Strukturanalyse des binären Toxins C2 aus Clostridium botulinum, von Protease Inhibitor Komplexen und der 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans

INAUGURALDISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von Diplom-Chemiker Christian Schleberger Freiburg im Breisgau März 2007

Tag der Bekanntgabe der Prüfungsergebnisse: 26. April 2007

Dekan: Prof. Dr. A. Bechthold Referent: Prof. Dr. G. E. Schulz Korreferent:Prof. Dr. Th. Friedrich

RESEARCH: if it worked the first time you would simply call it SEARCH

Die überwiegenden Teile dieser Arbeit wurden in folgenden Artikeln veröffentlicht: Matern, U.*, Schleberger, C.*, Jelakovic, S., Weckesser, J. & Schulz, G. E. (2003). Binding structure of elastase inhibitor Scyptolin A. Chem. Biol. 10, 997-1001. (PREVIEW: McDonough, M. A. & Schofield, C. J. (2003). New structural insights into the inhibition of serine proteases by cyclic peptides from bacteria. Chem. Biol. 10, 898-900.) Schleberger, C., Hochmann, H., Barth, H., Aktories, K. & Schulz, G. E. (2006). Structure and action of the binary C2 toxin from Clostridium botulinum. J. Mol. Biol. 364, 705-715. Kraft, M.*, Schleberger, C.*, Weckesser, J. & Schulz, G. E. (2006). Binding structure of the leucine aminopeptidase inhibitor Microginin FR1. FEBS Lett. 580, 6943-6947. Schleberger, C.*, Sachelaru, P.*, Brandsch, R. & Schulz, G. E. (2007). Structure and action of a C-C bond cleaving α/β-hydrolase involved in nicotine degradation. J. Mol. Biol. 367, 409418. *

Der Beitrag dieser Autoren war gleichwertig.

Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Protein Data Bank (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, www.rcsb.org/pdb) unter folgenden Eintragungen hinterlegt: 1OKX

Elastase : Scyptolin-A Komplex

2J3V

C2-I(K20E)

2J3X

C2-I(K20E-S361R)

2J3Z

C2-I(Q77R)

2J42

C2-II

2J9A

blLAP : Microginin-FR1 Komplex

2JBW

DHPON-Hydrolase

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung............................................................................................................................... 1 1.1 C2 aus Clostridium botulinum.........................................................................................1 1.1.1 Bakterielle Toxine................................................................................................... 1 1.1.1 Clostridium botulinum und das C2-Toxin............................................................... 3 1.2 Peptidinhibitoren aus Cyanobakterien.............................................................................4 1.2.1 Cyanobakterien........................................................................................................ 4 1.2.2 Sekundärmetabolite aus Cyanobakterien.................................................................4 1.3 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans........... 6 1.3.1 Abbau von Nikotin durch Arthrobacter nicotinovorans......................................... 6 1.3.2 Charakterisierung der 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase.....................8 1.4 Ziele der Arbeit............................................................................................................... 9 2 Materialien...........................................................................................................................11 2.1 Geräte............................................................................................................................ 11 2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits.....................................................................................12 2.3 Nährmedien, Puffer und Lösungen............................................................................... 13 2.4 Organismen und Plasmide.............................................................................................16 3 Methoden............................................................................................................................. 17 3.1 Gentechnische Methoden.............................................................................................. 17 3.1.1 Transformation und Stammkulturen......................................................................17 3.1.2 Plasmidpräparation................................................................................................ 18 3.1.3 Primer-Entwurf...................................................................................................... 18 3.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................ 18 3.1.5 QuikChange™ Mutagenese...................................................................................19 3.1.6 DNA-Sequenzierung............................................................................................. 21 3.2 Proteinpräparation......................................................................................................... 21 3.2.1 Expression und Reinigung von C2-I..................................................................... 21 3.2.2 Expression und Reinigung von C2-II.................................................................... 23 3.2.3 Probenvorbereitung von Elastase.......................................................................... 26 3.2.4 Isolation und Reinigung von bovine lens LAP (blLAP)........................................26 3.2.5 Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase.............................................. 27 3.3 Proteincharakterisierung................................................................................................27 3.3.1 Konzentrationsbestimmung................................................................................... 27 3.3.2 Diskontinuierliche-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese..................................28 3.3.3 Molekularmassenbestimmung durch Massenspektroskopie..................................29 3.3.4 Bestimmung der enzymatischen Aktivität von C2-I............................................. 29 3.4 Proteinkristallographie.................................................................................................. 29 3.4.1 Kristallgitter und Kristallsymmetrie...................................................................... 29 3.4.2 Lösungsmittelgehalt von Proteinkristallen............................................................ 30 3.4.3 Kristallisation von Proteinen................................................................................. 31 3.4.4 Kristallmontage..................................................................................................... 33 3.5 Röntgenstrukturanalyse................................................................................................. 34 3.5.1 Physikalische Grundlagen der Röntgenstreuung................................................... 34 3.5.2 Reziprokes Gitter und Ewaldkonstruktion............................................................ 36 3.5.3 Temperaturfaktoren............................................................................................... 39 3.5.4 Patterson-Funktion.................................................................................................40 3.5.5 Datensammlung..................................................................................................... 41 3.5.6 Prozessierung, Skalierung und Reduktion der Datensammlung............................42 I

3.5.7 Phasenbestimmung durch isomorphen Ersatz....................................................... 43 3.5.8 Phasenbestimmung durch anomale Streuung........................................................ 48 3.5.9 Phasenbestimmung durch molekularen Ersatz...................................................... 54 3.5.10 Nicht-kristallographische Symmetrie.................................................................. 55 3.5.11 Dichtemodifikation.............................................................................................. 56 3.5.12 Modellbau und Elektronendichtekarten...............................................................59 3.5.13 Verfeinerung des Modells................................................................................... 61 3.6 Proteinstrukturen........................................................................................................... 67 3.6.1 Validierung von Proteinstrukturen........................................................................ 67 3.6.2 Darstellung und Analyse von Proteinstrukturen....................................................68 3.6.3 Strukturvergleiche................................................................................................. 69 4 Ergebnisse und Diskussion................................................................................................. 70 4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum........................70 4.1.1 Expression und Reinigung der enzymatischen Komponente C2-I........................ 70 4.1.2 Planung von Oberflächenmutanten zwecks Verbesserung der Kristallisation...... 70 4.1.3 Kristallisation von C2-I......................................................................................... 72 4.1.4 Datensammlung..................................................................................................... 73 4.1.5 Strukturlösung von C2-I(K20E)-TaBr...................................................................76 4.1.6 Strukturlösung von C2-I(Q77R)............................................................................ 77 4.1.7 Qualität der Modelle von C2-I...............................................................................78 4.1.8 Strukturbeschreibung.............................................................................................79 4.1.9 Vergleich mit bekannten ADP-Ribosyltransferasen..............................................83 4.1.10 Aktivitätsmutante C2-I(K20E-S361R) und Enzymaktivität................................84 4.1.11 Expression und Reinigung der Transportkomponente C2-II...............................86 4.1.12 Kristallisation von C2-II...................................................................................... 87 4.1.13 Datensammlung................................................................................................... 88 4.1.14 Strukturlösung von C2-II.....................................................................................89 4.1.15 Qualität des Modells von C2-II........................................................................... 89 4.1.16 Strukturbeschreibung der Transportkomponente C2-II.......................................90 4.1.17 Vergleich mit Transportkomponenten anderer Toxine........................................90 4.1.18 Modell der C2-IIa pre-Pore und C2-I Translokation...........................................92 4.2 Ergebnisse und Diskussion zum Elastase : Scyptolin-A-Komplex...............................94 4.2.1 Probenvorbereitung der Elastase........................................................................... 94 4.2.2 Kristallisation von Elastase : Scyptolin-A-Komplexen.........................................94 4.2.3 Datensammlung..................................................................................................... 95 4.2.4 Strukturlösung des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes.........................................96 4.2.5 Qualität des Modells.............................................................................................. 96 4.2.6 Struktur des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes................................................... 97 4.2.7 Vergleich mit anderen bekannten Elastase-Inhibitor-Strukturen.......................... 99 4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex.........................101 4.3.1 Expression und Reinigung der blLAP................................................................. 101 4.3.2 Kristallisation von blLAP : Microginin-FR1-Komplexen...................................102 4.3.3 Datensammlung .................................................................................................. 103 4.3.4 Strukturaufklärung des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes............................ 103 4.3.5 Qualität des Modells............................................................................................ 104 4.3.6 Struktur des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes............................................. 104 4.3.7 Vergleich mit anderen bekannten blLAP-Inhibitoren......................................... 107 4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase................................................... 110 4.4.1 Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase............................................ 110 II

4.4.2 Kristallisation der DHPON-Hydrolase................................................................ 110 4.4.3 Datensammlung................................................................................................... 112 4.4.4 Strukturlösung der DHPON-Hydrolase...............................................................113 4.4.5 Qualität des Modells der DHPON-Hydrolase..................................................... 115 4.4.6 Strukturbeschreibung...........................................................................................116 4.4.7 Aktives Zentrum.................................................................................................. 119 4.4.8 Vergleich mit anderen bekannten Hydrolasen.....................................................120 4.4.9 Reaktionsgeometrie und Mechanismus der DHPON-Hydrolase........................ 122 5 Zusammenfassung und Ausblick..................................................................................... 126 5.1 C2 aus Clostridium botulinum.....................................................................................126 5.2 Die Proteaseinhibitoren Scyptolin-A und Microginin-FR1........................................ 127 5.3 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans....... 128 6 Literatur.............................................................................................................................130 7 Anhang............................................................................................................................... 141 7.1 Eichgraden Gelpermeationschromatographie............................................................. 141 7.1.1 HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade (alt)..................................................... 141 7.1.2 HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade (neu)................................................... 141 7.2 Temperaturfaktoren .................................................................................................... 142 7.2.1 Temperaturfaktoren C2-I(K20E)......................................................................... 142 7.2.2 Temperaturfaktoren C2-I(Q77R).........................................................................142 7.2.3 Temperaturfaktoren DHPON-Hydrolase.............................................................143 7.3 Cα-Distanzen............................................................................................................... 144 7.3.1 Cα-Distanzen C2-I(K20E–Q77R)....................................................................... 144 7.3.2 Cα-Distanzen DHPONH Dimer: A/C und B/D...................................................144 7.4 Selfrotation.................................................................................................................. 145 7.4.1 Selfrotation C2-I(Q77R)......................................................................................145 7.4.2 Selfrotation DHPON-Hydrolase..........................................................................145 8 Danksagung....................................................................................................................... 146

III

IV

Abkürzungsverzeichnis Ax

Absorption bei einer Wellenlänge von λ = x nm

ACE

angiotensin-converting enzyme

Ahda

(2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-decan-säure

Ahp

3-Amino-6-hydroxy-2-piperidon

ART

ADP-Ribosyl-Transferase

blLAP

bovine lens Leucin-Aminopetidase

B-Faktor

kristallographischer Temperaturfaktor (Versetzungsfaktor)

C2-I

enzymatisch aktive Komponente des Toxins C2

C2-II

ungeschnittene Variante der Transportkomponente des Toxins C2

C2-IIa

aktivierte Variante der Transportkomponente des Toxins C2

C2-II20

20 kDa schwere N-terminale Domäne von C2-II

D1'

erste Domäne von C2-IIa bzw. PA63

D2, D3, D4

zweite, dritte, vierte Domäne von C2-IIa bzw. PA63

ddH2O

doppelt destilliertes Wasser

DHP

2,6-Dihydroxy-pyridin

DHPON

2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin

DHPON-H

2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin Hydrolase

GABA

γ-Aminobuttersäure (γ-aminobutyric acid)

GPC

Gelpermeationschromatographie

GST

Glutathion-S-Transferase

IEC

Ionenaustausch-Chromatographie (ion exchange chromatography)

KDH

Keton Dehydrogenase

LLG

log likelihood gain

MAB

γ-N-methyl-aminobutyrat

β-ME

β-Mercaptoethanol

MAD

multiple anomale Streuung (multiple anomalous diffraction)

MIR

Multipler isomopher Ersatz (multiple isomorphous replacement)

MR

Molekularer Ersatz (molecular replacement)

NCS

nicht-kristallographische Symmetrie

NiNTA

mit Ni2+-Ionen besetzte, an eine Matrix gebundene Nitrilotriessigsäure

OD600

Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm

PA

Transportkomponente des Anthrax Toxins (protective antigen)

PA63

63 kDa schwere aktivierte (geschnittene) Variante des PA

PEG-X

Polyethylenglykol mit einer mittleren Molekularmasse von X g/mol

Rcryst

kristallographischer R-Faktor

Rfree

freier kristallographischer R-Faktor

Riso

R-Faktor für isomorphe Differenzen

Rmeas

R-Faktor für gewichtete symmetrieverwandte Reflexintensitäten

V

Rsym

R-Faktor für symmetrieverwandte Reflexintensitäten

SAD

einfache anomale Streuung (single anomalous diffraction)

SeMet

L-Selenomethionin

SIR

einfacher isomorpher Ersatz (single isomorphous replacement)

TaBr

[Ta6Br12]2+-Cluster

TCEP

Tri-(2-carboxyethyl)-phosphin

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

VIP

vegetatives insektizidales Protein (vegetative insecticidal protein)

VIP1

enzymatisch aktive Komponente von VIP

VIP2

Transportkomponente von VIP

WT

Wildtyp

VI

Glossar alignment

Ausrichtung, im Speziellen von Aminosäuresequenzen

barrel

Fass-Struktur

batch

in Schüben oder größeren Bündeln

beamline

Messplatz am Synchrotron

bulk solvent

ungeordnetes Solvens im Kristall

constraints

Abweichungen vom Sollwert werden nicht zugelassen

cryo loop

kleine Schleife aus Kunststofffaser zur Kristallmontage

cryo-Schutz

Glasbildner für wässrige Medien bei tiefen Temperaturen

docking

Ausbildung eines Komplexes, auch Anpassung einer Komplexstruktur

downstream

in 3'-Richtung der DNA

figure of merit

Gütekriterium berechneter Phasen

frame

Diffraktionsaufnahme

grid

Gitter, Raster

hanging (sitting) drop

Kristallisationsmethode mit hängendem (sitzendem) Tropfen

high oder low energy remote

bei MAD: Wellenlänge, die in Bezug auf die peak-Wellenlänge zu höherer oder niedrigerer Energie verschoben ist

image plate

Bildplatte (Detektortyp für Röntgenstrahlung in der Proteinkristallographie)

inflection point

Wendepunkt einer Kurve

kit

Zusammenstellung von Lösungen und Reagenzien

linker

Verbindungsglied zwischen zwei Einheiten

loop

Schleife, Bereich ohne Sekundärstruktur

maximum likelihood

statistische Methode der Wahrscheinlichkeitsrechnung

model bias

Einfluss eines vorgegebenen Modells

peak

Maximum einer Kurve

pellet

fester Bestandteil nach einer Zentrifugation

phasing power

Beitrag eines Schweratomderivats zur Phasierung

primer

Oligonukleotid für die PCR

restraints

Abweichungen vom Sollwert werden eingeschränkt zugelassen

rigid body

starrer Körper

scan

Reihenmessung bei der ein Parameter kontinuierlich geändert wird

screen

Reihentest

simulated annealing

Molekulardynamik mit erhöhten Anfangsgeschwindigkeiten der Atome

solvent flattening oder flipping

Methoden des Solvensglättens einer Elektronendichtekarte

sparse matrix

Matrix mit unregelmäßigen besetzten Netzpunkten

tag

Molekülmarkierung, die spezifisch an eine Matrix binden kann

VII

VIII

Symbole und mathematische Zeichen a ,  b ,c ,  ,  ,  *

*

*

*

Elementarzellparameter im realen Raum *

a ,  b ,c ,  ,  , 

*

Elementarzellparameter im reziproken Raum

hkl 

Phase des Strukturfaktors F  hkl 

Å

Ångström (10-10 m = 0.1 nm)

d

Netzebenenabstand

E

normierte Strukturfaktoramplitude

E

normierter komplexer Strukturfaktor

f F

Atomformfaktor

, F

*

F calc , F obs

komplexer Strukturfaktor (konjugiert komplexer Strukturfaktor) aus dem Modell berechnete bzw. gemessene Strukturfaktoramplituden

F P , F H , F PH  F P , F H , F PH  Strukturfaktor (-amplitude) von Protein, Schweratomderivat bzw. Schweratom g

Erdbeschleunigung

hkl hkl 

Millersche Indices (Millersche Indices des Friedelpaars)

i

imaginäre Einheit (i² = -1)

 k

Richtungsvektor von Röntgenwellen

λ

Wellenlänge

m

figure of merit

P u , v , w

Pattersonfunktion

 el

Elektronendichte

s

Ortsvektor im reziproken Raum

σ

Standardabweichung

σA

Gewichtungsfaktor für Strukturfaktoren

u ,v ,w

Koordinaten im Pattersonraum

V EZ

Volumen der Elementarzelle

VM

Matthews- oder Packungsparameter

x , y ,z

Ortskoordinaten im realen Raum

IX

X

1 Einleitung

1

Einleitung

1.1 1.1.1

C2 aus Clostridium botulinum Bakterielle Toxine

Exotoxine sind die wichtigsten Pathogenitätsfaktoren vieler Bakterien. Sie werden von den Bakterien sezerniert und können dann unabhängig ihre Wirkung entfalten. Sie binden selektiv an Zellrezeptoren und beeinflussen nach ihrer Aufnahme wichtige Zell-Komponenten, wie z.B. das Zytoskellet, was letztendlich zum Zelltod führt. Eine notwendige Eigenschaft für die Toxine ist die Fähigkeit zur Passage biologische Membranen, damit sie an ihren Wirkort im Zytosol gelangen können. Hierzu bestehen die Toxine aus einer Komponente zur Translokation/Bindung (B) und einer enzymatisch aktiven Komponente (A). Dabei wird zwischen Toxinen unterschieden, bei denen diese beiden Komponenten als Domänen hintereinander auf einer Polypetidkette liegen und solchen, deren Komponenten getrennt hergestellt und sezerniert werden. Zu letzteren gehören die binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine (Barth et al., 2004) und die Anthrax-Toxine (Collier & Young, 2003). Binäre Toxine Das hier untersuchte Toxin C2 aus Clostridium botulinum gehört zu Familie der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, die auch das Iota-Toxin aus Clostridium perfringens, das Clostridium spiroforme Toxin, die Clostridium difficile ADP-ribosyl-Transferase und das vegetative insektizide Protein (VIP) aus Bacillus thuringiensis einschließt (Barbieri et al.; 2002; Barth et al., 2004). Diese Toxine bestehen aus zwei separaten Proteinen: Eine der Komponenten ist die Aktin-modifizierende Komponente, die andere wird für die Rezeptorbindung und die Translokation in die Zelle genutzt. Dieser Eintrittsmechanismus gleicht dem des Toxins von Bacillus anthracis, dessen Binde-/Translokationskomponente ähnlich ist. Jedoch unterscheidet sich dessen enzymatische Komponenten erheblich in ihrer Funktionalität und Sequenz (Leppla, 1995). Für die Transportkomponente des Anthrax-Toxin, die auch protective antigen (PA) genannt wird, ist die Struktur der monomeren inaktiven Form (Petosa et al., 1997; Santelli et al., 2004) als auch der des aktivierten Heptamers bekannt (Petosa et al., 1997; Lacy, et al., 2004). Mit Ausnahme der C-terminalen Rezeptor-bindenden Domäne teilt sich das PA mit den Transportkomponenten der Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine eine hohe Sequenzhomologie (Barth et al., 2004).

1

EINLEITUNG Aufnahme und Wirkungsweise binärer ADP-ribosylierender Toxine Nach ihrer Freigabe müssen die Komponenten der binären Toxine erst einen Komplex bilden, der in die Zellen aufgenommen werden kann. Die als inaktives Monomer sezernierte Transportkomponente muss hierzu durch eine Protease (im Falle von C2-II z.B. Trypsin) geschnitten werden, um in ihre aktive heptamere Form überzugehen. Dieses Heptamer ist dann in der Lage, die enzymatisch aktive Komponente und anschließend an einen Rezeptor zu binden (Aktories & Barth, 2004). Anschließend wird der Komplex über Endozytose aufgenommen. Nach der Verschmelzung mit dem frühen Endosom kommt es innerhalb des Vesikels zu einer pH Erniedrigung, woraufhin an der Transportkomponente eine Konformationsänderung ausgelöst wird. Dadurch wir eine Pore im Vesikel erzeugt, durch die die enzymatisch aktive Komponente in das Zytosol geschleust wird (Blöcker et al., 2003). Dort wird dann durch die enzymatisch aktive Komponente globuläres Aktin am Arg177 ADP-ribosyliert (Vandekerckhove et al., 1988). Lagert sich ein so modifiziertes G-Aktin an das schnell wachsende Ende eines Aktinfilaments an, so wird dort die weitere Polymerisation verhindert. Da am langsam wachsenden Ende des Aktinfilaments die Dissoziation fortschreitet, werden die Aktinfilamente immer kürzer und durch die ADP-ribosylierung die entstehenden G-Aktine aus dem Gleichgewicht abgefangen. Letztendlich wird so das komplette Zytoskellet abgebaut und die Zelle stirbt (Abbildung 1). Dies kann durch die Änderung der ursprünglichen Morphologie der Zelle zu einer runden Form beobachtet werden.

Abbildung 1 Schema der Aktivierung und Aufnahme des C2-Toxins. C2-II wird durch Proteolyse aktiviert und bildet ein Heptamer. Dieses bindet C2-I und an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche. Der Komplex wird durch Rezeptor vermittelte Endozytose aufgenommen. Im Endosom kommt es zur pH-Erniedrigung, durch die die Translokation von C2-I ins Zytosol ausgelöst wird. In der Zelle ADP-ribosyliert C2-I globuläres Aktin, welches sich in wachsende Aktin Filamente einbaut und diese dadurch blockiert (capping). Die fortschreitende ADPribosylierung des G-Aktin zieht dieses aus dem Gleichgewicht mit dem F-Aktin (trapping) und führt somit zu dessen Auflösung.

2

1.1 C2 aus Clostridium botulinum

1.1.1

Clostridium botulinum und das C2-Toxin

Clostridien sind ubiquitäre Bakterien, die vor allem im Boden aber auch im Verdauungstrakt von Tieren und Menschen zu finden sind. Sie wachsen zumeist anaerob und können zum Teil äußerst hitzebeständige Sporen bilden. Die wohl bekanntesten Vertreter sind C. botulinum (Erreger der Lebensmittelvergiftung) und C. tetani (Erreger des Wundstarrkrampf). Sie verdanken ihre Pathogenität Neurotoxinen auf deren Grundlage sie auch in verschiedene Serotypen eingeteilt werden. Diese Neurotoxine sind Proteasen, die den Exozytoseapparat von Neuronen zerstören, so dass damit die Weiterleitung von Signalen zum Erliegen kommt. Durch die hohe Effektivität haben schon kleinste Mengen diese Toxins dramatische Folgen für den gesamten Organismus. Für C. botulinum sind bis heute sieben verschiedene Serotypen (A-G) bekannt, wobei die Typen A, B, E die häufigsten Giftbildner in Lebensmitteln sind (Simpson, 1981). Neben den Neurotoxinen produzieren Clostridien noch andere Toxine, deren zellzerstörende Wirkung z.B. für Darmerkrankungen, wie die pseudomembranöse Colitis durch C. difficile verantwortlich ist. C. botulinum vom Typ C und D sind keine Pathogene für den Menschen jedoch für Vögel und Rinder. Diese Typen produzieren neben dem Neurotoxin noch das binäre C2-Toxin (Ohishi et al., 1980), das Aktin ADP-ribosyliert, sowie das C3-Toxin, das die GTPase Rho ADPribosyliert. Das C2-Toxin besteht aus einer Binde/Translokationskomponente C2-II (80 kDa) und

der

enzymatisch

aktiven

Komponente

C2-I

(49 kDa).

