Efecto de la atresía folicular temprana sobre la competencia de los oocitos bovinos y la cantidad de embriones producidos in vitro (Resultados preliminares)

Investigador principal Rodrigo Urrego Zoot MSc. Universidad CES

Coinvestigadores Maria Camila Baena est. MVZ Universidad CES Laura Borrero Angel est. MVZ Universidad CES Verónica Hoyos Solís est. MVZ Universidad CES Laura Muñoz Sánchez est. MVZ Universidad CES Luisa F. Saldarriaga Valencia est. MVZ Universidad CES Clara M. Villada Sierra est. MVZ Universidad CES

GRUPOS DE INVESTIGACIÓN Grupo INCA-CES, Línea de Fisiología y Biotecnología de la Reproducción Animal

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA UNIVERSIDAD CES Medellín 2011

Resumen Este estudio pretende evaluar el efecto de la atresia folicular temprana sobre la tasa de blastocistos producidos in vitro y la expresión de los genes OCT-4 y MATER en el oocito y de FST en células del cúmulo. Los ovarios son aspirados a las 0 h y a las 4 h después del faenado, las células del cúmulo son separadas en medio TL-Hepes con 2.5% de tripsina precalentada a 39 ° C y 5 min de vortex. Se ha determinado que un total de 80 oocitos son suficientes para obtener una adecuada cantidad de RNA (1.000- 3.000 ng/µl) extraído por el método Trizol®. El RNA total es pasado a cDNA y la estandarización de la qPCR se realizó con las siguientes secuencias de primers: OCT-4 (NM_174580.2) F 5´AGTGAGAGGCAACCTGAAGA3´ R 5´ ACACTCGGACCA CGTCTTTC3´, MATER (NM_001007814.2) F 5´GAAGTGTGGCTGCAGTTGA A3´

y

R

5´ATGCCTCAGCAAATTCATCC

3´,

FST

(NM_175801.2)

F

5´AAAACCTACCGCAACGAATG3´ y R 5´GAGCTGCCTGGACAGAAAAC3´, gen

normalizador

GAPDH

F

5´TGCTGGTGCTGAGTATGTGGT3´

y

R

5´AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT3´. La cuantificación se está realizando con el kit QuantiTect® SYBR® Green PCR y las condiciones de la qPCR son 95 ° C 15 min para una desnaturalización inicial y 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 60 °C por 20 s, 72° C por 20 s y una extensión final de 72 ° C por 5 min. Se realizarán tres repeticiones por cada grupo para analizar la expresión génica y las tasas de desarrollo embrionario. Los resultados se analizarán por ANOVA utilizando SAS 9.1.3 y la expresión génica relativa se calculará usando el software REST

Palabras claves: OCT-4, MATER, Folistatina, expresión génica

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Planteamiento del problema Dentro de las biotecnologías reproductivas utilizadas en la industria ganadera la producción in vitro de embriones (PIVE), ha mostrado ser una práctica eficiente y una alternativa a los programas de ovulación múltiple y transferencia de embriones (MOET) (1,2); además, su uso se ha ido incrementando a gran escala comercial en todo el mundo (3,4). A pesar de los avances obtenidos en la PIVE en las últimas dos décadas, diversos estudios han demostrado que los embriones bovinos producidos in vitro son de menor calidad que aquellos producidos in vivo (5,6). La evidencia incluye diferencias morfológicas, asincronía en su desarrollo, menor resistencia a bajas temperaturas, alteraciones metabólicas y alteraciones en la expresión génica (7). Adicionalmente, sólo entre el 20% y el 30% de los oocitos aspirados de ovarios de hembras sacrificadas, logran desarrollarse in vitro hasta blastocisto (6). Esta disminución en la calidad y la baja eficiencia del proceso puede deberse, al menos parcialmente, al uso de oocitos de baja calidad (8). De esta manera, la evaluación de la calidad de los oocitos es uno de los pasos más importantes y desafiantes dentro de la PIVE (9). De manera rutinaria, la calidad de los oocitos es evaluada inmediatamente después de su recuperación, utilizando técnicas no invasivas como la evaluación morfológica de los Complejos Cumulos Oocitos (CCOs) (10) y el diámetro tanto del folículo como del oocito (11,12). Los oocitos que poseen un cúmulo compacto y conformados por varias capas de células de la granulosa y además con un citoplasma homogénea son considerados de buena calidad; estos oocitos son seleccionados para ser madurados y fertilizados in vitro (9). Se han realizado estudios que evalúan la competencia de los oocitos bovinos según parámetros morfológicos y han revelado que los CCOS que muestran signos de atresia temprana, como ligera expansión de las células del cúmulo y presencia de una ligera granulación del citoplasma, presentan un desarrollo potencial alto, definido como la capacidad que tiene el oocito de quedar fertilizado y desarrollarse hasta blastocisto (13-15). Igualmente, el porcentaje de blastocistos aumenta cuando se observa atresia folicular temprana (13,16). Recientemente, se han reportado perfiles globales de transcripción en el oocito y en las células de la granulosa (17-19). Los oocitos claramente dependen de la presencia de células foliculares para generar señales celulares específicas que coordinan el crecimiento y la maduración. Las células del cúmulo a su vez expresan señales que son cruciales para el proceso de maduración (20,21). Patel y colaboradores (2002) asociaron positivamente los niveles de mRNA de folistatina, expresados por las células del cúmulo, con la competencia del oocito (17). El desarrollo embrionario temprano depende en gran medida de los transcriptos y proteínas presentes en el oocito al momento de la fertilización, los cuales son sintetizados durante la ovogénesis (22). Entre los genes expresados por el oocito directamente implicados en la competencia se encuentran el factor de transcripción POU5F1, más conocido como OCT-4, el cual es un marcador de pluripotencia que a su vez regula el desarrollo embrionario temprano (23,24). E igualmente, el gen MATER, (Maternal Antigen that Embryos Require),

