Diss. ETHNo. 13409

Inhibitionof tumor induced angiogenesis

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERALINSTITUTEOF TECHNOLOGYZÜRICH for the

degree of

DOCTOROF NATURALSCIENCES

Presentedby AlessandraVitaliti Dipl. Natw. ETH born December 9, 1970 from Bedigliora. TI

aeeepted

on

the recommendationof

Prof. Dr. D. Neri, examiner Prof. Dr. R. Klemenz,co-examiner

Zürich, November 1999

1.

Summary

development of a malignant, life-threatening tumor is a multistep process. One critical step thereby is the conversion of the nonangiogenic to the angiogenic

The

state. The

ingrowth of blood vessels into

a

solid tumor allows the tumor to grow

mm3. In addition, tumor-penetratingvessels are the entry site of metastatic cells and, are therefore, crucially involved in the

beyond the critical size dissemination of

of 1 to 2

malignant

Interfering with this process of neovascularizationshould prevent progression of tumor growth and might even lead to its regression. Two basically different concepts have been developed to abrogate tumor angiogenesis: angiogenesis can be inhibited by antiangiogenic Compounds, or the tumor vasculature could be destroyed by therapeutic agents that are speeifieally targeted to tumor derived endothelial cell surface proteins. For the inhibition of tumor vascular endothelial

tumors.

angiogenesis,

we

growth factor (VEGF),

chose one

the target molecule the of the critical triggers of as

angiogenesis. Recombinant mouse VEGF was produced in E. coli and purified. This protein was used to isolate single chain antibodies (scFv) from a human semi-synthetic phage-

display library. Two out of four

selected scFv showed

the chicken chorioallantoic membrane assay

these antibodies into tumor

an

antiangiogenic

effect in

(CAM). Daily injection of

one

of

bearing mice reduced tumor growth by 50%. In order to improve the inhibitory efficiency I generated scFvs with higher affinity to VEGF by introducing mutations in the CDR3 of the variable light chain domain, which was constant in the original library. Two of these new antibodies showed a stronger antiangiogenic activity in the CAM assay compared to V65. To prolong the half-life of the antibodies in the body, we fused the anti-VEGF scFv to the Fe part of a human IgG and generated a cell line that synthesizes and secretes this protein. One way to neutralize VEGF, which is constantly producedby tumors, is the constant delivery of anti-VEGF scFv in the blood. For this reason it is planned

to

encapsulate the anti-VEGF scFv-Fc producing

capsules

and to

cell line into

semipermeable

implant

them into animals. Alternatively we will generate recombinant adenoviruses, which will direct the in vivo production of anti-VEGF scFv. These strategies will enable us to test the anti-VEGF scFv antibody and derivates thereof more extensively, without having to produce these proteins in

large quantities. A

protein marker, which is exclusively expressed on endothelial cells that line

the tumor

targeting. part of

penetrating blood vessels

my doctoral work focused were

on

subjected to

a

isolated from Lewis

subtractive

is

tumor

vessel

known; thus, a major

identifying such a marker. CD31 positive

metastases as well as from normal lung were

required for specific

only one marker with this property

At present

endothelial cells

is

Lung Carcinoma (LLC) lung

tissue. cDNAs derived from these cells

hybridization procedure

and cDNA clones

overrepresented in the tumor derived endothelial cells were isolated. cDNAs encoding surface proteins were selected using the signal peptide sequence trap method. Different cDNAs sequence and which

were

were

identified which encode

differentially expressed in

a

signal peptide

tumor derived

endothelial

cells. One of the isolated cDNAs encodes H-cadherin. Immunohistochemical analysis of the expression pattern of H-cadherin revealed an overexpression on

endothelial cells in several tumors. Interestingly, H-cadherin was expressed by endothelial cells of LLC lung metastases, but not by those of B16F10 melanoma

lung metastases, demonstrating that different tumors can influence the expression of surface proteins in endothelial cells differently. In some normal organs, the

expression of H-cadherin is restricted to a subset of endothelial cells while it is absentin others. We speculate that this differential expressioncould be exploited for tumor blood vessel targetine.