Die

Aktivierung

der

Transportkomponente erfolgt im Intestinaltrakt durch die dort vorhandenen Proteasen. Dort ruft das Toxin Nekrosen und hämorrhaghische Läsionen hervor (Ohishi & Odagiri, 1984). Die mittlere letale Dosis bei Mäusen beträgt bei intravenöser Injektion weniger als 50 fmol (Simpson, 1982). Die enzymatische Komponente C2-I C2-I besteht aus 431 Aminosäuren und kann in zwei Domänen eingeteilt werden. Aus den bereits bekannten Strukturen der beiden zu C2-I homologen Enzyme VIP (Han et al., 1999) und Iota-Toxin geht hervor, dass die beiden Domänen durch eine Genduplikation einer ADPRibosyltransferase entstanden sind. Die N-terminale Domäne hat sich dann zu einer Bindedomäne für die Transportkomponente entwickelt. Anhand von auf Sequenzvergleichen basierenden Aktivitätsmutanten wurden die katalytisch relevanten Aminosäuren von C2-I charakterisiert (Barth et al., 1998). Dazu gehören Glu389 und das STS-Motiv, das N-terminal von diesem positioniert ist. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass die ersten 87 Aminosäuren

3

EINLEITUNG für einen vollständigen Transport durch C2-II ausreichend sind (Barth et al., 2002) und somit die Bindekomponente für C2-II enthalten. Die Binde-/Transportkomponente C2-II Die Transportkomponente C2-II des C2-Toxins besteht aus 721 Aminosäuren und hat ein Molekularmasse von etwa 80 kDa. Nach der Aktivierung durch die proteolytische Abspaltung einer 20 kDa großen Domäne vom N-terminus bildet sich ein Heptamer (C2-IIa) aus, das einen äußeren Durchmesser von ca. 13 nm hat (Barth et al., 2000). Durch die Sequenzhomologie mit dem Anthrax PA kann C2-II auch in die fünf Domänen C2-II20, D1', D2, D3 und D4 aufgeteilt werden. Die erste Domäne wird für die Aktivierung abgespalten, während D2 und D3 die Pore bilden und die für die Membraninsertion wichtigen Reste tragen. D4 macht den Rezeptor bindenden Teil aus. Das zeigt sich auch an der geringen Sequenzhomologie dieser Domäne mit der von Anthrax PA, da die Transportkomponenten an unterschiedliche Rezeptoren binden. Es konnte gezeigt werden, dass C2-IIa an bestimmte Zuckerstrukturen auf der Zelloberfläche bindet (Eckhardt et al., 2000).

1.2 1.2.1

Peptidinhibitoren aus Cyanobakterien Cyanobakterien

Cyanobakterien, auch Blaualgen genannt, zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur Photosynthese aus. Sie sind sowohl im Süßwasser als auch im Salzwasser zu finden und haben eine hohe Toleranz gegen widrige Lebensbedingungen, wie z.B. gegen starke Schwankungen der Ionen­ konzentration, Sauerstoffmangel oder Lichtmangel. Außerdem sind sie zur Stickstofffixierung befähigt. Durch ihre Anpassungsfähigkeit sind sie auch in exotischen Umgebungen, wie heißen Quellen oder in der Wüste zu finden (Fay, 1983). Cyanobakterien sind auch der Hauptverursacher der so genannten Wasserblüte, die bei einem zu hohen Nährstoffangebot in Gewässern auftritt. Durch die hohe Population färben sich die Gewässer in den meisten Fällen grün, was sich auf die Pigmentierung der Cyanobakterien zurückführen lässt. 1.2.2

Sekundärmetabolite aus Cyanobakterien

Die sekundären Metabolite aus Cyanobakterien sind toxisch (Carmicheal, 1997) und können teilweise sogar Tumorwachstum und Deformationen bei Fischen und Amphibien hervorrufen (Oberemm et al., 1999; Nishiwaki-Matsushima et al., 1992). Neben diesen Toxinen produzieren Cyanobakterien auch nicht-toxische Peptide, von denen manche eine bemerkenswerte

4

1.2 Peptidinhibitoren aus Cyanobakterien

biologische Aktivität haben (Namikoshi & Rinehart, 1996) und deshalb von pharmazeutischen Interesse sind. Cyanopeptoline Depsipetide sind Verbindungen, die aus β-Hydroxy und α-Aminocarbonsäuren in Ester- und Amid-Verknüpfungen aufgebaut sind. Eine Gruppe der zyklischen Depsipetide sind die Cyanopeptoline. Der erste Vertreter dieser Substanzklasse, das Dolastin-13, wurde aus dem Seehasen Dolabella auricularia isoliert (Petitt, 1997). Charakteristisch für diese Verbindungen ist die aus sechs Aminosäuren bestehende 19-gliedrige Peptidkette, die meist über ein Threonin zu einem Lacton zyklisiert ist (Martin et al., 1993). Ein weiteres Merkmal ist die ungewöhnliche Aminosäure 3-Amino-6-hydroxy-2-oxo-1-piperidin (Ahp), die auch als zyklisches Glutamin­ säurealdehyd beschrieben werden kann. Die dem Ahp folgende Aminosäure liegt außerdem immer in cis-Konfiguration vor, während die restlichen trans-konfiguriert sind. Der N-terminale Arm der Cyanopeptoline ist variabel in seiner Länge und Zusammensetzung und oftmals durch hydrophobe Säuren N-blockiert (Weckesser et al., 1996). Cyanopeptoline zeichnen sich durch vielfache biologische Aktivitäten aus, wobei meist die Protease-hemmenden, fungiziden oder zytotoxischen Wirkungen im Vordergrund stehen. Eine Ausnahme bildet Microcystilid-A, das die Differenzierung von HL-60 Zellen fördert (Tsukamoto et al., 1993). Die Inhibition von Serinproteasen wurde am Beispiel von Trypsin durch die Komplexstruktur mit dem Cyanopeptolin A90720A studiert (Lee et al., 1994). Die Struktur zeigt, dass der 19-gliedrige Ring durch zwei starke interne Wasserstoffbrücken fixiert ist und der Inhibitor wie ein antiparalleler β-Strang an das aktive Zentrum bindet. Die Cyanopeptoline Scyptolin-A und B wurden in Kulturen des Cyanobateriums Scyptonema hoffmanni gefunden (Matern et al., 2001). Der N-terminale Arm ist N-butyroyl-Ala-Thr in Scyptolin-A wohingegen Scyptolin-B eine zweite N-butyrol-alanyl Gruppe mit Esterbindung am Thr2 besitzt, was zu einem verzweigten N-terminalen Arm führt. Beide Verbindungen enthalten ein 3'-chloro-N-methyl-Tyr (cmTyr), welches das Amidmethyl enthält, das die bereits erwähnte cis-Peptidbindung herbeiführt. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden Scyptoline die Serinprotease Elastase inhibieren (Matern et al., 2001), die bezeichnenderweise Elastin abbaut, das die Basis für flexibles Bindegewebe ist (Bieth, 2001). Falls das Gleichgewicht zwischen solchen Proteasen und seinen natürlichen Inhibitoren bzw. Regulatoren gestört ist, kann das zu übermäßiger Proteolyse von Gewebe führen, was sich dann Krankheitsbildern wie Pankreatitis, Arthritis, Emphysem, zystischen Fibrose oder Psoriasis äußert (Reboud-Ravaux, 2001).

5

EINLEITUNG In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur des Komplexes zwischen Scyptolin-A und Elastase bestimmt. Aus der Bindung zur Elastase und dem Vergleich mit dem bekannten Inhibitorstrukturen konnten Ausagen über die Spezifität und den Inhibitionsmechanismus abgeleitet werden. Microginine Unter den linearen und zyklischen Peptiden, die von den Cyanobakterien produziert werden, befinden sich unter anderen die Microginine. Dies sind lineare Pentapeptide, die erstmals aus Microcystis aeroginosa (NIES-100) isoliert wurden (Okino et al., 1993). Charakteristisch für diese Substanzen ist die N-terminale β-Aminosäure 3-Amino-2-hydroxy-decansäure. Bisher sind über 20 Strukturvarianten bekannt, die eine inhibitorische Wirkung auf Enzyme haben. Hauptsächlich sind die Leucin-Aminopetidasen (LAP) und das angiotensin converting enzyme (ACE) davon betroffen (Ishida et al., 2000). Die Microgenine zeigen eine Verwandtschaft mit den bekannten Inhibitoren Bestatin (Umezawa et al., 1976) und Amastatin (Aoyagi et al., 1978) aus Streptomyces, die ebenfalls LAP Inhibitoren darstellen. Für den Inhibitor Bestatin konnte gezeigt werden, dass durch seine Gabe HIV-Infektionsraten reduziert werden (Pulido-Cejudo et al., 1997). Der genaue Zusammenhang konnte noch nicht geklärt werden, jedoch ist anzunehmen, dass microsomale LAP, die in der Immunabwehr involviert ist, durch Bestatin inhibiert wird. Gerade für die microsomale LAP zeigt das in dieser Arbeit untersuchte Microgenin-FR1 weitaus bessere Inhibitionseigenschaften als Bestatin oder Amastatin und bietet sich somit als Leitstruktur für den Entwurf von potenteren LAP Inhibitoren an.

1.3 1.3.1

2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans Abbau von Nikotin durch Arthrobacter nicotinovorans

Der Konsum von nikotinhaltigen Substanzen ist ein Gesundheitsrisiko für viele Menschen. Für den menschlichen Körper stellt Nikotin ein Xenobiotika dar. Es beeinflusst das zentrale Nervensystem und hat dadurch Wirkung auf den kompletten Organismus. Es wird auf ver­ schiedenen Wegen abgebaut (Hukkanen et al., 2005). Von den Pflanzen wird dieses Neurotoxin produziert um Frassfeinde unschädlich zu machen. In höheren Dosen ist es auch für Menschen tödlich. Trotz seiner gesundheitsschädlichen und abhängig machenden Wirkung werden immer noch Tabakprodukte hergestellt. Bei deren Produktion fallen etwa 7000 Tonnen reines Nikotin an, die etwa 2 Millionen Tonnen Abfall kontaminieren, der entgiftet werden muss (Novotny & Zhao, 1999). Es existieren jedoch Bakterien, die Niktotin als ihre einzige Kohlen- und 6

1.3 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans

Stickstoffquelle nutzen können (Hochstein & Rittenberg, 1959; Gries et al., 1961), was sie für die Tabak verarbeitende Industrie interessant macht. Unter ihnen ist das Bodenbakterium Arthrobacter nicotinovorans, dessen Nikotinabbauweg sehr gut erforscht ist (Brandsch, 2006). Seine Fähigkeit Nikotin zu verwerten ist mit Plasmid pAO1 verknüpft, auf dem alle für den Abbau essentiellen Gene kodiert sind (Brandsch & Decker, 1984). Ein Teil der Schritte ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2 Darstellung des zentralen Teil des Nikotinstoffwechselweges von A. nicotinovorans. Neben den dominierenden L-Nikotin wird auch das D-Enantiomer umgesetzt. Im weiteren Verlauf des Stoffwechsels wird DHP am C3 hydroxyliert und der aromatische Ring wird in einem weiteren Prozess geöffnet.

Als erstes wird der Pyridinring am C6 hydroxyliert, gefolgt von einer Oxidation und Öffnung des Pyrrolidinrings. Daran schließt sich eine zweite Hydroxylierung des Pyridinrings an. Das resultierende 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin (DHPON) ist nicht stabil, da in einer irreversiblen Reaktion innerhalb von Minuten ein 4',5'-Dihydro-pyrrolring ausgebildet wird, wodurch 2,6-Dihydroxy-N-methyl-Myosmin entsteht (Brandsch, 2006). Die beiden Pyridinhydroxylierenden Enzyme sind nahe miteinander verwandt. Beide nutzen einen Molybdän Pyranopterin-Dinukleotid-Kofaktor, FAD und ein Eisen-Schwefel-Cluster (Brandsch, 2006). Die 7

EINLEITUNG Oxidation des Pyrrolidinrings wird durch zwei verschiedene strukturell bekannte FAD-bindende Enzyme (Koetter & Schulz, 2005) durchgeführt, wobei jeweils ein Enzym ein bestimmtes Enatiomer umsetzt. Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, wird dann die Spaltung von DHPON in γ-N-methyl-aminobutyrat (MAB) und 2,6-Dihydroxy-pyridin (DHP) durch die seit kurzen bekannte DHPON-Hydrolase (Sachelaru et al., 2005) katalysiert. 1.3.2

Charakterisierung der 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase

In der Gegenwart von Nikotin werden bestimmte Gene auf dem Plasmid pAO1 im erhöhten Maße transkribiert. Dazu gehört unter anderem das Gen der großen Untereinheit der KDH (kdhL) (Igloi & Brandsch, 2003). In nächster Nähe dieses Gens liegen ORF116 und ORF367. Es konnte gezeigt werden, dass die Gene mit diesen ORF (open reading frame/s) nur in Anwesenheit von Nikotin im Kulturmedium nachweisbar sind (Sachelaru et al., 2005). Das Produkt des ORF367 ist ein 43 kDa Enzym, dass über Aktivitätstests als DHPON-Hydrolase identifiziert wurde (Sachelaru et al., 2005). Die Suche nach Sequenzhomologen und Strukturvorhersagen ergaben, dass das Enzym vermutlich zur Klasse der α/β-Hydrolasen gehört. Über Aktivitätsmutanten wurde die für diese Hydrolasen charakteristische katalytische Triade Asp-His-Ser bestimmt. Die Spaltung von C-C Bindungen ist bereits durch β-Ketolasen bekannt, die 1,3-Diketone oder 1,5-Dioxyvinyle akzeptieren (Pokorny et al., 1999). Da das Substrat der DHPON-Hydrolase in Lösung in seiner Ketoform vorliegen kann, wäre eine Einordnung als 1,3β-Ketolase bzw. 1,5-β-Ketolase denkbar.

8

1.4 Ziele der Arbeit

1.4

Ziele der Arbeit

Aufbauend auf dem von Dirk Haschke und Iris Merkel erarbeitenden Expressions- und Reinigungsprotokoll für C2-I sollten durch die Mutation von Oberflächenaminosäuren röntgentaugliche Kristalle erhalten werden, um anschließend die Kristallstruktur zu bestimmen. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Aktories (Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie

und

Toxikologie,

Albert-Ludwigs-Universität,

Freiburg)

sollte

das

Reinigungsprotokoll für die Transportkomponente C2-II verbessert werden, um anschließend durch Kristallisationsversuche röntgentaugliche Kristalle für die Strukturbestimmung zu erhalten. Anhand der Strukturen sollten biochemische Daten verifiziert werden und ein detaillierter Einblick in die Wirk- und Funktionsweise des Toxins gegeben werden. Im Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Weckesser (Institut für Biologie II, Mikrobiologie, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) sollten die dort gewonnen peptidischen Inhibitoren Scyptolin-A und Microginin-FR1 mit ihren jeweiligen Zielenzymen Elastase bzw. LeucinAminopetidase kristallisiert werden, um durch die anschließende Röntgenstrukturanalyse die spezifischen Wechselwirkungen zwischen den Inhibitoren und den Enzymen zu untersuchen und Aussagen über den Inhibitionsmechanismus machen zu können. Aufgrund ihrer oftmals ungewöhnlichen Geometrie und Bindung werden von den Inhibitorstrukturen neue Leitmotive für das Design von Medikamenten erwartet. Der Ausgangspunkt für die Strukturbestimmung der DHPON-Hydrolase war die bereits im Arbeitskreis Brandsch (Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Albert-LudwigsUniversität, Freiburg) etablierte Expression und Reinigung. In Kooperation sollte die Reinigung verbessert und das Enzym kristallisiert werden. Nach erfolgreicher Strukturbestimmung sollten anhand der Struktur weitere Aktivitätsmutanten zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus geplant und umgesetzt werden. Unter Zuhilfenahme der Struktur und der biochemischen Daten sollte die von der DHPON-Hydrolase katalysierte Reaktion im Detail aufgeklärt werden.

9

EINLEITUNG

10

2 Materialien

2 2.1

Materialien Geräte

Allgemein Pipetten Reinwasseranlage Wasserbad Zentrifugen Vortex Waagen Photometer pH-Elektrode Küvetten

2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL und 5000 µL Multipetten Research Pro 10 / 100 Milli-Q Gradient K4 Electronic 5415 C, 5804 R und 5417 R SpeedVac Concentrator REAX 2000 AE 240 und PE 3600 PR 2210 IJ44/Meteo K-Küvetten 407 1/1 und UVette 220-1600 nm

Molekularbiologische Arbeiten Agarosegel-ElektrophoreseGNA 100 Kammer Thermocycler PTC-200 Peltier Thermal Cycler Proteinpräparation Brutschrank Bakterienschüttler Dampfsterilisator Sterilfilter Ultraschallbad Zentrifugen French-Press Ultrafiltraionszellen Ultrafiltrationsmembran Zentrifugal-Konzentratoren Centricon Einmal-Filterhalter Dialyse Chromatographie Chromatographieanlagen Software Schlauchpumpe Säulen/-materialien

Innova 4230 KS 125 und KS 250 Novotron Varioklav 500 EV 0.2 µm, steril Sonorex RK 106 Super RC-2B; RC-5B French-Pressure Cell

Gilson Eppendorf Millipore MGW Lauda Eppendorf Savant Heidolph Mettler Eppendorf GAT Eppendorf Amersham Biosciences MJ-Research

8050 und 8010 PM 30 Vivaspin 15 mL 2 mL 0.2 und 0.45 µm, steril Schläuche Knöpfe, Eigenbau

New Brunswick Scientific IKA Labortechnik Invors AG H & P Labortechnik Sarstedt Bandelin Du Pont SIM AMICO Spectronic Instruments Amicon Amicon Vivascience Amicon Renner GmbH Serva Institutswerkstatt

ÄKTA Purifier 100 ÄKTA Explorer 100 ÄKTA prime Unicorn Version 3.00 und 3.10.11 PrimeView 1.0 ISM321A Superdex-200 26/60 prep grade Mono-Q 1 mL Resource-Q 6 mL HiTrap GST HIC Phenylalanin

Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences Ismatec Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences Amersham Biosciences

11

MATERIALIEN SDS-PAGE Elektrophorese-Apparatur Spannungsquelle Geltrockenrahmen

Mini-Protean II Power Pac 3000 Eigenbau

Biorad Biorad Institutswerkstatt Pharmacia Pharmacia

IEF-Gele

Multiphor 2117 Power Supply ECPS 3000/150 Volthour Integrator VH-1 Servalyte Precotes

ESI-MS Massenspektrometer

TSQ 7000 mit Quadrupol-Analysator

Finnigan

∅ 21 mm, Stärke 2 Linbro-Kultur-Boxen Crystal Clear Strips, 96er Greiner 609120 – CrystalQuick™ Pferdeschweifhaare Stemi 2000 Laborlux-12 POL S Wine-cooler Cammedia C-3030 Zoom

Hecht-Assistent Flow Laboratories Hampton Research Greiner schwarz (10 Jahre, ♀) Zeiss Leitz Bosch Olympus

Isoelektrische Fokussierung IEF-Apparatur Spannungsquelle

Kristallisation Deckgläser Kristallisationsboxen Seeding Mikroskope Temperierschränke Kristallaufnahmen

Röntgenographische Methoden cryo loops 0.1-1.0 mm Goniometerkopf Huber Röntgengeneratoren RU-200B und RU-H2C Detektoren X 1000 MAR Image Plate, ∅ =30 cm Tieftemperaturgenerator 600series

2.2

Serva

Hampton Research Hampton Research Rigaku Siemens Marresearch Oxford Cryosystems

Chemikalien, Enzyme und Kits

Gängige Laborchemikalien sind von den Firmen Fluka, Merck, Roth, Serva oder Amersham Biosciences bezogen und hier nicht aufgeführt. Enzyme wurden von den Firmen Roche Diagnostics, Amersham Biosciences und New England Biolabs bezogen. Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle Chemikalien mit Reinheitsgrad p.a. verwendet. (NH4)2SO4 (zur Kristallisation) Fluka Acrylamid, research grade Fluka Agar-Agar Gibco Agarose, research grade Fluka Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck Ampicillin, Natriumsalz Sigma und Gerbu Bromphenolblau Serva Casein Pepton (Pepton 140) Gibco Chloramphenicol Fluka Coomassie Brilliant Blue R-250 Serva Dithiothreitol (DTT) Gerbu DNA-Längenstandard (λ-Marker, BstE II-geschnitten) New England Biolabs EDTA, Dinatrium-Salz Gerbu Ethidiumbromid Merck Galaktose Fluka und Sigma Glucose Fluka und Sigma Glycerin Serva Hefeextrakt (Bakterienkultivierung) Gibco

12

2.2 Chemikalien, Enzyme und Kits

Hefeextrakt (Hefekultivierung) HEPES Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), biotechnical grade kb DNA-Längenstandard β-Mercaptoethanol MES MPD N,N'-Methylenbisacrylamid, research grade Natriumcitrat PEG (Polyethylenglycole) Peptone primatone Polidocanol Ponçeau-S SDS Silikonisierlösung TEMED Tris Triton X-100

Sigma Gerbu Gerbu New England Biolabs Serva Fluka Sigma-Aldrich Serva Fluka Fluka Sigma Simec Trade AG Fluka Fluka Serva Merck Fluka, Merck Serva

Enzyme Benzonase (250 U/µL) Thrombin (1 U/µL)

Merck Amersham Biosciences

Kits Qiagen PCR Cloning Kit QIAquick PCR Purification Kit E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit QIAGEN Plasmid Midi Kit Taq-DNA-Polymerase Pfu-Turbo-DNA-Polymerase

Qiagen Qiagen PeqLab Qiagen Qiagen Stratagene

Kristallisationskits Crystal Screen I/II Crystal Screen lite Wizard Screen I/II Wizard Cryo I/II JB Screen 1-10 Detergent Screen I Detergent Screen II Detergent Screen III Additive Screen I Additive Screen II Additive Screen III

Hampton Research Hampton Research Emerald Biostructures Emerald Biostructures Jena Bioscience Hampton Research Hampton Research Hampton Research Hampton Research Hampton Research Hampton Research

2.3

Nährmedien, Puffer und Lösungen

Bakterienkultivierung LB-Medium

LBA-Medium

Casein Pepton Hefeextrakt NaCl pH 7.5 (RT, 5 M NaOH) LB-Medium Ampicillin (steril filtriert)

10 g/L 5 g/L 10 g/L

100 µg/mL

13

MATERIALIEN 2YT-Medium

Casein Pepton Hefeextrakt NaCl pH 7.5 (RT, 5 M NaOH)

16 g/L 10 g/L 5 g/L

2YTA-Medium

2YT-Medium mit Ampicillin (steril filtriert)

100 µg/mL

SOC-Medium

Hefeextrakt Bacto-Tryptone NaCl KCl MgCl2 Glucose pH 7.0 (RT, 5 M NaOH)

5 g/L 20 g/L 5 mM 2.5 mM 10 mM 20 mM

Alle verwendeten Medien und Medienzusätze wurden 20 min bei 120° C und 1 bar sterilisiert. Proteinpräparation C2-I-Lyse-Puffer

C2-I-Denaturierungspuffer C2-I-Naturierungspuffer C2-I-IEC-Puffer-A C2-I-IEC-Puffer-B C2-I-Kristallisationspuffer-A C2-I-Kristallisationspuffer-B

C2-I-Aufbewahrungspuffer C2-I-cryo-Puffer-A C2-I-cryo-Puffer-B C2-II-Lyse-Puffer

C2-II-GST-Waschpuffer C2-II-IEC-Puffer-A

14

Tris NaCl MgCl2 pH 7.4 (RT, konz. HCl) Lyse Puffer + Harnstoff Lyse Puffer + Argininmonohydrochlorid Tris MgCl pH 8.0 (RT, konz. HCl) C2-I-IEC-Puffer A + NaCl (NH4)2SO4 Citrat pH 3.0 (RT, konz. HCl) (NH4)2SO4 MES CoCl2 pH 6.1 (RT, konz. HCl) (NH4)2SO4 Citrat pH 3.0 (RT, konz. HCl) C2-I-Aufbewahrungspuffer A + Glyzerin C2-I-Kristallisationspuffer B + Glyzerin Tris NaCl CaCl2 pH 7.5 (RT, konz. HCl) C2-II-Lyse-Puffer A + MgCl2 ATP Tris CaCl2 pH 9.0 (RT, konz. HCl)

