROFLORA LEVADURIFORME DE INTERÉS AGROINDUSTRIAL PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL ASOCIADA A BOROJÓ (Borojoa patinoi) Y LULO (Solanum topiro).

PRESENTADO POR: JUAN MANUEL SANCLEMENTE

DIRECTOR: RAUL ALBERTO CUERVO MULET. Biólogo Ph.D

CO-DIRECTOR: MARNEY PASCOLI CEREDA. Ingeniera Ph.D UNIVERSIDAD CATÓLICA DOM BOSCO – BRASIL

CO-DIRECTOR: FABIÁN FELIPE FERNANDEZ DAZA Biólogo MSc UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA – CALI

UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA – CALI INGENIERIA AGROINDUSTRIAL FACULTAD DE INGENIERIA Santiago de Cali 2015

DEDICATORIA A mis padres que lo han dado todo.

AGRADECIMIENTOS Agradeciendo primero a Dios. Para el desarrollo de esta investigación fue fundamental el apoyo de mis compañeros, familiares y profesores. A todos aquellos quienes intervinieron en la construcción de cada ápice de este estudio, gracias. Gracias al director y codirectores del proyecto de investigación, Raúl Alberto Cuervo Mulet PhD., Marney Pascoli Cereda PhD. y Fabián Felipe Fernández MSc. A mis compañeros de estudio y laboratorio, Lina Fernanda Escobar, Juan Camilo Saldarriaga y Maria Fernanda Posada. Al laboratorista Johannes Delgado MSc. A la directora del programa Claudia Liliana Zuluaga. A todos mis profesores, que mediante la enseñanza, me transmitieron la capacidad de disentir y analizar información importante para culminar con éxito esta investigación. Finalmente a mi familia, porque les debo todo.

CONTENIDO RESUMEN ..................................................................................................................... 11 INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 12 1 ANTECEDENTES ...................................................................................................... 13 2 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 16 3 MARCO TEÓRICO ................................................................................................... 18 3.1 Conceptos generales de las levaduras ...................................................................... 18 3.2 Fermentación .......................................................................................................... 18 3.2.1 Fermentación alcohólica ................................................................................... 19 3.3 Melaza .................................................................................................................... 19 3.4 Levaduras nativas en Colombia .............................................................................. 20 3.5 Levaduras endófitas ................................................................................................ 20 3.6 Frutas endémicas del Pacifico Colombiano ............................................................. 21 3.6.1 Lulo (Solanum topiro) ...................................................................................... 21 3.6.2 Borojó (Borojoa patinoi) .................................................................................. 22 3.7 Etanol ..................................................................................................................... 23 4 HIPÓTESIS ................................................................................................................. 25 5 OBJETIVOS ............................................................................................................... 26 5.1 Objetivo general ..................................................................................................... 26 5.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 26 6 METODOLOGÍA ....................................................................................................... 27 6.1 Recolección de las muestras.................................................................................... 27 6.2 Aislamiento de levaduras ........................................................................................ 27 6.3 Caracterización de las levaduras ............................................................................. 28 6.3.1 Caracterización morfológica de la colonia ........................................................ 28 6.3.1.2 Caracterización microscópica de levaduras ................................................ 28 6.3.2 Caracterización bioquímica .............................................................................. 28 6.4 Identificación del género......................................................................................... 29 6.5 Adaptación al sustrato ............................................................................................. 29 6.6 Evaluación de producción de etanol ........................................................................ 29 7 RESULTADOS. .......................................................................................................... 31 7.1 Caracterización morfológica y bioquímica .............................................................. 32

7.1.1 Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de Lulo (Solanum topiro). ................................................................................ 32 7.1.2 Caracterización bioquímica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir del fermento de Lulo (Solanum topiro)...................................................................... 37 7.1.3 Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de Borojó (Borojoa patinoi). ............................................................................ 39 7.1.4 Caracterización bioquímica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir del fermento de Borojó (Borojoa patinoi).................................................................. 42 7.2 Clasificación de aislados en agrupaciones de posibles Saccharomyces sp para Borojó (Borojoa patinoi) y Lulo (Solanum topiro). .................................................................. 44 7.3 Resultados de producción de etanol. ....................................................................... 45 8 DISCUSIÓN ................................................................................................................ 48 9 CONCLUSIONES....................................................................................................... 50 10 REFERENCIAS ........................................................................................................ 51 RECOMENDACIONES ................................................................................................ 57 ANEXOS ........................................................................................................................ 58

ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Características fisicoquímicas del lulo (Solanum topiro) .................................... 22 Tabla 2. Características microbiológicas de la pulpa de lulo (Solanum topiro) en condiciones deseables para la elaboración de néctares ......................................................................... 22 Tabla 3. Propiedades fisicoquímicas de la pulpa de borojó (Borojoa patinoi) .................. 22 Tabla 4. Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de la fermentación de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ................................................................. 36 Tabla 5. Caracterización de perfiles bioquímicos de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de lulo (Solanum topiro) suelo proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ........................................................... 37 Tabla 6. Halotolerancia de los aislamientos obtenidos a partir fermento de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ................................................................................................................... 38 Tabla 7. Tolerancia a etanol de los aislamientos obtenidos a partir fermento de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura. .................................................................................................................. 39 Tabla 8. Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de la fermentación de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ........................................................... 41 Tabla 9. Caracterización de perfiles bioquímicos de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de borojó (Borojoa patinoi) suelo proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura. ................................................. 42 Tabla 10. Halotolerancia de los aislamientos obtenidos a partir fermento de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ................................................................................................................... 43 Tabla 11. Tolerancia a etanol de los aislamientos obtenidos a partir fermento de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura .............................................................................................................. 43 Tabla 12. Cantidad de posibles Saccharomyces Cerevisiae por fruta según perfil bioquímico ........................................................................................................................................ 44

Tabla 13. Porcentajes de etanol producido, contenido de glucosa y fructosa en gramos por litro, consumo de glucosa en gramos por litro y volumen de etanol producido .................. 45 Tabla 14. Evaluación de las poblaciones iniciales y finales de los aislados en el mosto de melaza ............................................................................................................................. 46 Tabla 15. Solidos disueltos (°Brix) y potencial hidrogeno (pH), inicial y final de cada mosto de melaza inoculado con los aislados ............................................................................... 47

ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Número de aislados obtenidos por sustrato (epicarpio, fruto completo y mesocarpio) a partir de Lulo (Solanum topiro) y Borojó (Borojoa patinoi). ...................... 31 Figura 2. Número de aislamientos levaduriformes obtenidos por día de fermentación a partir de Lulo (Solanum topiro) y Borojó (Borojoa patinoi)....................................................... 32 Figura 3. Morfotipos obtenidos a partir de los aislamientos en la fermentación de lulo (Solanum topiro) provenientes de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito de Buenaventura ................................................................................................................... 35 Figura 4. Morfotipos obtenidos a partir de los aislamientos en la fermentación de borojó (Borojoa patinoi) provenientes de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ................................................................................................ 41 Figura 5. Hongos filamentosos que dificultaron el aislamiento levaduriforme en borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro). ....................................................................... 61

ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Medios de cultivos usados en el laboratorio ...................................................... 58 Anexo 2. Hongos filamentosos que dificultaron el aislamiento levaduriforme de las frutas borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro).............................................................. 60 Anexo 3. Cromatogramas de las muestras de melaza fermentada con aislados de Borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro), control positivo y blanco mediante la técnica HPLC............................................................................................................................... 61

RESUMEN Procesos de transformación en muchas industrias de diferentes sectores deben sus productos a la labor que desempeñan los microoganismos. Las levaduras son uno organismos con más injerencia en este aspecto, por ejemplo, son las responsables de la fermentación en panificación, cervecería, producción de alcohol, entre otros; además cumplen una función importante en los procesos de aprovechamiento de subproductos agroindustriales. Es de resaltar que el aislamiento y la caracterización de nuevas especies de levaduras es de vital importancia para la innovación y la mejoría de procesos productivos y biotecnológicos. Por tal motivo se planteó este estudio donde se aislaron y caracterizaron especies levaduriformes asociadas a dos frutos endémicos; borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro), del pacifico colombiano en el Distrito de Buenaventura, Valle del Cauca; y se evaluó la capacidad de producción de etanol en la melaza, un residuos agroindustrial del sector azucarero. Se conoce que las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisae son las principales responsables de la fermentación de sustratos ricos en azúcares para la producción de etanol (Vázquez & Dacosta, 2007), por tal motivo se hicieron pruebas bioquímicas en los aislados para identificar su género y probar en fermentación a los que arrojaron el perfil bioquímico propio de esta especie (Kurtzman, Fell & Boekhout, 2011). Los microorganismos que se aislaron y caracterizaron se obtuvieron del epicarpio, la fruta completa y el mesocarpio del lulo (Solanum topiro) y el borojó (Borojoa patinoi) en diferentes días de fermentación de sus mostos. En total se obtuvieron 50 aislados, de los cuales el los cuales el 66% de los aislados corresponden al lulo (Solanum topiro) y el 34% restante al borojó (Borojoa patinoi). Según los perfiles bioquímicos encontrados en los aislados, el 6% correspondió a levaduras del género Saccharomyces. En cuanto a la producción de etanol se tiene que la mayor producción de etanol la registró un aislado proveniente del lulo (Solanum topiro) con un producción de 0,940% (V/V), que frente a la cepa control de Saccharomyces cerevisae comercial representa un porcentaje del 34,89% de su producción etanólica.

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INTRODUCCIÓN Las levaduras son microorganismos de alto interés agroindustrial, biotecnológico y científico, tienen funciones de importancia en diversos procesos de transformación en la industria alimentaria y no alimentaria. Entre los sectores donde son empleadas se encuentra el de panificación, cervecería, vinícola, etanolero y farmacéutico. La actividad fermentativa es el mayor atractivo de estos microorganismos, en este proceso metabólico se libera energía a partir de un azúcar u otra molécula orgánica (Tortora, Funke & Case, 2007) y se obtienen metabolitos de interés. Existen varios tipo de fermentación y su diferencia radica en el producto a obtener y el sustrato que se somete al proceso. Hay fermentación alcohólica que tiene como finalidad la producción de etanol, y la fermentación láctica que tiene como finalidad la producción de ácido láctico. Productos como colorantes, pan, jamón curado, embutidos, vinagre, salsa de soya, sake, vino, cerveza, café, col ácida, pickles, queso, el yogurt, kéfir y la nata acida son algunos de los que resultan de procesos fermentativos. Es importante resaltar que muchos de los procesos donde se involucran las levaduras representan una solución para actividades que generan subproductos, un ejemplo claro de ello, son los compostajes donde se aprovechan los materiales que no son el principal eje de la producción transformándolos en productos que pueden ser comercializados o implementados en la propia actividad. La naturaleza es muy amplia y entrega la posibilidad de mejorar todos estos procesos y generar nuevos productos a partir de la acción de microrganismos. Es por esta razón que nuevas especies presentes en sustratos de diferentes características es de suprema importancia; conocerlos es indispensable y para ello se deben aislar y caracterizar levaduras asociadas a suelos, frutas, ríos, lagos y hasta en el mar. En Colombia, el estudio de levaduras presentes en frutas endémicas es muy escaso, teniendo en cuenta esto y su importancia en diferentes sectores se convierte en una buena apuesta investigativa. Por lo anterior, el presente estudio es un aporte investigativo en ese sentido, puesto que se aislaron y caracterizaron levaduras asociadas a frutos endémicos del pacífico colombiano; borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro), y se evaluó su capacidad en la producción de etanol a partir de melaza de caña, un subproducto de la industria azucarera.

