Molecular characterization of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) isolated from dairy cattle in Rhineland-Palatinate (Germany) by a combination of Mycobacterial Repetitive Unit-Variable-Number Tandem Repeat (MIRU-VNTR) and Multilocus Short Sequence Repeats Analysis (MLSSR) genotyping J. A. Fernández–Silvaa,b*, A. Abdulmawjoodd, Ö. Akinedena, K. Drägerc, W. Klawonnc, M. Bültea a

Institute of Veterinary Food Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Justus Liebig University Giessen, Giessen, Germany. b Escuela de Medicina Veterinaria (Grupo Centauro), Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia. c Tiergesundheit und tierärztliche Umwelthygiene, Abteilung Fachaufsicht und Risikomanagement, Landesuntersuchungsamt Rheinland–Pfalz, Koblenz, Germany. d Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Germany The objectives of this study were the molecular characterization of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) using Mycobacterial Repetitive Unit–Variable Number Tandem Repeat (MIRU–VNTR) and Multilocus Short Sequence Repeats (MLSSR) genotyping methods, the evaluation of both methods in terms of discriminatory ability, the comparison of results with previous studies, and the analysis of Map molecular epidemiology isolated from dairy cattle in Rhineland– Palatinate (Germany). Eleven and six different genotypes were detected by MIRU– VNTR and MLSSR with an index of discrimination (D) of 0.74 (95% CI: 0.66–0.81) and 0.78 (95% CI: 0.76 – 0.80), respectively. The calculation of the allelic diversity (h) for individual MIRU–VNTR loci revealed differences ranging from 0.03 (VNTR–32) to 0.50 (VNTR–292). The allelic diversity (h) for MLSSR loci was 0.03 and 0.75 for locus 8 and for locus 2, respectively. The combination of both methods produced 25 genotypes with an index of discrimination (D) of 0.93 (95% CI: 0.91–0.95). Comparison with previous studies revealed similar epidemiological patterns at the country level, but differences at the continental and international level. Regional molecular epidemiology appeared to be influenced from the management practices and the cattle movements. The results of this study revealed the usefulness of MIRU–VNTR and MLSSR to differentiate Map strains in frame of epidemiological studies at a regional scale, and the high genetic diversity among Map isolated from cattle in Rhineland–Palatinate (Germany). Korrepondenzadresse: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Fachbereich Veterinärmedizin, Justus– Liebig–Universität Giessen. Frankfurter Straße 92, 35392, Giessen, Germany.

Genotyping of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) from cattle feces in an experimental infection model J. A. Fernández-Silvaa,c, A. Abdulmawjoodd, Ö. Akinedena, M. Fischera, M. Bültea a

Institute für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Justus-Liebig-Universität Giessen, Giessen, Germany c Escuela de Medicina Veterinaria (Grupo Centauro), Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia d Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, Germany Accurate identification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) used as challenge strain is a logical condition in frame of the experimental infection studies using models for Johne´s disease. However, the majority of studies until today do not inform about the genotype of the challenge strain used. This article reports the experiences on identification of Map strains in an experiment to improve early diagnosis of paratuberculosis in cattle by using of genotyping methods based on repetitive elements. The method known as Multilocus Short Sequence Repeats (MLSSR) was chosen based on its accuracy and relative less-time consuming procedure to regular genotyping of the strain used along the experiment. The method was successful to confirm the identity of the strain used as inoculum and to identify a foreign strain in feces of an infected calve detected by PCR previous to the first challenge dose. Due to the long time required to obtain results and due to contamination of culture slants, DNA used for PCR was used to genotype the MapDNA responsible for the double infection. Three loci (locus 1, 2 and 8) were amplified to determine repetitive elements (short sequences-SSR) in Map genome. From three loci just one (Locus 1) delivered a satisfactory result in the initial DNA amplification and was sequenced. Results showed the usefulness of strain genotyping before, during, and after experimental inoculation, and that in one case the Map-DNA detected by PCR was not of the challenge strain, but from a field strain. Results of the study demonstrate the need of include accurate typing methods to control the identity of the strain along studies using animal models. Korrepondenzadresse: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Fachbereich Veterinärmedizin, Justus– Liebig–Universität Giessen. Frankfurter Straße 92, 35392, Giessen, Germany.