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identificado en el modelo murino como un factor del oocito determinante de la competencia (22,25). Además, se ha observado que una adecuada expresión del gen de Folistatina en células de la granulosa está asociada con competencia del oocito (26). El estudio de la expresión de genes en folículos, incluyendo las células del cúmulo y el oocito, puede contribuir a un mejor entendimiento de la relación existente entre expresión génica y competencia del oocito (27). Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es identificar diferencias en la expresión de folistatina en células del cúmulo y de OCT-4 y MATER en oocitos bovinos obtenidos a partir de folículos con atresia temprana y su relación con la competencia del oocito y cantidad y calidad de blastocistos producidos in vitro.

Justificación La producción in vitro de embriones bovinos es un proceso ineficiente comparado con la producción in vivo de embriones. En la PIVE tan solo el 2030% de los CCOs seleccionados para el proceso llegan al estado de blastocisto (6). Dentro del proceso, la maduración in vitro de los oocitos es un factor limitante, debido a que después de una cuidadosa selección bajo parámetros morfológicos se logra obtener una población homogénea de CCOS; pero de esa población previamente seleccionada, tan solo el 30% logran tener una maduración citoplasmática y poseen la competencia para ser fertilizados y producir embriones transferibles (6,28). Rizos et al (2008) plantea que las condiciones in vitro bajo las cuales se realiza el cultivo de los embriones no es responsable de la disminución de la competencia (29). Esta afirmación parece confirmada por un estudio que demuestra que en CCOs madurados in vivo y fertilizados y cultivados in vitro, el potencial desarrollo se incrementa, doblando el porcentaje de embriones producidos (30). Sin embargo, muchos estudios demuestran que el cultivo in vitro afectan el metabolismo y la expresión de genes en embriones tempranos (31) . El folículo preovulatorio le confiere al oocito un ambiente necesario para que esté complete la maduración citoplasmática y poder generar un desarrollo embrionario viable (16). De esta manera, se hace necesario buscar estrategias que permitan aumentar la competencia en los oocitos para poder aumentar las tasas de blastocistos producidos in vitro. De igual forma, se hace necesaria la utilización de marcadores moleculares para predecir la capacidad que posee un CCO de desarrollarse en un embrión transferible Pregunta de investigación In vivo el folículo preovulatorio padece una atresia temprana, la cual está asociada con un aumento en la competencia del oocito, entonces: ¿Qué influencia tendrá la inducción de atresia temprana en folículos aspirados de ovarios obtenidos en el faenado sobre la competencia del oocito, medida por la cantidad de embriones producidos in vitro y el patrón de la expresión génica?

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Estado del arte Las tecnologías de reproducción asistida en animales domésticos han llegado a un gran avance en esta última década, en la cual se ha obtenido un mejor enetendimiento de los procesos fisiológicos que ocurren en el oocito y embriones de diferentes especies (32). Esta es la situación de la PIVE bovinos, una biotecnología utilizada por muchas compañías comerciales alrededor del mundo, especialmente en Brasil, donde el 70% de los embriones son producidos por esta técnica (33). Aunque la PIVE en bovinos es ampliamente utilizada aún persisten muchas limitantes para que el sistema sea óptimo. La proporción de embriones que llegan hasta el estado de blastocisto después de la FIV es extremadamente influenciada por el desarrollo competente del oocito, el cual depende de la influencia folicular (6). Estudios previos en animales Bos taurus han demostrado que CCOs provenientes de folículos con signos de atresia temprana poseen un desarrollo potencial alto (26, 28,34). De otro lado, la síntesis de ARNm y su almacenamiento en los oocitos de los mamíferos después de la reanudación de la meiosis está estrechamente relacionada con la capacidad que va a adquirir el oocito de generar un adecuado desarrollo embrionario temprano, tanto in vivo como in vitro (35). El correcto equilibrio de la síntesis de ARNm y su disminución en las primearas divisiones es esencial para que se de una correcta activación del genoma embrionario bovino (36) y un adecuado desarrollo que llegue a buen término. Utilizando el modelo bovino, se ha reportado que la variación en la expresión de algunos genes está relacionada con calidad del oocito y peuden ser utilizados como predictores de competencia (18). Genes que se expresan preferencialmente el oocito (como MATER, Zp1, Zp2, Zp3, Fig α y GDF-9) participan en la regulación de vías requeridas para el crecimiento folicular, crecimiento del oocito y desarrollo embrionario. Sin embargo los genes exclusivos del oocito y sus funciones aún no han sido completamente caracterizados (35). Por ende, se hace necesario realizar estudios para proveer información acerca de genes relacionados con competencia de los oocitos, además de estudiar el efecto de la atresia folicular temprana estudiada en animales Bos taurus más no en animales Bos indicus, los cuales constituyen el principal acervo genético de nuestra ganadería.