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1 ANTECEDENTES El aislamiento de levaduras data casi desde el momento en que Charles Cagniard de la Tour descubriera en el año 1836 la existencia de las levaduras y además formulara la hipótesis de que su principal labor radicaba en la transformación de azúcares en alcohol y ácido carbónico (Dubos, 1960), y que Louis Pasteur, en 1857 lograra demostrar que las fermentaciones tienen un vínculo directo con el desarrollo de microorganismos, convenciendo al mundo científico de que son procesos bioquímicos celulares que se generan naturalmente o a nivel de laboratorio. Posterior a esto, investigadores concentran sus esfuerzos en la búsqueda de levaduras (y su utilidad) presentes en diferentes tipos sustrato; tractos digestivos de animales, granos, frutas, suelos, ríos, lagos y hasta en el mar. En Suecia, se han aislado y caracterizado levaduras presentes en el intestino de peces como salmón (Salmo gairdneri) y rodaballo (Scophtalmus maximus) (Andlid., et al, 1998) obteniéndose especies levaduriformes como Debaryomyces hansenii, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra, y R. glutinis, en Chipre han aislado y caracterizado levaduras epifitas asociados a las variedades de uva (Vitis vinifera sp vinífera) “Cabernet Sauvignon” y “Maratheftiko” (Pantelides., et al, 2015), obteniendo aislados de A. pullulans (67,3% de la población total identificado, 37 aislamientos), Cryptococcus magnus (16,4%, 9 aislamientos), Hanseniaspora uvarum (5,5%, 3 aislamientos) , Candida zeylanoides (3,6%, 2 aislamientos) , Candida sake (3,6%, 2 aislamientos) , Rhodotorula mucilaginosa (1,8%, 1 aislado) y Pseudozyma aphidis (1,8%, 1 aislado), también lo han hecho en Brazil, aislando y caracterizando levaduras de granos de café indígenas durante su etapa de fermentación húmeda (De Melo., et al, 2014), el resultado obtenido fueron las especies P. fermentans (28 aislados), P. kluyveri (16 aislados), C. grabata (12 aislados), C. quercitrusa (8 aislados), Saccharomyces sp. (7 aislados), P. guilliermondii (7 aislados), P. caribbica (4 aislados) y H. opuntiae (4 aislados), en México se encuentra la Colección de Levaduras Marinas del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR), conformada por 64 aislamientos pertenecientes a seis géneros (Aspergillus, Candida, Debaryomyces, Exophiala, Rhodotorula y Yarrowia) (Ochoa & Vázquez-Juárez, 2004). También cobran importancia los estudios donde se han aislado y caracterizado levaduras presentes en sustratos como la leche y la salmuera del queso. En Dinamarca, por ejemplo, se han obtenido aislados en leche cruda y

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salmuera del queso (Van den Tempel & Jakobsen, 1998), en el primer sustrato se identificaron 37 aislamientos, entre las levaduras predominantes se encuentran incluidas Candida famata, Candida catenulata, Candida lipolytica, Candida krusei y Trichosporon cutaneum, y en el segundo sustrato se identificó un total de 29 aislamientos, de los cuales las levaduras que mostraron mayor predominancia fueron C. famata y Candida globosa. En Colombia, pese a la gran variedad de sustratos donde podrían habitar especies de levaduras adaptadas a las condiciones propias del territorio y del mismo material, el aislamiento y caracterización de estos microorganismos es incipiente; más aún en regiones del país con vocación azucarera y etanolera como es en los departamentos del Valle del Cauca, Cauca y Risaralda (FNB, 2015). Es por esta razón que se destacan estudios como los de Solarte (2012) y Osorio., et al (2008), los cuales evalúan la diversidad de levaduras asociadas a la naranja (Citrus sinensis) y guayaba (Psidium guajava), y del “champús” (bebida fermentada) respectivamente; reportando las especies Saccharomyces cerevisiae (33 aislados), Lodderomyces elongisporus (3 aislados), Metschnikowia koreensis (2 aislados), Hanseniaspora opuntiae (2 aislados), Hanseniaspora uvarum (1 aislados), Pichia guilliermondii (1 aislados), Kodamaea ohmeri (2 aislados) y Wickerhamomyces anomalus (5 aislados) en el primer sustrato, Pichia kluyveri (11 aislados), Cryptococcus diffuens (1 aislados), Meyerozyma guilliermondii (2 aislados), Hanseniaspora guilliermondii (3 aislados), Hanseniaspora uvarum (4 aislados), Hanseniaspora opuntiae (7 aislados), Debaromyces nepalensis (1 aislado) y Pichia membranifaciens (11 aislados) en el segundo y especies de S. cerevisae, Issatchen kia orientalis, P. fermentans, Zygo saccharomyces fermentati, Torulospora del bruekii, Pkluyverivar. Kluyveri, y Galactomyces geotrichum en el tercer sustrato. Existen estudios sobre levaduras que evalúan la cinética de crecimiento celular, la asimilación de azucares y capacidad fermentativa de diferentes sustratos en la producción de etanol. Entre los estudios se encuentran el de Garzón & Hernández (2009), donde se comparó la producción de etanol en diferentes concentraciones de melaza (180, 200 y 250 g/L), entre Saccharomyces cerevisae silvestre, Saccharomyces cerevisae ATCC 9763 y Candida utilis ATCC 9950, adicional a esto se evaluó la cepa Saccharomyces cerevisae ATCC 9080. Los resultados de esta investigación arrojaron que las cepas Saccharomyces cerevisae ATCC

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9763, ATCC 9080 y Candida utilis ATCC 9950 presentaron un porcentaje de alcohol del 8% (V/V), mientras que la Saccharomyces cerevisae silvestre mostró un porcentaje del 6,5% (V/V) a la concentración de 250g/L. Otro estudio que se destaca es el de Fajardo & Sarmiento (2007), donde evalúan la melaza de caña como sustrato para la producción de Saccharomyces cerevisae. En esa investigación se realizaron cultivos de dos cepas levaduriformes, una de Saccharomyces cerevisae nativa y la otra de Saccharomyces cerevisae reconocida como prebiótico en el comercio, utilizando diferentes concentraciones de melaza de caña (10%, 20% y 30% (P/V)), con el fin de determinar la concentración adecuada para obtener la mayor concentración de biomasa. Los resultados obtenidos mostraron que los valores más altos de crecimiento se encontraron en la cepa de Saccharomyce cerevisae nativa a una concentración de 20% (P/V) de melaza de caña con una productividad de 2,769 gL-1h-1, mientras que en la otra cepa se evidenció una productividad de 0,233 gL-1/h-1. Además se evidenció que Saccharomyces posee la enzima invertasa la cual hidroliza la sacarosa y es asimilada con mayor facilidad, y que el medio de melaza de caña al 20% (P/V) es un medio medianamente productivo y altamente selectivo para Staphylococcus aureus.

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2 JUSTIFICACIÓN Las levaduras se encuentran en la mayoría de las frutas y de las flores y en los exudados de las plantas. Estas levaduras fermentan los azúcares, produciendo CO 2 y etanol. (Ingraham J. & Ingraham C., 1998) y se consideran los principales microorganismos empleados en la fermentación en el proceso de obtención del bioetanol. El Valle del Cauca cuenta con un área de 176.244 Ha sembradas en caña de azúcar (Procaña, 2013). Esta es la principal materia prima para la producción de bioetanol en el departamento y teniendo como base las cifras de Asocaña (2013), se tiene que durante el año 2014 la producción de bioetanol en el Valle del Cauca fue de 369 millones de litros. Esto muestra la gran importancia que tiene esta actividad agroindustrial para el sector socioeconómico del departamento y con el fin de generar aportes de investigación que correspondan a la mejoría de los procesos propios de la producción de bioetanol, en especial los fermentativos, se trabajó en este proyecto de investigación, el cual busca la obtención de nuevas cepas levaduriformes nativas del género Saccharomyces sp que puedan ser empleadas en esta agroindustria y al mismo tiempo que permitan reemplazar las cepa Saccharomyces cerevisae proveniente de la india que hoy se utilizan a un alto costo y no adaptadas al medio ambiente nuestro. Desde el punto de vista biotecnológico las levaduras son los microorganismos de mayor impacto para el sector agroindustrial debido a la gran cantidad de procesos donde intervienen. Estos involucran desde una fermentación clásica hasta la injerencia en los procesos de respiración en frutas. (Esteve-Zarzoso., et al, 2001) En Colombia, y específicamente en el Valle del Cauca, el empleo de este tipo de microorganismos se puede utilizar en la producción a escala industrial de combustibles (biotenol), azúcar, metabolitos secundarios, vacunas, entre otros. Sin embargo, existe un desconocimiento general acerca de la biodiversidad de las levaduras existentes en nuestro país, siendo solo dos grupos de investigación adscritos a Colciencias, uno de la Universidad del Valle y el otro el grupo de Biotecnología de la Universidad de San Buenaventura-Cali, los que reportan trabajos sobre aislamiento y caracterización de levaduras nativas para la obtención de bioetanol. Debido al limitado número de investigaciones que contemple la función de almacenar, registrar, y evaluar las distintas cepas nativas y comerciales utilizadas 16

en nuestro país, se hace necesario entonces estudios que permitan el conocimiento de la biodiversidad nativa levaduriforme y la posible aplicación comercial como en este caso su uso en la obtención de un biocombustible (Etanol). Esta importancia se observa en especial en el área de los biocombustibles, donde uno de los más importante es el alcohol carburante (etanol), el cual puede ser utilizado como oxigenante de la gasolina, elevando su contenido en O2, lo que permite una mayor combustión de la misma disminuyendo las emisiones contaminantes de hidrocarburos no oxidados completamente. El etanol se obtiene a partir de la caña de azúcar en países tropicales como Brasil e India. En algunos países europeos como Francia se utilizan melazas de remolacha azucarera. La materia prima principal para la obtención de etanol en los EEUU es el almidón (Madson., et al, 1995) Se considera que la denominada biomasa lignocelulósica, que incluye residuos agrícolas, forestales y sólidos urbanos, así como residuos agroindustriales, de la industria de alimentos y de otras industrias, comprende aproximadamente el 50% de la biomasa en el mundo (Guillamón., et al, 1996).

Esta biomasa es un recurso que puede ser procesado de diferentes formas para la obtención de una gran variedad de productos además del etanol como gas de síntesis, metanol, hidrógeno y electricidad. En la región del Valle del Cauca, donde existen 4 plantas productoras de bioetanol, las cuales emplean cepas no nativas (extranjeras), durante el proceso de fermentación (FNB, 2015); con este panorama es preponderante evaluar la existencia de levaduras nativas con potencial en la producción de bioetanol, y establecer si pueden ser alternativas a emplear en nuestra industria. En esta investigación se planteó identificar las levaduras asociadas al borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro) e identificar su potencial en la producción de etanol.