Nachweis von Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) in minimal-invasiv entnommenen Lymphknoten aus natürlich infizierten Kälbern Fischer1, M., Akineden1, Ö., Abdulmawjood2, A., Doll3, K., Schillinger4, S. und M. Bülte1 1

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Justus-Liebig-Universität Gießen Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 3 Klinik für Wiederkäuer und Schweine, Justus-Liebig-Universität Gießen 4 Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere, Justus-Liebig-Universität Gießen 2

Die Paratuberkulose ist eine chronische, nicht therapierbare Darmentzündung der Wiederkäuer. Die Tiere infizieren sich intrauterin oder in den ersten Lebenswochen bis Monaten durch kontaminiertes Kolostrum bzw. Milch, bis zum Ausbruch der Krankheit vergehen allerdings in der Regel mindestens 18-20 Monate. Bislang ist eine zuverlässige Erkennung von infizierten Tieren nur bei Tieren über 2 Jahren erfolgversprechend. Ziel unseres Projekts „Frühdiagnostik von Infektionen mit MAP bei Rindern“ war daher die Entwicklung von Methoden zur Früherfassung der infizierten Tiere. In der ersten Projektphase wurde im Tierversuch ein Real TimePCR-basiertes Verfahren (Schönenbrücher et al., 2008) zum Nachweis von MAP in Darmlymphknoten, welche minimal-invasiv von den Projektpartnern der AG Doll gewonnen wurden, etabliert. Um die Treffsicherheit zu erhöhen, wurden parallel ein konventionelles nested PCR-System (Bull et al., 2003) sowie die kulturelle Anzüchtung des Erregers eingesetzt. In der hier dargestellten zweiten Projektphase wurden die im Infektionsmodell entwickelten Verfahren an Kälbern aus Feldbetrieben angewendet. Hierbei wurden 32 Kälber aus Paratuberkulose-Problembetrieben sowie 15 Kälber aus Paratuberkulose-unverdächtigen Betrieben einbezogen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Nachweis von MAP in Darmlymphknoten auch bei natürlich infizierten Tieren bereits im Alter von ca. 3 Monaten gelingt. Die Real TimePCR nach Schönenbrücher et al. (2008) kann hierfür empfohlen werden, da sie sich nicht nur als sensitiv, sondern ebenfalls als kosten- und zeitsparend erweist. (Die Arbeiten werden durch das Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz sowie durch die Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung gefördert. Förderkennzeichen: 28-1-32.006-06). Anschrift der Verfasser: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde,

Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen Tel.: 0641-99 38264, Fax: 0641-99 38259 Email: [email protected]

Nachweis von Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Organ-, Umgebungs- und Kotproben in einem hessischen Milchviehbetrieb Fischer1, M., Akineden1, Ö., Abdulmawjood2,A., Lück3, S. und M. Bülte1 1

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Justus-Liebig-Universität Gießen Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 3 Klinik für Wiederkäuer und Schweine, Justus-Liebig-Universität Gießen 2