50 mM 10 mM 5 mM 6M 0.6 M 50 mM 5 mM 2M 0.8 M 100 mM 2.1 M 100 mM 30 mM 1.4 M 100 mM 30% (v/v) 30% (v/v) 50 mM 150 mM 2 mM 10 mM 2 mM 50 mM 2 mM

2.3 Nährmedien, Puffer und Lösungen

C2-II-IEC-Puffer-B C2-II-Kristallisationspuffer

C2-II-cryo-Schutz blLAP-GPC-Puffer

blLAP-Kristallisationspuffer

DHPON-H-Aufbewahrungspuffer

DHPON-H-Kristallisationspuffer DHPON-H-cryo-Puffer

Agarose-Gelelektrophorese 50xTAE-Puffer

C2-II-IEC-Puffer A + NaCl (NH4)2SO4 Natriumacetat Isopropanol Ethanol pH 4.6 (konz. HCl) (NH4)2SO4 Glyzerin Tris NaCl ZnSO4 pH 7.8 (konz. HCl) Tris MPD ZnCl2 pH 7.8 (konz. HCl) Tris NaCl TCEP pH 7.4 (konz. HCl) PEG 10000 Tris pH 8.2 (konz. HCl) Tris PEG 10000 Glyzerin pH 8.6

300 mM 1.5 M 100 mM 5% (v/v) 3% (v/v) 2M 30% (v/v) 50 mM 200 mM 50 µM 50 mM 50% (v/v) 50 µM 50 mM 200 mM 0.5 mM 35% (w/v) 100 mM 100 mM 35% (w/v) 10% (v/v)

Tris Essigsäure EDTA pH 8.1 (RT, 6 M HCl)

0.1 M 1M 100 mM

Probenpuffer

Tris EDTA Glycerin Bromphenolblau pH 7.5 (RT, 6 M HCl)

10 mM 1 mM 50% (v/v) 0.05% (w/v)

kb-Standard

0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 kb

New England Biolabs

Kompetente Zellen und Transformation FSB-Puffer KOAc (steril filtriert) KCl MnCl2 CaCl2 [Co(NH3)6]Cl3 Glyzerin SDS-PAGE Acrylamid-Stammlösung

Acrylamid Bisacrylamid

10 mM 100 mM 45 mM 10 mM 3 mM 10% (v7v) pH 6.4 (RT, 6 M HCl) 39% (w/v) 1% (w/v)

15

MATERIALIEN Elektrophoresepuffer

Tris Glycin SDS pH 8.3

50 mM 380 mM 0.1% (w/v)

Sammelgelpuffer

Tris SDS pH 6.8 (RT, 6 M HCl)

0.5 M 0.4% (w/v)

Sammelgel, 6% (w/v)

Acrylamid-Stammlösung Sammelgelpuffer deion. Wasser APS 10% (w/v) TEMED

0.375 mL 0.625 mL 1.5 mL 25 µL 2.5 µL

Trenngelpuffer

Tris SDS pH 8.8 (RT, 6 M HCl)

1.5 M 0.4% (w/v)

Trenngel, 12% (w/v)

Acrylamid-Stammlösung Trenngelpuffer deion. Wasser APS 10% (w/v) TEMED

1.5 mL 1.25 mL 2.25 mL 50 µL 5 µL

SDS-Probenpuffer

Sammelgelpuffer SDS 16% (w/v) Glycerin Bromphenolblau 0.2% (w/v) pH 6.8 (RT, 6 M HCl)

2 mL 2 mL 4 mL 1 mL

Färbelösung

Coomassie Brilliant Blue R-250 Ethanol Essigsäure

0.25% (w/v) 30% (v/v) 10% (v/v)

Entfärbelösung

Ethanol Essigsäure

30% (v/v) 10% (v/v)

LMW-Längenstandard

Phosphorylase B (94 kDa) Rinderserumalbumin (67 kDa) Ovalbumin (43 kDa) Carboanhydrase (30 kDa) Trypsin-Inhibitor (20 kDa) α-Lactalbumin (14 kDa)

64 µg/µL 83 µg/µL 147 µg/µL 83 µg/µL 88 µg/µL 121 µg/µL

2.4

Organismen und Plasmide

Bakterienstämme und Plasmide XL1-Blue BL21(DE3) BL21(DE3) RIL pET-3b pGEX-2T (modifiziert)

16

Stratagene Invitrogen Invitrogen Novagen Pharmacia (Arbeitskreis Aktories, Universtät Freiburg)

3 Methoden

3

Methoden

3.1 3.1.1

Gentechnische Methoden Transformation und Stammkulturen

Die Einführung von Plasmid-DNA in kompetente Zellen wird als Transformation bezeichnet. Um die Zellen kompetent, also aufnahmebereit, zu machen, wurde die Methode nach Hanahan (1983) angewendet. Hierbei wirken divalente Kationen (z.B. Mg2+, Ca2+) auf Zellen in der frühen log-Phase des Wachstums ein. Die kompetenten Zellen wurden nach folgendem Protokoll hergestellt: Je 10 mL 20 mM MgCl2-haltiges 2YT-Medium wurden mit 100 mL Glycerinkultur versetzt und bei 37 °C und 300 rpm geschüttelt. Bei einer OD595 von ca. 0.4 wurden die Zellen durch Zentrifugation (3000×g, 4° C, 10 min) geerntet und von nun an stets auf Eis gelagert. Nach dem Dekantieren des Überstandes wurden die Zellen nach 10-minütiger Inkubation auf Eis in 4 mL FSB-Puffer durch vorsichtiges Pipettieren mit einer sterilen Pasteurpipette resuspendiert. Es wurde abermals 10 min auf Eis inkubiert und durch anschließende Zentrifugation sedimentiert (3000×g, 4° C, 10 min). Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in 0.8 mL eisgekühltem FSB-Puffer durch mehrfaches Pipettieren suspendiert. Nach Zugabe von 28 mL DMSO, kurzem Umschwenken, 15 min Inkubation auf Eis und erneuter Zugabe von 28 mL DMSO waren die Zellen kompetent. Die Zellen wurden zur Steigerung der Kompetenz noch eine weitere Stunde auf Eis gehalten und anschließend in flüssigem Stickstoff zur Lagerung bei -80 °C schockgefroren. Zur Kontrolle der Plasmidaufnahme wird ein E.coli-Stamm benutzt, der von sich aus nicht gegen Ampicillin resistent ist. Das aufzunehmende Plasmid hingegen trägt das Gen für die β-Lactamase vermittelte Ampicillinresistenz, so dass nach Plattierung auf ein mit Ampicillin supplementiertes Medium später nur Bakterien wachsen, die das Plasmid aufgenommen haben. Die Transformation von Plasmid–DNA in die Zellen erfolgte durch die Hitzeschock-Methode. Hierbei werden in einem auf Eis vorgekühlten Eppendorf-Hütchen zu 200 µL kompetenter Zellen 4 µL Plasmid–DNA pipettiert. Nach einer Inkubation von 60 min wurden die Zellen im 42 °C Wasserbad einem Hitzeschock von 45 s ausgesetzt. Anschließend wurde erneut für 2 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde mit auf 42 °C temperiertem SOC-Medium versetzt und eine Stunde unter Schütteln (300 rpm) kultiviert. Danach wurde der Transformationsansatz auf einer LBA-Agar-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

17

METHODEN Von der Platte wurde eine einzelne Kolonie gepickt und mit dieser 15 mL 2YTA-Medium angeimpft. Nachdem die Kultur eine OD595 von 0.8 erreicht hatte, wurden jeweils 500 µL 1:1 mit Glycerin vermischt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren um anschließend bei -80 °C eingelagert zu werden. 3.1.2

Plasmidpräparation

Zur Transformation und Sequenzierung wird gereinigte Plasmid-DNA benötigt. Die Plasmidpräparation wurde mit dem E.Z.N.A.® Plasmid MiniprepKit II der Firma PeqLab durchgeführt. Diesem Kit liegt das Prinzip der alkalischen Lyse zu Grunde. Hierzu werden die Zellen einer 15 mL Übernachtkultur zunächst zentrifugiert und das Zellpellet anschließend in RNase-haltigem Puffer resuspendiert. Durch Zugabe von NaOH und SDS werden die Zellen vollständig lysiert. SDS löst hierbei Phospholipide aus den Zellwänden. Chromosomale und Plasmid-DNA denaturiert in Natronlauge. Die Neutralisation des alkalischen Lysats mit Kaliumacetat-Puffer bewirkt, dass die Plasmid-DNA spezifisch renaturiert. Chromosomale DNA wird unspezifisch renaturiert und kann durch Zentrifugation zusammen mit Protein-SDSKomplexen abgetrennt werden. Die verbleibende Plasmid-DNA wird durch spezifische Bindung an Kieselgelsäulen gereinigt. Die Durchführung erfolgte nach der Anleitung des Herstellers. Eluiert wurde mit 100 µL ddH2O. 3.1.3

Primer-Entwurf

Für die Mutagenese nach der QuikChange™-Methode, die DNA-Sequenzierung und die PCR werden DNA-Nukleotide benötigt. Für ein erfolgreiches Ablaufen der dieser Methoden zugrundeliegenden PCR müssen die primer bestimmten Anforderungen gerecht werden (Barik, 1993). Die Länge soll 20-40 Basen betragen. Eventuelle Mutationsstellen sollten sich in der Mitte der entworfenen primer befinden. Die Enden sollten mit einem Cytidin oder Guanosin abschließen.

Außerdem

sollte

der

GC-Gehalt

möglichst

50%

betragen

und

die

Schmelztemperatur (Tm) über 78 °C liegen. Diese Schmelztemperatur wurde mit der so genannten %GC-Formel (Gleichung 1) abgeschätzt (Suggs et al., 1981). T m =81.50.41 % GC − N % Fehler

3.1.4

675 − % Fehler N

Gleichung 1

Anzahl der Basen Anteil der fehlgepaarten Basen

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Mit der PCR lassen sich ganze DNA-Abschnitte, deren flankierenden Sequenzen bekannt sind, amplifizieren. Hierdurch ist es möglich komplette Plasmide oder auch Teilabschnitte zu

18

3.1 Gentechnische Methoden

vervielfältigen. Die verwendeten primer müssen so beschaffen sein, dass sie an den Enden der zu amplifizierenden Sequenz hybridisieren und ihre 3'-Enden aufeinander zeigen. Die primer können so entworfen werden, dass in die zu amplifizierende Sequenz Mutationen oder weitere Schnittstellen eingefügt werden. Durch ein zyklisches dreistufiges Temperaturprogramm wird der gewünschte DNA-Abschnitt mit Hilfe einer temperaturstabilen DNA-Polymerase exponentiell amplifiziert. Im ersten Schritt wird die dsDNA bei 95 - 98 °C aufgeschmolzen. Anschließend erfolgt das annealing der primer bei Temperaturen zwischen 55 und 65 °C. Danach erfolgt bei einer Temperatur von 72 °C die Verlängerung der primer durch die DNA-Polymerase. Der Zeitraum dieser extension hängt von der Länge des zu vervielfältigenden Abschnittes ab und wird mit 2 min/kb veranschlagt. Dieser Zyklus wird bis zu 30 mal durchlaufen, wodurch die exponentielle Vervielfältigung des gewünschten Abschnittes erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde mit der TurboPfu DNA-Polymerase der Fa. Stratagene gearbeitet. Mit dem zur Verfügung stehenden Thermocycler konnte ein Temperaturgradient erzeugt werden, so dass gleichzeitig verschiedene annealing Temperaturen getestet werden konnten. Die Zusammensetzung eines typischen Ansatzes kann aus Tabellen 1 entnommen werden. Tabelle 1

3.1.5

Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes Inhalt

Volumen [µL]

Templat-DNA (25 ng/µL)

4

primer (25 ng/µL)

je 1

dNTP-Lösung (10mM)

2

10×Reaktionspuffer

10

Pfu-DNA-Polymerase (1 U/µL)

2

ddH2O

ad 100

QuikChange™ Mutagenese

Um die gewünschten Mutationen in die Gene einzuführen, wurde die QuikChange™Methode (Fa. Stratagene) benutzt. Hierbei wird dsDNA thermisch in ssDNA getrennt. Hierauf folgt das annealing zweier genau komplementärer Mutagenese–primer an die elterliche ssDNA. Diese primer werden dann mit einer DNA-Polymerase verlängert, bis zur gesamten Matrize komplementäre Einzelstränge vorliegen. Der Vorgang wird mehrmals wiederholt, wobei sich die neu gebildete DNA exponentiell amplifiziert. Anschließend wird die methylierte elterliche DNA mit DpnI, einem Restriktionsenzym, das spezifisch methylierte DNA schneidet, verdaut. Danach

19

METHODEN wurde die Plasmid-DNA in spezielle superkompetente Zellen transformiert, in denen die noch vorhandenen Einzelstrangbrüche geschlossen werden. Die Reaktionsansätze wurden nach Vorschrift des Herstellers in 200 µL PCRReaktionsgefäßen gemischt (Tabelle2). Das Temperaturprogramm ist entsprechend dem GCGehalt und der Größe des Templats geändert worden (Tabelle3). Das noch vorliegende Templat wurde durch Zugabe von 1 µL DpnI (10 U/µL) und Inkubation bei 37 °C verdaut. DpnI verdaut hierbei spezifisch nur die methylierte DNA. Somit bleibt das nicht-methylierte PCR-Produkt erhalten, wohingegen die Templat-DNA entfernt wird. Die mutierten Plasmide wurden nach dem Transformationsprotokoll der Fa. Stratagene in superkompetente Epicurian coli® XL-1-Blue Zellen transformiert.

Abbildung 3

20

Schematische Darstellung der ortsgerichteten Mutagenese mit dem QuikChange™-Kit

3.1 Gentechnische Methoden

Tabelle 2

Tabelle 3

3.1.6

Zusammensetzung für einen QuikChange™-Mutagenese-Ansatz Inhalt

Volumen [µL]

10x Reaktionspuffer

5

ds-DNA-template (5-50 ng/µL)

0.5-2

primer #1 (25 ng/µL)

12.5

primer #2 (25 ng/µL)

12.5

dNTP Lösung (10 mM)

1

ddH2O

17-18.5

PfuTurbo DNA-Polymerase

1

Temperaturprogramm für einen QuikChange™-Mutagenese-Ansatz. Vorgang

Temperatur [°C]

Zeit [min]

Denaturierung

95

0.5

Denaturierung

95

0.5

annealing

55-72

1

extension

68

10

Denaturierung

95

0.5

annealing

55-75

1

extension

68

15

Zyklen

15-18

1

DNA-Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierungen wurden von der Firma Sequence Laboratories Göttingen GmbH (SEQLAB) ausgeführt. Hierzu wurden 15-20 µL DNA-Lösung aus einer Plasmidpräparation eingeschickt. Die benötigten primer wurden ebenfalls von der Fa. SEQLAB hergestellt und, wenn nicht vorgegeben, geplant. Eigene primer-Sequenzen wurden, wie in Kap. 3.1.3 be­ schrieben, entworfen.

3.2 3.2.1

Proteinpräparation Expression und Reinigung von C2-I

Bakterienkultivierung und Zellaufschluss C2-I wurde in BL21-DE3-RIL Zellen exprimiert. Hierzu wurden 20 mL LBA-Medium mit 20 µL Glyzerinkultur angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt (250 rpm). 2.5 mL Übernachtkultur wurden dann zu 250 mL LBA-Medium im 1 L Erlenmeyerkolben ohne Schikane gegeben. Dieser Ansatz wurde bei 37 °C und 220 rpm bis zu einer OD595 von ca. 1.2

21

METHODEN (Zeitraum: ca. 4 h) inkubiert. Hier wurde dann durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 2 mM die Expression von C2-I induziert. Nach weiteren 2 h wurden die Zellen durch Zentrifugation (16'000×g, 4 °C, 12 min) geerntet. Das Zellpellet wurde in ca. 30 mL C2-I-Lyse-Puffer resuspendiert. Für den Zellaufschluss wurden die Zellen mit 1 µL Benzonase (250 U) zum Abbau von DNA versetzt. Die Suspension wurde drei- bis viermal in einer French®Press-Druckentspannungs-Anlage (4 °C, 100 bar) aufgeschlossen. Isolierung der Einschlusskörper und Naturierung Die Einschlusskörper wurden durch fraktionelle Zentrifugation des Lysats (3000×g, 4 °C, 12 min) abgetrennt. Der Überstand wurde verworfen, das gewonnene Pellet erneut in 30 mL C2-I-Lyse-Puffer resuspendiert und danach wiederholt zentrifugiert (3000×g, 4 °C, 12 min) um noch eventuell vorhandene Membrantrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde erneut verworfen und das Pellet in 60 mL Denaturierungspuffer aufgelöst. Zur Unterstützung dieses Vorgangs wurde die Lösung auf ca. 70 °C gebracht und für 20 min gerührt. Unlösliche Verunreinigungen wurden durch zentrifugieren (47'000×g, 4 °C, 20 min) abgetrennt. Zur Naturierung wurde der klare Überstand über Nacht bei 4 °C unter Rühren in 1 L Naturierungspuffer getropft, so dass eine schnelle Verdünnung der Proteinlösung resultierte. Das Volumen dieser Lösung wurde anschließend auf ca. 30 mL konzentriert und gegen 2 L IECPuffer A dialysiert. Anionenaustausch-Chromatographie Die Ionenaustausch-Chromatographie basiert auf der elektrostatischen Bindung von Proteinionen an die geladenen funktionellen Gruppen eines chemisch inerten Säulenmaterials. Die Proteinionen werden während der Reinigung durch die im Elutionspuffer enthaltenen Ionen in Abhängigkeit vom gewählten pH verdrängt. Zur Reinigung von C2-I wurde mit einer vorgepackten Resource-Q Säule gearbeitet. Hierbei handelt es sich um einen starken Anionen­ austauscher, der auf einer Polystyrol-Divinylbenzol-Matrix mit quartären Aminen basiert. Die dialysierte Lösung wurde zentrifugiert (47'000×g, 4 °C, 20 min) um eventuell aus­ gefallenes Protein abzutrennen. Der Überstand wurde dann auf die zuvor mit C2-I-IEC-Puffer-A äquilibrierte Säule aufgetragen. Im Anschluss wurde bis zu einer konstant niedrigen UV-Absorption mit C2-I-IEC-Puffer-A gewaschen, um nicht-bindende Proteine zu entfernen. Die Elution erfolgte durch einen linearen Gradienten von Natriumchlorid in C2-I-IEC-Puffer-A. Details zur Chromatographie können Tabelle 4 entnommen werden. Der Verlauf der Chromato­ graphie wurden durch Absorptionsmessungen bei den Wellenlängen 260 und 280 nm (Kap.

22

3.2 Proteinpräparation

3.3.1) verfolgt und die Reinheit und Proteingehalt der Fraktionen durch SDS-PAGE (Kap. 3.3.2) ermittelt. Tabelle 4

Parameter der IEC mit einer Resource-Q Chromatographiesäule Säulenmaterial

Resource-Q

Säulenvolumen (= VT) [mL]

6

Säulendurchmesser [mm]

16

Säulenhöhe [mm]

30

Äquilibrierung [VT]

6 C2-I-IEC-Puffer-A

Waschen [VT]

5 C2-I-IEC-Puffer-A

Flussrate [mL/min] Injektion Eluation

2.0 6.0

Salzgradient [mM]

0-300 / 300-1000 /1000-2000

Gradientenvolumen [VT]

12 / 10 / 2

Fraktionsvolumen [mL]

1.0

Detektion [nm]

260, 280

Temperatur [°C]

4

Konzentrieren von Proteinlösungen und Dialyse Um eine Proteinkonzentration von über 5 mg/mL zu erreichen, wurden die Proteinfraktionen vereinigt und in Zentrifugalkonzentrationszellen gegeben, deren Ausschlussvolumen bei 30 kDa liegt. Diese enthalten Membranen, die von Molekülen mit kleinerer Masse als 30 kDa passiert werden können. Durch Zentrifugation (4500×g, 4 °C, 45 min bis 2 h) passieren nun Wasser- und Puffermoleküle die Membran und das Protein wird angereichert. In dieser Arbeit wurden die Konzentratoren der Fa. VIVASPIN verwendet. Die Dialyse ist ein Mittel zur Entsalzung oder Umpufferung von Proteinlösungen. Hierzu werden semipermeable Membranen mit einem definierten Ausschlussvolumen verwendet, durch die nur kleine Salz-Ionen und Pufferlösungen diffundieren können. Moleküle, die das Aus­ schlussvolumen überschreiten, werden zurückgehalten. Um initiale Kristallisationsbedingungen zu finden, wurde das Protein vor der Kristallisation über Nacht gegen ddH2O dialysiert. Dadurch wurden Puffermoleküle und Salzionen entfernt, die evtl. die Kristallisation beeinflussen könnten. 3.2.2

Expression und Reinigung von C2-II

Bakterienkultivierung und Zellaufschluss C2-II wurde in BL21-DE3 Zellen exprimiert. Hierzu wurden 20 mL LBA-Medium mit 20 µL Glycerinkultur angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt (250 rpm). 2.5 mL Übernacht­ kultur wurden dann zu 250 mL LBA-Medium im 1 L Erlenmeyerkolben mit Schikane gegeben. 23

METHODEN Dieser Ansatz wurde bei 37 °C und 220 rpm bis zu einer OD595 von ca. 0.7 (Zeitraum: ca. 3 h) inkubiert. Hier wurde dann durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM die Expression von C2-II induziert. Nach weiteren 20 h Kultivierung bei 23 °C wurden die Zellen durch Zentrifugation (16'000×g, 4 °C, 12 min) geerntet. Das Zellpellet wurde in ca. 40 ml C2-II-Lyse-Puffer resuspendiert. Für den Zellaufschluss wurden die Zellen mit 1 µL Benzonase (250 U) zum Abbau von DNA versetzt. Die Suspension wurde drei- bis viermal in einer French®Press-DruckentspannungsAnlage (4 °C, 100 bar) aufgeschlossen. Unlösliche Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (47'000×g, 4 °C, 12 min) abgetrennt. Der Überstand wurde dekantiert und als Rohextrakt für die weitere Reinigung verwendet. Affinitätschromatographie und Thrombinverdau Die Affinitätschromatographie basiert auf spezifischen Wechselwirkungen zwischen dem zu reinigenden Protein und an eine Chromatographiematrix gebundenen Liganden. Das zu reinigende Protein wird hierzu oftmals mit einem tag versehen, der den entsprechenden Bindungspartner für diesen an die Matrix gebunden Liganden darstellt. Im vorliegenden Falle wurde mit einem Glutathion-S-Transferase-tag (GST-tag) gearbeitet, der über einen linker, welcher eine Erkennungssequenz für Thrombin beinhaltet, mit C2-II N-terminal verbunden ist. Durch die Thrombinschnittstelle kann nach der Reinigung der tag samt linker durch Proteolyse mit Thrombin entfernt werden. Der Auftragspuffer enthält eine hohe Salzkonzentration (150 mM NaCl) um unspezifische Wechselwirkungen mit dem Säulenmaterial zu vermeiden. In der vorliegenden Arbeit wurde nach dem Auftrag des Rohextraktes und Waschen der Säule noch ein zusätzlicher Waschschritt eingeführt, um eventuell an das Protein gebundenes DnaK (ein heatshock-protein aus E. coli) zu entfernen. Hierzu wurden zwei Säulenvolumen C2-II-GSTWaschpuffer, der ATP und MgCl2 enthält, aufgetragen und anschließend 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde erneut mit C2-II-Lyse-Puffer gewaschen. Die Abspaltung des GST-tag erfolgte auf der Säule durch Auftrag von einem Säulenvolumen C2-II-Lyse-Puffer in dem 20 NIH-Einheiten Thrombin gelöst waren und 20 stündiger Inkubation bei 20 °C. Beim folgendem Schritt wurde eine Benzamidine-Säule zur Entfernung des Throm­ bins nachgeschaltet, so dass nur gespaltenes C2-II eluiert wurde. Weitere Parameter der Chroma­ tographie sind in Tabelle 5 aufgeführt. Reinheit und Proteingehalt wurden durch Absorptions­ messung bei einer Wellenlänge von 280 nm (Kap. 3.3.1) und SDS-PAGE (Kap. 3.3.2) ermittelt.