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3 MARCO TEÓRICO

3.1 Conceptos generales de las levaduras Las levaduras son organismos vivos ampliamente distribuidos en la naturaleza, definidos por García (2005) como hongos en los que la forma unicelular es evidente, comúnmente son clasificadas en dos grupos filéticos que son: levaduras ascomicetosas, anamórficas y teleomórficas y levaduras basidiomicetosas y anamórficas (Esteve-Zarzozo., et al, 1999). Estos microorganismos cumplen un papel primordial en la historia de la humanidad luego de que fuera descubierta su potencialidad en los procesos de transformación y por consecuencia se diversificaran las posibilidades en la culinaria y más adelante en la agroindustria (Audesirk., et al, 2008). 3.2 Fermentación El principal argumento por el cual se reconoce lo fundamental de la tarea de las levaduras en la transformación de alimentos, es el papel que cumplen en la fermentación, proceso metabólico que para ser reconocido como tal, según Tortora, Funke & Case (2007) en este se debe liberar energía a partir de un azúcar u otra molécula orgánica, no es necesaria la presencia de oxígeno ni de una cadena transportadora de electrones pero si de una molécula orgánica que actúe como aceptor final de los mismos. En el proceso de fermentación hay dos actores importantes que es necesario nombrar para entender la dinámica metabólica en la que las levaduras intervienen. Uno es el piruvato: compuesto de suma importancia en el metabolismo, que es el resultado de un conjunto de reacciones bioquímicas conocido como glucolisis a través de las cuales la glucosa se metaboliza para producir energía (Cody., et al, 2000; Hernández, 1999), y el otro es la nicotinamida adenina dinucleótido: conocida como NAD+ en su forma oxidada y como NADH en su forma reducida; estas son biomoléculas que se encuentran en organismos eucariotas y procariotas, son conocidas como coenzimas y trabajan en muchas reacciones redox transfiriendo los átomos de hidrógeno y los electrones de un metabolito a otro (Xie, 2008). Existen varias clases de fermentación y están relacionadas directamente con el tipo de microorganismo, tipo de sustrato y tipo de enzimas que se encuentran presentes y en estado 18

de activación (Tortora., et al, 2007). Cada una puede lograr un producto diferente según se conjuguen los elementos anteriores. Claros ejemplos de ello son la fermentación láctica, en donde el piruvato se reduce directamente por acción del NADH para formar lactato como producto final y la fermentación alcohólica, donde es liberado CO2 del piruvato y se produce un compuesto de dos carbonos acetaldehído que luego es reducido por el NADH para convertirse finalmente en etanol (Campbell & Reese, 2007). 3.2.1 Fermentación alcohólica La fermentación alcohólica es una bioreacción que permite degradar azúcares en alcohol y dióxido de carbono. Las principales responsables de esta transformación son las levaduras. La Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con más frecuencia. La conversión se representa mediante la ecuación (Vásquez y Dacosta, 2007): C6H12O6 → 2C5H2OH + 2CO2 Según Prescott y Cecil (1992), para que una fermentación sea considerada como buena, es fundamental hacer un tratamiento preliminar que incluye condiciones como concentración de carbohidratos, pH y temperaturas optimas; la adición de sustancias nutritivas al mosto, evitar contaminación por otros microorganismos. También es importante utilizar microorganismos que toleren altas concentraciones de etanol, mantener la reacción en condiciones anaerobias y una vez se produzca el producto proceder de manera inmediata a un proceso de destilación. 3.3 Melaza La Norma Técnica Colombiana NTC 587 “Industrias alimentarias e industrias de bebidas. Melaza de caña” de 1994, define como miel final o melaza (no cristalizable) al jarabe o líquido denso y viscoso, separado de la misma masa cocida final y de la cual no es posible cristalizar más azúcar por métodos usuales (ICONTEC, 1994). La composición de la melaza es muy heterogénea y puede variar considerablemente dependiendo de la variedad de la caña de azúcar, suelo, clima, periodo de cultivo, de la operación de la fábrica, sistema de ebullición del azúcar, tipo y capacidad de los evaporadores, entre otros. Por otro lado la melaza de caña se caracteriza por tener grados Brix o sólidos disueltos entre 68 y 75 % un pH de 5.0 a 6.1 (Fajardo y Sarmiento, 2008). 19

3.4 Levaduras nativas en Colombia En Colombia son pocos los estudios enfocados a la diversidad de levaduras presente en diferentes sustratos. (Mambuscay., et al, 2013). Sin embargo, de bebidas fermentadas se han aislado y caracterizado especies como Saccharomyces cerevisiae, Issatchen kia orientalis, P. fermentans, Zygo saccharomyces fermentati, Torulospora del bruekii, P. kluyverivar. kluyveri, y Galactomyces geotrichum. (Osorio., et al, 2008). También se ha hecho de frutas como guayaba, naranja, uva, piña y mora, puesto que muchas de estas frutas se fermentan a partir de microorganismos (Bacterias y Levaduras) que son desconocidas tanto a nivel científico como a nivel industrial. Este desconocimiento no permite potenciar el uso de levaduras nativas adaptadas a nuestro ecosistema y que posiblemente pueden tener un mejor desempeño a nivel industrial, agrícola o farmacéutico de las conocidas y utilizadas habitualmente. (Chang., et al, 2001; Chen., et al., 2000; Cuervo, 2014). De frutas como las anteriores se han encontrado especies de Lodderomyces elongisporus, Kodamaea ohmeri, Metschnikowia koreensis, Hanseniospora opuntiae, Lodderomyces elongisporus,

Kodamaea ohmeri,

Pichia guilliermondii,

Hanseniospora ovarum,

Wicherhamomyces anomalus, Saccharomyces cerevisiae, Wickerhamomyces anomalus, Hanseniaspora uvarum, Wickerhamomyces pijperi, Candida sp., Pichia kluyveri, Hansenia sporauvarum, Candida boidinii, Candida oleophila, Meyerozyma caribbica, Candida pseudointermedia,

Pichia

sp.,

Hanseniaspora

pseudo

guilliermondii,

Pichia

membranifaciens, Candida azyma y Issatchenkiaterricola. (Solarte, 2012; Mambuscay., et al, 2013) 3.5 Levaduras endófitas Las levaduras endófitas son microorganismos que viven en el interior de plantas y frutos. Estos microorganismos endófitos pueden infectar espacios intracelulares, intercelulares o tejidos vasculares. (Schulz & Boyle, 2005) Diferentes estudios como el de Wilson (1995) presenta a los organismos endófitos como hongos, levaduras o bacterias que durante parte o todo su ciclo de vida invaden tejidos vegetales vivos y causan infecciones asintomáticas completamente dentro del tejido vegetal.

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3.6 Frutas endémicas del Pacifico Colombiano Según indica Szumik (2002), el concepto de endémico alude al hecho de habitar en un único lugar, sin importar cuán grande o chico sea éste; es un concepto relativo y que depende de la escala de análisis porque implica que los taxones endémicos poseen áreas de distribución geográfica restringida comparados con el tamaño del área de estudio. El pacifico colombiano es considerado una de las regiones con mayor biodiersidad del territorio nacional encontrándose algunas frutas endémicas como: Borojó (Borojoa patinoi), chontaduro (Bactris gasipaes), gulupa (Passiflora pinnatistipula), curuba (Passiflora tripartita), granadilla (Passiflora ligularis), guanábana (Annona muricata), papaya (Carica papaya), lulo (Solanum topiro), arazá (Eugenia stipitata), chirimoya (Annona cherimola), marañón (Anacardium occidentale), cocona (Solanum sessiliflorum), nance (Byrsonima crassifolia), acerola (Malpighia emarginata), balu (Erythrina edulis), entre otros. (Kalmar, 2013) 3.6.1 Lulo (Solanum topiro) El lulo del pacifico (solanum topiro) es nativo de Colombia y Perú. La altura óptima de crecimiento de la planta se encuentra entre los 200 y 800 msnm. Es una especie crece hasta casi dos metros de alto; el tronco es muy ramificado y sus ramas principales están cubiertas de pubescencia pulverulenta, dura y grisácea (León, 1968). La planta tiene la capacidad de autofecundarse, tiene inflorescencias en forma de cima y sus frutos son de forma variada de acuerdo con el genotipo (Pahlen, 1977). Como lo indica León (1968), la forma del fruto oscila desde casi esférico a ovoide y hasta oblado, y su tamaño varía entre cuatro a 6 cm de ancho y 4 a 5 cm de largo. Cuando el fruto está en su estado de madurez su color es amarillo marrón, opaco y está cubierto de pubescencia blanca, es decir, vello o pelusilla en la superficie de la corteza, es fina y suelta. La cáscara suave rodea la pulpa o mesocarpo, grueso, amarillo y acuoso. Las cuatro celdas están llenas de semillas, envueltas en mucilago claro.

21

Tabla 1. Características fisicoquímicas del lulo (Solanum topiro)

Acidez titulable pH °Brix/Acidez (% a. cítrico) Lulo 6 1,68 3,39 3,57 Adaptado de: Laboratorio de control de calidad Icfes-UN e Instituto SINCHI-Uniamazonia, Florencia, 1999-2002 Fruto °Brix

Tabla 2. Características microbiológicas de la pulpa de lulo (Solanum topiro) en condiciones deseables para la elaboración de néctares NMP Coliformes Totales Refrigerada < de 3 Congelada < de 3 Pulpa

RTO Mesófilos UFC/ml 45 X 10^3 28 X 10^3

RTO Hongos y Levaduras 100 40

Adaptado de: Laboratorio de control de calidad Icfes-UN e Instituto SINCHI-Uniamazonia, Florencia, 1999-2002 3.6.2 Borojó (Borojoa patinoi) El borojó es una fruta exótica originaria de la selva del pacifico Colombiano. El Borojó se encuentra de forma silvestre y cultivada comercialmente. Entre 1948 y 1995. Su nombre proviene de boro igual a cabeza y jo igual a fruto, o simplemente borojó igual a redondo. (Kalmar, 2013) La pulpa de borojó contiene cantidades muy bajas de proteína (0,70%), grasa (0,15%) y cenizas (0,8%), expresadas en relación peso a peso. (Sotelo, Casas & Camelo, 2010) Tabla 3. Propiedades fisicoquímicas de la pulpa de borojó (Borojoa patinoi) Humedad (g/100g base húmeda)

61,506 ± 1,864

Aw pH

0,902 ± 0,009 3,123 ± 0,008

Proteína (g/100g base húmeda)

0,702 ± 0,046

Grasa (g/100g base húmeda)

0,153 ± 0,112

Cenizas (g/100g base húmeda)

0,801 ± 0,022

Adaptado de: (Sotelo, Casas & Camelo, 2010)