Die Paratuberkulose ist eine chronische, nicht therapierbare Darmentzündung der Wiederkäuer, die mit großen wirtschaftlichen Verlusten einhergeht. Charakteristisch für diese Tierseuche ist neben der oft geringen Einzeltierprävalenz, dass die Infektion der Tiere ausschließlich in den ersten Lebenswochen bis -monaten oder auch intrauterin erfolgt, bis zum Ausbruch der Erkrankung vergehen allerdings meist mindestens 18-20 Monate. In der hier gezeigten Studie wurden in einem hessischen ParatuberkuloseProblembetrieb verschiedene Matrizes auf das Vorkommen von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), dem Erreger der Paratuberkulose, untersucht. Hierbei wurden Kotproben von verdächtigen Tieren (Abmagerung und/oder Durchfall), Umgebungsproben, Gewebe- und Kolostrumproben einer bekannt kulturpositiven Kuh mit klinischen Symptomen sowie Mekonium ihres Kalbes einbezogen. Der MAP-Nachweis erfolgte molekularbiologisch mit dem MAPsureEasy®-Real Time-PCR-Detektionskit, basierend auf dem Marker F57 mit integrierter Amplifikationskontrolle; parallel erfolgte die kulturelle Anzüchtung des Erregers. Die klinisch kranke Mutterkuh wurde wenige Tage nach der Kalbung euthanasiert. Im Rahmen einer Sektion wurden zahlreiche Lymphknoten- und Gewebeproben entnommen. MAP konnte hierbei in diversen Abschnitten des Dünn- und Dickdarms sowie in den zugehörigen Lymphknoten und im Uterus nachgewiesen werden. Obwohl die Kuh zu diesem Zeitpunkt den Erreger aktiv ausschied, konnten keine MAP-Kontaminationen im Kolostrum gefunden werden. Kotproben ihres Kalbes erwiesen sich in allen 3 Beprobungszeitpunkten als negativ. Obwohl alle adulten Tiere, welche Abmagerung und Durchfall aufwiesen, im Direktnachweis als negativ befundet wurden, konnte MAP in 4 von 7 Umgebungsproben (Melkstand, Laufstand 1 und 2 und Gülle) nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse verdeutlichen nochmals, dass nicht nur die Verhinderung des Kontakts der Kälber zu adulten Tieren bei ParatuberkuloseBekämpfungsmaßnahmen im Vordergrund stehen sollte, sondern weiterhin insbesondere aufgrund der hohen Tenazität des Erregers auch Hygienemaßnahmen im Betrieb beachtet werden müssen. Das eingesetzte molekularbiologische Verfahren erwies sich gegenüber der Kultur als weitaus weniger zeit- und laborintensiv. Die kulturelle Anzüchtung wurde insbesondere durch das betriebsspezifisch überdurchschnittliche hohe Vorkommen von Schimmelpilzen erschwert, welche durch das vorgeschaltete Dekontaminationsprotokoll kaum erfolgreich zu reduzieren waren.

Anschrift der Verfasser: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen Tel.: 0641-99 38264, Fax: 0641-99 38259 Email: [email protected]

Inaktivierung von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Kolostrum bei verlängerter Dauererhitzung Philipp Hammer, Ingrid Clawin-Rädecker, Hans-Georg Walte, Karin Knappstein Max Rubner-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ernährung und Lebensmittel, Institut für Sicherheit und Qualität bei Milch und Fisch, Hermann-Weigmann-Str. 1, 24103 Kiel, E-Mail: [email protected] Solange eine unmittelbare oder mittelbare Beteiligung von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) an der Crohnschen Erkrankung des Menschen nicht auszuschließen ist, muss es das Ziel eines vorbeugenden Verbraucherschutzes sein, den Nahrungsketteneintrag von MAP zu vermindern. Der anerkannt beste Weg dazu ist, die Infektionskrankheit in den Tierbeständen zu bekämpfen. Zur Verhinderung einer Infektion der Kälber auf Betrieben mit Paratuberkuloseproblematik wäre es wünschenswert, ein Verfahren zur Behandlung des für die Gesunderhaltung der Kälber wichtigen Kolostrums zu haben, das einerseits MAP weitgehend inaktiviert, andererseits die Immunglobuline möglichst wenig schädigt. Ein weiterer Aspekt ist, dass Kolostrum auf Grund des hohen Immunglobulingehaltes als besonders gesundes Lebensmittel roh in den Verkehr gebracht wird. Vor dem oben dargelegten Hintergrund ist hier die Lebensmittelsicherheit, unter Erhalt der Immunglobuline, bei Verzehr von Kolostrum sicherzustellen. Hierfür wurden Versuche zur Dauererhitzung im unteren Temperaturbereich (60 °C) mit stark ausgedehnter Heißhaltezeit (bis 120 min) durchgeführt. Das Kolostrum wurde kurz nach der Kalbung von drei Erstkalbinnen und drei Kühen in der 6. bzw. 7. Laktation ermolken. Die Kontamination erfolgte unabhängig voneinander mit einem MAP-Feldstamm, einem Referenzstamm oder mit natürlich mit MAP kontaminiertem Kot. Bei den beiden Teststämmen wurden nach 45 min Heißhaltezeit log 10-Reduktionen von > 2,4 erzielt, bei den mit kontaminiertem Kot beimpften Proben wurden ähnliche Werte erreicht. Für den Feldstamm wurde ein mittlerer D-Wert von 10,8 min +/- 4,4 min ermittelt, für den Referenzstamm 12,8 +/- 4 min. Die Ergebnisse waren abhängig von Ausgangskeimzahl und Heißhaltezeit, dagegen hatten Teststamm, Tier und Laktationsnummer keinen Einfluss. Für die Bestimmung des Immunglobulingehaltes wurden vor der Erhitzung und nach 30, 60 und 120 min entnommene Kolostralmilchproben mittels Reversed PhaseChromatographie in Anlehnung an die Methode nach DIN 10473 untersucht. Hierbei werden durch Säurefällung bei pH 4,6 das Casein und denaturierte, aggregierte Molkenproteine vor der Analyse abgetrennt. Die Immunglobuline wurden als Gesamtgehalt bestimmt, eine Differenzierung war nicht möglich. Eine signifikante Abnahme der säurelöslichen Gehalte der Immunglobuline im Verlauf der Erhitzung konnte nicht beobachtet werden. Lediglich bei einzelnen Kolostralmilchproben war die Löslichkeit der Molkenproteine durch Gelbildung aufgrund des sehr hohen Proteingehaltes stark eingeschränkt, die Proben daher nur bedingt auswertbar.