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Marco teórico La producción in vitro de embriones y la ganadería bovina colombiana En el proceso de globalización en marcha, la ganadería es un actor de primera línea, no sólo por estar calificado como un sector con alto potencial dentro de la Apuesta Exportadora Agropecuaria, sino porque los acuerdos comerciales incorporan la posibilidad de acceso a nuestro país de los productos de países que son potencias ganaderas mundiales como Brasil, Argentina, Uruguay y Estados Unidos (37). De esta manera, nuestra meta ganadera debe ser convertir a Colombia en otra más de estás potencias ganaderas, para lograr acceso real a los Estados Unidos y a muchos más mercados en todo el mundo, y para preservar nuestro significativo mercado interno (37). Ante este panorama, se deben de dar pasos acelerados para mejorar la productividad, en este sentido, las biotecnologías reproductivas permiten aumentar la eficiencia en la producción animal, preservar recursos genéticos y mejorar la calidad de los productos; además, sirven como estrategia para el desarrollo de nuevos productos de origen animal (38). La producción in vitro de embriones bovinos ha demostrado ser una tecnología con una relación costo-beneficio positiva que se viene aplicando de una forma comercial por varias compañías en diferentes países del mundo (3). Básicamente, la PIVE comprende tres pasos que son: 1) la maduración in- vitro de los oocitos (MIV) obtenidos de ovarios por medio de aspiración folicular, 2) la fertilización in-vitro (FIV) de los oocitos madurados y 3) el cultivo in-vitro de embriones. La PIVE, es una biotecnología reproductiva utilizada como herramienta en el mejoramiento genético bovino, posee aplicabilidad comercial y además, permite estudiar los fenómenos moleculares y bioquímicos ocurridos durante la maduración del oocito, la capacitación espermática, la interacción de gametos y el desarrollo embrionario temprano. En países como Holanda (Holland Genetics), Inglaterra (Genus), Italia (CIZ), Francia (UNCEIA), Canadá (DELTA) y Estados Unidos (EMTRAM); por citar algunos, se viene aplicando esta tecnología en forma comercial por las compañías referidas entre paréntesis (3). En Colombia, se destacan empresas como CGR, embriones del Sinú, Central Genética Contadora (CGC) y Brahmancol quienes han reportado un creciente aumento de está biotecnología reproductiva en nuestro medio, además se producen aproximadamente 60.000 embriones al año, pero si contamos que hoy tenemos una población bovina de 23.000.000 millones de cabezas, el porcentaje de embriones resulta muy pequeño. Al calcular que se están realizando más o menos entre 400.000 y 500.000 inseminaciones en el país, la cifra también es muy baja. Posiblemente tengamos que efectuar entre 7% y 8% de inseminaciones en nuestra vacada para llegar a más de 1.000.000 de vacas inseminadas, para así hacer un mejoramiento genético grande y ojala producir cerca de 150.000 embriones anuales, a fin de que suceda un mejoramiento genético acelerado (39).

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Calidad del oocito y origen folicular En la PIVE bovina, aproximadamente entre el 60-80% de los oocitos puestos a madurar no llegan al estado de blastocisto, lo cual está relacionado con la calidad intrínseca del oocito puesto a madurar (40). El origen folicular del oocito tiene una influencia significativa sobre su potencial desarrollo debido a que el ambiente folicular provee unas condiciones adecuadas para que el oocito realice su proceso de capacitación para ser fertilizado y progresar adecuadamente en el proceso de desarrollo temprano (6). En las condiciones in vitro, la adición de una variedad de gonadotropinas, esteroides y factores de crecimiento han reportado un ligero aumento en las tasas de blastocistos, aunque no alcanzan las tasas de desarrollo de oocitos madurados in vivo (41). La competencia del oocito definida como la capacidad de generar desarrollo embrionario hasta el estado de blastocisto, ha sido positivamente asociada con el tamaño folicular (42,43), el estado de la onda folicular (44,45) y la forma de maduración in vivo vs in vitro (46,47). Una posible hipótesis para explicar el bajo desarrollo de los oocitos obtenidos de ovarios de hembras sacrificadas es que estos son obtenidos de folículos pequeños o medianos (2-8mm de diámetro). En caso tal de que uno de estos folículos fuese seleccionado como dominante le faltarían varios días para la posible ovulación. En contraste, el folículo ovulatorio posee un diámetro de 1520 mm y el oocito está maduro en estado de metafase II. Al someter al proceso de maduración in vitro a oocitos aspirados de ovarios de hembras sacrificadas, estos son capaces de generar altas tasas de maduración nuclear pero no poseen adecuadas tasas de maduración citoplasmática. Además, los oocitos madurados in vivo poseen un positivo estimulo de LH lo cual genera un ambiente folicular propicio para realizar el proceso de maduración (6). Aunque, es posible que la manipulación del crecimiento folicular afecte el desarrollo competente de los oocitos inmaduros después de haberlos removido del folículo. Un periodo de “coasting” entre la estimulación hormonal y la recuperación de los ovarios en el faenado (48) como el tiempo de intervalo entre la recuperación del ovario y la aspiración del oocito (28) afecta significativamente el subsecuente desarrollo del oocito. En un estudio, los mejores resultados fueron obtenidos cuando el animal recibió 6 inyecciones de FSH con un periodo “coasting” de 48h y con administración de LH 6h antes de la punción folicular, bajo este modelo el 80% de los oocitos recuperados llegaron al estado de blastocisto realizando todo el proceso bajo condiciones in vitro (16), estás condiciones experimentales inducen una atresia folicular temprana la cual está relacionada con un aumento de la competencia del oocito (16,49). Relación entre atresia folicular temprana y competencia del oocito La competencia de un oocito para generar blastocistos dentro de un sistema de producción in vitro no solo depende de factores intrínsecos, sino también de los procedimientos durante la PIVE (46). Hay resultados que muestran que el desarrollo competente de los oocitos bovinos quizá puede ser potenciado cuando los ovarios son incubados a condiciones estables de temperatura por