22

3.7 Etanol En el mundo existe una creciente demanda de energía. Es por esto que alrededor de los 5 continentes se ha visto la necesidad de buscar alternativas que permitan disminuir el impacto ambiental negativo y garanticen ser eficaces para el desarrollo de diferentes actividades. Por lo anterior, surgen nuevas tecnologías como los biocombustibles. La FAO en su documento UWET Terminología unificada sobre dendroenergía, publicado en septiembre de 2006, los define como combustibles orgánicos primarios y/o secundarios derivados de la biomasa que pueden utilizarse para generar energía térmica por combustión o mediante otra tecnología. Entre los biocombustibles más utilizados a nivel mundial están el biodiesel y el bioetanol que deben su importancia en el escenario energético al sustancial uso como mezcla con otros combustibles fósiles, por ejemplo el etanol mezclado con gasolina ha sido empleado en automóviles prácticamente desde su aparición (Balat, 2005). En Latinoamérica existen 17 países que han adoptado políticas de biocombustibles, la mayoría en etanol y biodiesel (Dufey, 2010). El bioetanol, corresponde a un destilado líquido producido de la fermentación de los azúcares de plantas ricas en azúcar y de cereales (caña de azúcar, maíz, remolacha, yuca, trigo, sorgo) (Dufey, 2006). La fórmula molecular del etanol es C2H6O. Este contiene un grupo hidroxilo en su estructura y es considerado un isómero estructural del metoxi-metano. Ambos tienen la misma fórmula molecular pero diferente fórmula estructural. (N. F., 1973) Según el Secretariado de la OCDE y de la FAO (2013), el uso de materias primas agrícolas en la producción de biocombustibles sigue siendo un componente importante en la demanda a largo plazo de los productores agrícolas que mantiene los precios en niveles históricamente altos. En 2022, se prevé que la producción mundial de etanol aumente casi 70% respecto a la media de 2010-2012, creciendo 4% anual hasta llegar a unos 168 Mml. Los países que hicieron importantes avances en el campo de bioetanol (por ejemplo Brasil) tienen márgenes correspondientes para seguir creciendo porque tienen vastas zonas baldías

23

y disfrutan de condiciones climáticas favorables a los cultivos energéticos (Raboni, Viotti & Capodaglio, 2015). En Colombia, la producción de etanol aumentó en algo más del 15% en el periodo de septiembre de 2014 al mismo mes en el año 2015, pasando de una producción de 36’272.000 a 41’855.000 litros/mes. (FNB, 2015). Esta producción de etanol proviene principalmente de la caña de azúcar y el departamento con mayor participación en esta actividad es el Valle del Cauca. Este departamento cuenta con un área de 176.244 Has sembradas en caña de azúcar (Procaña, 2013), de las cuales 100.153 Has están destinadas a la producción del biocombustible y son sometidas a molienda cerca de 28.000 toneladas de caña de azúcar por día para su transformación en bioetanol. Durante el año 2014 la producción de bioetanol en el Valle del Cauca fue de 369 millones de litros (Asocaña, 2015).

24

4 HIPÓTESIS El Distrito de Buenaventura cuenta con una extensión de casi 6.800 km2 (Pérez, 2007), de los cuales un importante porcentaje corresponde a selvas vírgenes (Lara & Cárdenas, 2015) y tiene salida hacia el mar pacifico. Cuenta con una abundante fauna y flora, lo que convierte a buenaventura en un territorio de diversos ecosistemas (CRC, 1983). Al tener en cuenta esto y que en la mayoría de las frutas, flores y exudados de plantas se encuentran levaduras (Ingraham J. e Ingraham C., 1998), se pensó que: 1. Existía la posibilidad de encontrar estos microorganismos en dos frutos endémicos de buenaventura que son el Lulo (Solanum topiro) y el Borojó (Borojoa patinoi) 2. Las levaduras aisladas tuviesen algún potencial biotecnológico, gracias a su adaptabilidad a las condiciones propias de la región pacífica. 3. Tengan importantes aplicaciones a nivel industrial o científico, en especial para la producción de bioetanol.

25

5 OBJETIVOS Partiendo de las hipótesis anteriormente descritas se plantearon los siguientes objetivos: 5.1 Objetivo general Aislar y caracterizar morfológica y bioquímicamente la microflora levaduriforme asociada a los frutos de borojó (Borojoa patinoi), y lulo (Solanum topiro) y evaluar el potencial de Saccharomyces sp encontradas en la producción de bioetanol. 5.2 Objetivos específicos 1. Aislar y caracterizar morfológica y bioquímicamente las levaduras asociadas a asociada al de los frutos de borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro). 2. Identificar el género de Saccahrommyces sp aisladas de los frutos de borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro). 3. Evaluar el rendimiento en producción de etanol y la adaptación a la melaza de las cepas de Saccharomyces sp aisladas e indentificadas a partir de los frutos de borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro).

26

6 METODOLOGÍA 6.1 Recolección de las muestras Los frutos de Borojó (Borojoa patinoi) y Lulo (Solanum topiro) se colectaron en la costa pacífica colombiana, exclusivamente de la zona vallecaucana, en el Distrito Especial de Buenaventura en las localidades de Rio Dagua (corregimiento 6) para Lulo y Bajo Calima (corregimiento 1) para Borojó, ubicados a los (3°52'58.8682"N - 77°1'10.9956"W) y (4°00'05.0"N - 76°58'33.4"W) respectivamente. Las muestras de frutos (3 por cada uno) fueron empacadas individualmente en bolsas estériles y luego dentro de una nevera de icopor sellada a temperatura ambiente. Estas fueron trasportadas hasta el laboratorio de investigaciones de la Universidad de San Buenaventura en la ciudad de Santiago de Cali, Valle del Cauca, donde fueron almacenadas a 10°C para su posterior utilización. 6.2 Aislamiento de levaduras Se emplearon tres niveles para el aislamiento de levaduras: la litósfera, el interior de los frutos y los frutos completos de Borojó (Borojoa patinoi) y Lulo (Solanum topiro). En el primer caso se emplearon 450 ml de agua estéril para hacer un lavado superficial y se almacenaron muestras de 1 ml por triplicado en tubos eppendorf del líquido resultante para crecimiento microbiano posterior. Para el fruto completo se tomaron 50 g, se midió la concentración de solidos solubles (°Brix) con refractómetro y posteriormente, se sometieron a licuefacción con el restante del agua de lavado anterior. De igual manera se hizo con el interior de los frutos, con la diferencia que a estos se les retiró la cáscara y se utilizaron 450 ml de agua estéril para licuefacción (Kurtzman, 2006; Daniel, 2003). Posteriormente se midió la concentración de solidos disueltos de cada mosto y se ajustaron a 10°Brix con dextrosa, luego tomaron 0,1 ml de cada uno de los mostos para ser extendidas en cajas Petri con medio YPDA (Sigma aldrich), al cual le fue adicionado 0,5 g/l de cloranfenicol (Calbiochem) y se incubaron a 28ºC en incubadora Memmert durante 48h. Cada muestra fue sembrada por triplicado y se realizaron resiembras para cada una de las colonias asiladas hasta lograr cultivos axénicos (Kurtzman, 1998).

27

6.3 Caracterización de las levaduras La caracterización de las especies levaduriformes se realizó evaluando su fenotipo (morfología, bioquímica y fisiología), esta se hizo empleando los criterios descritos por Kurtzman et al. (1998), los cuales incluyen caracterización morfológica, descripción del tipo de reproducción, crecimiento y tolerancia en diferentes sustratos, y capacidad de fermentación. 6.3.1 Caracterización morfológica de la colonia Las características morfológicas de la colonia evaluadas fueron: color, elevación, borde, apariencia y forma, estas evaluaron empleando un en estereoscopio a 40X (Fell et al., 2000; Kurtzman, 1998). 6.3.1.2 Caracterización microscópica de levaduras Para la caracterización microscópica se introdujeron las levaduras en azul de lactofenol para tinción, fueron observadas en microscopio a 100X y se procedió a registrar las características de la célula (forma que puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, cilíndrica, triangular e incluso alargada), presencia de filamentos, tipo de reproducción (González de Buitrago, 2004) 6.3.2 Caracterización bioquímica A cada cepa de levadura obtenida se le realizaron pruebas bioquímicas fermentación de azúcares (maltosa, sacarosa, glucosa y lactosa) y crecimiento (maltosa, sacarosa, glucosa y lactosa), tolerancia NaCl (10% y 15%) y etanol (10% y 15%) de acuerdo a la metodología descrita por Boekhout et al. (2004). Las pruebas de crecimiento se realizaron en un medio que contenía 20g/L de Peptona, 10g/L de extracto de levadura, 20g/L de agar y 20g/L de cada azúcar a evaluar; se incubaron a 30°C durante 24 horas y observó el crecimiento. La capacidad de fermentación se realizó en tubos con 5 mL de medio que contenía 20g/L de Peptona, 10g/L de extracto de levadura, y 20g/L del azúcar a evaluar; a la solución se le adicionó 1.6mL de rojo de metilo a 100ppm, se determinó que la coloración roja fue positivo para fermentación, y la coloración amarilla negativa (Olivas & Alarcón, 2004).

28

La tolerancia a NaCl se realizó en medio YPDA, adicionado 10% y 15%, de NaCl (MARKa), sobre este medio se sembró por agotamiento la levadura crecida e incubó a 30°C por 24h, se consideró negativo la ausencia de colonias. La tolerancia a etanol se realizó en tubos con 5 ml medio líquido YPD, al cual se adicionó 10 y 15 % de etanol al 96%, a estos se les inoculó 200 μL de inoculo a 1x106 cel/mL, se incubó a 30 °C y 60 rpm, durante 24 h, finalizada se tomó 10uL y se realizó conteo en cámara de Neubauer, si la concentración fue menor al a la concentración inicial se consideró no tolerante. 6.4 Identificación del género La identificación de los géneros se realizó analizando los resultados de las pruebas de caracterización morfológica y bioquímica con las bases de datos: Mycobank (http://www.mycobank.org/),

CBS-KNAW

Fungal

Biodiversity

Centre

(http://www.cbs.knaw.nl/) y apoyándose en la bibliografía de Kurtzman (2011) con el libro The Yeast. A taxonomic study y Cuervo, et al, (2015) con el libro Hongos levaduriformes aislados de frutas y suelos de la región del Valle del Cauca, Colombia. También probaron en la producción de etanol los aislados que toleraron etanol mínimo al 10%. 6.5 Adaptación al sustrato La adaptación al sustrato se determinó mediante la identificación del crecimiento de los aislados en melaza. Además se determinó el crecimiento de la cepa control y se comparó con el crecimiento de los aislados. 6.6 Evaluación de producción de etanol Esta se realizó empleando las cepas que fueron tolerantes a concentraciones de 15% de etanol, estas fueron crecidas en 5mL de medio YPD, durante 24 h a 30° y 60rpm, finalizada la incubación se realizó conteo celular en cámara de Neubauer. Paralelamente se adecuó la melaza, la cual se esterilizó y ajustó a 14° brix, pH 4.5, y se le adicionó 4,8g/L de urea y 2,4g/L de fosfato bibásico. De esta se depositaron 30 mL en tubos falcon y se adicionó un inóculo a una concentración de 1x106 cel/mL, se incubó a 30°C y 60 rpm durante 48horas. Finalizada la fermentación se evaluó la producción de etanol por HPLC (Hitachi Elite Lachrome), para esto se tomó 1ml de solución (medio antes y después de fermentar) y se 29

centrifugó a 10000 rpm por 10 min, seguidamente se filtró por membrana de 0,22 μm y se almacenaron a -20°C. En la muestra se evaluó la concentración de: glucosa, maltosa, fructosa y etanol a partir de 20 μl de muestra, las cuantificaciones se realizaron en una columna Aminex Hi-Plex H (Agilent Technologies, USA) a 65°C con una fase móvil H 2SO4 5 mM y una tasa de flujo de 0,4 ml/min. Los picos fueron detectados por RI (índice de refracción). Se empleó la cepa control Saccharomyces cerevisae, adquirida en el mercado local.

