Diss. ETH Nr. 9889

THE PLASMA MEMBRANE CALCIUM PUMP:

ISOFORMS, ALTERNATIVE RNA SPLICING AND EXPRESSION IN THE BACULOVIRUS SYSTEM

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the

degree of

Doctor of Natural Sciences

presented by

ROGER HEIM Dipt.

Natw. ETH

born 19th June 1963 citizen of

accepted

on

Krattigen,

BE

the recommendation of

Prof. Dr. Ernesto Carafoli, examiner Dr. Emanuel E. Strehler, co-examiner

Prof. Dr. Jean-Claude Perriard, co-examiner Zurich 1992

Summary

1

SUMMARY Plasma membrane Ca2+ ATPases (PMCAs)

fine-tuning eucaryotic

of

cytoplasmic

cells. At the outset of this

known for two rat and

were

isoforms. In contrast, another

available allow

comprehensive

determine its

together a

were

from the

erythrocyte

revealed that the

as

corresponded

partial

in

structures

deduced from cloned to the first of the two

human sequence which

this novel isoform, it

on

was

was

family.

To to

necessary

sequence. Therefore, several screenings of human

performed

and

correspond

not

yielded overlapping

coding

novel rat sequence had been

termed hPMCA4.

ubiquitous

novel member of the PMCA gene

covered the entire PMCA

which, however, did was

a

studies

complete

cDNA libraries

also

coded for

clearly

involved in the

to be

study, complete primary

human PMCA

one

cDNA. The human sequence (hPMCAl) rat

crucially

are

Ca2+ levels, and thus appear

clones which

sequence. Since in the meantime

published

under the

to the new human

name

rPMCA3

isoform, the latter

Sequence comparisons of available peptides

derived

PMCA with the two human cDNA deduced isoforms

erythrocyte

enzyme

mainly

consists of hPMCA4 and to

a

minor extent of hPMCAl. One hPMCA4 cDNA clone contained

a

178

bp

insertion

a

154

bp

exactly

exon occurs

Another

position

where the alternative

human cDNA sequence

corresponded

completed by applying protocols

was

chain reaction. The

alignment

putative phospholipid-sensitive region pump. Alternative RNA

species containing

of the alternative

specialization

or

135

found to be encoded

were

isoform 2. The

to rat

based

the

on

of the sequence

in the N-terminal

splicing obviously generated

either 0, 42

bp. The unequal distribution

regulation

bp

by

of the

three different

splice

for the

portion

of the

the observed cDNA

insertions. The

optionally spliced

exons

of 33, 60 and 42

variants suggests

splicing pathways

of the encoded isoform

development

of

a

suitable

the baculovirus system

of the human

lacking

plasma

tissue-specific

and indicates functional

subtypes.

expression

system. Isoform 4b

(Spodoptera frugiperda

was

putative

requires

the

chosen to test

Sf9 cells) for the

membrane Ca2+ pump. A 105 kDa

the first two

polymerase

coding

Elucidation of functional differences between PMCA isoforms

pump

of

of the different isolated clones revealed

microheterogeneity immediately upstream

sequences

splicing

in the hPMCAl isoform.

partial

sequence

at the

expression

fragment

of the

transmembrane domains and the

so-

Summary

2

called transduction domain 10 times the ATPase

hardly

background

activity cells,

judged

as

was

the

underestimation.

7-10

fold

The isolated pump

was

formed

which

phosphoenzyme 105 kDa

membranes,

or

laser

was

it

as

the

the Sf9 cell

hydrolyzed

stabilized

by La3+,

The

to the

molecular mass) than the

slower

and had

microscopy

traditionally

studied

an

inactive.

and fluorescent

fragment

were

pump in Sf9 cells

membrane Ca2+ pump in

gel mobility (i.e.,

it

Ca2+

test on cell

proved

and the 105 kDa

expressed

a

contrast, the

phosphoenzyme

membrane. The

endogenous plasma a

confocal

expressed pump

plasma

unrelated cell lines had

the

ATP in

exceeding 3,

By

measurements after its isolation

scanning

antibodies showed that the

correctly targeted

an

isolated from

calmodulin stimulation factor

fragment, assayed by

by activity

Experiments using

well

were

of about 1 uM in the presence of calmodulin.

expressed

certainly on

functionally competent.

pump to be

of

preparations

was

assays

functionally competent, i.e., a

a

factor

detergent fragment preparations by calmodulin affinity chromatography.

the presence of Ca2+ with

as

gels

ATP-dependent phosphoenzyme

solubilized membrane

7-

was

of Sf9 cells. Since

of membrane

enrichment

expressed

level

expression

preparations

pump and the 105 kDa

expressed

The

from Ca2+ and calmodulin stimulated

visible in stained

membranes showed the

optimum

expressed.

measurements in membrane

any pump

control

also

was

a

number of

apparently greater

erythrocyte

pump.

3

Zusammenfassung

ZUSAMMENFASSUNG

Ca2+ ATPasen (PMCAs) sind entscheidend

Plasmamembran

cytoplasmatischen Ca2+-Spiegels beteiligt

des

Feinregulierung

der

an

und daher in

eukaryontischen

Zellen allgegenwartig. Zu Beginn dieser Studie waren komplette menschliche, von klonierter cDNA abgeleitete

sowohl eine

PMCA-Primarstruktur als auch zwei PMCA- Isoformen der Ratte bekannt.