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unas pocas horas antes de la aspiración folicular, cuando los ovarios son almacenados a 30°C por un periodo de 4 h después de haber sido recuperados en el faenado se ha reportado una significativa mejora en el desarrollo competente de los oocitos (28). Los autores han sugerido que ese periodo de 4 h crea un microambiente folicular específico que induce a una atresia folicular temprana que afecta positivamente al oocito. Al parecer, existe una positiva relación entre la atresia folicular temprana y la competencia del oocito (50-52) .Se ha encontrado que una significativa proporción de CCOs recuperados de folículos subordinados durante la fase de regresión temprana expandieron y una gran proporción de estos oocitos muestran evidencias de maduración nuclear con respecto a los recuperados durante la fase de crecimiento; además, los oocitos obtenidos de folículos subordinados con regresión temprana (día 5 de la onda folicular) poseen una mayor capacidad para generar embriones en un sistema in vitro que los obtenidos a partir de folículos en crecimiento (día 2) y de folículos subordinados en fase de regresión tardía (día 7), lo que permite inferir que hay una relación positiva entre folículos subordinados tempranos y competencia del oocito (51). Se ha sugerido que los oocitos que han finalizado su fase de crecimiento y síntesis de ARN deben padecer un periodo de premaduración antes de la maduración final. La premaduración ocurre normalmente durante la fase preovulatoria del desarrollo folicular in vivo. Sin embargo, en pequeños folículos los cambios de la premaduración pueden ser inducidos por la atresia,45 cambios similares al interior del folículo ocurren durante el desarrollo preovulatorio y la fase de atresia (53,54). Basados en estudios más recientes, en donde se estudia el efecto de la atresia folicular sobre el desarrollo competente de los oocitos usando un sistema de cultivo de microgota individual se llega a la misma conclusión, la atresia folicular temprana tiende a mejorar la competencia del oocito, pero además también se concluye que la tendencia a mejorar la competencia quizá varié de acuerdo al tamaño del folículo y al grado de expansión del cúmulos (52). El CCOs es la última estructura afectada por la apoptosis durante la atresia folicular (15). Quizá los oocitos inmaduros de dichos folículos estén en estado de apoptosis temprana antes de la fragmentación del DNA; sin embargo, no se conoce como la apoptosis temprana puede afectar la capacidad de desarrollo del oocito, pero se ha encontrado que muchos oocitos de CCOs inmaduros con características de apoptosis temprana poseen muy buena competencia para generar un adecuado desarrollo embrionario (9). Lo cual, concuerda con los reportes que sugieren que un bajo nivel de atresia folicular tiende a mejorar la competencia de los oocitos in vitro (16,52).

Marcadores moleculares para predecir la competencia del oocito El entendimiento de los factores que regulan la foliculogenésis aumenta y la relación entre el oocito y las células somáticas que lo circundan es aún más compleja y representa un factor determinante para el desarrollo competente. Se ha establecido que la comunicación entre las células del cúmulo y el oocito es

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un proceso esencial para la adquisición de la competencia (55). El estudio de la expresión génica folicular, incluyendo a las células del cúmulos y al oocito, quizá contribuya a mejorar el entendimiento de procesos como la maduración, la fertilización y el desarrollo embrionario temprano (40). Durante la fase de crecimiento folicular, el oocito activamente transcribe y almacena ARNm hasta llegar a su máximo crecimiento que se da cuando el folículo posee aproximadamente 15-20 mm de diámetro en el caso de los bovinos.56 Después de ese momento la transcripción cesa y los ARNm y proteínas del oocito deben de dirigir los procesos de maduración, fertilización y desarrollo embrionario temprano hasta la activación del genoma embrionario bovino. El almacenamiento del ARNm durante la fase de crecimiento folicular y el almacenamiento de los trascriptos a partir de la extensión de la cola poli (A) del extremo 3’ ha emergido como un importante elemento de regulación para determinar la estabilidad de las moléculas (18). Se ha mostrado que muchos transcriptos que poseen un bajo patrón de poliadenilación que conlleva a una corta cola poli (A) en el extremo 3´ está correlacionado con bajo desarrollo competente (56). Después de que se da el quiebre de la vesícula germinal durante el proceso de maduración, el control de la expresión génica queda bajo la regulación postranscripcional, la cual involucra degradación diferencial, almacenamiento y estabilización de algunos transcriptos y su reclutamiento en un momento determinado por la maquinaria basal de traducción (57). Diferentes estudios han evaluado el perfil de expresión génica del oocito y el papel de ciertos genes en la competencia. Se han propuesto diversos genes candidatos para ser usados como marcadores moleculares de competencia (18,27). Entre ellos se encuentran genes expresados por las células del cúmulo como folistatina, activina, EGFR, catepsina B, catepsina S, y catepsina Z (18,19,26) y genes expresados por el oocito como MATER, OCT-4, DPPA3 o STELLA (22,24). Los genes OCT-4, MATER y folistatina y desarrollo competente de oocitos El factor de transcripción OCT-4 es expresado en células con alto potencial de diferenciación cono las células germinales primordiales (PGC), esperamtógonias no diferenciadas, durante el desarrollo embrionario se expresa en blastómeros y en la masa celular interna (ICM) y en células madres embrionarias derivadas de la ICM (58). OCT-4 también es expresado en oogonías, en ovarios de adultos y en oocitos primordiales. Cuando inicia la foliculogenésis, es un regulador corriente abajo, cuando los folículos son reclutados para comenzar el crecimiento, OCT-4 es re-expresado y se mantiene hasta la reanudación de la meiosis, hasta que el oocito llega a MII (59). La expresión de OCT-4 en ovarios de hembras adultas, quizá indica que los folículos en cada estado del crecimiento folicular entran a una vía que permite la adquisición de un total desarrollo competente precedido al estado de maduración; en contraste los oocitos que no expresan OCT-4 pueden ser eliminados durante la foliculogenésis. Aunque la presencia de OCT-4 probablemente no es suficiente para el establecimiento del desarrollo competente, igual que otros factores con acción corriente arriba o corriente