30

7 RESULTADOS.

En este estudio se obtuvo 50 aislamientos levaduriformes; de los cuales 17 corresponden a Borojó (Borojoa patinoi) (34%) y 33 a Lulo (Solanum topiro) (66%). Ambos frutos recolectados en el Distrito de Buenaventura, Valle del Cauca. El aislamiento se hizo en tres niveles para cada fruta; en el epicarpio (parte externa del fruto), en el lulo no se obtuvo ningún aislamiento y en el borojó se obtuvieron 4 aislados (23%); del mesocarpio se obtuvo un total de 36 aislamientos de los cuales correspondieron 30 (90.1%) corresponden al lulo, y 6 (35.3%) al borojó; en la fruta completa (epicarpio + mesocarpio), se obtuvieron 10 aislamientos, los cuales correspondieron a 3 (9%) fueron del lulo y 7 (41.2%) borojó. (Figura 1) 35

Número de aislamientos levaduriformes

30 25 20 Lulo

15

Borojó 10 5 0 Epicarpio

Fruta completa Sustrato de Aislamiento

Mesocarpio

Figura 1. Número de aislados obtenidos por sustrato (epicarpio, fruto completo y mesocarpio) a partir de Lulo (Solanum topiro) y Borojó (Borojoa patinoi). Un 87,88% de los aislados levaduriformes (46) se obtuvieron a partir del mosto en el día 1, de los cuales 29 aislados corresponden al lulo y 17 corresponden al borojó. En los días 2 y 3 no se obtuvo ningún aislado proveniente del borojó y 2 (6,06%) aislados para cada día en el caso del lulo (Figura 2).

31

Número de aislamientos levaduriformes

35 30 25 20 Lulo

15

Borojó 10 5 0 1

2

3

Día de aislamiento

Figura 2. Número de aislamientos levaduriformes obtenidos por día de fermentación a partir de Lulo (Solanum topiro) y Borojó (Borojoa patinoi) 7.1 Caracterización morfológica y bioquímica La caracterización morfológica mostró en total 39 morfotipos, de los cuales el lulo presentó el mayor número con 25 (64,11%) y el menor número se presentó en los aislamientos provenientes del Borojó con 14 (35,89). Respecto a la caracterización bioquímica donde se evaluó la capacidad de crecer y fermentar medios con maltosa, lactosa, sacarosa y glucosa; al igual que la tolerancia a concentraciones de NaCl (10% y 15%) y Etanol (10%) en los aislamientos levaduriformes obtenidos, se observaron 30 perfiles bioquímicos, los cuales el 53,33% (16) se presentaron en Borojó y el 46,67% (14) en Lulo. 7.1.1 Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de Lulo (Solanum topiro). Del Lulo se obtuvieron 33 aislados, los cuales se agruparon por morfología de colonia y célula, en 25 grupos (Figura 3). Las colonias observadas presentaron forma circular, irregular, puntiforme o rizoide, observándose márgenes enteros, irregulares, onduladas o lobuladas, con elevaciones de forma plana, umbeliforme o convexa, y donde a nivel celular

32

se presentaron formas esféricas y alimonadas, con reproducción por gemación monopolar o por fisión. (Tabla 4). COLONIA 40X

CÉLULA 100X

COLONIA 40X

CÉLULA 100X

1A

1B

2A

2B

3A

3B

4A

4B

5A

5B

6A

6B

7A

7B

8A

8B

9A

9B

10A

10B

33

11A

11B

12A

12B

13A

13B

14A

14B

15A

15B

16A

16B

17A

17B

18A

18B

19A

19B

20A

20B

34

21A

21B

22A

22B

23A

23B

24A

24B

25A

25B

Figura 3. Morfotipos obtenidos a partir de los aislamientos en la fermentación de lulo (Solanum topiro) provenientes de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito de Buenaventura El agrupamiento mediante la morfología de la colonia y célula, permitió establecer 25 morfotipos (Tabla 4).

35

Tabla 4. Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de la fermentación de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ID Aislado LCED01,3 LCED02,2 LCED07,2 LCED03,3 LCED01,5 LCED05,2 LCED04,6 LCED04,5 LCED02,4

n

%

Nu. Foto Grupo Color

4

12,12

1

Blanco

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

2

6,06

2

Blanco

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

2

6,06

3

Blanco

Plano

Entero

Circulo

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

Elevación

Borde

Forma

Apariencia Forma célula Filamentos Reproducción

1

3,03

4

Blanco

Plano

Entero

Circulo

Brillante

Alimonada

N/O

N/O

LCD21,2 1 LCD21,1 2 LCED03,4 LCED04,4 1

3,03

5

Blanco

Plano

Lobulado Circulo

Brillante

Alimonada

N/O

Gemación

6,06

6

Blanco

Plano

Ondulado Irregular

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

3,03

7

Blanco

Plano

Ondulado Irregular

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED04,3 1 LCED01,4 LCED02,1 3 LCED04,1 LCED02,5 1

3,03

8

Blanco

Plano

Ondulado Circulo

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

9,09

9

Blanco

Plano

Ondulado Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

3,03

10

Blanco

Umbeliforme Entero

Rizoide

Brillante

Alimonada

N/O

Gemación

LCED06,2 1

3,03

11

Blanco

Umbeliforme Lobulado Rizoide

Brillante

Alimonada

N/O

Gemación

LCED02,3 1

3,03

12

Blanco

Umbeliforme Ondulado Circulo

Opaco

Esférica

N/O

N/O

LCED06,5 1

3,03

13

Blanco

Umbeliforme Ondulado Circulo

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED11,2 1

3,03

14

Café

Plano

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED06,1 1

3,03

15

Café y blanco Umbeliforme Entero

Rizoide

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED04,2 1

3,03

16

Crema

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

LCED01,1 1

3,03

17

Crema

Plano

Irregular

Irregular

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED02,6 1

3,03

18

Crema

Plano

Ondulado Puntiforme Brillante

Alargada

N/O

Gemación

LCED03,2 1

3,03

19

Gris oscuro

Plano

Entero

Esférica

N/O

Gemación

LCED02,7 1

3,03

20

Rosa

Plano

Ondulado Puntiforme Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED07,1 1

3,03

21

Rosa

Plano

Entero

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

LCD11,1

1

3,03

22

Rosa claro

Plano

Ondulado Irregular

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

LCED03,1 1

3,03

23

Rosa oscuro

Plano

Entero

Circulo

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED01,2 1

3,03

24

Salmón

Plano

Entero

Puntiforme Brillante

Esférica

N/O

Gemación

LCED05,1 1

3,03

25

Salmón

Plano

Entero

Circulo

Esférica

N/O

Gemación

Total

Ondulado Irregular

Circulo Circulo

Opaco

Opaco

33 100,00

ID aislado, corresponde al número del aislado, n al número de aislados con ese fenotipo, % al porcentaje de aislados con esa descripción, Nu. Foto grupo, al número de la foto en la figura 1 y grupo; color a la tonalidad de la colonia, borde a la forma del perímetro de la colonia, forma a fenotipo de la colonia, apariencia al brillo u opacidad de la colonia, elevación a silueta horizontal de la colonia, adicionalmente se describe la forma de la Célula y la reproducción. N/O significa “no observado”.

36

7.1.2 Caracterización bioquímica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir del fermento de Lulo (Solanum topiro). Al evaluar la capacidad de los aislamientos obtenidos a partir del fermento de lulo (Solanum topiro), de crecer y fermentar los sustratos: maltosa, lactosa, sacarosa y glucosa; se observó la formación de 14 grupos. (Tabla 5). Tabla 5. Caracterización de perfiles bioquímicos de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de lulo (Solanum topiro) suelo proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito de Buenaventura ID. Aislamientos

n

LCED01,2

1

LCED02,7, LCED03,1 2

Crecimiento Fermentación Nu. Grupo Glucosa Lactosa Sacarosa Maltosa Glucosa Lactosa Sacarosa Maltosa 3,03 1 + %

6,06

2

-

-

-

+

+

-

-

-

1 1

3,03 3,03

3 4

-

+

-

+ +

+ +

-

+ -

-

LCED01,1, LCED05,2 3 y LCD21,2

9,09

5

+

-

+

+

-

-

-

-

4 12,12

6

+

+

+

+

-

-

-

-

1

3,03

7

+

+

+

+

-

-

-

+

LCED01,4, LCED04,5, 5 15,15 LCED04,4, LCED07,2 y LCED03,3

8

+

+

+

+

-

-

+

+

LCED01,3 LCED06,1

LCED02,2, LCD11,1, LCED05,1 y LCED04,2 LCED04,3

LCED03,2 y LCED11,2 LCD21,1 LCED01,5

2

6,06

9

+

-

-

+

+

-

-

-

1 1

3,03 3,03

10 11

+ +

+

+ +

+ -

+ +

-

-

-

LCED02,6, LCED02,4, LCED06,2 4 12,12 y LCED03,4

12

+

+

+

+

+

-

-

-

LCED06,5, LCED04,6 3 y LCED07,1

9,09

13

+

+

+

+

+

-

-

+

LCED02,1, LCED02,5, LCED02,3 4 12,12 y LCED04,1

14

+

+

+

+

+

-

+

+

Total

33

100

ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase, Un. Grupo corresponde al grupo de agrupamiento de los aislados que comparten un mismo perfil 37

bioquímico. La capacidad de crecimiento y fermentación se describe empleando: + si es positivo y si es negativo.

En los aislamientos obtenidos a partir del lulo (Solanum topiro), se observó que 14 (42,42%) asilamientos, no presentaron tolerancia a NaCl en el medio, 10 (30,30%) solo tuvieron tolerancia a concentraciones no superiores a 10% de NaCl y 9 (27,27%) crecieron a concentraciones de NaCl del 10% y 15%. (Tabla 6). Tabla 6. Halotolerancia de los aislamientos obtenidos a partir fermento de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura

ID. Aislamientos LCED01,2, LCED01,3, LCED01,5, LCED02,7, LCED02,6, LCED02,4, LCED01,1, LCED03,1, LCED11,2, LCED05,2, LCD21,1, LCD21,2, LCED06,1 y LCED06,2.