Haltungsparameter, Labordaten und post mortem Befunde zur Identifizierung von mit MAIC belasteten Betrieben – Ein Ansatz Nina Langkabel, Lieselotte Bräutigam, Anja Ludwig, Stephanie Meyer, Robin Großpietsch und Reinhard Fries

1. Einleitung Mykobakterien des Mykobakterium avium intracellulare-Complex (MAIC) kommen ubiquitär vor, wobei das Schwein eine erhöhte Empfänglichkeit zeigt und der Erreger auch bei gesunden Tieren nachgewiesen werden kann. Der Anschnitt der Lnn. mandibulares ist beim Schwein nach der VO (EG) 854/2004 obligat vorgeschrieben und zielt auf das Erkennen dieses Erregers ab. Allerdings kann es so zu einer Kontamination und Verschleppung kommen. Andererseits birgt die visuelle Untersuchung die Gefahr, MAIC-Infektionen zu übersehen. Alternativ müssten zusätzliche Informationen vorliegen und Daten aufgenommen werden. Ziele dieser Untersuchung waren das sichere Erkennen von Lymphknotenabszessen, die Einführung anderer Untersuchungstechniken, um der Kontaminationsgefahr auszuweichen und die Identifizierung belasteter Betriebe.

2. Der Ansatz p. m. Befunde: Im Zeitraum von 2005 – 2009 wurden die p. m. Befunde aller an einen Schlachtbetrieb angelieferten Schweine von bis zu 296 Betrieben zweier Erzeugergemeinschaften (EZG) aufgenommen, Befunde, die auf MAIC-Verdacht hinwiesen (Veränderungen der Lymphknoten im Kopf- und Darmbereich) wurden über die Lieferanten-Nr. mit dem jeweiligen Betrieb verknüpft. Anschließend wurde jahrgangsweise für jeden Befund eine Rangliste erstellt und für jedes Jahr die Betriebe identifiziert, die am häufigsten bei dem betrachteten Befund auftraten. Es konnten jeweils 20 Betriebe identifiziert werden, wobei 5 Betriebe bei beiden betrachteten Befunden auftraten. Labor: 2007 wurden 44 Lymphknotenproben mit sichtbaren Veränderungen von Betrieben der beiden EZG entnommen und von verändertem und unverändertem Gewebebereichen Untersuchungen mittels PCR durchgeführt. Von den 44 untersuchten Lymphknoten waren 28 positiv auf MAIC. Positive Ergebnisse konnten sowohl in den veränderten als auch in den unveränderten Gewebebereichen nachgewiesen werden. Die Matrix hatte keine störenden Auswertungen insofern, als der Nachweis gelang.

3. Diskussion Auf jeder Stufe der Lebensmittelkette können Einträge zoonotischer Agentien erfolgen, für MAIC dürfte die Primärproduktion die Eintrittspforte darstelllen. Der vorgestellte Ansatz verbindet die tägliche Routineüberwachung mit Labormethoden und bezieht Rückverfolgungselemente mit ein, um Belastungen mit MAIC zu identifizieren. Die PCR kann dabei als Unterstützung der p. m. Untersuchung angewandt werden, da so auch sichtbar unveränderte Proben als positiv identifiziert werden können. Es war möglich, Betriebe zu identifizieren, die häufig mit potentiellen MAIC-Läsionen auffielen. Eine Identifizierung möglicher Eintragsquellen steht noch aus.