24

3.2 Proteinpräparation

Tabelle 5

Parameter der Affinitätschromatographie mit einer GSTrap Chromatographiesäule Säulenmaterial

Agarose

Säulenvolumen (= VT) [mL]

5

Säulendurchmesser [mm]

16

Säulenhöhe [mm]

25

Äquilibrierung [VT]

5 C2-II-Lyse-Puffer

Waschen 1[VT]

10 C2-II-Lyse-Puffer

DnaK-Entfernung [VT]

2 C2-II-GST-Waschpuffer

Waschen 1[VT]

10 C2-II-Lyse-Puffer

Flussrate [mL/min]

2.0

Fraktionsvolumen [mL]

5.0

Detektion [nm]

260, 280

Temperatur [°C]

4

Anionenaustausch-Chromatographie Nach Dialyse der vereinigten Fraktionen der GST-Affinitätschromatographie gegen C2-II-IECPuffer A wurde ein Reinigungsschritt mit dem starken Anionentauscher Mono-Q angeschlossen. Die Parameter der Chromatographie sind in Tabelle 6 aufgeführt. Der Verlauf der Chromatographie wurden durch Absorptionsmessungen bei den Wellenlängen 260 und 280 nm verfolgt und die Reinheit und Proteingehalt der Fraktionen durch SDS-PAGE (Kap. 3.3.2) ermittelt. Um initiale Kristallisationsbedingungen zu finden, wurde das Protein auf 5 mg/mL konzentriert und vor der Kristallisation über Nacht gegen ddH2O dialysiert. Tabelle 6

Parameter der IEC mit einer Mono-Q Chromatographiesäule Säulenmaterial

Mono-Q

Säulenvolumen (= VT) [mL]

1

Säulendurchmesser [mm]

5

Säulenhöhe [mm]

50

Äquilibrierung [VT]

5 C2-II-IEC-Puffer A

Waschen [VT]

5 C2-II-IEC-Puffer A

Flussrate [mL/min] Injektion Eluation

0.5 1.0

Salzgradient [mM]

0-15 / 15-180 /180-300

Gradientenvolumen [VT]

3 / 30 / 5

Fraktionsvolumen [mL]

1.0

Detektion [nm]

260, 280

Temperatur [°C]

4

25

METHODEN 3.2.3

Probenvorbereitung von Elastase

Elastase zur Kokristallisation mit Scyptolin-A wurde in Kooperation mit U. Matern (Arbeitskreis von J. Weckesser, Institut für Biologie II, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) vorbereitet. Hierzu wurde lyophilisierte Elastase (EC 3.4.21.36, Serva Elektrophoresis) in Elastase-Puffer (0.1 M Natriumacetat, pH 5.0) gelöst, so dass eine Endkonzentration von 30 mg/mL vorlag. Die Elastaselösung zeigte eine ausreichende Reinheit zur Kristallisation, wie durch SDS-Geleletrophorese gezeigt werden konnte (U. Matern, persönliche Mitteilung). 3.2.4

Isolation und Reinigung von bovine lens LAP (blLAP)

Die Isolation und Vorreinigung von blLAP (EC 3.4.11.1) wurde in Kooperation mit M. Kraft (Arbeitskreis von J. Weckesser, Institut für Biologie II, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) durchgeführt. Dabei konnte auf ein schon etabliertes Protokoll (Rich et al., 1984; Burley et al., 1990) zurückgegriffen werden. Die hierzu nötigen Rinderaugen wurden vom Schlachthof Freiburg i. Br. bezogen. Gelpermeationschromatographie Die Gelpermeationschromatographie (GPC) trennt Proteingemische anhand der Größe und Form der enthaltenen Spezies. Das Säulenmaterial besteht hierbei aus einer porösen Matrix definierter Porengrößen, in die Moleküle entsprechender Größe eindringen können. Das Trennprinzip beruht dabei auf der unterschiedlich großen Retardierung der Moleküle durch die Matrix. Durch die Möglichkeit in mehr Hohlräume der Matrix eindringen zu können als größere Moleküle steht den kleinen Molekülen ein größeres Volumen der stationären Phase gegenüber, das es zu durchlaufen gilt. Moleküle, die nicht in die Poren eindringen können, weil sie eine kritische Größe überschreiten, eluieren im so genannten Ausschlussvolumen, dem Anteil der mobilen Phase am Gesamtvolumen der Säule. Eine abschließende Reinigung der blLAP wurde durch GPC erreicht. Das Protein wurde dafür auf 10 mg/mL konzentriert und filtriert (0.45 µm). Abweichend vom aus der Literatur bekannten Protokoll wurde eine HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade Chromatographiesäule benutzt. Weitere Details zur GPC können aus Tabelle 7 entnommen werden. Mittels Absorption bei 280 und 260 nm Wellenlänge (Kap. 3.3.1) und analytischer SDS-PAGE (Kap. 3.3.2) wurden die blLAP-haltigen Fraktionen identifiziert. Für die Kristallisation wurden die Fraktionen vereinigt und auf 12 mg/mL konzentriert.

26

3.2 Proteinpräparation

Tabelle 7

3.2.5

Parameter der GPC mit HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade Chromatographiesäule Säulenmaterial

Agarose mit Dextran

Säulenvolumen (= VT) [mL]

320

Säulendurchmesser [mm]

26

Säulenhöhe [mm]

600

Äquilibrierung [VT]

2 blLAP-GPC-Puffer

Flussrate [mL/min]

1.0

Fraktionsvolumen [mL]

3.0

Detektion [nm]

260, 280

Temperatur [°C]

4

Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase

Die Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase wurde in Kooperation mit P. Sachelaru (Arbeitskreis von R. Brandsch, Institut für Biochemie und Molekularbiologie, Uni­ versität Freiburg) durchgeführt. Hierbei wurde ein schon etabliertes Protokoll (P. Sachelaru) optimiert. Das Protein wurde mit einem C-terminalen His-tag in E. coli expremiert und über Affinitätschromatographie

(NiNTA) und anschließender IEC (Mono-Q) gereinigt. Da das

Protein bei zunehmender Konzentration zur Aggregation über Oberflächencysteine neigte, wurde unter reduzierenden Bedingungen gearbeitet. Das Selenomethioninderivat wurde nach der Methode von LeMaster (Hendrickson et al., 1990) hergestellt und nach demselben Protokoll gereinigt.

3.3 3.3.1

Proteincharakterisierung Konzentrationsbestimmung

Bei bekanntem molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten A280 ist es möglich, die Proteinkonzentration mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes aus der Absorption zu berechnen (Gleichung 2). Dieser lässt sich nach Gill & von Hippel (1989) theoretisch bestimmen, indem die Summe der Extinktionskoeffizienten aller zur Absorption bei 280 nm beitragenden Tryptophan-, Tyrosin- und Cystinreste gebildet wird (Gleichung 3).

c [ mg /mL ]=

A280⋅M r [ Da]  M −1 cm−1 ⋅d [cm]

A280

Absorption bei λ = 280 nm

Mr

Molekularmasse

d

Schichtdicke der Küvette

= Faktor⋅A280

Gleichung 2

27

METHODEN

Gleichung 3

280 = nTrp⋅5500n Tyr⋅1490nCystin⋅125⋅M −1 cm−1 nx A280 Tabelle 8

3.3.2

Anzahl der entsprechenden Aminosäuren im Protein molarer dekadischer Extinktionskoeffizient des Proteins bei 280 nm Extinktionskoeffizienten Protein

nTyr

nTrp

ncys

Mr [Da]

ε280 [M-1cm-1]

Faktor

C2-I

13

4

0

49175.5

41370

1.19

C2-II

33

6

0

80697.0

82170

0.98

blLAP

9

7

0

52220.6

51910

1.01

DHPON-H

14

9

0

40994.8

70360

0.58

Diskontinuierliche-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) können Proteingemische getrennt werden (Laemmli, 1970). Hierdurch kann die Reinheit von Proteinfraktionen überprüft werden. Die Gele werden durch Kopolymerisation von Acrylamid mit N,N'-Methylenbisacrylamid hergestellt. Durch Variation der Konzentration und des Verhältnisses der beiden Komponenten kann die Porengröße des Gels beeinflusst werden (Westermeyer, 1990). SDS bindet an denaturiertes Protein in einem konstanten Massenverhältnis von 1.4 g SDS : 1 g Protein (Reynolds & Tanford, 1970), wodurch die Eigenladung des Proteins maskiert wird. Somit wird die elektrophoretische Mobilität nur durch Molekularsiebeffekte bestimmt. Die Laufstrecke ist ungefähr proportional zum negativen dekadischen Logarithmus der Molekularmasse. Durch Vergleich mit einem ebenfalls aufgetragenen Standard ist eine Massenabschätzung der Proteine möglich. Durch Verwendung eines größerporigen Sammelgels werden die Proteinbanden fokussiert, wodurch die Banden im Trenngel schärfer werden. Die SDS-PAGE wurde in dieser Arbeit mit 6%igen Sammelgelen und 12%igen Trenngelen durchgeführt. Die Proben wurden meistens im Verhältnis 1:1 mit SDS-Probenpuffer verdünnt und für 5 min auf 98 °C erhitzt. 10-20 µL der Proben wurden auf die Gele aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei konstanter Stromstärke von 40 mA betrieben. Nachdem die Bromphenolblau-Bande die untere Gelkante erreicht hatte, wurde die Elektrophorese abgebrochen und die Gele in heißer Coomassie-Lösung 5 min gefärbt. Anschließend wurden sie mit heißer Entfärbelösung behandelt. Zur Konservierung wurden die Gele zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet.

28

3.3 Proteincharakterisierung

3.3.3

Molekularmassenbestimmung durch Massenspektroskopie

Bei der electrospray-ionisation- (ESI-) Massenspektroskopie wird der zu untersuchende Analyt durch eine Mikrokapillare in eine Ionisierungskammer gesprüht. Die hierbei gebildeten Tröpfchen laden sich elektrostatisch auf. Durch das Verdampfen des Lösungsmittels nimmt das Volumen des Tropfens ab und somit wird seine Ladungsdichte immer größer, bis es durch die elektrostatischen Abstoßung der Oberflächenladungen zur so genannten Coulomb-Explosion kommt. Die dabei entstehenden Tropfen kleineren Volumens durchlaufen diesen Prozess wiederholt bis schließlich vollständig desolvatisierte Analytionen vorliegen. Diese werden ins Hochvakuum

überführt,

durch

ein

elektrisches

Feld

beschleunigt

und

mit

einem

Massenanalysator, hier ein Quadrupol-Analysator, nach ihrem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis aufgetrennt. Sämtliche Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden von C. Warth (Institut für Organische Chemie und Biochemie, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) durchgeführt. Zur Probenvorbereitung wurden die Proteinlösungen vor dem Einspritzen in die Ionisierungskammer über eine RP-HPLC-Säule aufbereitet. 3.3.4

Bestimmung der enzymatischen Aktivität von C2-I

Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität von C2-I wurden 4 mM Enzym zu einem Testpuffer gegeben, der α- bzw. β/γ-Aktin und unter Anderem isotopenmakiertes NAD+ enthielt. Nach 60 min Inkubation wurde die Reaktion durch Erhitzen auf 95 °C abgebrochen und die Proben durch SDS-PAGE analysiert. Die ADP-ribosylierung der Aktinbanden wurde anschließend durch einen Phosphorimager quantifiziert. Die hier aufgeführten Messungen wurden im Arbeitskreis Aktories (Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Albert-LudwigsUniversität , Freiburg) durch H. Hochmann durchgeführt.

3.4 3.4.1

Proteinkristallographie Kristallgitter und Kristallsymmetrie

Die zur Röntgenstrukturanalyse erforderlichen Einkristalle zeichnen sich durch ihren periodischen Aufbau aus identischen Einheiten, den Elementarzellen aus. Diese beinhalten die komplette Strukturinformation einschließlich der Symmetrie des Kristalls und werden durch die

a,  drei sie aufspannenden Vektoren  b und c charakterisiert. Ihre Beträge als auch die durch sie eingeschlossenen Winkel α, β und γ werden als Zellparameter des Kristalls bezeichnet. Die Periodizität des Kristalls kann vollständig durch Symmetrieelemente und Translationsparameter beschrieben werden. Insgesamt existieren 32 Möglichkeiten, die in Kristallen erlaubten

29

METHODEN Symmetrieoperationen zu kombinieren, was die Definition von 230 verschiedene Raumgruppen erlaubt (International Tables for Crystallography, 1996). Jede Raumgruppe zeichnet sich durch einen Satz Symmetrieoperatoren aus, durch deren Anwendung Bestandteile der Elementarzelle ineinander überführt werden können. Der Teil der Zelle aus dem durch Anwendung dieser Symmetrieoperatoren die vollständige Elementarzelle erzeugt werden kann, wird asymmetrische Einheit genannt. Somit ist die Strukturanalyse dieser asymmetrischen Einheit ausreichend, um die Elementarzelle zu rekonstruieren. Aufgrund der in Kristallen erlaubten 32 Punktgruppen lassen sich sieben Kristallsysteme unterscheiden: triklin, monoklin, orthorhombisch, tetragonal, trigonal, hexagonal und kubisch. Unter Berücksichtigung von primitiven, flächen- und innenzentrierten Packungen ergeben sich 14 mögliche Bravais-Gittertypen. Durch die Chiralität biologischer Makromoleküle wird die Zahl der möglichen Punktgruppen auf elf reduziert, da Spiegelebenen und Inversionszentren als Symmetrieoperatoren wegfallen. Somit bleiben nur noch 65 so genannte Bioraumgruppen übrig. 3.4.2

Lösungsmittelgehalt von Proteinkristallen

Neben den biologischen Makromolekülen bestehen Proteinkristalle zu einen erheblichen Anteil aus Lösungsmittelmolekülen, die zum größten Teil ungeordnet vorliegen. Nach einer statistischen Analyse bekannter Kristallstrukturen wurde ein so genannter Matthews- bzw. Packungsparameter VM definiert (Gleichung 4, Matthews, 1968).

V M=

V EZ M⋅z⋅n

VEZ M z n

Gleichung 4

Volumen der Elementarzelle Molekularmasse des Proteins [Da] Molekülanzahl in der asymmetrischen Einheit Zahl der asymmetrischen Einheiten pro Elementarzelle

Der Packungsparameter VM beschreibt das Volumen in ų, das im Kristall jeder Molekularmasseneinheit [Da] zur Verfügung steht. Für lösliche Proteine bewegt sich der Packungsparameter meist im Bereich von 1.7 – 3.5 ų/Da mit einem Verteilungsmaximum bei 2.2 ų/Da (Kantardjieff & Rupp, 2003). Unter Berücksichtigung dieser Statistik kann bei bekannter Molekularmasse des kristallisierten Proteins sowie bekannter Raumgruppe und Zellparametern häufig auch ohne Kenntnis der Kristallstruktur auf die Anzahl z der Moleküle in der asymmetrischen Einheit geschlossen werden. Bei Annahme einer Proteindichte von 1.35 g/cm³ lässt sich aus dem Packungsparameter der Solvensgehalt χ des Kristalls errechnen (Gleichung 5). 30

3.4 Proteinkristallographie

=1−

1.23 VM

Gleichung 5

Der Solvensgehalt üblicher Proteinkristalle beträgt zwischen 40% und 60%. Im Allgemeinen besteht eine Abhängigkeit zwischen der Molekularmasse eines Proteins und den Solvensgehalt der entsprechenden Kristalle (Matthews, 1977), so dass bei größeren Proteinen in der Regel auch der Solvensgehalt der Kristalle größer ist. Für die Verbesserung der Phaseninformation durch Dichtemodifikation (Kap. 3.5.11) ist die Kenntnis des Solvensgehalt der Elementarzelle wesentlich. 3.4.3

Kristallisation von Proteinen

Für die Röntgenstrukturanalyse sind Einkristalle der Proteine notwendig. Die Kristalle sollten möglichst groß sein, geringe Mosaizität und ein hohes Streuvermögen aufweisen. Gängige Kristallisationsmethoden beruhen darauf, dass die Löslichkeit des Proteins durch Erhöhung der Fällungsmittelkonzentration langsam verringert wird. Das Fällungsmittel (anorganische Salze, organische Verbindungen) konkurriert dabei mit dem Protein um das Solvens. Dadurch kann es zu Protein-Protein-Wechselwirkungen kommen, die zur Bildung von Kristallisationskeimen führen. Bei idealen Bedingungen wachsen nur wenige dieser Keime im labilen, übersättigten Zustand des Systems und erniedrigen so die Proteinkonzentration in der Lösung bis ein metastabiler Zustand erreicht wird, der nur noch das Wachstum der Kristalle zulässt, jedoch nicht die Keimbildung (McPherson, 1990). Übliche Fällungsmittel zur Proteinkristallisation sind anorganische Salze der Hofmeister Reihe, wasserlösliche Polymere sowie organische Lösungsmittel. Screening Da das Auffinden geeigneter Kristallisationsbedingungen bis heute ein empirischer Vorgang ist, wird der multidimensionale Parameterraum durch so genannte screens punktuell durchgetestet. (Carter & Carter, 1979; Cudney et al., 1994). Es kann zwischen bifaktoriellen grid screens und multifaktoriellen sparse matrix unterschieden werden. Bei den bifaktoriellen screens werden nur zwei Parameter des Systems, oft Fällungsmittelkonzentration und pH-Wert, in regelmäßigen Abständen variiert. Dieses System bietet sich vor allem bei der Verfeinerung einer bereits gefunden Bedingung an. Bei den multifaktoriellen screens wird hingegen eine große Variationsbreite an pH-Werten, Fällungsmitteln und -konzentrationen sowie zusätzlichen Additiven wie Salzen und organischen Molekülen mit geringer Molekularmasse. Durch die 31

METHODEN statistische Analyse erfolgreicher Kristallisationsexperimente (Jancarik & Kim, 1991) und der entsprechenden Zusammenstellung der screens wird eine möglichst große Trefferquote erwartet. Kristallisation Die

Kristallisationsexperimente

in

der

vorliegenden

Arbeit

wurden

nach

dem

Gasdiffusionsverfahren vorgenommen. Im speziellen handelte es sich hierbei um die Methode des hanging drop und des sitting drop. Dazu wird die Protein-Lösung mit dem Fällungsmittel vermischt und dann über ein Fällungsmittelreservoir höherer Konzentration gebracht. Entweder geschieht dies hängend an einem silanisiertem Deckplättchen oder sitzend auf einem dafür vorgesehenem Plateau (Abbildung 4). Durch Abdichten mit Silikonöl oder Hochvakuumfett oder durch Aufkleben von Crystal-Clear-Tape (Firma Hampton Research) entsteht ein geschlossenes System. Das Konzentrationsgefälle zwischen Tropfen und Reservoir wird durch Gasdiffusion langsam ausgeglichen, wobei die Fällungsmittelkonzentration im Tropfen steigt, was im Idealfall zur Kristallbildung führt. Initiale Kristallisationstests wurden in der vorliegenden Arbeit vorwiegend mit der sitting drop Methode in 96er Crystal Quick Boxen (Firma Greiner) durchgeführt. Tropfen aus 1 µL Proteinlösung wurden dazu mit dem gleichen Volumen an Kristallisationspuffer vermischt und gegen 70 µL Reservoirlösung äquilibriert. Zur Verfeinerung initialer Bedingungen wurden mit der hanging drop Methode in Linbro-Kultur-Boxen mit 24 Kammern gearbeitet. Hierbei wurden Tropfen mit bis zu 10 µL Volumen gegen ein Reservoir von 500 µL Kristallisationspuffer äquilibriert. Sämtliche Kristallisationsansätze wurden bei 20 °C inkubiert.

Abbildung 4

Schematische Darstellung der hanging drop Methode (A) und der sitting drop Methode (B).

Tränkexperimente Durch ihren hohen Anteil an Solvens sind Proteinkristalle von miteinander vernetzten Lösungsmittelkanälen durchzogen. Verbindungen geringer Molekularmasse besitzen dadurch die Möglichkeit im Kristall zu spezifischen Bindestellen zu diffundieren. Durch das Tränken von 32

3.4 Proteinkristallographie

Kristallen in geeigneten Lösungen können somit Schweratomderivate oder Protein:SubstratKomplexe erhalten werden. Falls sich Bindestellen in Kristallkontakten befinden oder eine Konformationsänderung des Proteins induziert wird kann dies zur Störung des Kristallgitters und somit zur Verminderung der Kristallqualität bis hin zur Zerstörung des Kristalls führen. Schweratomderivate von Kristallen wurden durch Zugabe von Schweratomverbindungen in ungelöster Form zu Kristallen in ihrer Mutterlauge oder einem geeigneten Aufbewahrungspuffer hergestellt. Die Tränkzeit (30 min bis mehrere Tage) der Kristalle wurde entsprechend ihrer Integrität in der jeweiligen Lösung angepasst. Kokristallisation Falls Tränkexperimente scheitern, weil die Bindestellen für das entsprechende Substrat im Kristall nicht erreichbar sind, bietet sich alternativ die Kokristallisation an. Hierzu wird das Protein mit dem Substrat vorinkubiert und dann als Komplex kristallisiert. Sowohl beim Elastase : Scyptolin-A Komplex als auch beim blLAP : Microginin-FR1 Komplex wurden die Proteine mit dem entsprechenden Inhibitor im 1.5-fachen molaren Überschuss für eine halbe Stunde bei 37 °C inkubiert. Dabei lag Scyptolin-A als methanolische Lösung und Microginin-FR1 in DMSO gelöst vor, die bis zur gewünschten Endkonzentration zu den Proteinen geben wurden. 3.4.4

Kristallmontage

Um die Strahlenschäden an den Kristallen möglichst gering zu halten, wurde die Datensammlung während des Röntgenexperiments bei 100 K durchgeführt. Dazu wurde der Kristall mit einem so genannten cryo-loop aufgenommen und möglichst schnell in einen Stickstoffstrom von 100 K gebracht oder in ein Bad aus flüssigen Stickstoff getaucht. Durch die Messungen bei tiefen Temperaturen werden primäre und sekundäre Strahlenschäden im Kristall drastisch verringert (Garman, 1999), wodurch eine Datensammlung an Synchrotrons erst möglich wird. Da sich durch dieses Schockgefrieren Eiskristalle bilden können, werden die Kristalle vor dem Einfrieren kurz in eine Montagelösung getaucht, die so genannte cryoprotectants wie Glycerin oder niedermolekulares PEG in ausreichender Konzentration enthalten. Dadurch kann ein glasartiger Zustand des Wassers erreicht werden was eine Störung verhindern. Nach dem Experiment können diese Kristalle für spätere Messungen gelagert werden, indem das komplette loop unter flüssigem Stickstoff mit einer Schutzkappe versehen wird und dann in ein mit Stickstoff gefülltes Dewargefäß überführt wird. Alle in dieser Arbeit gemessenen Daten wurden unter cryo Bedingungen gesammelt. Die Kristalle von C2-I und C2-II wurden für etwa 1 min in einer Lösung aus dem entsprechenden 33

METHODEN Aufbewahrungspuffer und 30% Glyzerin getaucht und dann eingefroren. Die Elastase : Scyptolin-A-Kristalle wurden mit einer Lösung aus 0.025 M Natriumsulfat in Wasser mit 50% Glyzerin vorbehandelt. Bei den blLAP : Microginin-FR1-Kristallen war im Kristallisationspuffer genug Glasbildner enthalten um ausreichend cryo-Schutz zu gewährleisten. Die DHPONHydrolase-Kristalle wurden in Kristallisationspuffer gegeben der zusätzlich 5% Glyzerin ent­ hielt. Die Tränkzeiten waren bei allen Kristallen um 1 min.