LCED02,3, LCED03,2, LCED04,2, LCED04,3, LCED06,5, LCED04,6, LCED04,5, LCED04,4, LCED07,2 y LCED03,4. LCED01,4, LCED02,1, LCED02,2, LCED02,5, LCD11,1, LCED05,1, LCED04,1, LCED03,3 y LCED07,1. Total

Halotolerancia 10% 15%

Total n

%

-

-

14

42,42

+

-

10

30,30

+

+

9

27,27

33

100,00

ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase. La tolerancia se describe empleando: + si es positivo y - si es negativo.

También fue evaluada la tolerancia a concentraciones de etanol de los aislamientos obtenidos a partir del lulo (Solanum topiro), se observó que 16 (48,48%) asilamientos, no presentaron tolerancia a etanol en el medio, 3 (9,09%) solo tuvieron tolerancia a concentraciones no superiores de 10% de etanol y 14 (42,42%) crecieron a concentraciones de etanol del 10% y 15%. (Tabla 7).

38

Tabla 7. Tolerancia a etanol de los aislamientos obtenidos a partir fermento de lulo (Solanum topiro) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura. ID. Aislamientos

Tolerancia etanol 10% 15%

Total n

%

LCED01,2, LCED01,3, LCED01,5, LCED02,7, LCED02,4, LCED01,1, LCED03,1, LCED03,2, LCD21,2, LCED04,1, LCED06,5, LCED06,1, LCED04,6, LCED04,4, LCED03,3 y LCED07,1.

-

-

16

48,48

LCED11,2, LCED06,2 y LCED04,5

+

-

3

9,09

+

+

14

42,42

33

100,00

LCED01,4, LCED02,1, LCED02,2, LCED02,5, LCED02,6, LCED02,3, LCD11,1, LCED05,1, LCED05,2, LCD21,1, LCED04,2, LCED04,3, LCED07,2 y LCED03,4. Total

ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase. La tolerancia se describe empleando: + si es positivo y - si es negativo.

7.1.3 Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de Borojó (Borojoa patinoi). A partir de los fermentos de Borojó se obtuvieron 17 aislamientos, los cuales se ordenaron o agruparon por morfología de colonia y celular, en 14 grupos (Figura 2). Las colonias observadas presentaron forma circular, irregular, puntiforme o rizoide, observándose márgenes enteros, irregulares, onduladas o lobuladas, con elevaciones de forma plana, umbeliforme o convexa, y donde a nivel celular se presentaron formas esféricas y alimonadas, con reproducción por gemación monopolar o por fisión. (Tabla 8).

39

COLONIA 40X

CÉLULA 100X

COLONIA 40X

CÉLULA 100X

1A

1B

2A

2B

3A

3B

4A

4B

5A

5B

6A

6B

7A

7B

8A

8B

9A

9B

10A

10B

40

11A

11B

12A

12B

13A

13B

14A

14B

Figura 4. Morfotipos obtenidos a partir de los aislamientos en la fermentación de borojó (Borojoa patinoi) provenientes de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura El agrupamiento mediante la morfología de la colonia y célula, permitió establecer 14 morfotipos, donde los grupos 1, 6 y 13 están compuestos por 2 (11,76%) aislamientos (aislados BCED01 y BCED01,5; BCED01,2 y BCD01,6; BLD01,2 y BLD01,3 respectivamente), y en los grupos 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, y 14, 1 (5,88%) aislamiento (aislados BCED01,1, BCD01,4, BCED01,7, BCD01,5, BLD01,4, BCED01,6, BCD01,1, BCD01,2, BCD01,3, BCED01,3 y BLD01,1 respectivamente). (Tabla 8) Tabla 8. Caracterización morfológica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de la fermentación de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ID Aislado n BCED01,4 BCED01,5

2

Nu. Foto Color Grupo Blanco 11,76 1 Blanco %

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Alimonada

N/O

Reproducció n Gemación

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Alimonada

Elevación Borde

Forma

Apariencia Forma célula Filamentos

N/O

Gemación

5,88

2

Blanco

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

1

5,88

3

Café claro

Plano

Lobulado

Irregular

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

BCED01,7 1

5,88

4

Crema

Plano

Entero

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

5,88

5

Crema

Plano

Entero

Circulo

Brillante

Esférica

N/O

Gemación

BCED01,1 1 BCD01,4 BCD01,5 BCED01,2

1

Crema

Convexo Filamentodo Circulo

Opaco

Esférica

O

Fisión

Crema

Convexo Filamentodo Circulo

Opaco

Esférica

O

Fisión

2

11,76

6

1

5,88

7

Crema

Plano

Lobulado

Irregular

Opaco

Esférica

N/O

Fisión

BCED01,6 1

5,88

8

Crema

Plano

Ondulado

Irregular

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

BCD01,6 BLD01,4 BCD01,1

1

5,88

9

Crema

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

BCD01,2

1

5,88

10

Crema

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

BCD01,3

1

5,88

11

Crema

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

BCED01,3 1

5,88

12

Crema y blanco

Plano

Lobulado

Irregular

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

Salmón

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

Salmón

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Esférica

N/O

Gemación

Salmón

Plano

Ondulado

Circulo

Opaco

Alimonada

N/O

Gemación

BLD01,2 BLD01,3 BLD01,1 Total

2

11,76

13

1

5,88

14

17 100,00

ID aislado, corresponde al número del aislado, n al número de aislados con ese fenotipo, % al porcentaje de aislados con esa descripción, Nu. Foto grupo, al número de la foto en la figura 1 y 41

grupo; color a la tonalidad de la colonia, borde a la forma del perímetro de la colonia, forma a fenotipo de la colonia, apariencia al brillo u opacidad de la colonia, elevación a silueta horizontal de la colonia, adicionalmente se describe la forma de la Célula y la reproducción. N/O significa “no observado” y O quiere decir “observado”.

7.1.4 Caracterización bioquímica de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir del fermento de Borojó (Borojoa patinoi). Al evaluar la capacidad de los aislamientos obtenidos a partir del fermento de Borojó (Borojoa patinoi), de crecer y fermentar los sustratos: maltosa, lactosa, sacarosa y glucosa; se observó la formación de 16 grupos. (Tabla 9) Tabla 9. Caracterización de perfiles bioquímicos de los aislamientos levaduriformes obtenidos a partir de borojó (Borojoa patinoi) suelo proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura. ID. Aislamientos n BLD01,3, BCED01,2 y BCD01,6 BCED01,7 BLD01,1 BCD01,1 BLD01,2 BCED01,3 BCD01,3 BCED01,1 BCD01,2 BCED01,4 BCED01,5 BCED01,6 BCD01,5 BLD01,4 BCD01,4 Total

%

Nu. Crecimiento Fermentación Grupo Glucosa Lactosa Sacarosa Maltosa Glucosa Lactosa Sacarosa Maltosa

3 17,65

1

-

-

-

-

+

-

-

-

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

+ + + + + + + + +

+ + + + + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + +

+ + + + + + + +

+ + + + + + + + +

+ +

+ + + + + + + + + + +

5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 5,88 100

ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase. La capacidad de crecimiento y fermentación se describe empleando: + si es positivo y - si es negativo. En los aislamientos obtenidos a partir de fermento de borojó (Borojoa patinoi), se observó que 14 (42,42%) asilamientos, no presentaron tolerancia a NaCl en el medio, 10 (30,30%) solo tuvieron tolerancia a concentraciones no superiores a 10% de NaCl y 9 (27,27%) crecieron a concentraciones de NaCl del 10% y 15%. (Tabla 10).

42

Tabla 10. Halotolerancia de los aislamientos obtenidos a partir fermento de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ID. Aislamientos

BLD01,1, BLD01,2, BLD01,3, BLD01,4, BCED01,1, BCED01,2, BCED01,3, BCED01,5, BCED01,6, BCED01,7, BCD01,1, BCD01,2, BCD01,3, BCD01,4 y BCD01,6. BCD01,5 BCED01,4

Halotolerancia 10% 15%

-

-

+ +

+

Total n

%

15

88,24

1 5,88 1 5,88 Total 17 100,00 En la tabla 10, ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase. La tolerancia se describe empleando: + si es positivo y - si es negativo.

También fue evaluada la tolerancia a concentraciones de etanol de los aislamientos obtenidos a partir de fermento de borojó (Borojoa patinoi), se observó que 16 (94,12%) aislamientos, no presentaron tolerancia a etanol en el medio, 1 (5,88%) tuvieron tolerancia a concentraciones no superiores de 10% de etanol y 0 (0%) crecieron a una concentración de etanol del 15%. (Tabla 11). Tabla 11. Tolerancia a etanol de los aislamientos obtenidos a partir fermento de borojó (Borojoa patinoi) proveniente de la región pacífica del Valle del Cauca en el Distrito Especial de Buenaventura ID. Aislamientos

BLD01,1, BLD01,2, BLD01,3, BLD01,4, BCED01,2, BCED01,3, BCED01,4, BCED01,5, BCED01,6, BCED01,7, BCD01,1, BCD01,2, BCD01,3, BCD01,4, BCD01,5 y BCD01,6. BCED01,1

Tolerancia etanol 10% 15%

-

-

+ +

+

Total n

%

16

94,12

1 5,88 N/A 0 0,00 Total 17 100,00 En la tabla 11, ID corresponde al código del aislado, n corresponde al número de aislados que

43

comparten el perfil bioquímico o grupo, % al porcentaje del total que representa el grupo de aislamientos de la clase. La tolerancia se describe empleando: + si es positivo y - si es negativo.

7.2 Clasificación de aislados en agrupaciones de posibles Saccharomyces sp para Borojó (Borojoa patinoi) y Lulo (Solanum topiro). Las levaduras de la especie Sacharomyces sp presentan, según Cuervo, et al, (2015), un perfil bioquímico, el cual presenta crecimiento celular en medios con glucosa, lactosa, sacarosa y maltosa, así mismo poseen actividad fermentativa nula en lactosa, pero positiva en glucosa, sacarosa y maltosa. Teniendo en cuenta los perfiles bioquímicos arrojados para los aislados de los frutos, se obtuvieron en total 3, donde la totalidad de los aislados corresponde a cepas provenientes del lulo. Estas, junto con los aislados que toleraron concentraciones del 10% o superiores de etanol, fueron empleadas para la fermentación de melaza y evaluación de etanol por HPLC (Tabla 12). Tabla 12. Cantidad de posibles Saccharomyces sp por fruta según perfil bioquímico %

n

Fruta

Aislado

100

3

Lulo

LCED02,1, LCED02,5 y LCED02,3

0 0 Borojó Total 3 % corresponde al porcentaje de aislamientos que posiblemente sean Sacharomyces sp por fruta, n es la cantidad de aislados, Fruta es la especie de proveniencia los aislados y Aislado es la denominación de los aislados.

Tabla 13. Aislados que toleraron al menos 10% de etanol %

n Fruta

Aislado LCED01,4, LCED02,2, LCED02,6, LCD11,1, LCED11,2, LCED05,1, LCED05,2, LCD21,1, 92,86 13 Lulo LCED04,2, LCED04,3, LCED06,2, LCED04,5, LCED07,2 y LCED03,4 7,14 1 Borojó BCED01,1 Total 14 % corresponde al porcentaje de aislamientos que toleraron al menos 10% de etanol, n es la cantidad de aislados, Fruta es la especie de proveniencia los aislados y Aislado es la denominación de los aislados.