Kontakt:

Tierärztin Nina Langkabel Wissenschaftliche Einrichtungen VPH, Institut für Fleischhygiene und –

technologie Brümmerstr. 10 14195 Berlin

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Justus-Liebig-Universität Gießen

„Schnellnachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) mittels optimiertem DNA-Extraktionsverfahren und Real Time-PCR in Milch“

Molitor, A.1, Akineden, Ö.1, Abdulmawjood, A.2, Bülte, M.1

1

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen, Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen 2

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Lebensmittelqualität und – sicherheit, 30173 Hannover

Nach wie vor wird für Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), dem Erreger der Paratuberkulose bei Wiederkäuern, in der Fachliteratur ein kausaler Zusammenhang mit der Ätiologie des beim Menschen vorkommenden Morbus Crohn diskutiert. MAP zeichnet sich durch eine außergewöhnlich hohe Tenazität aus und kann sogar die technologischen Be- und Verarbeitungsschritte in der Molkerei, insbesondere die Wärmebehandlung, überleben. Erschwert wird die kulturelle MAP-Diagnostik aus Milch und Milchprodukten zum einen durch die lange Wachstumsdauer von MAP von mehreren Wochen bis Monaten, zum anderen dadurch, dass der Anteil von MAP, der das Hitzeverfahren überlebt hat, durch Kultivierungsverfahren häufig nicht mehr nachweisbar ist. Für eine schnelle und zuverlässige Diagnostik sind daher molekularbasierte Methoden notwendig. Diese Versuchsreihe diente der Optimierung und Validierung von DNAExtraktionsverfahren zum Nachweis von MAP mittels einer spezifischen und gleichzeitig sensitiven TaqMan®-Real Time-PCR (MAPsureEasy, Firma TransMIT, Gießen), basierend auf dem MAP-spezifischen Marker f57. Hierfür wurde Rohmilch mit vier unterschiedlichen MAP-Referenzstämmen artifiziell kontaminiert. Die DNA-Extraktion erfolgt vergleichend mit zwei unterschiedlichen kommerziellen DNA-Extraktionskits („High Pure PCR Template Preparation Kit“ der

Firma Roche Applied Science, Mannheim; „DNeasy Blood & Tissue Kit“ der Firma Qiagen, Hilden) sowie einem automatisierten System („Maxwell 16® System“ der Firma Promega, Mannheim). Ziel der Versuchsreihe war es, ein Verfahren zur Erfassung von MAP-Zellen in Rohmilch zu finden, das als Screeningmethode eingesetzt werden kann. Da ein mögliches zoonotisches Risiko z.Z. nicht ausgeschlossen werden kann, haben insbesondere Nachweisverfahren, die auf der Ebene der Molkereien für einen großen Probenumfang eingesetzt werden, ein besonders hohes Verwertungspotential. Die Ergebnisse sollen zeigen, ob eine Empfehlung für eines der verwendeten Verfahren ausgesprochen werden kann.

Anschrift der Verfasser: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Frankfurter Str. 92, 35392 Giessen Tel.: 0641-99 38273, Fax: 0641-99 38259 Email: [email protected]

Die Untersuchungen werden durch Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert (Förderkennzeichen: 01KI0754).

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Justus-Liebig-Universität Gießen

Herstellung und Nachweis Zellwand-defekter Zellen (Sphäroblasten) von Mycobacterium smegmatis als Modell für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP)