3.5

Röntgenstrukturanalyse

Röntgenstrahlung ist eine elektromagnetische Strahlung im Wellenlängenbereich von 1.0 bis 0.01 nm (1-125 keV). Im Labormaßstab wird Röntgenstrahlung durch Beschuss einer Metallanode, in der Regel aus Kupfer, mit hoch beschleunigten Elektronen erreicht. Neben der Bremsstrahlung der Elektronen tritt hierbei eine charakteristische Strahlung des Elements auf, die für die Röntgenstrukturanalyse genutzt werden kann. Alternativ wird Synchrotronstrahlung genutzt, die bei der Ablenkung von geladenen Teilchen hoher Energie im Magnetfeld entsteht (Rosenbaum et al., 1971). Die bei der Richtungsänderung frei werdende Energie wird als Strahlung in einem Frequenzspektrum vom sichtbaren Licht bis zu harter Röntgenstrahlung emittiert. Durch Monochromatoren kann die gewünschte Wellenlänge sehr genau eingestellt werden. 3.5.1

Physikalische Grundlagen der Röntgenstreuung

Wenn Röntgenstrahlung auf Materie trifft, werden die in der Materie enthaltenen Elektronen durch das Wechselfeld der elektromagnetischen Strahlung zum Schwingen angeregt. Als oszillierende Dipole emittieren sie eine kohärente Streustrahlung, wobei die Wellenlänge der des Primärstrahls entspricht und Phase in einer eindeutigen Beziehung zu der des Primärstrahls steht. Diese Streustrahlung wird auch als elastische bzw. Thomson-Streuung bezeichnet. Die inelastische Streuung (Compton-Streuung) wird bei der Röntgenstrukturanalyse nur in Spezialfällen berücksichtigt. Da die Wellenlänge des Primärstrahls in der Größenordnung der Atomabstände im Streuer liegt, kommt es zu Interferenzerscheinungen, die bei einem Einkristall ein Interferenzmuster (Reflexmuster) zeigen, das durch dessen Gittersymmetrie bestimmt ist. Die Intensität dieser Reflexe wird durch die Elektronendichteverteilung in der asymmetrischen Einheit bestimmt. Bei Betrachtung der Röntgenstrahlung als ebene Welle kann der Streuvorgang anhand des in Abbildung 5 dargestellten Modells veranschaulicht werden.

34

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Abbildung 5 Schematische Darstellung der Röntgenstreuung an Materie. Die einfallende Röntgenstrahlung wird als Ebene Welle betrachtet.

Dabei wird die einfallende Welle durch den Richtungsvektor k0 der Länge 2π/λ und die gestreute Welle durch den Vektor  k mit gleichen Betrag charakterisiert. Die Streuung eines Reflexes am Ort  R ergibt sich durch die Integration über alle Volumenelemente V des Streuers mit der Elektronendichte el r  (Gleichung 6). Der Term vor dem Integral beschreibt die physikalische Ausbreitung der Welle, während das Integral Informationen über die Elektronendichteverteilung enthält und daher auch als Strukturfaktor F bezeichnet wird. Nach Einführung des Streuvektors 2 s=  k − k0 als Vereinfachung wird dieser durch Gleichung 7 beschrieben. Dadurch ist es möglich die ortsabhängige Elektronendichte el r  durch eine Fouriertransformation aus dem realen in den reziproken Raum der von s abhängigen Strukturfaktoren zu überführen.

Streuung=const⋅e

 i  t −k R



0

∫ el  r  e i k −k  r d r

Gleichung 6

Vol

Kreisfrequenz ω und Wellenlänge λ der Röntgenstrahlung Zeit Wellenvektor des einfallenden Strahls ∣k∣=∣k0∣=2/  Wellenvektor des gestreuten Strahls r Elektronendichte am Ort 

=2 c / t k0  k el r 

F  s = ∫ el  r ⋅e

2  i s r

d r

Gleichung 7

Vol

s

k− k0 Streuvektor 2  s= 

35

METHODEN Da bei der Streuung nur dann konstruktive Interferenz auftritt, wenn die Phasenverschiebung von einfallendem und gestreuten Strahl ein ganzzahliges Vielfaches von 2π ist, was auch als Laue-Bedingung bekannt ist, so ergibt sich Gleichung 8. 1

F h , k , l =V EZ ∫

1

1

∫ ∫ el  x , y , z ⋅e 2  i  hxky lz  dxdydz

Gleichung 8

x=0 y=0 z=0

VEZ h, k, l x, y, z

Volumen der Elementarzelle Miller´sche Indizes Koordinaten des Volumenelements = r

Durch Fouriertransformation kann die Elektronendichte in Abhängigkeit der Strukturfaktoren dargestellt werden, wobei die Integrale in Summen über die ganzen Zahlen h, k und l übergehen.

el  x , y , z =

1 −2 i hxkylz F h , k ,l ⋅e ∑ ∑ ∑ V EZ h k l

Gleichung 9

Der Strukturfaktor F kann als komplexe Zahl bestehend aus der Amplitude F(h,k,l) und der Phase α(hkl) beschrieben werden (Gleichung 10). Da die Reflexintensitäten Iobs(h,k,l) propor­ tional zum Betragsquadrat des Strukturfaktors ist (Gleichung 11), ist der Realteil aus Gleichung 10 durch Messung der Intensität experimentell zugänglich. Der Imaginärteil und somit die Phasen, sind jedoch nicht direkt zugänglich. Dieses so genannte Phasenproblem der Röntgenstrukturanalyse kann durch indirekte Methoden gelöst werden (Kap. 3.5.7, 3.5.8, 3.5.9). F h , k , l= F  h , k , l ⋅e i  h ,k ,l 

2

Gleichung 10

*

const⋅I obs h , k , l=∣F  h , k , l∣ =F h , k , l ⋅F h , k ,l 

3.5.2

Gleichung 11

Reziprokes Gitter und Ewaldkonstruktion

Das Braggsche Gesetz besagt, dass bei Streuung an kristallinen Systemen Reflexe nur unter einen bestimmten Glanzwinkel θhkl auftreten (Gleichung 12). Hierbei wird der Sreuprozess als Reflektion an Scharen paralleler Netzebenen (hkl) des Kristalls interpretiert. Ist die Phasendifferenz zweier benachbarter Wellenzüge ein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge des einfallenden Strahls, dann tritt konstruktive Interferenz auf. Aus der Laue-Bedingung ergibt

36

3.5 Röntgenstrukturanalyse

sich, dass der Streuvektor s hkl der Länge 1/dhkl senkrecht auf den zugehörigen Netzebenen steht, was zusammen mit ∣s hkl∣=2sin / zu Gleichung 12 führt. n =2d hkl sin  hkl n λ dhkl θhkl

Gleichung 12

1, 2, 3, .... Wellenlänge [Å] Netzebenenabstand [Å] Glanzwinkel des Reflexes (hkl) [°]

Abbildung 6 Schematische Darstellung der Röntgenstreuung entsprechend dem Braggschen Gesetz. Positive Interferenz tritt nur auf, wenn der Gangunterschied der gestreuten Welle einem Vielfachen der Wellenlänge λ entspricht.

Werden die Streuvektoren s hkl der Reflexe von einem gemeinsamen Ursprung aus abgetragen, so definieren deren Endpunkte P(hkl) das so genannte reziproke Gitter mit den  *=s 100 ,  Basisvektoren a b *=s 010 und c *=s 001 . Zusammen mit der Laue-Bedingung wird diese räumliche Beziehung durch Gleichung 13 beschrieben.

s hkl =h

 b×c c × a a × b k l =h  a *k b *l c * a  b×c  a  b×c   a  b ×c  

Gleichung 13

37

METHODEN

Abbildung 7 Die Ewaldkonstruktion zeigt den Zusammenhang zwischen Real- und reziproken Raum in einem Diffraktionsexperiment mit monochromatischer Strahlung. Der Kristall liegt in der Mitte der Ewaldkugel mit dem Radius 1/λ. Der Ursprung O der reziproken Raums ist als Schnittpunkt des Primärstrahl mit der Ewaldkugel definiert. Ein Reflex tritt auf, wenn der Endpunkt des Streuvektors s hkl (ein reziproker Gitterpunkt) auf der Oberfläche der Ewaldkugel zu liegen kommt.

Mit Hilfe der Ewaldkonstruktion wird dieser Zusammenhang sowie die Reflexbedingung nach dem Braggschen Gesetz veranschaulicht. Die so genannte Ewaldkugel mit dem Radius 1/=∣k∣/2  hat den Kristall als Mittelpunkt. Der Schnittpunkt des Primärstrahls mit der Ewaldkugel ist als Ursprung des reziproken Gitters definiert. Ein Reflex entsteht dann, wenn ein Gitterpunkt P(hkl), also der Endpunkt des Streuvektors s hkl , auf der Oberfläche der Ewaldkugel zu liegen kommt. In diesem Fall steht der Streuvektor senkrecht auf der reflektierenden Gitterebene und seine Länge beträgt 1/ d hkl =2sin hkl /  womit das Braggsche Gesetz erfüllt ist. Durch Drehen des Kristalls, und mit ihm des realen Gitters, wird auch das reziproke Gitter gedreht, wodurch weitere P(hkl) auf die Oberfläche der Ewaldkugel gebracht werden. Wird die anomale Streuung vernachlässigt, dann besitzt das reziproke Gitter im Unterschied zum realen Gitter ein Inversionszentrum. Die Intensität eines Reflexes hkl ist identisch mit der des Reflexes h k l , da es keinen Unterschied macht, ob der Röntgenstrahl an der Ober- oder Unterseite einer Gitterebene gestreut wird. Das Friedelsche Gesetz beschreibt diese Eigenschaft (Gleichung 14). Im Falle anomaler Streuung verliert das Friedelsche Gesetz seine Gültigkeit und die resultierenden Intensitätsdifferenzen können zur Lösung des Phasenproblems herangezogen werden (Kap. 3.5.8).

38

3.5 Röntgenstrukturanalyse

2 2 ∣F hkl ∣ =∣F  h  k l ∣ und somit I hkl= I  h k l 

3.5.3

Gleichung 14

Temperaturfaktoren

Eine alternative Beschreibung des Strukturfaktors ist durch die Summe der Streubeiträge aller Atome in der Elementarzelle möglich (Gleichung 15). Sowohl die thermische Bewegung der Atome sowie Fehlordnungen im Kristallgitter führen zu einer Verringerung der Intensität der Streustrahlung zu größeren Streuwinkeln hin (Debye, 1914). Dies wird durch den Korrekturterm exp −0.25 Bi /d 2hkl  , einer Gauß Funktion von (1/dhkl) berücksichtigt. Die Größe Bi wird dabei Temperaturfaktor genannt und ist proportional zum mittleren Verschiebungsquadrat 〈u 2 〉 eines Atoms von seiner Ruheposition (Gleichung 16). Bei sehr hoch aufgelösten Kristallstrukturen ist es möglich, anisotrope Versetzungsparameter zu bestimmen, um so die unterschiedlichen Ampli­ tuden der Auslenkung in die drei Raumrichtungen zu beschreiben, was aber zu einer erheblich Erhöhung der Modellparameter führt. n

F hkl =∑ f 0i e−0.25 B

2

i

/d hkl

e2  i r s i

Gleichung 15

i

0

Zahl der Elektronen von Atom i Temperaturfaktor (B-Faktor)

fi Bi

2

2

Bi =8 〈 ui 〉

Gleichung 16

Bestimmung des absoluten Skalierungsfaktors und des mittleren Temperaturfaktors Der Skalierungsfaktor C, der die Strukturfaktoramplituden auf eine absolute Skala bringt, sowie der mittlere Temperaturfaktor B können durch ein Wilson-Diagramm bestimmt werden. Dazu wird der Quotient aus der mittleren Intensität einer Auflösungsschale 〈 I  s 〉 und der berechneten Intensität aller Atome im Ruhezustand 〈 I abs  s 〉 gegen sin /2 aufgetragen. Der Skalierungsfaktor C und der Temperaturfaktor B können dann durch lineare Regression (Gleichung 17) bestimmt werden. Durch die Anwesenheit von charakteristischen Sekundär­ strukturen in Proteinen gibt es Abweichungen vom linearen Verlauf bei niedriger Auflösung, was die Bestimmung dieser Faktoren durch das Wilson-Diagramm auf Daten mit einer Auflösung besser als 3 Å beschränkt.

39

METHODEN

ln

〈 I s 〉 sin 2  =ln C−2B 2 ∑  f 0i 2

Gleichung 17

i

3.5.4

Patterson-Funktion

Die Patterson-Funktion (Gleichung 18) ist eine Fouriertransformation der gemessenen Reflexintensitäten. Sie kann direkt ohne Kenntnis der Phasenwinkel aus den gemessenen Daten berechnet werden. Um eine Verwechslung mit den Realraumkoordinaten x,y,z zu vermeiden

u beschrieben. werden die Koordinaten des Pattersonraums als Triplett (u,v,w) des Vektors  Durch umformen der Patterson-Funktion in Gleichung 19 kann diese als Summation aller Vektoren zwischen allen Atomen der Einheitszelle interpretiert werden, da das Produkt der u nur dann verschieden von Null ist, wenn u Elektronendichte am Ort r1 und r1  dem Differenzvektor zweier Atome entspricht. Eine Patterson Funktion mit N Atomen weist somit N(N+1) Maxima auf, die nicht auf dem Ursprung liegen. Da es zu jedem Atompaar zwei Vektoren mit gegensätzlicher Richtung gibt, ist die Patterson-Funktion zentrosymmetrisch. Durch dieses Inversionszentrum im Ursprung werden die Schraubenachsen des Realraums zu einfachen Rotationsachsen im Pattersonraum. Die Höhe der Maxima ist proportional zum Produkt der Anzahl der Atome der jeweiligen Atompaare.

P u , v , w=

1 ∣F hkl ∣2 cos[2 hukvlw ] ∑ V EZ h

Gleichung 18

P  u =∫  r1⋅ −[u −r1 ] d r1

Gleichung 19

r1

In der Kleinmolekül-Kristallographie mit nur wenigen Atomen in der Elementarzelle können die Positionen im Realraum mit numerischen Algorithmen anhand der Differenzvektoren rekonstruiert werden. In der Proteinkristallographie ist die Anzahl der Atome um ein Vielfaches größer und die Datenqualität zu gering, was diese Art der Strukturlösung bis auf wenige Fälle unmöglich

macht.

Die Patterson-Funktion

findet

jedoch

bei der

Bestimmung

der

Schweratomkoordinaten von derivatisierten Kristallen aus anomalen oder isomorphen Differenzen (Kap. 3.5.7 und 3.5.8), bei der Methode des molekularen Ersatzes (Kap. 3.5.9) und zur Bestimmung der Rotations- und Translationskomponenten nichtkristallographischer Symmetrie ihre Anwendung.

40

3.5 Röntgenstrukturanalyse

3.5.5

Datensammlung

Für die Röntgenstrukturanalyse ist es notwendig einen vollständigen Datensatz aufzunehmen, der alle Reflexe bis zu einer gegebenen Auflösungsgrenze beinhaltet. Die Qualität der gesammelten Daten ist von entscheidender Bedeutung für die Strukturlösung und die Qualität des resultierenden Modells, da Fehler und Ungenauigkeiten zu Problemen bei der Raumgruppenbestimmung, bei der Phasierung und nachfolgenden Berechnungen führen können, die unter Umständen die Strukturlösung ganz unmöglich machen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Messung der Reflexintensitäten nach der Rotationsmethode (Arndt et al., 1973) vorgenommen. Hierbei wird der zu vermessende Kristall in kleinen Intervallen um eine definierte Achse gedreht. Während dieser Drehung werden von einem positionsauflösenden Detektor die gestreuten Röntgenquanten akkumuliert und so ein Bild (auch image oder frame) erhalten, das die Intensitätswerte zu jeden in diesem Winkelbereich gemessenen Reflex enthält. Üblicherweise werden zu diesem Bild noch Informationen zur Detektorgeometrie gespeichert. Bei Messungen an den Hausanlagen wurde die Röntgenstrahlung mit einer wassergekühlten rotierenden Kupferanode erzeugt, die bei 45 kV und 120 mA betrieben wurde. Die dabei entstehende Kupfer Kα Strahlung (λ=1.54 Å) wurde mit einem Graphit-Monochromator selek­ tiert und auf 0.3 – 0.4 mm je nach Kristallgröße kollimiert. Die Messanordnung der Hausanlage mit dem image plate Detektor ist exemplarisch in Abbildung 8 gezeigt. Die Belichtungszeit betrug 10 bis 15 min pro image, wobei der Kristall um 0.5 bis 1 ° um die φ-Achse gedreht wird. Messungen mit Synchrotronstrahlung wurde an der Swiss Light Source (SLS, Villigen, Schweiz, beamline X06SA), am Berliner Elektronen­ speicherring (BESSY, Berlin, Deutschland, beamline BL 14.1) und am Deutschen Elektronen Synchrotron Hamburg (DESY, Hamburg, beamline X11) durchgeführt. Die images wurden mit CCD Detektoren (marCCD-165 am BESSY und DESY, marCCD-165 und -225 am SLS, beide Firma MarResearch) aufgenommen. Dabei wurde die Belichtung am BESSY und DESY dosisabhängig durchgeführt während die Belichtungszeit am SLS aufgrund des stärkeren und konstanten Röntgenstrahls 1 Sekunde betrug. Der abgefahrene Winkelbereich pro image betrug an allen Synchrotrons zwischen 0.3 und 1 °.

41

METHODEN

Abbildung 8 Messanordnung an der image plate. Der Kristall kann bei dem verwendeten Goniometersystem nur um φ gedreht werden.

3.5.6

Prozessierung, Skalierung und Reduktion der Datensammlung

Die Rohdaten wurden mit dem Programmpaket XDS (Kabsch, 1988, 1993) prozessiert. Der erste Schritt hierbei ist die Bestimmung der Orientierungsmatrix, die die Lage und Dimensionen eines primitiven Kristallgitter im Verhältnis zu den Laborkoordinaten beschreibt. Anhand der stärksten Reflexe wird dann das reziproke Gitter indiziert. Da die meisten Reflexe nur teilweise auf einen image erfasst sind, werden zunächst dreidimensionale Reflexprofile starker vollständig erfasster Reflexe erstellt. Dies wird für unterschiedliche Detektorregionen und sowie unterschiedlichen Sätzen (batches) von images wiederholt. Im nächsten Schritt werden dann die Reflexe unter Zuhilfenahme des bestmöglichen Profils integriert (profile fitting). Anschließend werden noch geometrische Parameter wie die Zellachsen, Detektorabstand und Orientierung gegen Reflexe verfeinert, die nahe genug an ihrer vorhergesagten Position liegen (post refinement). Die erhaltenen Rohintensitäten und deren Standardabweichungen werden abschließend in Bezug auf Lorentz-Polarisation und Absorption korrigiert und durch eine einfache Skalierung aneinander angepasst. Da sich die experimentellen Bedingungen während der Datensammlung ändern können (schwankende Intensität des Röntgenstrahls, nachlassende Streukraft durch Strahlenschäden oder Anisotropie des Kristalls), müssen die erhaltenen Intensitäten innerhalb des Datensatzes skaliert werden um die durchschnittliche Abweichung der Intensität zwischen den verschiedenen Messungen äquivalenter Reflexe zu minimieren (Evans, 2006). Die Skalierungsfaktoren variieren hierbei mit der Auflösung als auch mit dem Rotationswinkel. Während der Skalierung können teilweise auch durch Strahlungsschäden hervorgerufene Effekte kompensiert werden (Diederichs, 2006). Nach dieser Skalierung wurden die Daten auf die asymmetrische Einheit des 42

3.5 Röntgenstrukturanalyse

reziproken Raumes der Raumgruppe reduziert. Hierzu wurden die Programme XSCALE und XDSCONV des XDS-Pakets (Kabsch, 1988, 1993) benutzt. Bei Datensätzen mit schon bekannter Raumgruppe und Zellparametern wurde das Programm APRV (Kroemer et al., 2004) benutzt, das die beschriebenen Schritte der Programme XDS, XSCALE und XDSCONV automatisch durchführt und die Eingabeparameter optimiert. Zur Bewertung der Datenqualität werden eine Reihe von statistischen Indikatoren herangezogen, welche alle in Auflösungsschalen berechnet werden, da die Qualität der Reflexintensitäten stark auflösungsabhängig ist. Der R-Faktor (reliability) misst die Genauigkeit als Verhältnis zwischen den durchschnittlichen Differenzen der Intensitäten äquivalenter Reflexe und der durchschnittlichen Intensität dieses Reflexes. Der gebräuchlichste R-Faktor ist der Rsym (Gleichung 20), welcher die Übereinstimmung symmetrieverwandter Reflexe beschreibt. Da der Rsym stark von der Multiplizität der Messungen beeinflusst wird, indem sich sein Wert verschlechtert je öfter eine Reflex gemessen wird, schwächt dies seine Aussagekraft gerade bei schwachredundant gemessenen Daten. Deshalb wurde der Rmeas (auch Rr.i.m.) als robusteres Kriterium eingeführt (Gleichung 21) um eine realistischere Beurteilung der Daten zu erlauben (Diederichs & Karplus, 1997). Zusätzlich zu den R-Faktoren wird noch das Signal-RauschVerhältnis I/σ(I), sowie die Vollständigkeit und Multiplizität der Daten als Qualitätskriterien aufgeführt. n hkl

∑ ∑ ∣I hkl i −〈 I hkl 〉∣ R sym=

hkl i=1

Gleichung 20

nhkl

∑ ∑∣I hkl i∣ hkl i=1

I hkl i 〈 I  hkl 〉

∑

Rmeas = hkl

Intensität des i-ten Reflexes (hkl) mittlere Intensität aller symmetrieverwandten Reflexe (hkl)



n hkl n ∑∣I hkl i−〈 I  hkl〉∣ n hkl −1 i=1 hkl

n hkl

Gleichung 21

∑ ∑ ∣I hkl i∣ hkl i=1

nhkl

3.5.7

Anzahl unabhängiger Messungen des Reflexes (hkl)

Phasenbestimmung durch isomorphen Ersatz

Die Methode der Phasenbestimmung durch isomorphen Ersatz beruht auf der Bindung von elektronenreichen Schweratomen an definierte Positionen des Proteins, ohne dabei Konfor­ 43

METHODEN mationsänderungen am Protein oder eine Umordnung des Kristallgitters zu verursachen. Die zusätzliche Elektronendichte der Schweratome führt zu einer Veränderung der Reflexintensitäten im Vergleich zum nativen Kristall, die zur Bestimmung der Proteinphasen genutzt werden kann (Green et al., 1954). Schweratomderivate können durch Kokristallisation oder durch Tränk­ experimente mit nativen Kristallen hergestellt werden. Obwohl es einige Anhaltspunkte gibt, die eine erfolgreiche Derivatisierung versprechen, ist dies ein weitgehend empirischer Prozess. Es müssen oftmals viele verschiedene Verbindungen und Bedingungen durchprobiert werden, bis ein isomorphes Derivat mit ausreichend stark gebundenen Schweratomen erhalten wird. Um festzustellen, ob eine Derivatisierung erfolgreich war, müssen der native und der Schweratomdatensatz aufeinander skaliert werden. In dieser Arbeit wurden die Datensätze mit dem Programm SCALEIT (CCP4, 1994) nach der Kraut Methode (Kraut et al., 1962) aufeinander skaliert. Der hierzu notwendige Skalierungsfaktor k berechnet sich nach Gleichung 22.

k=

∑ F P⋅F PH 1 hkl

2

∑F hkl

2 PH

{[

∑ F 2P⋅∑ F 2PH

3 hkl 1− 1− ⋅ hkl 4 ∑ F P⋅F PH



hkl

2



]} 1 /2

∑∣F PH −F P∣ Riso = hkl ∑ FP

Gleichung 22

Gleichung 23

hkl

k FPH FP

Skalierungsfaktor Strukturfaktoramplitude des Derivats Strukturfaktoramplitude des nativen Kristalls

Nach der Skalierung kann anhand der Größe der Differenzen der Strukturfaktoramplituden die Qualität eines Derivates beurteilt werden. Hierzu wird der isomorphe R-Faktor Riso (Gleichung 23) berechnet. Werte zwischen 10 und 30% deuten auf ein brauchbares Derivat hin, wohingegen kleinere Werte auf eine schwache bzw. nicht erfolgreiche Derivatisierung anzeigen. Zu hohe Werte jenseits von 25% sind aber meist ein Zeichen für Nicht-Isomorphie der beiden Datensätze. Als weiteres Qualitätskriterium dient der auflösungsabhängige Verlauf der isomorphen Differenzen 〈∣F PH − F P∣〉 . Während die isomorphen Differenzen aufgrund der Proportionalität zu FP mit zunehmender Auflösung abnehmen, bleibt der nicht-isomorphe Anteil gleich oder erhöht sich (McRee, 1993).