44

7.3 Resultados de producción de etanol. Los resultados de la producción de etanol a partir de melaza, se hizo con los aislados BCED01,1 de borojó y LCED07,2, LCED05,2, LCD21,1, LCED02,1, LCED01,4, LCED06,2, LCED02,5, LCED02,3, LCED03,4, LCED02,6 y LCED04,5 de lulo, y se obtuvieron producciones no mayores al 1%. El aislado LCED07,2, con la producción más alta (0,940%) comparado con el porcentaje de contenido de etanol producido por la cepa control (2,684%) es un 65,10% más bajo, y por debajo de 32,88% en comparación con la misma se encuentran los aislado LCED05,2 con un producción del 0.886%, LCD21,1 con 0.724%, LCED02,1 con 0.690%, LCED01,4 con 0,678%, LCED06,2 con 0,590%, LCED02,5 con 0.578%, BCED01,1 con 0,576%, LCED02,3 con 0.522%, LCED03,4 con 0.384%, LCED02,6 con 0.284% y LCED04,5 con 0,00% (Tabla 10). También fueron evaluados los aislados LCED02,2, LCD11,1, LCED11,2, LCED05,1, LCED04,2 y LCED04,3 y reportaron producciones del 0,00%. Tabla 14. Porcentajes de etanol producido, contenido de glucosa y fructosa en gramos por litro, consumo de glucosa en gramos por litro y volumen de etanol producido Nombre del aislamiento

Etanol Glucosa Consumo de glucosa (%) (g/L de melaza) (g/L de melaza)

LCED07,2 LCED05,2 LCD21,1 LCED02,1 LCED01,4 LCED06,2 LCED02,5 BCED01,1 LCED02,3 LCED03,4 LCED02,6 LCED04,5 Blanco Control positivo

0,940 0,886 0,724 0,690 0,678 0,590 0,578 0,576 0,522 0,384 0,248 0,000 0,000 2,694

26,520 5,444 4,286 22,186 24,336 12,000 20,442 14,008 20,028 16,520 14,008 28,940 23,420 N/O

14,514 13,680 11,179 10,654 10,469 9,110 8,925 8,894 8,060 5,929 3,829 0,000 0,000 41,596

Fructosa (g/L de melaza)

mL de etanol / L de melaza

41,500 5,444 4,286 37,612 40,400 16,594 40,000 14,008 32,810 16,520 14,008 26,640 23,420 N/O

9,400 8,860 7,240 6,900 6,780 5,900 5,780 5,760 5,220 3,840 2,480 0,000 0,000 26,940

Nombre del aislamiento, es el nombre del aislado probado en fermentación de solución de melaza, Etanol (%) es el porcentaje de etanol producido, Glucosa (g/L) es la relación de gramos de glucosa por litro de solución con melaza, % consumo de glucosa es el porcentaje de consumo de glucosa (teórico) y Fructosa (g/L) es la relación de gramos de fructosa por litro de solución con melaza. Los aislados que no aparecen reportados en la tabla no modificaron la composición del blanco y no produjeron etanol. Los 7 aislados restantes no fermentaron la melaza, por lo tanto, no hubo producción de etanol ni consumo de azúcares 45

Fueron evaluadas las poblaciones (Tabla 14), °Brix y pH (Tabla 15) de cada mosto con el aislado, al inicio y luego de transcurridas 48h de fermentación. Los resultados muestran que 4 (22,22%) aislados tuvieron muerte celular y los 14 (77,78%) restantes tuvieron un crecimiento celular por encima del 90%. También se evaluó el crecimiento celular con respecto al crecimiento de la cepa control de Saccharomyces cerevisae evidenciándose un crecimiento mayor al 20% en relación al control en 4 (33,33%) aislados, mayor a 10% y menor a 20% en 4 (22,22%) y menor a 10% en 4 (22,22%) aislados. Los °Brix disminuyeron en los mostos inoculados con los aislados LCED01,4, LCED02,1, LCED02,5, LCD11,1, LCED05,2, LCD21,1, LCED06,2, LCED07,2 y LCED03,4, BCED01,1, los mostos donde no hubo disminución en la cantidad de solidos disueltos fue en los que fueron inoculados con los aislados LCED02,2, LCED02,7, LCED02,6, LCED02,3, LCED03,2, LCED11,2, LCED05,1, LCED04,2, LCED04,3 y LCED04,5. El pH mostró aumento en todos los mostos de melaza inoculados con los aislados, evidenciándose un incremento de hasta 7,78% en el que más subió y un 3,11% para el que menos aumentó. Tabla 15. Evaluación de las poblaciones iniciales y finales de los aislados en el mosto de melaza Nombre de l Población inicial ais lamie nto (Ce l/mL) LCED01,4 LCED02,1 LCED02,2 LCED02,5 LCED02,6 LCED02,3 LCD11,1 LCED11,2 LCED05,1 1,00E+06 LCED05,2 LCD21,1 LCED04,2 LCED04,3 LCED06,2 LCED04,5 LCED07,2 LCED03,4 BCED01,1 Control

Población final (Ce l/mL) 6,09E+07 4,22E+07 3,28E+07 7,66E+07 0,00E+00 7,19E+07 2,97E+07 0,00E+00 5,16E+07 6,56E+07 3,91E+07 1,56E+07 0,00E+00 2,97E+07 0,00E+00 5,31E+07 6,88E+07 2,97E+07 3,02E+08

∆Población (Ce l/mL) 5,99E+07 4,12E+07 3,18E+07 7,56E+07 -1,00E+06 7,09E+07 2,87E+07 -1,00E+06 5,06E+07 6,46E+07 3,81E+07 1,46E+07 -1,00E+06 2,87E+07 -1,00E+06 5,21E+07 6,78E+07 2,87E+07 3,01E+08

C/C (%) 98,36 97,63 96,95 98,69 M/C 98,61 96,63 M/C 98,06 98,48 97,44 93,60 M/C 96,63 M/C 98,12 98,55 96,63 99,67

C/C con re s pe cto al de control (%) 19,94 13,70 10,58 25,14 M/C 23,58 9,54 M/C 16,82 21,50 12,66 4,87 M/C 9,54 M/C 17,34 22,54 9,54

Nombre del aislamiento corresponde a la denominación de los aislados probados en la producción de etanol, población inicial (Cel/mL) la cantidad de celular por mililitro presentes al iniciar la 46

fermentación, Población final (Cel/mL) la cantidad de celular por mililitro presentes al finalizar la fermentación (48h), ∆Población (Cel/mL) es la diferencia entre la población final y final, C/C (%) el porcentaje de crecimiento celular, C/C con respecto al de control (%) es el porcentaje de crecimiento celular con respecto al crecimiento celular de la cepa control de Saccharomyces sp.y M/C significa muerte celular.

Tabla 16. Solidos disueltos (°Brix) y potencial hidrogeno (pH), inicial y final de cada mosto de melaza inoculado con los aislados

Nombre del aislamiento LCED01,4 LCED02,1 LCED02,2 LCED02,7 LCED02,5 LCED02,6 LCED02,3 LCD11,1 LCED03,2 LCED11,2 LCED05,1 LCED05,2 LCD21,1 LCED04,2 LCED04,3 LCED06,2 LCED04,5 LCED07,2 LCED03,4 BCED01,1 Blanco Control

°Brix inicial °Brix final ∆°Brix

14

13,6 13,2 14 14 13 14 14 13,8 14 14 14 13 12,5 14 14 13,6 14 12,3 13,8 13,4 14 8

-0,4 -0,8 0 0 -1 0 0 -0,2 0 0 0 -1 -1,5 0 0 -0,4 0 -1,7 -0,2 -0,6 0 -6

pH inicial

pH final

∆°pH

4,5

4,69 4,71 4,81 4,68 4,77 4,81 4,71 4,77 4,79 4,66 4,77 4,64 4,67 4,82 4,72 4,85 4,73 4,71 4,85 4,66 4,78 4,92

0,19 0,21 0,31 0,18 0,27 0,31 0,21 0,27 0,29 0,16 0,27 0,14 0,17 0,32 0,22 0,35 0,23 0,21 0,35 0,16 0,28 0,42

En la tabla 15. Nombre del aislamiento corresponde a la denominación de los aislados de las frutas, °Brix inicial la cantidad inicial de solidos disueltos en el mosto de melaza, °Brix final la cantidad final de solidos disueltos en el mosto de melaza, ∆°Brix la diferencia entre °Brix final y °Brix final, pH inicial el potencial hidrogeno inicial en el mosto de melaza, pH final el potencial hidrogeno final en el mosto de melaza y ∆pH es la diferencia entre el pH final y el pH inicial.

47

8 DISCUSIÓN Las frutas son fuentes importantes de levaduras debido a su gran cantidad de azúcares simples y a la constante visita de vectores. La microbiota natural de las futas está compuesta generalmente por levaduras y hongos levaduriforfmes de los género, Aureobasidium, Rhodotorula, Sporobolomyces, Cryptococcus, Candida, Pichia, Hanseniaspora y raramente Saccharomyces y Schizosaccharomyces (Skinner, Passmore & Davenport., 1980; Phaff, 1990), esto es coherente con los resultados de este trabajo donde se obtuvieron 50 aislados (33 a partir de lulo y 17 de Borojò) y de ellos solo 3 pertenecen según la caracterización morfológica y bioquímica al género Saccharomyces, muy posiblemente a la especie cerevisiae, sin embargo, esto último deberá ser validado a partir de pruebas moleculares. En este estudio se identificaron 4 levaduras de la especie Saccharomyces sp obtenidas a partir de los zumos fermentados de frutas de lulo provenientes del pacífico Colombiano, sin embargo, no fue posible el aislamiento de Saccharomyces sp a partir del fruto de borojò, esto muy posiblemente debido a la alta presencia de esporas e hifas de hongos filamentosos que se desarrollaron a medida que transcurrió la fermentación. Cabe anotar que la literatura expresa que muchos hongos filamentosos cosmopolitas inhiben el crecimiento tanto de bacterias como de levaduras, como por ejemplo Penicillium sp, el cual es un fuerte inhibidor de bacterias gram negativas y levaduras tipo Saccharomyces sp. (Kurtman, 2011). De otro lado el borojò alcanza mayores grados Brix en la maduración (18) que el lulo (10-12), esta alta concentración de azúcares en el borojò hace que la presión osmótica sea demasiada alta para la supervivencia de las levaduras y la mayoría de las bacterias mesófilas, esto se puede observar en nuestro trabajo cuando se obtienen los aislados, en donde los que provenían del lulo (33) fueron muchos más que los que provenían del borojò (17), este último con la presión osmòtica alta.. En este estudio solo fue posible aislar y caracterizar por medio de pruebas de morfología y perfiles bioquìmnicos 3 cepas de Saccharomyces sp, lo cual plantea la incógnita del porqué este bajo número, sin embargo, realizando una revisión de literatura (Esteve-Zarzoso., et al, 2011), se encontró que muchos de los hongos filamentosos cosmopolitas presentes en el exocarpio de las frutas inhiben el crecimiento de las cepas levaduriformes, debido a metabolitos altamente específicos que ellos producen, por lo anterior se propone para un 48