Nguyen1, K., Akineden1, Ö., Bülte1, M. und S. Arnhold2

Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) ist ein schnellwachsender, nichtpathogener Mikroorganismus der Familie Mycobacteriaceae. Durch die kurze Generationszeit wird M. smegmatis häufig als Surrogat für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP), einem langsamwachsenden pathogenen Mykobakterium, verwendet. Eine Infektion mit MAP kann bei Wiederkäuern eine chronische, nicht therapierbare Darmentzündung (Paratuberkulose) hervorrufen. Seit Mitte des 20. Jahrhunderts wird die Frage, ob MAP an Morbus Crohn beim Menschen - einer ebenfalls chronischen Darmentzündung - mitbeteiligt ist, kontrovers diskutiert. MAP konnte bereits aus Darmgewebe bzw. Blut von Morbus Crohn-Patienten isoliert werden. Verbesserte Isolierungstechniken sowie die Fortentwicklung molekularbiologischer Methoden weisen momentan darauf hin, dass MAP, zumindest bei einer Subpopulation von Morbus Crohn-Patienten, in einem komplexen Zusammenspiel von genetischen, immunologischen, infektiösen und umweltbedingten Faktoren bei der Entstehung beziehungsweise Unterhaltung dieser Erkrankung eine Rolle spielt. Umstritten ist auch die Frage, ob Zellwand-defekte MAP-Zellen an der Ätiologie von Morbus Crohn mitbeteiligt sind. Bisher konnten MAP-Sphäroblasten aus reseziertem Darmgewebe von Morbus Crohn-Patienten isoliert werden. Aufgrund der veränderten Zellwandeigenschaften werden diese möglicherweise nicht vom Immunsystem des Menschen erfasst und können nicht mit den gängigen Nachweismethoden detektiert werden. Dadurch gestaltet sich der Nachweis von Sphäroblasten als schwierig und langwierig und erscheint in manchen Fällen sogar unmöglich. In dem folgenden Beitrag wird die Herstellung Zellwand-defekter M. smegmatisZellen sowie deren Nachweis in vitro vorgestellt. Dabei werden sowohl kulturelle als auch mikroskopische Untersuchungsverfahren (Licht-, Fluoreszenz-, Elektronenmikroskop) gegenübergestellt. Weiterhin wird der Frage nachgegangen,

ob sich Sphäroblasten wieder in Zellwand-intakte Zellen umwandeln lassen. Dazu werden verschiedene Medien für die „Resuszitation“ (Wiederherstellung) bezüglich ihrer Handhabung und Wirksamkeit verglichen. Die Herstellung Zellwand-defekter Formen und deren Nachweis sowie die Wiederherstellung Zellwand-intakter Formen von M. smegmatis dient als Modell für die zukünftigen Untersuchungen von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Hierdurch sollen neue Erkenntnisse bezüglich des zoonotischen Potentials von MAP gewonnen werden.

Anschrift der Verfasser: 1

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde,

Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen Tel.: 0641-99 38264, Fax: 0641-99 38259 Email: [email protected]

2

Institut für Veterinär-Anatomie, -Histologie und –Embryologie

Frankfurter Str. 98, 35392 Gießen

Die Untersuchungen werden durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert (Förderkennzeichen: 01KI1003E).

Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, Dienststelle Oberschleißheim

Nachweis von Mycobacterium spp. in Milch und Milchprodukten

Albert Rampp, U. Messelhäußer, P. Kämpf, S. Hörmansdorfer, B. Schalch, P. Wallner, G. Barth

Das Genus Mycobacterium umfasst mehr als 85 Spezies; allerdings sind nur wenige davon als mögliche durch Lebensmittel übertragbare Pathogene bekannt. Insbesondere zwei Vertreter des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes, M. bovis und M. caprae, werden über infizierte Tiere, im überwiegenden Fall Wiederkäuer, in die Lebensmittelkette eingetragen. Derzeit sind Tuberkulosefälle, bei denen der Nachweis einer lebensmittelbedingten Übertragung erbracht werden kann, in Europa äußerst selten. Allerdings gibt es einige Faktoren, die diese Erreger im Hinblick auf die Lebensmittelkette zu einem sog. „re-emerging-risk“ werden lassen. Ein weiterer möglicherweise durch Lebensmittel übertragbarer Erreger des Genus Mycobacterium, M. avium ssp. paratuberculosis, der u. a. mit Morbus Crohn beim Menschen in Verbindung gebracht wird, ist ebenfalls hauptsächlich mit Wiederkäuern assoziiert. Deshalb zählen unpasteurisierte (und ggf. in Bezug auf M. avium ssp. paratuberculosis auch pasteurisierte) Milch, Rohmilchprodukte sowie rohes oder nicht vollständig durcherhitztes Fleisch zu den wahrscheinlichsten lebensmittelassoziierten Übertragungswegen dieser Zoonoseerreger. Kontrollmaßnahmen für Bakterien des M. tuberculosis-Komplexes sowie auch zum Teil bzgl. M. avium ssp. paratuberculosis beruhen in der Europäischen Union im Wesentlichen auf Untersuchungsverfahren im Rahmen der Schlachttier- und Fleischuntersuchung sowie auf Erhitzungsverfahren von Milch und Milchprodukten. Bei Produkten wie Rohmilchkäse allerdings kann zumindest der Eintrag der Erreger in die Lebensmittel nicht vollumfänglich ausgeschlossen werden. Um im Sinne des vorbeugenden Verbraucherschutzes die Relevanz der genannten Erreger in derartigen Produkten erfassen zu können, wurde am bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit ein kultureller Nachweis in Kombination mit einem real-time-PCR Verfahren zum Nachweis der genannten Zoonoseerreger in Milch- und Milchprodukten etabliert und u. a. an künstlich kontaminierten Milch-, Quark- und Yoghurtproben validiert. Die bisher vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass das Nachweisverfahren für Statuserhebungen bei Milch und unterschiedlichen Milchprodukten auf Einzelhandelsebene im Rahmen der amtlichen Überwachung geeignet ist. Aktuelle Ergebnisse werden vorgestellt.