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abajo contribuya a una vía que permita la total adquisición del desarrollo competente (58). El gen MATER es conocido por tener un efecto maternal y su transcripto es almacenado durante la oogenésis (60-62). El producto de este gen ha sido inicialmente identificado en ratones, el cual muestra un papel crucial en las primeras divisiones del desarrollo embrionario, antes de la activación del genoma (63). En bovinos, se ha observado una disminución de los transcriptos de MATER durante la maduración (64) pero no se logrado determinar en donde la variación en la expresión de este gen en oocitos bovinos inmaduros está asociado con desarrollo competente (32). Pennetier et al 2006 demostraron que el transcripto de MATER y su proteína son específicamente expresados en oocitos de folículos primarios en bovinos, la proteína es almacenada en el citoplasma de oocitos en crecimiento y persiste durante la maduración, la fertilización y el desarrollo embrionario, la ausencia en la expresión de MATER en oocitos hace que se bloquee el desarrollo embrionario(64).

Estudios previos han establecido una relación positiva entre la competencia del oocito y la abundancia relativa del gen folistatina (26). La Folistatina es clasifica como una proteína de unión de alta afinidad a la activina (65). La Folistatina puede también unirse y regular la actividad de miembros de la superfamilia de TGF-β (66-68). La unión de la folistatina bloquea la unión de los factores a los receptores I y II de treonina quinasa, este bloquea la unión del ligando Smad al receptor, bloqueando la ruta de señalización involucrada en muerte celular (69). La asociación de Folistatina con calidad del oocito proviene de dos experimentos claves en donde se demuestra que está permite potenciar la vía de señalización mediada por TGF-β (70). La expresión de la Folistatina está involucrada en una adecuadas divisiones celulares después del a fertilización hasta la activación del genoma embrionario (19,26). Hipótesis

HO: La inducción de una atresia temprana en folículos de ovarios obtenidos a partir de hembras sacrificadas no induce la competencia del oocito, lo cual no se ve reflejado en un aumento en la cantidad y calidad de embriones producidos in vitro, ni en un patrón de expresión génica que se relacione con alta cantidad de blastocistos producidos HI: La inducción de una atresia temprana en folículos de ovarios obtenidos a partir de hembras sacrificadas induce la competencia del oocito, lo cual se ve reflejado en un aumento en la cantidad y calidad de embriones producidos in vitro y en un patrón de expresión génica que se relaciona con alta cantidad de blastocistos producidos

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Objetivos

General

Evaluar el efecto de la inducción de una atresía folicular temprana sobre la competencia de oocitos bovinos (Bos indicus) y las tasas de desarrollo embrionario in vitro. (Nivel de cumplimiento 40%)

Específicos

1. Evaluar si la realización de la aspiración folicular después de haber dejado los ovarios por un periodo de 4h a 30 ° C estimula un aumento en la competencia de oocitos de hembras Bos indicus. (Nivel de cumplimiento 40%).

2. Evaluar el patrón de expresión de los genes OCT-4 y MATER en oocitos de hembras Bos indicus después de haber inducido una atresia folicular temprana y correlacionarlos con la cantidad y calidad de los embriones producidos in vitro. (Nivel de cumplimiento 50%).

3. Evaluar el patrón de expresión del gen folistatina, en células de la granulosa después de haber inducido una atresia folicular temprana y correlacionarlo con la cantidad y calidad de los embriones producidos in vitro. (Nivel de cumplimiento 40%)

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Metodología

Tipo de estudio

Se está realizando un estudio experimental de carácter analítico en donde se evaluará el tiempo de almacenamiento de los ovarios, con el propósito de inducir competencia en el oocito, sobre la proporción de blastocistos producidos in vitro y la expresión de los genes Oct-4 (número de acceso en el GenBank DQ126156) y MATER (número de acceso en el GenBank Z86039) en el oocito y el gen folistatina (número de acceso en el GenBank L21716) en células del cúmulo.

Grupo I: Los ovarios se están almacenando a una temperatura de 30 -35 °C por 4 horas, con el propósito de inducir una atresía folicular temprana y posteriormente se procede a la obtención de los CCOs, su clasificación y un subgrupo se toma para los análisis moleculares y otro subgrupo se toma para la producción in vitro de embriones

Grupo II: Una vez llegan los ovarios al laboratorio se procede a la obtención de los CCOs, su clasificación y un subgrupo se está tomando para los análisis moleculares y otro subgrupo para la producción in vitro de embriones.