próximo estudio mejorar el lavado realizado en las frutas para eliminar la presencia de esporas fúngicas. Se debe tener en cuenta que debido a que las frutas tomadas en este estudio provenían de zonas de bosque tropical húmedo de la región de Buenaventura es de esperarse que estas posean una alta cantidad de esporas de hongos filamentosos que realicen la inhibición del crecimiento levaduriforme. A partir de este estudio se puede inferir las características morfológicas y bioquímicas de las cepas levaduriformes aisladas pertenecientes al género Saccharomyces sp, sin embargo se hace necesario en un posterior trabajo validar la información y los resultados aquí obtenidos por pruebas moleculares, más aun cuando la cepa LCED04,1 aislada del mesocarpio del lulo, presentaba el perfil morfológico y bioquímico (Asimilación y fermentación de azúcares) correspondiente al género Saccharomyces sp, sin embargo, al realizar las pruebas bioquímicas para tolerancia al etanol, estas fueron negativas por lo cual no fue tomada en cuenta como Saccharomyces sp. En este trabajo se encontró una microflora variada, solo 3 aislados cumplen con las características para ser ubicadas dentro del género Saccharomyces sp, quedando por fuera del estudio 47 aislados, lo cual evidencia la diversidad levaduriforme presentes en lulo y borojò. Los 47 aislados restantes no fueron tomados en cuenta debido a que no era el objetivo del estudio, el cual explícitamente manifestaba “Identificar las levaduras del género de Saccharomyces sp de los aislados provenientes del lulo y borojo”. La producción de etanol de los aislados (0,94-0,89 y 0,72 %), estuvo por debajo de la cepa control (2,69), esto puede indicar que la producción de alcohol no es suficientemente alto para ser de interés en la industria de producción de bioetanol, sin embargo, estas cepas si pueden ser de interés en otro tipo de industria como la de panificación o en la industria que requiera la producción de manoproteìnas, lo cual según la literatura (Kurtzman, 2006), este es comúnmente obtenido de cepas de Saccharomyces cerevisiae con baja producción de bioetanol. De otro lado estas cepas también pueden ser utilizadas para el desarrollo de alimento para consumo animal.

49

9 CONCLUSIONES 

Se caracterizaron 50 aislados provenientes de Lulo (Solanum topiro) y Borojo (Borojoa patinoi), de los cuales se aislaron y caracterizaron bioquímicamente 3cepas de levaduras nativas a partir del exocarpio y jugo de las frutas Lulo (Solanum topiro) y Borojo (Borojoa patinoi) que pertenecen al género Saccharomyces sp, presumiblemente a la especie cerevisiae, sin embargo, esto último debe ser probado mediante técnicas moleculares.



La identificación de levaduras a partir de morfología y de pruebas bioquímicas a partir de sustratos específicos no es suficiente para lograr una segura identificación, ya que es mediante pruebas moleculares que se tiene mayor certeza de la especie (González, 2006). Por lo que se hace necesario la identificación genética mediante las regiones ITS 1 y ITS 2 (Cuervo, 2014). Lo anterior, muestra la necesidad de trabajos posteriores que permitan corroborar mediante técnicas moleculares los datos aquí encontrados y la identificación de todas las demás cepas levaduriformes obtenidas en este estudio que no fueron caracterizadas por no ser objetivo de este trabajo.



La mayoría de las cepas de levaduras nativas aisladas y caracterizadas fueron obtenidas del zumo del Lulo, lo cual indica que la concentración de azúcares totales (°Brix) en ellas, hace de esta materia prima una fuente de interés para el crecimiento levaduriforme.



Aunque la producción de alcohol de las levaduras aisladas estuvo por debajo de la producción de alcohol de la cepa control, esto no minimiza la importancia industrial de los aislados encontrados, dado que pueden ser utilizadas en otras industrias diferentes a la de la producción de bioetanol. De otra forma este trabajo es un avance importante en el conocimiento de las levaduras asociadas a estos dos frutos endémicos del Pacifico Colombiano-Buenaventura.

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56

RECOMENDACIONES 

Se recomienda incluir dentro de la caracterización levaduriforme pruebas moleculares que permitan identificar las especies aisladas y de esta manera poder tener un grado de certeza mayor a la hora de probar las cepas de Saccharomyces aisladas en la producción de etanol, puesto que con las pruebas morfológicas y bioquímicas suelen generarse sesgos involuntarios frente a la identificación del microorganismo.



Se recomienda ampliar las pruebas bioquímicas para tener mayor certeza a la hora de elegir los aislados como Saccharomyces.



Se recomienda hacer una evaluación previa de la melaza para analizar la calidad y su potencial como sustrato fermentable.



También se recomienda comparar la actividad fermentativa de los aislados en melaza con la de otro sustrato con mayor concentración de monosacáridos.



Se recomienda comparar la actividad fermentativa de los aislados en melaza con la de otro sustrato con rico en sacarosa y analizar posible hidrolisis enzimática del sustrato.

57

ANEXOS Anexo 1. Medios de cultivos usados en el laboratorio YPDA (yeast, peptone, dextrosa, agar) Glucosa

2%

Peptona

2%

Extracto de levadura 1% Agar

2%

Agua destilada Medio para el crecimiento de las levaduras. Se añade el agua destilada en un frasco de boca grande con el agua destilada dependiendo del volumen deseado final. Los ingredientes se pesan e inmediatamente se añaden al agua. Se coloca el frasco a calentar con agitación hasta observar que los componentes se han unificado o el medio se torna de un color muy claro. Se autoclava a 120 °C por 15 min. y se sirve antes de que se solidifique en las cajas de petri, aprox. 20 mL C/U. Cuando se desea añadir antibiótico, el medio debe estar a una temperatura de más o menos 60 °C. YPD (yeast, peptone, dextrosa) Glucosa

2%

Peptona

2%

Extracto de levadura 1% Agua destilada Medio para el crecimiento de las levaduras. Se añade el agua destilada en un frasco de boca grande con el agua destilada dependiendo del volumen deseado final. Los ingredientes se pesan e inmediatamente se añaden al agua. Se coloca el frasco a calentar con agitación hasta

58

observar que los componentes se han unificado o el medio se torna de un color muy claro. Se autoclava a 120 °C por 15 min. y se sirve en los tubos de ensayo la cantidad requerida. Tolerancia al etanol Extracto de levadura 1% Peptona

2%

Glucosa

2%

Etanol

10% o 15% (v/v)

Medio utilizado para observar la tolerancia de las levaduras a las concentraciones del etanol al observar su crecimiento. Se añade el agua destilada en un frasco de boca grande con el agua destilada dependiendo del volumen deseado final. Los ingredientes se pesan e inmediatamente se añaden al agua (menos el etanol). Se mezcla el contenido del frasco con agitación hasta observar que los componentes se han unificado o el medio se torna de un color muy claro. Se autoclava a 120 °C por 15 min. El etanol debe ser adicionado al medio después de que este haya sido autoclavado a más o menos 60°C (para evitar la evaporación), se adicionan 5ml a cada tubo de ensayo. Prueba de halo-tolerancia Extracto de levadura 1% Peptona

2%

Glucosa

2%

Agar

2%

Cloruro de sodio

10% o 15% (p/v)

Medio utilizado para observar la tolerancia de las levaduras a las concentraciones de sal al observar su crecimiento. Se añade el agua destilada en un frasco de boca grande con el agua 59

destilada dependiendo del volumen deseado final. Los ingredientes se pesan e inmediatamente se añaden al agua. Se coloca el frasco a calentar con agitación hasta observar que los componentes se han unificado o el medio se torna de un color muy claro. Se autoclava a 120 °C por 15 min. se sirve antes de que se solidifique en las cajas de petri, aprox 20 mL C/U. Medio para evaluar el Crecimiento y la Fermentación de azúcares La habilidad para fermentar y asimilación de azucares es evaluada en un medio con 0.05% del azúcar a fermentar en agua mili-Q. El medio es colocado en un tubo de ensayo. El inoculo para este medio debe tener entre 24 y 48 horas. Los tubos con el inoculo se incuban a 30°C hasta por 48 horas. Para evidenciar los resultados es necesario añadir 1,6 ml de rojo de metilo a 100ppm y se tabulan para fermentación de la siguiente manera: si al adicional el rojo de metilo el líquido del tubo se torna de color rojo, es positivo (+) en fermentación, por el contrario, si se torna de color amarillo, es negativo (-) en fermentación. En cuanto a las pruebas de crecimiento, se realizan en un medio sólido que contenga 20g/L de Peptona, 10g/L de extracto de levadura, 20g/L de agar y 20g/L de cada azúcar a evaluar. Se autoclava a 120 °C por 15 min., se sirve antes de que se solidifique en las cajas de petri, aprox 20 mL cada una; se inoculan tres puntos en la superficie del medio, se incuban a 30°C durante 24 horas y se observa el crecimiento. Si se observa el crecimiento de 2 o más colonias crecidas el resultado es considerado como positivo (+), pero si se observa 1 o menos colonias se tabula como negativo (-). Medio de conservación Glicerol estéril

20%

Medio YPD

80%

Anexo 2. Hongos filamentosos que dificultaron el aislamiento levaduriforme de las frutas borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro)

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Las frutas tienen una microflora de microorganismos, donde hay presencia de levaduras, hongos filamentosos y algunas bacterias. Esto en ocasiones no permitió el aislamiento levaduriforme puesto que la carga fúngica era demasiada y dificultó la separación de las colonias. (Figura 3) Figura 5. Hongos filamentosos que dificultaron el aislamiento levaduriforme en borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro).

En la figura 3, se ven imágenes de algunos de los hongos que colonizaban los medios y no permitían la separación de las colonias de posibles levaduras.

Anexo 3. Cromatogramas de las muestras de melaza fermentada con aislados de Borojó (Borojoa patinoi) y lulo (Solanum topiro), control positivo y blanco mediante la técnica HPLC. Melaza fermentada por el aislado LCED01,4 – Lulo (Solanum topiro)

61

Melaza fermentada por el aislado LCED01,4 – Lulo (Solanum topiro)

Melaza fermentada por el aislado LCED02,5 – Lulo (Solanum topiro)

62

Melaza fermentada por el aislado LCED02,6 – Lulo (Solanum topiro)

Melaza fermentada por el aislado LCED02,3 – Lulo (Solanum topiro)

63

Melaza fermentada por el aislado LCED05,2 – Lulo (Solanum topiro)

Melaza fermentada por el aislado LCD21,1 – Lulo (Solanum topiro)

64

Melaza fermentada por el aislado LCED06,2 – Lulo (Solanum topiro)

Melaza fermentada por el aislado LCED04,5 – Lulo (Solanum topiro)

65

Melaza fermentada por el aislado LCED07,2 – Lulo (Solanum topiro)

Melaza fermentada por el aislado LCED03,4 – Lulo (Solanum topiro)

66

Melaza fermentada por el aislado BCED01,1 – Borojó (Borojoa patinoi)

Melaza control sin fermentación

67

Melaza control positivo con Saccharomyces Cerevisae

68