Anschrift des Verfassers:

Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Veterinärstr. 2 85764 Oberschleißheim [email protected]

Serologische Untersuchung zum Vorkommen von Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis bei Rothirschen in Bayern

A. Schwarz1, U. Ullrich1, E. Stüber1, M. Heurich2 und E. Märtlbauer1

Die Paratuberkulose ist eine durch den Erreger Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) hervorgerufene Erkrankung. Sie äußert sich bei Haus-, Zoound Wildwiederkäuern durch eine tödlich verlaufende, chronisch-granulomatöse Enteritis. Ein Zusammenhang zwischen Morbus Crohn, einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung des Menschen, und dem Erreger der Paratuberkulose wird diskutiert. Somit stellt MAP auch einen potentiellen Zoonoseerreger dar. Da die Paratuberkulose beim Rotwild noch nicht weitreichend erforscht wurde, war das Ziel dieser Untersuchung, einen ersten Überblick über das Vorkommen des Erregers bei Rothirschen (Cervus elaphus) zu erhalten. Das Untersuchungsmaterial stammt einheitlich von Tieren aus dem Nationalpark Bayerischer Wald. Hierfür wurden, im Zeitraum Oktober 2010 bis Januar 2011, von 68 Rothirschen unmittelbar nach dem Erlegen Blutproben entnommen und serologisch untersucht. Für die Bestimmung der Antikörperkonzentration im Serum wurde ein ELISA, der CATTLETYPE® MAP Ab I Paratuberculosis (Labor Diagnostik GmbH Leipzig), eingesetzt. Der hier verwendete Kit gehört zu den vier nach § 17c TierSG zugelassenen, kommerziell erhältlichen ELISA-Tests für MAP in Deutschland. Mittels ELISA konnten bei keiner der untersuchten Serumproben von Rothirschen Antikörper gegen den Erreger der Paratuberkulose nachgewiesen werden. Darmlymphknoten und Kotproben derselben Tiere sollen im Anschluß molekularbiologisch untersucht werden, um das Vorkommen des Erregers der Paratuberkulose bei den vorliegenden Proben noch weiter zu verifizieren.

1)

Lehrstuhl für Lebensmittelsicherheit, Veterinärwissenschaftliches Department der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Ansprechpartnerin: Anna Schwarz Schönleutnerstrasse 8, 85764 Oberschleißheim Tel.: (0049) - 89 - 2180 78539; [email protected]

2)

Sachgebiet für Forschung und Dokumentation, Nationalparkverwaltung Bayerischer Wald, Grafenau

Erfahrungen mit der Impfung gegen Paratuberkulose bei Ziegen mit Gudair® A.Stau1, M.Ganter1 1

Klinik für kleine Klauentiere, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