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Fig 1. Grupo I: se almacenaran los ovarios a 30 °C por un lapso de 4 h previo a la aspiración folicular. Grupo II. Se aspiraran los ovarios inmediatamente llegue al laboratorio 0 h. De cada grupo se obtendrán oocitos para análisis molecular y oocitos para producir embriones in vitro

Recolección de ovarios

Los ovarios bovinos son obtenidos de hembras sacrificadas en la planta de sacrificio Envicarnicos, ubicada en el municipio de Envigado, Antioquia. Los ovarios se depositan en solución salina estéril a 35°C para luego ser transportados (15-20 minutos aproximadamente) hasta el Laboratorio de Biotecnología en Salud de la Universidad CES ubicado en el municipio de Sabaneta. Una vez en el laboratorio, al azar los ovarios son divididos en dos grupos:Grupo I: se almacenaran a 30 °C por un lapso de 4 h previo a la aspiración folicular. Grupo II: Se procesara inmediatamente llegue al laboratorio. Luego con jeringa de 5 ml provista de aguja N° 18G, se procede a la aspiración de los folículos que posean un diámetro entre 3 y 8 milímetros y

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su contenido es recolectado en un tubo de plástico de 50ml colocado en baño maría a 30°C. El aspirado se deja decantar por un periodo de 15 minutos y luego bajo estereomicroscopio se procede a la selección de los complejos cúmulos-oocitos.

Evaluación de la calidad de los oocitos (criterios de inclusión y exclusión) Sólo se toman ovarios de hembras Bos indicus, los CCO’s se clasifican de acuerdo a la cantidad y calidad de capas de células del cumulus y la apariencia de su citoplasma según los parámetros establecidos por Li et al 2009 (9) (VER tabla1). Para el estudio solo se están seleccionando los CCOs grado I y II.

Tabla 1. Criterios de selección de CCOs según los parámetros de Li y colaboradores 2009.

Grado

Calidad

Características

1

Excelente

Cuatro o más capas de células del cúmulo. Citoplasma homogéneo y transparente.

Bueno 2

Capas múltiples de células del cúmulo (entre una y tres) Citoplasma homogéneo con zonas periféricas oscuras.

Regular 3

Desnudados, citoplasma irregular con zonas oscuras

Malo 4

células expandidas, citoplasma irregular con zonas oscuras

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Maduración in-vitro

Una vez obtenidos los CCO’s se lavan tres veces en medio de TL-Hepes suplementado con 10% (v/v) de Suero Fetal Bovino (SFB), 0.2 mM de ácido pirúvico y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina. Para el proceso de maduración se ponen 10 CCOs en gotas de 50 µl de medio de maduración TCM-199 suplementado con 10% de SBF, 0.5 µg/ml de FSH, 0.5 g/ml de LH, 1 µg/ml de 17-β estradiol, 0.25 mM de ácido pirúvico y 50 µg/ml de gentamicina (SigmaAldrich), las gotas son cubiertas con aceite mineral. El medio es equilibrado en la incubadora por dos horas antes de pasar los CCO’s. La maduración se hace por un período de 24 horas a una temperatura de 38.5 °C, en una atmósfera de 5% de CO2 y una humedad relativa del 90%. Fertilización in-vitro

Para la fertilización in-vitro se utiliza semen criopreservado de un toro con fertilidad comprobada. Los CCO’s madurados son lavados tres veces con medio TL-Hepes suplementado con 0.3% de BSA (libre de ácidos grasos), 0.25 mM de ácido pirúvico y 50 µg/ml de gentamicina y puestos en gotas de 40µl de medio de fertilización basado en una solución Tyrode lactato-piruvato (FertTALP) suplementado con 0.6% de BSA (libre de ácidos grasos), 0.2 mM de ácido pirúvico y 50 µg/ml de gentamicina. Después de la transferencia de los CCO’s se adiciona heparina (concentración final, 2 µg/ml) y PHE (2 mM de penicilamina, 1 mM de hipotaurina y 250 mM de epinefrina). Una pajilla de semen congelado es descongelada en baño maría a 35°C por 30 segundos y el semen preparado por gradiente de Percoll. A cada gota de medio se le adiciona 2µl de suspensión espermática (concentración final: 1 x 106 cel/ml) y se deja por un periodo de 18 horas en las mismas condiciones de incubación utilizadas en la maduración.

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Cultivo in-vitro de los presuntos cigotos

Pasadas las 18 horas de fertilización, los presuntos cigotos son lavados tres veces en medio TL-Hepes suplementado con 0.3% (W/V) de BSA (libre de ácidos grasos) y 0.2 mM de ácido pirúvico. Durante los lavados los cigotos son desnudados de sus células del cúmulos mediante repetidos “flushing” usando una pipeta de punta fina para luego ser llevados al medio de cultivo. El cultivo de los embriones está siendo llevado en dos medios de desarrollo, CR1aa y SOF ambos suplementados con

0.3% de BSA (libre de ácidos grasos), 0.2

mM de ácido pirúvico, 10% de SFB, 100 IU/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Los presuntos cigotos son transferidos en grupos de 25 a gotas de 50 µl de medio de desarrollo cubiertas con aceite mineral y preincubadas por un tiempo mínimo de 2 horas bajo las condiciones de cultivo. La división es evaluada 72 horas post-inseminación y la tasa de morúlas y blastocistos se evalua al día 7 de cultivo, después de 72 horas de cultivo el medio de desarrollo es renovado en un 50%.

Obtención de oocitos y células de la granulosa

Se estandarizó un proceso rápido para la remoción de las células de la granulosa como se describe a continuación: se utiliza un pools mínimo de 80 CCOs a los cuales se les remueve las células de la granulosa con una incubación por 5 min a 37°C con tripsina-EDTA al 2.5% (Irvine Scientific), luego son sometidos a vortex por 3 minutos y finalmente los oocitos son lavados y almacenado en agua DEPC a – 80 °C hasta el momento de la extracción del ARN. De otro lado, las células de la granulosa son centrifugadas a 10.000 x g por 5 min, el pellet es recuperado y almacenado en agua DEPC a – 80 °C hasta el momento de la extracción del ARN.