44

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Bestimmung der Schweratompositionen Um die isomorphen Differenzen für die Phasierung nutzen zu können müssen die Schweratompositionen bekannt sein. Diese können durch die Interpretation einer PattersonFunktion (Gleichung 18) erhalten werden, indem die Quadrate der isomorphen Differenzen  F iso 2= F PH −F P 2 als Koeffizienten eingesetzt werden. Im Idealfall würden hier nur die Differenzvektoren zwischen den Schweratomen als Maxima der Funktion erscheinen. Vektoren zwischen Atomen und ihren Symmetrieverwandten erzeugen Maxima (self peaks) auf so genannten Harker Ebenen. Auf den anderen Ebenen finden sich die Maxima die zu den Vektoren zwischen verschiedenen Atomen gehören (cross-peaks). Somit sind die Maxima auf den Harker Ebenen einfacher zuzuordnen, da sie oft weniger verrauscht sind. Sie bilden einen guten Startpunkt zur Interpretation der Patterson-Funktion. Sobald die ersten Schweratompositionen gefunden sind, können mit den daraus berechneten initialen Phasen weitere Positionen durch Differenz-Fouriersynthese (Gleichung 24) ermittelt werden. In dieser Arbeit wurden die Differenz Patterson-Funktion mit FFT (CCP4, 1994) berechnet und mit den Programmen XCONTOUR und XPADPRED aus dem XTALVIEW Programmpaket (McRee, 1992) interpretiert. Im Falle komplexer Patterson-Funktionen wurde mit dem Programm SHELXD (Schneider & Sheldrick, 2002) eine automatische Interpretation der Daten durchgeführt.   x , y , z =∑  F PH −F P  e

−i  −2 i  hx kylz

e

hkl

Gleichung 24

Phasierung und Verfeinerung der Schweratomparameter Sobald die Schweratomkoordinaten für ein Derivat i bekannt sind, kann der Schweratom­ strukturfaktor F

Hi

berechnet werden (Gleichung 15). Mit Hilfe der Harkerkonstruktion (Harker,

1956) können dann die Proteinphasen αP in einem Argand Diagramm bestimmt werden. Zuerst wird dabei ein Kreis mit dem Radius FP um den Ursprung gezeichnet. Dieser repräsentiert alle möglichen Werte für FP (Abbildung 9). Die Inverse des Strukturfaktors F Hi wird vom Ursprung aus abgetragen und ein Kreis mit dem Radius F PHi um ihren Endpunkt gezeichnet. Die Konstruktion wird für alle Derivate wiederholt. Die nativen Proteinphase αP wird ergibt sich dann aus dem Schnittpunkt aller Kreise. Mit dieser Konstruktion kann eine eindeutige Phase αP nur bei mindestens zwei Derivaten bestimmt werden (MIR, Abbildung 9B). Falls es nur ein Derivat gibt resultiert dies in zwei 45

METHODEN äquivalenten Schnittpunkten und somit in einem zweideutigen Ergebnis für die Proteinphase (Abbildung 9A). Diese Zweideutigkeit kann durch zusätzliche Phaseninformation aus anomaler Streuung (SIRAS, Kap. 3.5.8), Dichtemodifikation (Kap. 3.5.11) oder direkte Methoden (Liu et al., 1999; Wang et al., 2004) gebrochen werden. Der größte Fehler der Phasenbestimmung durch isomorphen Ersatz wird durch Nichtisomorphie hervorgerufen und lässt sich nach Blow & Crick (1959) als lack of closure (ε) für jedes Derivat i beschreiben. Dabei werden F Fehler i vollständig zu F

PHi

P

und F

Hi

als fehlerfrei angenommen und der

addiert (Abbildung 10).

Abbildung 9 Harkerkonstruktion im Argand-Diagramm. (A) Der SIR Fall. Die Schnittpunkte H und G der beiden Kreise definieren die beiden gleich wahrscheinlichen Möglichkeiten für αP. (B) MIR Phasierung. Falls zwei isomorphe Derivate vorliegen schneiden sich die drei Kreise in nur einem Punkt der eindeutig den Wert von αP festlegt.

46

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Abbildung 10 Fehlerbehandlung bei der Phasierung durch isomorphen Ersatz. (A) Im idealen isomorphen Fall addieren sich die Strukturfaktoren F P und F Hi , so dass sie F PHi ergeben. (B) In der Praxis schließt sich diese Dreieck aufgrund von Fehlern in den Schweratomparametern, Messfehlern und Nichtisomorphie nicht. F Hi wird immer noch an die Spitze von F P gesetzt, da beide als fehlerfrei angenommen werden. Die entstehende Lücke wird εi genannt.

In der vorliegenden Arbeit wurde vorwiegend das Programm SHARP (Bricogne et al., 2003) zur Verfeinerung der Schweratomparameter benutzt. In diesem Programm werden auf der Methode des maximum-likelihood basierende Zielfunktionen verwendet, um die Koordinaten, Besetzung, und B-Faktoren der Schweratome sowie auch die Skalierungsfaktoren und NichtIsomorphie Parameter zu berechnen. Die Qualität des Derivats und die Güte der SchweratomSubstruktur wurden anhand der Indikatoren figure of merit (FOM), Cullis R-Faktor RCullis sowie der phasing power (PP) bewertet. Der FOM leitet sich von der Wahrscheinlichkeitsverteilung der Phase für einen gegebene Reflex ab und wird für die Wichtung der Strukturfaktoren während der Berechnung von initialen Elektronendichtekarten herangezogen (Kap. 3.5.12). Es kann gezeigt werden, dass FOM dem durchschnittlichen Kosinus des Phasenfehlers eines Strukturfaktors hkl entspricht (Drenth, 1994). RCullis setzt den lack of closure mit der Differenz zwischen den nativen Strukturfaktoramplituden und denen des Derivates in Beziehung (Gleichung 25). Dieser Wert sollte für brauchbare Derivate unter 0.8 und für sehr gute unter 0.6 liegen. Die phasing power ist als Verhältnis zwischen der berechneten Strukturfaktoren der Schweratome und dem lack of closure (Gleichung 26). Werte über eins zeigen ein isomorphes Signal an, das größer als der Messfehler ist und deuten somit auf ein brauchbares Derivat hin.

∑∣F PHi−∣F P F Hi∣∣ RCullis= hkl ∑∣F PHi−F P∣

Gleichung 25

hkl

47

METHODEN

∑ F Hi PP=

hkl

Gleichung 26

∑∣F PHi−∣F P F Hi∣∣ hkl

Sowohl der RCullis als auch die PP sind fehleranfällig, da bei kleinen isomorphen Differenzen ∣F PHi − F P∣ und dazu passenden Besetzungszahlen  F Hi≈0 der Substruktur diese Werte sehr gut sein können, obwohl die resultierenden nativen Phasen sehr schlecht sind. Deshalb ist eine Inspektion der resultierenden Elektronendichte immer notwendig, um das Substrukturmodell endgültig zu validieren. 3.5.8

Phasenbestimmung durch anomale Streuung

Falls die Energie der bei der Datensammlung benutzten Röntgenstrahlung in der Nähe der Bindungsenergie von Elektronen eines Streuers liegt, kommt es zu Resonanzerscheinungen und die Annahme der elastischen Streuung verliert ihre Gültigkeit. Als Folge dieser inelastischen Wechselwirkung verändert sich sowohl die Intensität als auch die Phasenbeziehung der Streustrahlung gegenüber der Primärstrahlung. Dieser Effekt wird als anomale Streuung bezeichnet und wird in der Nähe aller Absorptionskanten beobachtet. In der Praxis werden die anomalen Streueffekte an den K- und L-Kanten der schwereren Elemente genutzt. Der anomalen Streuung wird durch zusätzliche wellenlängenabhängige Terme bei der Beschreibung des Strukturfaktors Rechnung getragen (Gleichung 27). Nach dem Friedel'schen Gesetz haben die Reflexe eines Friedelpaars die gleiche Amplitude aber invertierte Phasen. Wenn ein Proteinkristall nun einen anomalen Streuer A enthält, wird sein Beitrag durch einen wellenlängenunabhängigen

Strukturfaktor

F

A

und

einen

wellenlängenabhängigen

Strukturfaktor F A +  oder F A - beschrieben (Gleichung 28). Der wellenlängenabhängige Teil selbst ist durch zwei Komponenten beschrieben, einer reellen Komponente F ' A und einer imaginären Komponente F '' A deren Phase um 90° gegen die der reellen Komponente verschoben ist. Der Unterschied zwischen den anomalen Komponenten F '' A der Friedelpaare führt zu einem Unterschied in der Größe von F + und F - und damit zum Bruch des Friedel-Gesetzes (Abbildung 11). f = f 0 f 'if ''  f0 f '  f '' 

48

wellenlängenunabhängiger Streufaktor reeller Anteil des wellenlängenabhängigen Streufaktors imaginärer Anteil des wellenlängenabhängigen Streufaktors

Gleichung 27

3.5 Röntgenstrukturanalyse

F + = F P F A  +=F P F A F ' AF '' A F - = F P F A - = F P F A F ' A−F '' A FP FA F ' A= f '/ f 0  F A

F '' A= f ''/ f 0  F A

Gleichung 28

Strukturfaktor der normal streuenden Atome wellenlängenunabhängiger Teil des Strukturfaktors der anomalen Streuer reelle (normale) Komponente des wellenlängenabhängigen Teil des Strukturfaktors der anomalen Streuer imaginäre (anomale) Komponente des wellenlängenabhängigen Teil des Strukturfaktors der anomalen Streuer

Abbildung 11 Verletzung des Friedelgesetz im Falle der anomalen Streuung. Die Strukturfaktoren die zu den (-) Friedelpartner gehören wurden an der realen Achse für Illustrationszwecke gespiegelt. Die Symbole sind in Gleichung 28 erklärt. Während F P , F A und F A ' in beiden Friedelpartnern gleich sind, führen die Vorzeichenunterschiede in F A '' zu unterschiedlichen Phasen und Amplituden von F  + und F -  und somit zur Verletzung des Friedelgesetzes. Zur besseren Darstellung wurde die Größe der anomalen Beträge stark übertrieben.

Um anomale Streuung für die Phasierung nutzen zu können, ist es nötig mit einer Wellenlänge nahe einer Absorptionskante zu messen. Die K-Kanten der häufigsten Elemente in Proteinkristallen (C, N, O, P, S) sind technisch nicht zugänglich. Ab der vierten Periode der Periodensystems liegen die Übergangsenergien der K- und L-Schalen in den Bereich der heutzutage an Synchrotrons einstellbaren Energien. Da selbst starke anomale Streuer nur einen Anteil von ungefähr 3-5% am Gesamtsignal haben, müssen die Messungen sehr redundant und präzise durchgeführt werden. Hierbei muss jedoch berücksichtigt werden, dass bei langen Belichtungszeiten in der Nähe der Absorptionskanten gerade die anomalen Streuer als erstes unter Strahlenschäden leiden und somit mit einer zeitlich fortschreitenden Verschlechterung der Datenqualität zu rechnen ist. Anomale Streuer können können wie schon in Kap. 3.4.3 beschrieben durch Kokristallisation oder Tränkexperimente in den Proteinkristall eingebracht werden. Eine elegante Methode zur Einführung von anomaler Streuer in Proteinkristalle ist die direkte Inkorporation von Selen in Form von Selenomethionin (SeMet) während der 49

METHODEN Proteinherstellung (Hendrickson et. al., 1990). Das SeMet-Derivat kann oftmals unter den gleichen Bedingungen gereinigt und kristallisiert werden, wie das native Protein. Es ist jedoch auf eine reduzierende Umgebung zu achten, da es sonst bei Oxidation der Selenatome zu einer Verschiebung der Absorptionskante kommt. Kombination von isomorphen Ersatz mit anomaler Streuung Viele Schweratom-Derivate, die für den isomorphen Ersatz benutzt werden, eignen sich auch als anomale Streuer, da ihre Absorptionskanten in Energiebereichen liegen, die gut zugänglich sind. Wenn die Friedelpaare gemessen und separat ausgewertet werden, kann mit den isomorphen Differenzen zwischen Derivat und nativen Daten und den anomalen Differenzen zwischen den Friedelpaaren des Derivates die Zweideutigkeit der Phasen im SIR Fall gebrochen werden (Abbildung 12A). Somit können bei ausreichender Isomorphie der Derivat- mit den nativen Daten schon mit einem Derivat eindeutige Phasen bestimmt werden (SIRAS). Durch weitere isomorphe Derivate kann die Qualität der Phasen verbessert werden (MIRAS).

Abbildung 12 Harkerkonstruktionen für die SAD/SIRAS und MAD/MIRAS Fälle. (A) Im SAD Fall mit einem anomalen Streuer A gibt es zwei Möglichkeiten G und H als Endpunkt von F PA (der Vektor F PA ist nicht gezeigt). Falls ein nativer Datensatz hinzugefügt wird (SIRAS), dann schneidet der Kreis mit dem Radius F P (gepunktet) die anderen beiden Kreise nur in G und hebt damit die Zweideutigkeit der Phasen auf. (B) Im MAD Experiment kann die native Proteinphase  P eindeutig bestimmt werden, wenn ein zweiter Datensatz bei anderer Wellenlänge aufgenommen wird. Dadurch ändert sich die reelle Komponente des wellenlängenabhängigen Beitrags zum Strukturfaktor F A ' des anomalen Streuers. Dies ist äquivalent zur Einführung eines neuen Derivates (gestrichelte Linie, Messungen bei λ2). Im Falle von MIRAS reduziert ein natives Derivat (gepunktete Linie) die Zweideutigkeit der Phasen noch mehr. In dieser Darstellung wird MAD als Spezialfall von MIRAS gedeutet.

50

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Anomale Streuung bei multiplen Wellenlängen (MAD) Bei einem MAD Experiment (multiwavelength anomalous diffraction) werden von einem Proteinkristall, der anomale Streuer enthält, Datensätze bei verschiedenen Wellenlängen nahe einer passenden Absorptionskante aufgenommen. An der Kante ändern sich die Streufaktoren f ' und f '' auf eine charakteristische Weise (Abbildung 13). Der Wert von f '' lässt sich experimentell durch einen Fluoreszenz-scan und anschließender Auftragung der Absorption µ gegen die Röntgenenergie bestimmen (Gleichung 29).

f '' E= m e, e c h µ

me c 2he 2

E⋅µ  E

Gleichung 29

Elektronenmasse und Ladung Lichtgeschwindigkeit Plancksches Wirkungsquantum Absorption

Die Werte für den reellen Teil der anomalen Streuung f ' können durch die Kramers-Kronig Transformation (Hendrickson et al., 1985) aus der Kurve für f '' gewonnen werden. Um die Absorptionskante besitzen diese Kurve charakteristische Merkmale, die für eine MAD Phasierung genutzt werden können (Abbildung 13). An der Kante steigt f '' steil an während f ' am Wendepunkt (inflection point) von der f '' Kurve sein Minimum hat und dann wieder ansteigt.

Abbildung 13 Die Streufaktoren f '' und f ' als Funktion der Röntgenenergie E. lrm, low energie remote; ip, inflection point; pk, peak; hrm, high energy remote.

Für ein MAD Experiment ist es notwendig, die Messungen am gleichen Kristall durchzuführen, da die zu messenden Unterschiede in den Intensitäten sehr klein sind und sich normalerweise im Bereich von 1-3% befinden. In der Regel werden Datensätze bei drei verschiedenen Wellenlängen gemessen, wobei diese je nach ihrer Position auf der f '' -Kurve peak-, inflection point- oder high/low-energy-remote-Datensatz genannt werden. Der peak51

METHODEN Datensatz wird bei der Wellenlänge gemessen, bei der f '' sein Maximum hat, weil dort das anomale Signal am stärksten ist. Der inflection point-Datensatz wird bei der Wellenlänge des Wendepunkts der f '' -Kurve gemessen. Hier hat

f ' sein Minimum und somit sind die

isomorphen Unterschiede zwischen diesen und allen anderen Datensätzen die größten (Abbildung 12B). Die remote-Datensätze werden bei einer Energie von ca. 1000 eV jenseits der Absorptionskante gemessen. Wird nun eine Wellenlänge mit höherer Energie als die der Absorptionskante gewählt, ergibt sich oft ein signifikantes anomales Signal in diesem Datensatz, das für die Phasierung herangezogen werden kann. Da der remote-Datensatz üblicherweise für die Verfeinerung genutzt wird, muss hierfür der anomale Streubeitrag berücksichtigt werden und die Strukturfaktortabellen der verwendeten Programme entsprechend angepasst werden. Da bei einen MAD Experiment der peak- und inflection-point-Datensatz von großer Bedeutung für das Resultat sind, ist es unerlässlich einen Fluoreszenz-scan durchzuführen um die korrekten Wellenlängen zu bestimmen, da die Position der Absorptionskante auch von der jeweiligen Umgebung des anomalen Streuers im Kristall und dessen Oxidationsstufe abhängt. Bestimmung der Schweratompositionen durch anomale Streuung Für jeden Reflex hkl wird die anomale (bzw. Bijvoet) Differenz durch die Differenz der Intensitäten der Friedelpaare bestimmt (Gleichung 30).  F ano = F(+)− F(-)  

F(+) F(-)

Gleichung 30

Strukturfaktoramplituden der Friedelpaare bei der Wellenlänge 

Wenn Strukturfaktoramplituden bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt werden, dann wird die Differenz der Durchschnittsamplituden der Friedelpaare bei zwei verschiedenen Wellenlängen dispersive Differenz genannt (Gleichung 31). Diese dispersiven Differenzen ergeben sich aus der Änderung des wellenlängenabhängigen Teil der Streufaktoren ( f ' ) der anomalen Streuer zwischen zwei Wellenlängen. Da sich die Streufaktoren aller anderen Atome im Proteinkristall im Vergleich nicht ändern, sind diese Differenzen analog zu behandeln wie der isomorphe Ersatz. 1  −2 F ∣  F disp=∣ F 1 2

52

 F  F

Durchschnittswert von Durchschnittswert von

Gleichung 31  

F(+) und F(+) und

 

F(-) bei 1 F(-) bei  2

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Sowohl die anomalen als auch die dispersen Differenzen können genutzt werden, um eine Pattersonfunktion zu berechnen. Über die resultierenden peaks, die in einem MAD Experiment in beiden Fällen gleich sein sollten, lassen sich dann die Schweratompositionen bestimmen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, durch Lösen von Gleichung 32 die Amplitude des wellen­ längenunabhängigen Teil des Strukturfaktors der anomalen Substruktur FA (Abbildung 11) zu bestimmen und mit diesen FA Werten eine Patterson Funktion zu berechnen. Oftmals ergeben sich durch diese Methode die besten Resultate, jedoch können sich in schwierigen Fällen die anomalen Differenz-Pattersonfunktionen des peak-Datensatzes als die bessere Variante herausstellen. In dieser Arbeit wurden die MAD Datensätze mit dem Programm XPREP (Bruker Nonius) skaliert und analysiert. Um die Datenqualität zu beurteilen wurden das anomale Signal zu Rausch Verhältnis (> 1.3 σ), sowie der Korrelationskoeffizient der anomalen Differenzen zwischen den Datensätzen (> 30%) bestimmt. Weiterhin wurde XPREP benutzt um die  F und FA Werte für die Substrukturbestimmung mit SHELXD (Schneider & Sheldrick, 2002) zu berechnen. Phasierung und Verfeinerung der Schweratomparameter Nachdem die Substruktur der anomalen Streuer bestimmt ist, können deren Strukturfaktoren F A (+) und F A (-) mittels der Atompositionen und entsprechenden Streufaktoren für die gegebene Wellenlänge berechnet werden (Gleichung 15). In ähnlicher Weise, wie im SIR/MIR Fall, können dann die Strukturfaktoren des normal streuenden Teils der Proteins F

PA

durch eine

Harkerkonstruktion bestimmt werden (Abbildung 12B). Da das Friedelgesetz für den normal streuenden Teil gültig ist, ergibt sich der Phasenwinkel von F

PA

aus dem Schnittpunkt der

beiden Kreise. Die Zweideutigkeit der SAD Phasen kann durch das Einbringen von weiteren Wellenlängen ähnlich wie im MIR Fall aufgelöst werden. Alternativ können aus Mehrwellenlängendaten mit Hilfe der so genannten MAD observational equations (Hendrickson et al., 1985) die Proteinphasen auch direkt bestimmt werden. Im einfachsten Fall mit zwei Wellenlängen können vier Gleichungen aufgestellt werden: 2

2

2

1

F (+) =F PAa 1 F Ab1  F PA F A cos PA−A c 1  F PA F A sin PA− A 

1

F (-) = F PAa 1  F Ab 1  F PA F A cos  PA − A−c  1 F PA F A sin PA−A  Gleichung 32

2

F (+) = F PAa 2  F Ab 2  F PA F A cos PA− A c 2  F PA F A sin PA − A 

2

F (-) =F PAa  2 F Ab2  F PA F A cos  PA− A−c 2 F PA F A sin  PA− A

2

2

2

mit

2

2

2

2

2

2

2

2

a n = f ' n  f ''n  / 2 bn= 2 f ' n / f 0 c n =2 f '' n / f 0

53

METHODEN Für drei Wellenlängen können entsprechend sechs Gleichungen geschrieben werden. Da sich die Strukturfaktoramplituden F PA und F A nicht mit der Wellenlänge ändern sind, ist dieses Gleichungssystem für die drei unbekannten Parameter F PA , F A und PA− A  überbestimmt. Wenn die anomale Substruktur bekannt ist, kann dann der gewünschte Proteinphasenwinkel  PA direkt bestimmt werden. Da die Unterschiede zwischen F (+) und F (-) in der Praxis oft sehr klein sind, ist die MAD Phasierung nur möglich, wenn die verschiedenen Datensätze sehr isomorph zueinander sind. Andernfalls ist die Annahme, dass

F PA und F A für alle

Wellenlängen gleich sind, nicht mehr gültig. In dieser Arbeit wurde für die Verfeinerung der anomalen Substruktur und die Phasierung mit dem Programm SHARP durchgeführt. 3.5.9

Phasenbestimmung durch molekularen Ersatz

Die Methode des molekularen Ersatzes (MR, molecular replacement) kann angewendet werden, wenn die Struktur des zu analysierenden oder die eines strukturell homologen Proteins bekannt ist. Am einfachsten ist die Strukturlösung durch MR, wenn es darum geht Datensätze zu phasieren, die in anderen Raumgruppen kristallisiert sind als die schon gelöste, da dann nur sehr kleine Änderungen in der Struktur erwartet werden. Jedoch können auch hier durch eventuelle Domänenbewegung und dergleichen Probleme auftreten. Falls die Struktur eines homologen Protein gelöst werden soll, sollten die die Proteine einen hohen Grad an struktureller Ähnlichkeit aufweisen. Auf der Ebene der Proteinsequenzen wird erwartet, dass Proteine mit einer Sequenzidentität ab 30% mit Sicherheit eine ähnliche Faltung besitzen (Sander & Schneider, 1991). Statistische Analysen haben zu der Vorhersage geführt, dass in der Natur etwa 500 bis 1000 verschiedene Proteinfaltungen erwartet werden können (Schulz, 1981; Benner et al., 1997). Die MR Methode platziert ein Suchmodell in die Elementarzelle eines neuen Kristalls so, dass die Position und Orientierung im neuen Kristall erhalten wird. Anschließend können mit den Modellphasen zusammen mit den gemessenen Strukturfaktoramplituden Elektronendichtekarten gerechnet werden und mit dem Modellbau sowie der Verfeinerung begonnen werden. Das Platzieren des Modells in der Elementarzelle ist ein sechsdimensionales Problem, das sich in die Rotations- und Translationssuche aufteilen lässt (Rossmann & Blow, 1962). Sowohl die Rotations- als auch die Translationssuche sind als Patterson Korrelationsfunktionen imple­ mentiert, in die die Strukturfaktoramplituden des Suchmodells und des unbekannten Kristalls eingehen. Um einen eindeutige Lösung in beiden Funktionen zu erhalten, müssen das Such- und das Zielmolekül eine sehr hohe strukturelle Ähnlichkeit haben. Um die Qualität der erhaltenen Lösungen zu beurteilen, werden, je nach Programm, verschiedene Indikatoren ausgegeben, wie z.B. Korrelationskoeffizienten oder Z-Scores. Allen gemein ist die Tatsache, dass es bei einer 54

3.5 Röntgenstrukturanalyse

richtigen Lösung eine signifikanten Differenz zwischen der richtigen und den falschen Lösungen gibt. Dies gilt vor allem für die Translationssuche. Bei allen Lösungen aus der MR Methode muss berücksichtigt werden, dass die berechnete Elektronendichte sehr stark von dem Suchmodell bestimmt ist, da die Phasen ausschließlich von diesem stammen. Dieses so genannte model-bias stellt eine nicht zu unterschätzende Problematik in dieser Methode dar, die, gerade bei schlechten Daten, berücksichtigt werden muss und unter Umständen dazu führt, dass eine Phasierung über Schweratomderivate notwendig wird. In der vorliegenden Arbeit wurde mit den Programmen MOLREP (Vagin & Teplyakov, 1997) und PHASER (McCoy et al., 2005) gearbeitet. 3.5.10

Nicht-kristallographische Symmetrie

Die asymmetrische Einheit eines Kristalls kann mehr als eine Kopie eines Moleküls enthalten. In diesen Fall wird die Symmetriebeziehung zwischen den beiden Molekülen in der asymmetrischen Einheit als Nicht-kristallographische Symmetrie bezeichnet (NCS). In Protein­ kristallen sind Rotations- und Translationsoperatoren als NCS Operatoren möglich. Die Rotations NCS kann entweder geschlossen, also mit einem Rotationswinkel entsprechend (360/n)° oder offen sein. Der erste Fall wird oft in Kristallen von Proteinen gefunden, die in Lösung Oligomere mit einer n-fachen Rotationssymmetrie bilden (Cn Punktgruppen). Zusätzlich ist eine Translationsoperation notwendig, um die Position der rotierten Kopie relativ zur originalen zu beschreiben. NCS Operatoren zwischen zwei Kopien eines Proteins werden normalerweise als 3x3 Matrix für die Rotation und einen dreidimensionalen Vektor in orthogonalen Koordinaten für die Translation beschrieben. Die Rotationskomponente R des NCS Operators kann über die peaks in einer so genannten Selbstrotationsfunktion (Gleichung 33), einer Überlagerung der nativen Pattersonfunktion mit ihrer rotierten Kopie, bestimmt werden (Rossmann & Blow, 1962). Die Rotation wird um den u in jeden Schritt mit einer Ursprung in diskreten Schritten durchgeführt, indem der Vektor  u rot zu gelangen. Der anderen Rotationsmatrix C multipliziert wird, um zu dem rotierten Vektor 

maximale Radius der Integration r max muss klein genug sein, um nur Vektoren zwischen den Atomen eines Protomers einzuschließen. Falls der Integrationsradius zu groß gewählt wird, werden auch Vektoren zwischen Atomen zweier verschiedener Protomere mit eingeschlossenen, was zu Rauschen führt.