In einem Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-positiven Milchziegenbetrieb wurde im Rahmen eines Sanierungsversuchs die gesamte Herde mit dem Impfstoff Gudair® geimpft. Um die systemische und lokale Reaktion auf die Impfung zu untersuchen, wurden an einer Gruppe von vierzig Tieren, bestehend aus zwanzig Muttertieren, zehn Zutretern und zehn Lämmern, folgende Parameter untersucht: Körperinnentemperatur, Hautfaltendicke an der Injektionsstelle, Schmerzhaftigkeit der Injektionsstelle, Kraftfutteraufnahme und bei den melkenden Ziegen zusätzlich die Milchleistung. Die durchschnittliche Körpertemperatur aller Tiere stieg an Tag zwei nach der Impfung um 0,5°C ± 0,7°C an wobei diese nur bei den Muttertieren signifikant erhöht war (p < 0,0001). Die mittlere Hautfaltendicke erhöhte sich bei einem Ausgangsswert von 4,3 mm signifikant, bis sie an Tag 8 nach der Impfung ihren höchsten Wert erreichte und 70% der Tiere eine Verdickung von über 25,5 mm aufwiesen. Die Hautfaltendicke blieb bis zum letzten Untersuchungstag signifikant erhöht. Bis zu zehn der vierzig Tiere zeigten in den Tagen 1 bis 15 nach der Impfung Anzeichen von Schmerzhaftigkeit im Injektionsbereich und bei drei der vierzig Tiere traten Hautnekrosen und teilweise starker Wundsekretion auf. In den ersten beiden Tagen nach der Impfung nahmen sechs (Tag 1) bzw. drei Tiere (Tag 2) weniger oder kein Kraftfutter auf. An den folgenden Untersuchungstagen normalisierte sich bei allen untersuchten Tieren die Kraftfutteraufnahme wieder. Die mittlere Milchleistung der melkenden Ziegen zeigte keine signifikante Veränderung während des Versuchszeitraums.

Es zeigt sich, dass insbesondere die lokale Reaktion auf den Impfstoff sehr ausgeprägt ist, da sie mit einer starken und schmerzhaften lokalen Reizung einhergeht. Diese Tatsache ist auch im Hinblick auf mögliche Fehlinjektionen und hieraus resultierende Verletzungen beim Menschen zu beachten.

Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Justus-Liebig-Universität Gießen

Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in Säuglingsanfangsnahrung auf Milchpulverbasis

Weirich, S., Molitor, A., Akineden, Ö., Abdulmawjood, A., Failing, K. und M. Bülte

Seit längerem wird eine Mitbeteiligung von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) an der Entstehung von Morbus Crohn, einer chronischen Darmentzündung beim Menschen, kontrovers diskutiert. Da MAP die Pasteurisierung überleben kann gelten insbesondere Milch und Milchprodukte für den Menschen als zentrale Expositionsquelle. Sie wurden weltweit von zahlreichen Arbeitsgruppen auf vorhandene MAP-Zellen untersucht. Das Vorkommen von vermehrungsfähigen MAP-Zellen in pasteurisierter Milch beträgt weltweit ca. 1-3 %. In im Handel erhältlichem Käse konnte MAP molekularbiologisch und kulturell nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte MAP molekularbiologisch in Säuglingsnahrungsmitteln in der Tschechischen Republik nachgewiesen werden. Bei dieser Versuchsreihe wurde Säuglingsanfangsnahrung auf das Vorkommen von MAP-Zellen untersucht. Dabei wurden die kulturelle Anzucht (gold standard) auf Herrold’s-Egg-Yolk-Medium (HEYM) und ein Phagen-Assay in Kombination mit der Real-Time PCR-Methode zum Nachweis lebender MAP-Zellen eingesetzt. Darüber hinaus wurden sämtliche Proben molekularbiologisch mittels „High Pure PCR Template Preparation Kit“ (Fa. Roche, Deutschland) und Maxwell 16® System (Fa. Promega, Deutschland) untersucht. Zunächst wurden Einmischversuche in Säuglingsanfangsnahrung mit vier verschiedenen MAP-Stämmen durchgeführt. Anschließend wurde das in Deutschland erhältliche Spektrum an Säuglingsanfangsnahrung auf das Vorkommen von MAP-Zellen untersucht. In diesem Poster werden die Ergebnisse der untersuchten Säuglingsanfangsnahrungsmittel aus dem deutschen Handel dargestellt und diskutiert.

Anschrift der Verfasser: Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Professur für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen Tel.: 0641-99 38264, Fax: 0641-99 38259 Email: [email protected]

Die Untersuchungen werden durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert (Förderkennzeichen: 01KI0754). Die Dissertation wird durch ein Graduiertenstipendium der Justus-LiebigUniversität Gießen unterstützt.