Sequenz (hPMCAl) entspricht

Die menschliche

Isoformen. Daneben klar fur einen

auch eine menschliche

war

einer der beiden Ratten-

Teilsequenz bekannt,

anderen, damals noch unbekannten Vertreter der

Genfamilie kodierte. Um umfassende Studien iiber diese

ermoglichen,

war

notwendig,

es

ihre

Sequenz

die

PMCA-

Isoform

neue

zu

vervollstandigen.

zu

Verschiedene cDNA-Bibliotheken wurden daher gescreent und schliesslich Klone

iiberlappende kodierende

Sequenz

Rattensequenz nicht der

gefunden,

die

zusammen

menschlichen Isoform

hPMCA4 genannt.

Sequenzvergleiche

Erythrocyten-PMCA

herstammenden

abgeleiteten,

gesamte PMCA-

publiziert entsprach,

wurde die Letztere

zwischen

Peptiden

menschlichen Primarstrukturen

Enzym hauptsachlich

aus

neue

worden war, die aber

unter dem Namen rPMCA3

neuen

die

abdeckten. Da in der Zwischenzeit auch eine

hPMCA4 und

verfugbaren,

und den zwei

zeigten, dass einem

zu

das

der

von

von

cDNAs

Erythrocyten-

kleineren

Teil

aus

hPMCAl besteht. Ein cDNA Klon der hPMCA4-Isoform enthielt eine 178 Insertion genau alternative

an

der Stelle,

Spleissen

eines 154

Eine weitere menschliche 2. Die menschliche

wo

bp

bp

bei Isoform hPMCAl das bereits bekannte Exons vorkommt.

cDNA-Teilsequenz entsprach

PMCA2-Sequenz

wurde

der Ratten-Isoform

vervollstandigt

durch

neue

Methoden, die auf der Polymerase-Kettenreaktion beruhen. Der Vergleich von

der

so

erhaltenen Klonen brachte kleine

Sequenz,

die die mutmassliche

terminalen Teil der RNA

fiihrte

Insertionen

Sequenzen kodiert.

von

zu

den

von

Tage.

Alternatives

bp.

im N-

Spleissen

cDNA-Spezies

vor

genau

mit

von

den

Die variabel vorkommenden

drei verschiedenen Exons mit 33, 60 und 42

ungleiche Verteilung

gewebsspezifische Regulation funktionelle

zu

beobachteten

entweder 0, 42 oder 135

werden

Die

Pumpe kodiert,

offenbar

Langenunterschiede

Phospholipid-sensitive Region

Spezialisierung

der

der

Spleiss-Varianten legt

Spleissprozesse

der kodierten

bp

eine

nahe und deutet auf eine

Isoformsubtypen

hin.

Zusammenfassung

Die

funktioneller Unterschiede zwischen PMCA-Isoformen

Aufklarung

erfordert die hPMCA4

Entwicklung

der

ersten

fur

Ca2+ Pumpe

Plasmamembran

Fragment

um

Zellen)

Sf9

Pumpe

passenden Expressionssystems.

eines

gewahlt,

wurde

frugiperda

4

Baculovirus-System (Spodoptera

die

Expression

testen.

zu

Daneben wurde ein 105 kDa

Pumpe

Membranpraparationen

sichtbar war, ist der

Zellmembranen

Anreicherungsfaktor

dass die

zeigten,

Affinitatschromatographie ATP

stabilisiert worden

Gegensatz sowohl

im

zeigten,

ungefahr

war

1 uM in der

nach der Isolation.

als

nicht

(d.h.

ein

auch

Calmodulin-

einem

Phosphoenzym, von La3+, und sie von

welches hatte ein

Calmodulin. Im

Fragment ganzlich inaktiv,

Experimente

auch

als

bei

mit fluoreszierenden

und das 105 kDa

wurden. die

verwandten

Sowohl

Fragment die

endogenen Ca2+ Zellinien

scheinbar grosseres

traditionellerweise studierte

mit

solubilisierten

Laser-Scanning Konfokalmikroskopie

exprimierte Pumpe

transportiert

Sf9

funktionell, d.h. sie

war

Zellmembranen

an

an

funktionell ist. Die

Gegenwart

105 kDa

exprimierte

in Kombination mit

verschiedenen Gelmobilitat

das

Pumpe

Ca2+

3, bildete ein

Phosphoenzymtest

dass die

Pumpe

von

keine

7 bis 10 wohl eine

Detergenzien

durch die Anwesenheit

war

von

Plasmamembran

exprimierte

uber

von

Aktivitatsmessungen

Antikorpern

Gegenwart

in

Stimulationsfaktor

dazu

von

wurden mittels Calmodulin

Fragment mit

aus

Membranen isoliert. Auch die isolierte

Ca2+-Optimum

gefarbten

Kontrollzellen

exprimierte Pumpe

und das 105 kDa

exprimierte Pumpe

hydrolysierte

von

ATP-abhangige Phosphoenzym-Versuche

Unterschatzung.

Die

Membranpraparationen

von

7-10 mal uber dem Grundwert. Da auf

lagen

mit

Protein-Gelen

exprimiert.

der durch Ca2+ und

Messungen

von

Calmodulin stimulierten ATPase-Aktivitat und

menschlichen

ohne die sogenannte Transduktionsdomane und die

wurden auf Grund

Expressionsraten abgescharzt

der

mutmasslichen Transmembrandomanen

beiden

Isoform

das

zeigten

in

beide

Sf9

Pumpen eine

Molekulargewicht)

Erythrozyten-Pumpe.

zur

Zellen von

kleinere als

die