55

METHODEN

R=

∫

P  u  P  u rot  dV

∣u∣rmax

r max P  u P  u rot 

Gleichung 33

Integrationsradius u Wert der Pattersonfunktion bei  u rot Wert der Pattersonfunktion bei 

Im Gegensatz zur Rotationskomponente kann die Translationskomponente T der NCS nicht ohne zusätzliche Phaseninformation bestimmt werden. Jedoch können beide Komponenten in guter Näherung aus den Positionen der Schweratome in der Substruktur abgeleitet werden, falls genügend von ihnen der gleichen NCS gehorchen. In dieser Arbeit wurde hierzu das Programm RESOLVE (Terwilliger, 2002a) genutzt oder im Falle einer MR Lösung direkt aus den Positionen der Moleküle berechnet. 3.5.11

Dichtemodifikation

Nach der Phasenbestimmung durch isomorphen Ersatz, anomale Streuung oder Molekularen Ersatz ist die initiale Elektronendichte oftmals sehr verrauscht und schwer zu interpretieren, da hier noch starke Phasenfehler vorliegen. Deshalb sind Methoden entwickelt worden, um diese initialen Phasen und damit die Elektronendichte zu verbessern. Hierbei werden bestimmte bekannte Eigenschaften von Elektronendichtekarten der Makromoleküle als Einschränkungen bei den Berechnungen genutzt. Ein einfaches Beispiel für eine solche Einschränkung ist die Tatsache, dass negative Elektronendichte physikalisch keinen Sinn macht und somit nicht erlaubt wird. Ein weiteres Charakteristikum von guten Elektronendichtekarten ist, dass die mittlere Elektronendichte wie auch deren Varianz in Proteinregionen sehr hoch ist während diese Werte in Solvenzregionen wegen deren geringer Ordnung sehr niedrig sind. Die Anwendung solcher Einschränkungen auf Elektronendichtekarten im Realraum und deren anschließender Rücktransformation führt zu verbesserten Phasenwinkeln im reziproken Raum (Wang, 1985). Diese Prozedur kann iterativ wiederholt werden und auch für die Erweiterung der Phasen über ihre Auflösungsgrenze hinaus genutzt werden. Momentan existieren zwei prinzipiell verschiedene Ansätze zur Dichtemodifikation. In der konventionellen Herangehensweise wird die Elektronendichte wie oben beschrieben im Realraum modifiziert und zurück transformiert. Die so erhaltenen Phasen werden dann mit den experimentellen Originalphasen kombiniert, was zu einen verbesserten Satz Phasen führt, der wiederum genutzt werden kann um eine Elektronendichtekarte zu berechnen. Diese Methode beinhaltet zwei Probleme. Zum einem ist die Wahl eines angemessenen Wichtungsschemas für die Kombination der Phasen schwierig, zum anderen fehlt ein zuverlässiges Abbruchkriterium für die Dichtemodifikation. Ein neuer Ansatz ist die statistische Dichtemodifikation, die eine 56

3.5 Röntgenstrukturanalyse

Optimierung im reziproken Raum unter Berücksichtigung aller zur Verfügung stehenden Phaseninformationen zur Gewinnung neuer Strukturfaktoren darstellt (Terwilliger, 1999). Hierbei wird konsequent die Methode des maximum likelihood angewendet. Es wird eine zusammengesetzte Funktion für jeden möglichen Satz von Strukturfaktoren berechnet, bestehend aus einer Wahrscheinlichkeitsverteilung der observierten Strukturfaktoren (Unsicherheiten der Amplituden und Wahrscheinlichkeit der Phasen) und einer zweiten Verteilung die die Wahrscheinlichkeit für die aus diesen Daten berechnete Dichte an einen gegebenen Gitterpunkt beschreibt. Zur Berechnung dieser zweiten a-priori-Wahrscheinlichkeit werden die aus der klassischen Dichtemodifikation bekannten Annahmen gemacht. Somit entspricht eine Maximierung der zusammengesetzten Funktion dem Prozess der Dichtemodifikation. Im Folgenden sind Funktionen aufgeführt, die üblicherweise in der Dichtemodifikation angewendet werden. Solvensglätten (solvent flattening und solvent flipping) Proteinkristalle enthalten eine große Menge an ungeordneten Lösungsmittel. Hier sollte der Durchschnittswert als auch die Varianz der Elektronendichte in Lösungsmittelbereichen klein sein wohingegen für Proteinregionen das Gegenteil der Fall sein sollte. Wird diese Eigenschaften auf Elektronendichtekarten unbekannter Proteine angewandt, so ergeben sich verbesserte Phasen im reziproken Raum. Dieser Prozess besteht aus zwei Schritten. Im ersten muss eine Maske erstellt werden, die das Solvens vom Protein trennt. Hierzu gibt es automatische Methoden (Wang, 1985; Leslie, 1987; Terwilliger, 1999). Anschließend wird die Elektronendichte im von der Maske ausgeschlossene Solvensbereich auf einen konstanten Wert gesetzt (solvent flattening) oder invertiert (solvent flipping). In der statistischen Dichtemodifikation wird noch zusätzlich die Varianz der Elektronendichte um einen gegebenen Punkt mit berücksichtigt. Diese Methode ist besonders bei einem hohen Solvensgehalt der Kristalle effektiv. Histogramm-Anpassung (histogram matching) Es konnte gezeigt werden, dass Proteinkristalle mit gleichen Solvensgehalt und Auflösungsgrenzen immer die gleiche Verteilung von Elektronendichtewerten (Histogramme) haben, unabhängig davon ob sich die Aminosäuresequenz oder die Faltung unterscheidet. Deshalb können starke Abweichungen im Elektronendichtehistogramm als Phasenfehler interpretiert und entsprechend korrigiert werden. Hierzu wird die Elektronendichteskala in Schalen aufgeteilt und dann die Anzahl der zugehörigen Rasterpunkte in der Karte summiert. Das resultierende Histogramm wird dann mit einem Standardhistogramm für die entsprechende Auflösung und Solvensgehalt verglichen und anschließend angepasst (Zhang & Main, 1990). In 57

METHODEN der statistischen Dichtemodifikation fließt dies in die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Elektronendichtewerte ein (Terwilliger, 2000). Nicht-kristallographische Symmetrie Falls mehrere Kopien des gleichen Moleküls in der asymmetrischen Einheit vorhanden sind, kann deren NCS Beziehung dazu ausgenutzt werden, um die Elektronendichtekarten zu verbessern. Zuerst muss eine Maske wie bei der Solvensglättung definiert werden. Anschließend werden die Elektronendichtewerte in diesen Masken auf das Mittel aller mit ihnen über die NCS verknüpften Werten gesetzt. Für den reziproken Raum bedeutet dies eine Einschränkung der möglichen Phasenwinkel. Mit steigender Anzahl von NCS Kopien werden dadurch auch die Einschränkungen im reziproken Raum immer stärker, was zu einer erheblichen Verbesserung der Phasen führen kann. Dies ist jedoch nur möglich, wenn die zu überlagernden Regionen sehr hohe Ähnlichkeit ausweisen. Deshalb müssen die Korrelationskoeffizienten zwischen den zu mittelten Dichten beobachtet werden und gegebenenfalls eine entsprechende Wichtung vorgenommen werden (Abrahams & Leslie, 1996). In der statistischen Dichtemodifikation fließt die wiederum in die a-priori-Wahrscheinlichkeit für die Dichte an einen spezifischen Gitterpunkt ein. Lokale Mustererkennung (local pattern matching) Das Vorhandensein von definierten Sekundärstrukturelementen und deren wiederkehrenden Anordnungen in Proteinstrukturen führt zu sich wiederholenden charakteristischen Mustern, die sich klassifizieren lassen. Studien dieser Muster an Modellproteinen haben gezeigt, dass es eine limitierte Anzahl dieser Muster gibt und sich dies für die statistische Dichtemodifikation nutzen lässt (Terwilliger, 2003c). Dafür wird in einer Elektronendichtekarte die Elektronendichte­ verteilung auf einer Sphäre gegebener Größe für einen Gitterpunkt berechnet und mit einer Bibliothek aus Standardmustern verglichen. Der Elektronendichtewert wird dann auf den der ähnlichsten Sphäre aus der Bibliothek gesetzt. Dieser Vorgang wird für jeden Gitterpunkt der Elektronendichtekarte wiederholt, was zu einer Pseudo-Karte (image) führt, die nur aus rekonstruierten Elektronendichtewerten besteht. Die Fehler in diesem image sind nahezu unabhängig von denen in der originalen Elektronendichtekarte und somit kann es als eine nahezu unverzerrte (unbiased) Quelle von Phasen angesehen werden, die in die a-priori-Wahrschein­ lichkeitsverteilung einfließen und durch Kombination mit den original Phasenwahrscheinlich­ keiten zu verbesserten Phasen führen.

58

3.5 Röntgenstrukturanalyse

3.5.12

Modellbau und Elektronendichtekarten

Modellbau Nachdem das kristallographische Phasenproblem gelöst ist, muss die resultierende Elek­ tronendichtekarte interpretiert werden, indem ein Modell für das Molekül gebaut wird. Falls die Auflösung und Qualität der experimentellen Dichte hoch genug sind, kann dies automatisch durchgeführt werden. Die Methode, die im TEXTAL Paket (Ioerger et al., 1999; Holton et al., 2000) implementiert ist, gleicht der klassischen Methode im manuellen Modellbau, indem im ersten Schritt Cα Positionen in der Dichte gesucht werden. Das Programm nutzt bekannte Elektronendichtemuster, um Cα Atome in Hauptkettendichte zu bauen. Anschließend werden diese Cα Atome mit Peptidbindungen verknüpft, wobei auf eine sinnvolle Stereochemie geachtet wird.

Diesem

Poly-Alanin

Modell

wird

dann

die

Sequenz

unter

Beachtung

der

Seitenkettendichte zugeordnet. Anstatt ausschließlich Cα Atome in die Dichte zu platzieren, füllt das Programm ARP/wARP (Perrakis et al., 1999) die komplette Elektronendichte mit Pseudoatomen (dummy-atoms), die einem 1.1 Å Abstandskriterium und einem variablen Dichtegrenzwert gehorchen (free atom model). Danach sucht ein Mustererkennungsalgorithmus nach Gruppen von Pseudoatomen deren Abstände denen von Dipeptiden entsprechen. Diese Dipeptide werden zu Hauptketten verknüpft und die verbleibenden Pseudoatome, sofern sie Seitenketten zugeordnet werden können, ins Modell mit einbezogen. In beiden Schritten fließt schon das Wissen über Proteingeometrie in Form von Vorgaben und Einschränkungen ein, so dass das resultierende Modell diesen Kriterien genügt. Die einzelnen Peptidfragmente werden dann durch Überlagerung mit der Sequenz zugeordnet. Eine

weitere

Möglichkeit

des

Modellbaus

ist

das

Platzieren

von

kompletten

Proteinfragmenten anstatt einzelner Cα Atome. Dies kann im sowohl im Real- als auch im reziproken Raum durchgeführt werden, wobei sich die FFT-basierenden Suchalgorithmen im letzteren, wie sie in FFFEAR (Cowtan, 1998) und RESOLVE (Terwilliger, 2003a, 2003b) implementiert sind, als die bessere Variante herausgestellt haben. RESOLVE benutzt eine Bibliothek von Hauptkettenfragmenten unterschiedlicher Größe um die Hauptkette zu bauen. Die Position der Fragmente wird dann im Realraum verfeinert, indem die Korrelation von experimenteller und berechneter Dichte maximiert wird. Das Bauen der Seitenketten und das Zuordnen der Sequenz geschieht schließlich wie schon oben beschrieben unter Zuhilfenahme der Seitenkettendichte.

59

METHODEN In all diese Methoden werden die experimentellen Phasen verbessert, indem sie mit den aus dem initialen Modell erhaltenen bei entsprechender Wichtung kombiniert werden. Außerdem wird das Modell zwischen den einzelnen Bauzyklen mit einem Verfeinerungsprogramm wie etwa REFMAC (Murshudov et al., 1997) verbessert. Besonders mit der iterativen Dichtemodifikation wie sie in RESOLVE integriert ist können die Baualgorithmen gute Resultate liefern, selbst wenn die Startphasen relativ schlecht sind. In der vorliegenden Arbeit wurden zum automatischen Bauen die Programme ARP/wARP und RESOLVE genutzt. Zum manuellen Korrigieren und Bauen wurde mit den Programmen XFIT (McRee, 1999) und COOT (Emsley & Cowtan, 2004) gearbeitet. Zwischen den manuellen Korrekturen wurde das Modell im reziproken Raum automatisch verfeinert. Die folgenden Elektronendichtekarten wurden zur Validierung der Modelle genutzt. (Fobs * FOM)-Elektronendichtekarte Elektronendichtekarten mit dem Fourierkoeffizienten  F obs⋅FOM ei 

obs

werden direkt nach

dem experimentellen Phasieren benutzt um ein initiales Modell zu bauen. Die gemessenen Strukturfaktoramplituden F obs werden hierbei durch den FOM aus der Phasierung gewichtet. (Fobs – Fcalc)-Elektronendichtekarte Differenz-Fourierkarten mit den Koeffizienten

 F obs −F calc  ei 

zeigen Differenzen

calc

zwischen dem Modell und der echten Struktur. Fehlende Teile des Modells erscheinen als positive und falsch positionierte Teile als negative Differenzdichte.  F obs −F calc  -Dichtekarten werden für das Platzieren von ungebauten Teilen des Proteins, Wassermolekülen oder Kleinmolekülen genutzt. Normalerweise werden Differenzdichten ab 3 σ berücksichtigt. (2Fobs – Fcalc)-Elektronendichtekarte i Elektronendichtekarten die mit den Koeffizienten 2Fobs −F calc e

calc

berechnet werden,

i i können als Überlagerung einer  F obs e - mit der  F obs −F calc  e -Dichtekarte angesehen obs

calc

werden. Diese Elektronendichtekarten werden üblicherweise bei einem Konturniveau von 1.0-1.5 σ betrachtet. Wegen der starken Verzerrung in Richtung des bei der Berechnung genutzten Modells (model bias) werden diese Dichtekarten üblicherweise nicht genutzt, sondern stattdessen gewichtete Elektronendichtekarten eingesetzt. Gewichtete (mFobs – DFcalc)- und (2mFobs – DFcalc)-Elektronendichtekarten Falls das Modell nicht vollständig oder teilweise falsch gebaut ist sind Fehler in den Amplituden und Phasen der berechneten Strukturfaktoren zu erwarten. Um dies zu 60

3.5 Röntgenstrukturanalyse

berücksichtigten werden die Strukturfaktoren, die für die Berechnung der Dichtekarte benutzt werden, entsprechend gewichtet. Hierbei wird der Tatsache Rechnung getragen, dass sowohl die berechneten als auch die beobachteten Strukturfaktoramplituden fehlerbehaftet sind. In der σA-Wichtung (Read, 1986, 1990) fließen Korrekturen ein, die die Fehler im Modell, Unvollstän­ digkeit oder Unordnung, und Skalierungsfehler berücksichtigen (Abbildung 14). σA-gewichtete Dichtekarten wurden mit den Programmen REFMAC (Murshudov et al., 1997) oder CNS (Brünger et al., 1998) berechnet und für die Verfeinerung benutzt.

Abbildung 14 Koeffizienten zur Berechnung von gewichteten Elektronendichtekarten. Die berechnete Strukturfaktoramplitude des wahrscheinlichsten Modells (Fcalc) ist nicht die wahrscheinlichste Strukturfaktoramplitude (gestrichelt). Der wahrscheinlichste Wert der Strukturfaktoramplitude hat dieselbe Phase wie Fcalc, ist aber um den Faktor D verkürzt. Dieser Faktor ist eins, wenn das Modell als exakt und Null falls es als völlig falsch angenommen wird. Unsicherheiten in den berechneten Strukturfaktoren führen zu einer zweidimensionalen Gaussverteilung um DFcalc die sehr scharf wird, wenn die Koordinatenfehler klein sind bzw. sehr breit wird, wenn das Gegenteil der Fall ist. Ein figure of merit (FOM) m wird für die Wichtung der beobachteten Strukturfaktoramplituden benutzt. Mit steigender Qualität des Modells und einhergehender Verbesserung des mittleren Phasenfehlers nähert sich m dem Wert eins an.

3.5.13

Verfeinerung des Modells

Das Ziel jeder Röntgenstrukturanalyse ist es, ein chemisch und biologisch sinnvolles Modell zu bauen, das eine gute Übereinstimmung mit den gemessenen Daten zeigt. Mit einer inversen Fouriertransformation ist es möglich, die Strukturfaktoren des Modells unter Zuhilfenahme der Atompositionen, Besetzung und B-Faktoren zu berechnen. Diese können dann mit den tatsächlich gemessenen verglichen werden. Ein statistischer Indikator für die Übereinstimmung des Modells mit den Messwerten ist der kristallographische R-Faktor Rcryst (Gleichung 34). Gut

61

METHODEN verfeinerte Strukturen haben einen R-Faktor von 10-25% abhängig von der Auflösung. R-Faktoren von 50% sind üblich für initiale oder sehr unvollständige Modelle. Dies ist sehr nahe am theoretischen Maximum von 59% für zufällig verteilte Atome in der Einheitszelle (Wilson, 1949).  ∑ ∣F obs −kF calc∣ Rcryst =

hkl

∑∣F obs∣

Gleichung 34

hkl

k

auflösungsabhängiger Skalierungsfaktor

Das Ziel der Verfeinerung ist es den Unterschied zwischen den beobachteten Strukturfaktoren und denen des Modells zu minimieren indem die Parameter des Modells verändert werden. Je mehr Observablen (unabhängige Reflexe) vorhanden sind, umso einfacher ist es einen optimalen Satz an Parametern für das Modell zu finden. Das Observablen zu Parameter Verhältnis sollte in der Praxis um ein vielfaches größer als eins sein (Murshudov et al., 1997; Tronrud, 2004). Gute Verfeinerungpraxis ist es, mit einem hohen Observablen zu Parameter Verhältnis anzufangen, um schließlich immer mehr Parameter mit fortschreitender Verfeinerung und somit besseren Modell freizugeben (Kleywegt & Jones, 1995). Die Anzahl der Observablen hängt sowohl von der Auflösung als auch vom Solvensgehalt ab, wobei erstere der entscheidendere Faktor ist und üblicherweise während der Verfeinerung konstant bleibt. Das Observablen zu Parameter Verhältnis kann aber durch die Variation der Parametrisierung des Modells verändert werden. Hierbei können Einschränkungen in Form von restraints oder constraints gemacht werden. Im Falle constraints sind zwei oder mehr Parameter direkt miteinander verknüpft, so dass die Veränderung einer der Parameter die gleiche Veränderung der anderen nach sich zieht. Dadurch wird die Anzahl der Parameter faktisch um die Anzahl der verknüpften Parameter verkleinert. Bei restraints sind die Parameter auch verknüpft, dürfen jedoch in einem gewissen Maße voneinander abweichen. Das führt auch zu einer Vergrößerung des Parameter zu Observablen Verhältnis verglichen mit constraints. Während der Verfeinerung muss darauf geachtet werden, dass nicht zu viele Parameter in das Modell aufgenommen werden und somit experimentelles Rauschen modelliert wird (overfitting). Um dies zu vermeiden wird ein kleiner Satz von Reflexen, der Testdatensatz, bestehend aus ca. 5-10% des vollständigen Datensatzes (mindestens 500 Reflexe) nicht in die Verfeinerung mit einbezogen. Mit Hilfe dieses Testdatensatzes kann dann der so genannte freie R-Faktor (Brünger, 1993) in ähnlicher Weise wie der Rcryst berechnet werden (Gleichung 35). Der R free korreliert mit

62

3.5 Röntgenstrukturanalyse

dem durchschnittlichen Phasenfehler und wird als Indikator für den Verfeinerungsprozess herangezogen (Kleywegt & Brünger, 1996). Änderungen am Modell, die zu einer Erhöhung des R free beitragen, verbessern nicht das Modell, sondern sind ein Zeichen für overfitting.