Aislamiento de ARN y síntesis de cDNA El ARN total está siendo aislado con el método de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones de las casa manufacturera. La integridad

16

del ARN es analizada a través de una electroforesis en gel de agarosa, a una concentración del 2%, 100 voltios y 40 min. La cuantificación y pureza del ARN es determinada usando NanoDrop ND-2000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). El ARN total es normalizado a 4 ng y usado para la síntesis del cDNA utilizando el kit SuperScript III Platinum Two Step quantitative real-time polymerase chain reaction (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) siguiendo las instrucciones de la casa manufacturera. Las condiciones para la RT-PCR fueron 25 °C por 10 min, 42 °C por 50 min y 85 °C por 5 min.

El cDNA obtenido se almacena a -80 °C. hasta su

procesamiento.

Diseño de primers

Los primers para detección de la abundancia de transcriptos de OCT-4 (número de acceso en el GenBank DQ126156) y MATER (número de acceso en el GenBank Z86039) en el oocito y el gen FST (número de acceso en el GenBank L21716) en células del cúmulo, se diseñarán usando el software Primer Premier 3 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA). Se comparo en BLAST la secuencia de RNAm para determinar que no haya homología con otras regiones del genoma. Los primers diseñados poseen una longitud de 18 a 22 bases y el producto de amplificación estará entre 150 y 250 bases y la proporción de G/C estará entre 40 y 60%. Se evitaron regiones con repeticiones de nucleótidos o de dinucleótidos. Se evaluó la estabilidad de los primers en el extremo 3’ y se evaluó la posibilidad de formación de estructuras secundarias como dímeros y ganchos. Se eligieron primers que no formen productos secundarios y cuya temperatura de disociación esté entre 58º y 60ºC.

PCR cuantitativa en tiempo real

Se está ajustando la concentración de cDNA

a 0.5 µg/ml para iniciar con

concentraciones iguales para todas las muestras. Para la PCR cuantitativa en

17

tiempo Real se viene usando SYBR® GreenER™ qPCR SuperMixes (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Se medirá la abundancia de transcriptos de los genes OCT-4, MATER y FST en el RNA total extraído de los oocitos y células de la granulosa de ambos grupos. Se está utilizando 5 µl de cDNA para PCR en tiempo Real en una termociclador Rotor-Gene 6000. La concentración de los primers se ajusto a 10 µM. El perfil térmico que se viene realizando para la amplificación es de 95 °C por 15 min para una desnaturalización inicial de la muestra y activación de la Taq polimerasa y 40 ciclos de 94 °C por 15, 60 °C por 20 segundos y 72 °C por 20 segundos. La curva la melting es tomada entre 60-94 °C.

Análisis estadístico

Los valores de expresión se calcularán usando el método de curva estándar relativa, para la cual se incluirán diluciones seriales de cada gen y del gen de referencia GAPDH (número de acceso en el GenBank Z86039), el cual ha sido escogido por ser un gen validado en ensayos de expresión génica en oocitos, células de granulosa y embriones bovinos. Para medir el ciclo en el cual ocurre la amplificación exponencial. Las mediciones se harán con 3 repeticiones biológicas y 3 repeticiones técnicas, cada una con grupos de mínimo 80 oocitos.

Los datos se analizarán por ANOVA utilizando SAS 9.1.3 (SAS Institute inc. Carey, NC) y el software para calcular expresión relativa: (REST). El modelo matemático usado por REST se basa en la eficiencia de la PCR y la desviación entre muestras.

Para los experimentos en donde se evaluará la tasa de blastocistos producidos en cada uno de los grupos de trabajo, se realizaran cuatro repeticiones y se buscará obtener un mínimo de 100 blastocistos por grupo. El análisis estadístico de los datos se realizará por análisis de varianza y las correspondientes pruebas de medias (Duncan), utilizando el paquete estadístico SAS 9.1.3 (SAS Institute inc. Carey, NC)

18

Resultados preliminares

Producción in vitro de embriones Se viene trabajando en la implementación de un sistema de producción in vitro de embriones bovinos con medios preparados completamente en el laboratorio. Para tal fin se diseño un formato de registro (tabla 2) que nos permita realizar un control de los diferentes factores que afectan a la producción in vitro de embriones. Hasta el momento se han realizado 20 ensayos equivalentes a 20 semanas de trabajo en donde se han evaluado los medios, el material, la incubadora, los reactivos, tiempos, entre otras variables. Los mejores resultados se han obtenido utilizando el protocolo descrito en la metodología y utilizando material plástico de poliestireno, dichos resultados se resumen en la tabla 3.

19

Tabla 2. Registro para la toma de datos durante la producción in vitro de embriones

Registro PIVE Objetivo del experimento:

Colección de ovarios

Observaciones:

Fecha Procedencia Hora de llegada al Lab. No. de ovarios

Maduración

Observaciones:

Fecha Hora a la que fueron colocados en el medio No. de oocitos

Fertilización

Observaciones:

Cultivo

Observaciones:

Fecha Hora No. de oocitos Toro

Fecha Hora Grupo

Total

#

#

%

Oocitos Divididos Divididos

0

0

# Blast

% Blast

0

20

Tabla 3. Producción in vitro de embriones con medios preparados en el laboratorio de Biotecnología en Salud. Resultado del experimento con mejores resultados.