2. Zusammenfassung Entwicklung eines malignen, lebensbedrohlichen Tumors ist ein mehrstufigerProzess. Einer der kritischen Schritte in der Tumorentwicklungist der Uebergang vom nichtangiogenen zum angiogenen Stadium. Das Einwachsen Die

neuer von

Blutgefässe in den soliden Tumor ermöglicht diesem die kritische Grösse

1-2

mm3

zu

überschreiten. Zusätzlich erlauben die Tumor-infiltrierenden

Gefässe das somit bei

Eindringen von metastasierendenZellen in die Zirkulation und sind der Ausbreitung des malignen Tumors massgeblich beteiligt. Die

Hemmung der

Tumor Neovaskularization sollte das Wachstum der Tumore

hemmen oder gar

zu

Tumorregression führen. Zwei grundsätzlich

verschiedene

Konzepte wurden enwickelt um Tumorangiogenese zu verhindern: Entweder kann die Angiogenese mit antiangiogenenSubstanzen gehemmt werden oder die in den Tumor eindringenden Blutgefässe können mit therapeutischen Substanzen zerstört werden, indem Proteine, die spezifisch nur auf der Oberfläche von Endothelzellenvorhanden sind, als Angriffspunktebenutzt werden. Zur

Hemmung der Tumor Angiogenese haben wir den Vaskulären-Endothel

Wachstums Faktor (VEGF) gewählt. Dieses Protein ist eines der essentiellen Promotoren der Angiogenese. RekombinantesMaus-VEGF wurde in Bakterien

produziert. Dieses Protein wurde dann für die Selektion von EinzelkettenAntikörper (scFv) aus einer menschlichen, halb-synthetischen Phagen-Bibliothek benützt. Zwei

Wirkung

im

vier isolierten

Antikörpern zeigten

antiangiogene Huhn-Chorioallantoischen-Membran-Test (CAM). Tägliche

von

Injektionen einer dieser Antikörper in Tumorwachstum etwa

Tumor

eine

tragende Mäuse reduzierte das

50%. Um diesen Effekt zu verbessern haben wir Antikörper mit höherer Affinität an VEGF hergestellt, indem wir Mutationenin der CDR3 derjenigen Domäne eingeführt haben, welche von der variablen zu

leichten Kette abstammt. Diese

Wirkung in CAM Test als

Antikörper zeigen höhere antiangiogene V65. Um die Halbwertszeitder Antikörper im Blut zu neuen

verlängern, haben wir den anti-VEGF scFv an den Fc-Teil eines menschlichen IgG gekoppelt und einr Zellliniegeneriert, welch dieses Protein synthetisiert und sezerniert. Eine Art, das VEGF zu neutralisieren, welches

ständing von Tumoren

ausgeschüttet wird, ist die konstante Zugabe von anti-VEGF scFv ins Blut. Aus diesem Grund planen wir, semipermeable Kapseln mit anti-VEGF scFv-Fc produzierenden Zellinen zu füllen und in Mäuse zu implantieren. Eine alternative Methode besteht darin, ein rekombinantes Adenovirus hergestellen, welches die in vivo Synthese von anti-VEGF scFv steuert. Diese Strategien sollten es erlauben, den anti-VEGF scFv und deren Derivate extensiv

zu

testen ohne

Mengen dieser Proteine herstellen zu müssen. Für den spezifischen Angriff auf tumorinfiltierende Gefässe ist

dazu

grosse

Protein

zu

es

wichtig, ein

finden, welches nur auf der Oberfläche dieser Gefässe exprimiert ist.

Deshalb habe ich einen Grossteil meiner Dissertation der Identifizierung eines solchen Proteins gewidmet. CD31 positive Endothelzellenwurden von Lewis

Lung Carcinoma (LLC) Lungen-Metastasen sowie von normalem Lungengewebe isoliert. cDNAs, die

von

diesen Zellen stammen, wurden einer subtraktiven

Hybridsierung unterzogen, um Endothelzellen

von

Tumoren

Oberflächenproteine kodieren,

diejenigen cDNAs, zu isolieren die in überexprimiert sind. cDNAs, die für

nur

wurden mit der

Signalpeptidsequenz-Trap

Methode selektioniert. Verschiedene cDNAs wurden

gefunden, welche für Oberflächenmoleküle oder sezernierte Proteine kodieren und in Endothelzellen, die

aus

gereinigt wurden, überexprimiert sind.

Tumoren

Eine

von

diesen

isolierten cDNA codiert für H-Cadherin. ImmunohistochemischeAnalysen des

Expressionsmusters

von

H-Cadherin

zeigte

eine

Ueberexpression

Endothelzellenvon verschiedenen Tumoren. Interessanterweise auf Endothelzellen von LLC

war

auf

H-Cadherin

Lungen-Metastasen, nicht aber auf solchen von B16F10 Melanom-Lungen-Metastasen,exprimiert, was zeigt, dass verschiedene Tumore die Expression von Oberflächenproteinen in Endothelzellen unterschiedlich beeinflussen können. In gewissen normalen Organen beschränkt sich die Expression von H-Cadherin auf einen kleinen Teil der Endothelzellen

während

es

in anderen

Organen überhaupt nich exprimiert ist.. Wir "vermuten,

dass diese unterschiedliche Expression für einen Gefässe ausgenütztwerden könnte.

Angriff auf tumorinfiltierende