Experimento

Oocitos Divididos División

14

blastocistos

blastocistos

(n)

(n)

(%)

(n)

(%)

197

144

73,1

40

20,3

Análisis molecular

La extracción de RNA total se ha realizado con el protocolo que se estandarizo y que se describió anteriormente. Las concentraciones de RNA total en pools de 80 CCOs en todos los ensayos ha estado por encima de 2.000 ng/µl tanto para oocitos como para células del cumulo, cantidad suficiente para proceder a realizar la RT-PCR. Además, el RNA aislado conserva una adecuada integridad como se puede ver en la grafica 2 en donde claramente se distinguen las bandas de RNA ribosomal 28S y 18S. Lo que indica que el método de extracción funciona de manera adecuada.

Grafica 2. Evaluación de la integridad del RNA total a través de un gel de electroforesis al 2%. Claramente se distinguen las bandas correspondientes al RNA ribosomal 28S y 18S tanto en DNA obtenido de oocitos como de células de la granulosa.

21

Se diseñaron dos juegos de primers por cada gen y se realizaron sucesivas PCR en tiempo real con el propósito de observar su comportamiento. Los primers que tuvieron un mejor desempeño y que se van a utilizar en el estudio se muestran en la tabla X. Como gen normalizador para calcular la expresión génica se utilizara la secuencia de primers del gen GAPDH reportado por Perecin et al 2009

Tabla 4. Secuencia de primers que se utilizaran para el análisis de expresión génica por PCR en tiempo real.

Gene

Secuencia de primers (5´- 3´)

Tamaño

Número de

del

acceso

fragmento

GenBank

(pb) OCT-4_F

AGTGAGAGGCAACCTGAAGA

OCT-4_R

ACACTCGGACCACGTCTTTC

MATER_F

GAAGTGTGGCTGCAGTTGAA

MATER_R

ATGCCTCAGCAAATTCATCC

FST_F

AAAACCTACCGCAACGAATG

FST_R

GAGCTGCCTGGACAGAAAAC

GAPDH_F

TGCTGGTGCTGAGTATGTGGT

GAPDH_R

AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT

110

NM_174580.2

130

NM_001007814.2

122

NM_175801

295

XM_865742

Las graficas 3 y 4 muestran la curva de disociación de los genes OCT-4, MATER y FST y el perfil de la cinética de la reacción para cada uno de los genes amplificando tanto células de la granulosa como oocitos. No se observa la presencia de dímeros de primers u otras amplificaciones inespecíficas. Tampoco se observa amplificación del control negativo. Aunque cabe anotar que el nivel de fluorescencia inicial está alto, lo que indica que se puede bajar la concentración de primers. Además, se puede elevar un poco la temperatura de hibridación para obtener unas curvas de disociación más homogéneas. De

22

otro lado, Se observa una adecuada amplificación para todos los genes tanto en células de la granulosa como en oocitos excepto para el gen OCT-4 en células de la granulosa, que no es blanco dentro del estudio.

No. Colour Name 1

Oct-4 oocitos

2

Oct-4 CG

3

Mater oocitos

4

Mater CG

5

folistatina oocitos

6

folistatina cg

7

control negativo

Figura 3. Curvas de disociación para cada uno de los genes (OCT-4, MATER y FST) posterior a una amplificación por PCR en tiempo real en células de la granulosa y oocitos bovinos.

23

Figura 4. Perfil de la cinética de reacción utilizando el fluorocromo SYBR Green.

Conclusiones y perspectivas

Los resultados obtenidos hasta el momento permiten pasar a una nueva fase del estudio que es la obtención de datos para los análisis estadísticos tanto para la producción de embriones in vitro como para los análisis moleculares. Aunque la tasa de producción de embriones corresponde a las obtenidas en otros laboratorios de referencia, se espera que mejoren al renovar alícuotas que presentan envejecimiento. De otro lado, se han obtenido unas adecuadas concentraciones e integridad del RNA total utilizando como método de extracción el Trizol® Los resultados de la PCR muestran un buen diseño de primers, lo que permite avanzar a la siguiente fase del estudio, no sin antes realizar pequeños ajustes como en la concentración de primers. Con estos resultados, se genera un cuerpo de información que permite que el estudio pase de la fase de ensayos preliminares a la obtención real de datos.

24

Cronograma Número

Actividad

Desde

Hasta

Tiempo

1

Revisión base de datos bibliográficos

1

24

Meses

2

Adquisición de materiales y suministros

1

15

Meses

3

Entrenamiento del personal

1

9

Meses

4

Estandarización de las técnicas

3

9

Meses

5

Recolección De datos

10

21

Meses

5

Análisis de los datos y preparación de artículos

12

24

Meses

6

Entrega de informe final

22

24

Meses

Presupuesto global

Rubros

ADMINISTRACION

Contrapartida Financiado Otras Ejecutora COLCIENCIAS (UdeA(CES) Unalmed)

Total

2,000,000

2,000,000

0

4,000,000

0

1,000,000

0

1,000,000

30,000,000 91,500,000

0

121,500,000

0 14,000,000

0

14,000,000

MATERIALES

47,000,000 45,000,000

0

92,000,000

PERSONAL CIENTÍFICO

86,400,000 36,894,720 28,800,000

152,094,720

BIBLIOGRAFIA DESCRIPCION EQUIPOS MANTENIMIENTO

PUBLICACIONES Y PATENTES SERVICIOS TECNICOS VIAJES Totales

1,000,000

1,000,000

0

2,000,000

30,000,000

0

0

30,000,000

3,000,000

3,000,000

0

6,000,000

199,400,000 194394720 28800000 422,594,720

25

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