∑ ∣F obs hkl −k F calc hkl ∣

R free =

hkl ∈T

∑ ∣F obs hkl∣

Gleichung 35

hkl ∈T

Parametrisierung des Modells: Koordinaten In der Verfeinerung wird das Modell als eine Einheit aus einzelnen Atomen definiert, die durch die drei Ortskoordinaten x, y und z, einen Temperaturfaktor B sowie eine Besetzungszahl pro Atom parametrisiert sind. Da die Besetzungszahl im allgemeinen als 1.0 angenommen wird, bleiben vier Parameter pro Atom (neun im Falle von anisotropen B-Faktoren) um das Modell zu beschreiben. Daneben existieren noch einige andere Möglichkeiten das Modell zu beschreiben. Die einfachste Beschreibung eines Modells ist die als starrer Körper (rigid body). Eine rigid body-Verfeinerung wird dann benutzt, wenn sich die Position und Orientierung des Modells geändert hat jedoch nicht die innere Struktur. Da hier nur sechs Parameter pro rigider Gruppe vorliegen, kann diese Art von Verfeinerung bei sehr geringer Auflösung durchgeführt werden und hat einen sehr großen Konvergenzradius. Bei mittlerer Auflösung sind viel mehr Daten vorhanden, als für die rigid body Verfeinerung benötigt werden, aber oftmals nicht genug, um eine positionelle Verfeinerung durchzuführen. Stattdessen kann das Polypeptid über Torsionswinkel beschrieben werden, da es möglich ist die komplette Proteinfaltung über je zwei Hauptkettentorsionswinkel pro Peptid und einer variablen Anzahl von Seitenkettentorsionswinkel zu beschreiben. Die Bindungslängen und Distanzen werden dabei aus Standardbibliotheken erhalten (Engh & Huber, 1991) und eingeschränkt. Da der durchschnittliche Aminosäurerest ungefähr acht Atome und fünf Torsionswinkel aufweist, müssen in der Torsionswinkelverfeinerung im Schnitt nur 5 Parameter im Gegensatz zu 24 in der konventionellen positionellen Verfeinerung berücksichtigt werden. Dies führt zu einer ungefähr 5fachen Reduktion der Parameter und macht die Torsionswinkelverfeinerung, wie sie in CNS (Rice & Brünger, 1994; Brünger et al., 1998) implementiert ist, bei mittlerer Auflösung zum Mittel der Wahl. Falls im Kristall eine NCS vorliegt, kann die Anzahl der Parameter dadurch verkleinert werden, dass die NCS-Kopien untereinander verknüpft werden. Im Falle einer so genannten

63

METHODEN harten NCS wird jede Kopie als gleich betrachtet, wodurch die Parameter auf die Anzahl in einer der Kopien reduziert wird. Wird eine so genannte weiche (bzw. restraint) NCS benutzt, dürfen die korrelierenden Parameter der Kopien in einem gewissen Rahmen variieren, wodurch die Anzahl der Parameter gleich bleibt. Da die Parameter aber miteinander in Beziehung stehen, wirkt sich dies positiv auf das Parameter zu Observablen Verhältnis aus. Parametrisierung des Modells: Temperaturfaktoren Die Vibration der einzelnen Atome um ihren Ursprung wird durch den B-Faktor beschrieben (Kap. 3.5.3). Je nach Anzahl der Observablen kann der B-Faktor durch unterschiedlich viele Parameter beschrieben werden. Das einfachste Temperaturfaktormodell ist die Verfeinerung eines einzelnen B-Faktors für das ganze Modell. Dieses wird normalerweise bei der rigid body Verfeinerung für die einzelnen rigiden Gruppen angewandt. Ein komplizierteres Modell beschreibt einen B-Faktor pro Rest oder zwei individuelle B-Faktoren für die Seitenketten- und Hauptkettenatome in jeden Rest. Bei hoher Auflösung (etwa 2.0 Å) sind genug Observablen vorhanden, um die B-Faktoren individuell für jedes Atom zu verfeinern. Bei sehr hoher Auflösung können die B-Faktoren anisotrop verfeinert werden, was zu einer erheblichen Erhöhung der Parameterzahl führt. Da eine anisotrope Verschiebung der Atome innerhalb der Kristallordnung dazu führt, dass das Streuvermögen und damit die Anzahl der messbaren Observablen abnimmt, ist es wünschenswert die Beschreibung dieser Bewegung ins Modell mit einfließen zu lassen. Durch die TLS (translation, libration, screw) Methode (Schomaker & Trueblood, 1968; Winn et al., 2001) wird genau dies erreicht, wobei sich sich die Anzahl der zusätzlichen Parameter im Rahmen hält. Bei der TLS Verfeinerung wird das Modell in starre Gruppen eingeteilt, die TLS Gruppen (Abbildung 15). Die Verschiebung einer jeder dieser Gruppen wird durch drei 3x3 Tensoren T, L und S beschrieben. Die T und L Tensoren sind symmetrisch und beschreiben die Translation (in Ų Einheiten) und die Rotationskomponente (in rad² Einheiten) der Verschiebung. Der dritte Tensor ist nicht symmetrisch und beschreibt die Korrelation zwischen der Translations- und Rotationsbewegung. Insgesamt werden so 20 neue Parameter pro TLS Gruppe eingeführt. Das führt zu einer erheblich reduzierten Parameterzahl gegenüber einer vollen anisotropen B-Faktor Verfeinerung. Somit kann eine TLS Verfeinerung bei einer relativ geringen Auflösung genutzt werden und führt oftmals zu guten Ergebnissen (Winn et al., 2003; Painter & Merrit, 2006). In dieser Arbeit wurden TLS Verfeinerungen mit dem Programm REFMAC durchgeführt. Hierbei werden die verbleibenden isotropen B-Faktor Anteile nach der TLS-Verfeinerung an 64

3.5 Röntgenstrukturanalyse

REFMAC weitergeben und konventionell verfeinert. Wenn nötig wurden die vollständigen B- Faktoren mit dem Programm TLSANL (Howlin et al., 1993) wiederhergestellt. Durch TLSMD (Painter & Merrit, 2006) wurden optimale TLS Gruppen bestimmt.

Abbildung 15 Schematische Darstellung der TLS-Verfeinerung. Jede TLS-Gruppe schwingt dabei um ihren Schwerpunkt (Winn et al., 2003)

maximum likelihood Verfeinerung Heutige Verfeinerungsprogramme verwenden anstatt einer least square eine maximum likelihood Zielfunktion. Der Hauptunterschied besteht darin, dass die Fehler des Modells explizit mit einbezogen werden und zu den Abweichungen der experimentellen Daten im Wichtungsterm addiert werden (Gleichung 36). Die Wahrscheinlichkeit, dass das Modell richtig ist, wird nach demselben Prinzip, wie schon bei der statistischen Dichtemodifizierung beschrieben, berechnet. Stereochemische Einschränkungen fließen in die Wahrscheinlichkeitsverteilung der observierten Daten mit ein. Die in dieser Arbeit benutzten Verfeinerungsprogramme CNS (Brünger et al., 1998), REFMAC (Murshudov et al., 1997) und BUSTER-TNT (Blanc et al., 2004) arbeiten alle mit einer maximum likelihood Zielfunktion. [ F obs  hkl−〈 F calc hkl , P〉] 2 f  P =∑  obs  hkl2 calc  hkl , P2 hkl P 〈 F calc hkl , P〉  calc hkl , P  obs hkl 

Gleichung 36

Satz von Modellparametern Erwartungswert für F berechnet aus allen plausiblen Modellen die mit P übereinstimmen Breite der Verteilung der Werte für F calc hkl , P  experimentelle Standardabweichung für F  hkl 

65

METHODEN Solvenskorrektur Proteinkristalle enthalten üblicherweise eine große Menge an ungeordneten Solvens (bulk solvent), das lediglich zur Röntgenstreuung bei niedriger Auflösung beiträgt (ab 6-9 Å). Dennoch ist der Anteil bei niedriger Auflösung hoch genug, dass er für die exakte Berechnung der Strukturfaktoren des Modells in Betracht gezogen werden muss. Mit Hilfe des Babinet'schen Prinzip (die Streuung eines Objektes ist die gleiche, wie die seines Inversen nur mit invertierten Phasen) kann eine Korrektur für den Teil der asymmetrischen Einheit berechnet werden, der nicht vom Proteinmodell besetzt ist (Gleichung 37).



[

F calc,corr =F calc 1.0−k sol exp −B sol F calc,corr k sol B sol

sin 2  2

]

Gleichung 37

berechnete Strukturfaktoramplituden mit Solvenskorrektur Skalierungsfaktor des Solvens B-Faktor des Solvens

Im Solvensmodell werden so zwei zusätzliche Parameter eingeführt. k sol ist das Verhältnis der durchschnittlichen Elektronendichten von Solvens und Protein und B sol ist ein Messwert für den Abfall der Solvensstreung mit der Auflösung und ihrer Diffusität (Glykos & Kokkinidis, 2000). Durch die Skalierung des Solvens können alle Reflexe während der Verfeinerung genutzt werden, wodurch die Verfeinerung und die resultierenden Elektronendichtekarten verbessert werden. Die Solvenskorrektur ist in allen in dieser Arbeit verwendeten Verfeinerungs­ programmen implementiert. Einbau von Wassermolekülen und Liganden Wassermoleküle wurden in gewichtete mF obs −DF calc  Differenzdichtekarten automatisch mit ARP/wARP oder COOT eingebaut. Die Kriterien für den Einbau waren das Vorhandensein einer sphärischen Elektronendichte von mindestens 3 σ und die Präsenz von passenden Donoren/Akzeptoren im Umfeld. Nach der Verfeinerung wurde die Dichte für die neu eingebauten Wasseratome in einer 2mF obs −DF calc  Karte überprüft. Falls die Dichte unter 1 σ lag oder die Geometrie nicht in Ordnung war, wurden die Wasser gelöscht. Kleinmolekülliganden wurden manuell in mF obs −DF calc  Differenzdichtekarten mit COOT (Emsley & Cowtan, 2004) oder Xfit (McRee, 1999) eingebaut. Die nötigen Koordinaten und Bibliotheken wurden entweder aus der CCP4 monomer library, vom HIC-UP Server (Kleywegt et al., 2003) oder falls dort nicht vorhanden vom PRODRG2 Server (Schüttelkopf & van Aalten, 2004) erhalten. 66

3.6 Proteinstrukturen

3.6 3.6.1

Proteinstrukturen Validierung von Proteinstrukturen

Das finale Modell enthält nach der Verfeinerung noch Fehler. Diese können globaler Natur sein, wie Fehler in den Symmetrieoperatoren oder in der Skalierung, oder lokale Fehler wie fehlplatzierte Reste und schlechte Stereochemie, um nur einige aufzuzählen. Es existieren eine Reihe von statistischen Indikatoren für die Modellqualität, um diese Fehler aufzudecken. Kristallographischer R-Faktor Der kristallographische R-Faktor Rcryst beschreibt die Übereinstimmung der beobachteten Strukturfaktoramplituden mit denen, die anhand des ganzen Modells berechnetet werden (Gleichung 34). Somit stellt er nur einen globalen Indikator dafür dar, dass die modellierte Atomverteilung die gemessenen Reflexdaten erklären kann. Jedoch sagt er nichts über die Geometrie oder die chemische Plausibilität des Modells aus. Weiterhin ist er durch seine Abhängigkeit vom Observablen zu Parameter Verhältnis von geringen Nutzen bei der unabhängigen Beurteilung von Proteinstrukturen (Kleywegt & Jones, 1995). Der freie R-Faktor (Gleichung 35) hingegen ist gegen das so genannte Überverfeinern sensitiv und kann Rückschlüsse auf den Verlauf der Verfeinerung geben. Stereochemie Während

der

Verfeinerung

werden

verschiedene

stereochemische

Parameter

wie

Bindungslängen, Bindungswinkel und planare Gruppen eingeschränkt um einen Satz von idealen Werten zu genügen, der durch Kleinmolekülanalyse gewonnen wurde (Engh & Huber, 1991). Die mittlere quadratische Abweichung vom Idealwert wird üblicherweise als Messwert für die Modellqualität angegeben. Da aber die Idealwerte schon als Einschränkungen in die Verfeinerung mit eingeflossen sind, ist diese Abweichung eher ein Indikator dafür, wie stark diese Einschränkungen während der Verfeinerung gewichtet waren, als für die Modellqualität. In dieser Arbeit wurden die Abweichungen von der Standardgeometrie mit den Programmen PROCHECK (Laskowski et al., 1993) und WHATCHECK (Hooft et al., 1996) analysiert. Torsionswinkel Aufgrund der sterischen Hinderung von Peptidbindungen existieren in der Hauptkette nur zwei Rotationsfreiheitsgrade pro Rest. Die zwei Hauptkettenwinkel φ und ψ sind auf bestimmte Werte durch die Geometrie der Peptidgruppe festgelegt. Für alle Rest außer Glycin führt das Vorhandensein einer voluminösen Seitenkette am Cα zu Überschneidungen mit dem Wasserstoff

67

METHODEN am Hauptkettenstickstoff oder mit dem Carbonylsauerstoff. Im Ramachandran Diagramm wird φ gegen ψ für alle Reste des Modells aufgetragen. Die Reste sollten in erlaubten Regionen zu liegen kommen, die ursprünglich durch Modellierung (Ramachandran & Sasisekharan, 1968) und

später

durch

Bibliotheken

von

in

hoch

aufgelösten

Strukturen

beobachteten

Hauptkettentorsionswinkeln (Lovell et al., 2003) definiert wurden. Eine ähnliche Situation liegt auch für die Seitenkettentorsionswinkel vor. Durch Analyse von hochaufgelösten Strukturen wurde auch hier eine Bibliothek von bevorzugten Rotameren erstellt (Lovell et al., 2000), gegen die das Modell verglichen werden kann. In Proteinstrukturen taucht nur eine beschränkte Anzahl von Seitenkettenrotameren auf, so dass ein Satz von Torsionswinkeln einer Seitenkette, der einer häufig gefundenen Konformation entspricht, mit hoher Wahrscheinlichkeit korrekt ist. Da es für die Seitenkettenkonformationen während der Verfeinerung mehrerer äquivalente Energieminima gibt, können sie nur schwach oder gar nicht beschränkt werden. Dadurch sind sie ein sehr guter unabhängiger Qualitätsindikator in der Strukturvalidierung. In dieser Arbeit wurden Hauptkettentorsionswinkel (Ramachandran) Analysen mit PROCHECK (Laskowski et al., 1993) und RAMPAGE (Lovell et al., 2003) und Seitenkettentorsionswinkel (Rotamer) Analysen mit COOT (Emsley & Cowtan, 2004) und MOLPROBITY (Lovell et al., 2003) durchgeführt. 3.6.2

Darstellung und Analyse von Proteinstrukturen

Eine grafische Darstellung eines Proteinmodells mit allen enthaltenen Atomen ist nur dann sinnvoll, wenn ein kleiner Ausschnitt gezeigt wird. Bei der Darstellung von kompletten Proteinmodellen kann die Faltung in einer vereinfachten Form gezeigt werden, indem nur die Cα Positionen verknüpft (Cα trace) oder eine abstrakte Darstellung der Faltung gewählt wird (ribbon) die auch Sekundärstrukturelemente enthalten kann (Cartoon) (Richardson, 1985a, 1985b). In dieser Arbeit wurden die Sekundärstrukturelemente automatisch mit den Programmen DSSP (Kabsch & Sander, 1993) und STRIDE (Frishman & Argos, 1995) basierend auf Wasserstoffbrücken,

Hauptkettentorsionswinkeln

und

Abstandkriterien

zugewiesen

und

gegebenenfalls manuell korrigiert. Molekül und Solvens zugängliche Oberflächen wurden mit MSMS (Sanner et al., 1996), GRASP (Nicholls et al., 1991) oder POVSCRIPT+ (Fenn et al., 2003) berechnet. Proteindarstellungen wurden mit der Programmkombination POVSCRIPT+ und POVRAY (http://www.povray.org) erstellt. Kontakte zwischen Proteinmolekülen oder zwischen Ligand und Protein wurden mit CONTACT (CCP4, 1994) mit 3.4 Å und 5.5 Å maximalen Abstand für polare bzw. hydrophobe 68

3.6 Proteinstrukturen

Wechselwirkungen analysiert. Kontaktflächen wurden mit NACCESS (Lee & Richards, 1971; Hubbard & Thornton, 1993) und PISA (Krissinel & Henrick, 2005) berechnet. 3.6.3

Strukturvergleiche

Proteine haben selten eine einzigartigen Faltung sondern gehören meist einer Familie von Proteinen mit verwandter Struktur an. Deshalb werden Strukturüberlagerungen benutzt, um verschiedene Strukturen zu vergleichen und das Verhältnis zwischen den Mitgliedern einer Proteinfamilie aufzuzeigen. Beim Vergleich von verschiedenen Strukturen werden üblicherweise die Anzahl der strukturell äquivalenten Reste, ein Abstandskriterium (falls benutzt) und die mittlere quadratische Abweichung der strukturell äquivalenten Atome (in der Regel nur Cα) in Å angegeben. Die Programme, die in dieser Arbeit benutzt wurden arbeiten mit verschiedenen Methoden für die Überlagerung: Alignment von Distanzmatrizen in DALI (Holm & Sander, 1993), Zuordnung von Sekundärstrukturelementen in SSM (Krissinel & Henrick, 2004) und brute-force Methoden in LSQMAN (Kleywegt, 1996). All diese Programme berechnen Z-Werte, die die statistische Signifikanz der Zuordnung anzeigen. Um unbekannte strukturell homologe Proteine zu finden, wurde eine Suche mit DALI gegen eine nicht redundante Strukturdatenbank oder mit SSM gegen die vollständige PDB durchgeführt. Differenzen zwischen NCS-verwandten Protomeren oder verschiedener Kristallformen wurden mit ESCET analysiert (Schneider, 2002, 2004).

69

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4

Ergebnisse und Diskussion

4.1 4.1.1

Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum Expression und Reinigung der enzymatischen Komponente C2-I

Die Kultivierung C2-I produzierender E. coli erfolgte wie unter Kap. 3.2.1 beschrieben im 2 L Maßstab in Erlenmeyerkolben. Das Bakterienfeuchtgewicht lag bei ca. 5 g/L Medium. Die weiteren Reinigungsschritte erfolgten nach einem bereits etablierten Protokoll (I. Merkel, persönliche Mitteilung; Diplomarbeit D. Haschke, 2000), wobei jedoch der letzte Schritt der Reinigung, eine Gelfiltration, ausgelassen wurde, da das erhaltene Protein nach der IEC eine für die Kristallisation ausreichende Reinheit besaß. Nach dem Bakterienaufschluss, der Rückfaltung und IEC an einer Resource-Q (Kap. 3.2.1) lag die Gesamtausbeute an homogenen Protein üblicherweise bei 18 mg aus 2 L Kultur. Vor der Kristallisation wurde C2-I gegen das 500fache Volumen an deion. Wasser dialysiert.

4.1.2

Planung von Oberflächenmutanten zwecks Verbesserung der Kristallisation

Da der Wildtyp von C2-I nur schlecht kristallisierte und keine röntgentauglichen Kristalle hervorbrachte, wurden Oberflächenmutanten geplant und präpariert, um Kristalle besserer Streukraft zu erhalten. Für die Planung wurden sowohl Sekundärstrukturvorhersagen anhand der Sequenz (PredictProtein, Rost et al., 2004) als auch Modellvorhersagen (SwissProt, Guex et al., 1997) herangezogen. Hierbei wurden insgesamt 10 Positionen in der Sequenz herausgesucht, die nach beiden Vorhersagemethoden exponiert sein sollten. Bei fünf der zehn Positionen wurde noch zusätzlich die Bedingung gestellt, dass es sich um Lysine handeln musste. Die Mutanten C2-I(K20E) und C2-I(Q77R) führten zu der erwünschten besseren Kristallisation des Proteins und liegen in den entsprechenden Kristallpackungen in großen Kristallkontakten (Kap. 4.1.8).

70

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Abbildung 16 Elutionsprofil der Reinigung von C2-I (beispielhaft an der Mutante K20E gezeigt) durch IEC mit dem starken Ionenaustauscher Resource-Q. Durchgezogene Linie: UV-Absorption bei 280 nm Wellenlänge, gepunktete Linie: angelegter NaCl-Gradient, gestrichelte Linie: Leitfähigkeit.

Abbildung 17 SDS-PAGE ausgesuchter Fraktionen der Reinigung von C2-I durch IEC mit dem starken Anionenaustauscher Resource-Q. Bahn 1 Molekularmassenstandard Bahn 2 Fraktion 24 (98 – 99 mL) Bahn 3 Fraktion 26 (100 – 101 mL) Bahn 4 Fraktion 28 (102 – 103 mL) Bahn 5 Fraktion 32 (106 – 107 mL) Bahn 6 Fraktion 34 (108 – 109 mL) Bahn 7 Fraktion 36 (110 – 111 mL)

71

ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4.1.3

Kristallisation von C2-I

C2-I(K20E) Erste Kristallisationsversuche von C2-I(K20E) wurden mit einer Proteinkonzentration von 12 mg/mL durchgeführt. Dabei wurden 2 µL Protein- mit 2 µL Reservoirlösung gemischt und nach der hanging-drop-Methode gegen 500 µL Reservoirlösung äquilibriert. Eine initiale Bedingung wurde mit den Crystal Screens I+II gefunden, die dann mit einem (NH4)2SO4-screen verfeinert wurde. Die resultierenden Kristalle waren linsenförmig und wuchsen bis zu einer Länge von 400 µm und einer Breite von 100 µm.

Abbildung 18 Kristalle von C2-I(K20E). (A) Initiale Kristalle aus Crystal Screen I, Bedingung 32. (B) Typischer Kristall aus den verfeinerten Kristallisationsbedingungen.

Tabelle 9

Kristallisationsbedingung für C2-I(K20E) Proteinkonzentration a

10 mg/mL

Reservoirlösung

100 mM Citrat, pH 3.0 0.8 M (NH4)2SO4

Tropfengröße b

10 µL

Temperatur

20 °C

a b

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens Gleiche Volumen Reservoir- und Proteinlösung wurden gemischt

C2-I(Q77R) Erste Kristallisationsversuche der Mutante Q77R wurden bei einer Proteinkonzentration von 14 mg/mL durchgeführt. Dabei wurden 2 µL Protein- mit 2 µL Reservoirlösung gemischt und nach der hanging-drop-Methode gegen 500 µL Reservoirlösung äquilibriert. Auch hier wurde eine initiale Bedingung mit den Crystal Screens I+II gefunden. Da das Reservoir während des Kristallisationszeitraums leicht ausgetrocknet war konnte die genaue Zusammensetzung des 72

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Reservoirs und des Tropfens und damit die Kristalle nur schlecht reproduziert werden. Durch eine Erhöhung der Fällungsmittelkonzentration im Reservoir im Vergleich zur Lösung im Tropfen war schließlich die Reproduktion der Kristalle möglich. Letztendlich stellte sich heraus, dass die CoCl2 Konzentration ausschlaggebend für die Kristallisation war.

Abbildung 19 Kristalle von C2-I(Q77R). (A) Initiale Kristalle aus Crystal-Screen I, Bedingung 25. (B) Kristalle aus verfeinerter Bedingung

Tabelle 10

Kristallisationsbedingung für C2-I(Q77R) Parameter Proteinkonzentration Reservoirlösung

Wert a

14 mg/mL 100 mM MES, pH 6.5 2.1 M (NH4)2SO4 0.03 M CoCl2

Tropfengröße b

10 µL

Temperatur

20 °C

a b

4.1.4

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens Gleiche Volumen Reservoir- und Proteinlösung wurden gemischt

Datensammlung

Für die Aufbewahrung und Derivatisierung einzelner Kristalle wurden diese in einen Aufbewahrungspuffer überführt, der die gleiche Zusammensetzung des Reservoirs bis auf eine 10%ige Erhöhung der Fällungsmittelkonzentration hatte. Dadurch konnten die Kristalle über einen Zeitraum von Tagen bis Monaten stabil gelagert werden. Zur röntgenographischen Untersuchung der Kristalle bei 100 K wurden sie vor dem Einfrieren zwischen 1-3 min in eine Lösung bestehend aus dem Aufbewahrungspuffer mit zusätzlichen 30% Glycerin als cryo protectant getaucht (Kap. 3.4.4). 73

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Aufgrund ihrer zuverlässigen Reproduzierbarkeit wurden die Kristalle der C2-I(K20E) Mutante gewählt, um Schweratomderivate zu suchen. Hierzu wurden einzelne Kristalle in den Aufbewahrungspuffer überführt und anschließend zu den einzelnen Tropfen verschiedene Schweratomverbindungen als Salz zugegeben. Hierbei ist zwar eine genaue Dosierung ausgeschlossen, jedoch kann in den meisten Fällen davon ausgegangen werden, dass sich eine Sättigung der Lösung mit der Schwermetallverbindung einstellt. Kristalle, die nach einem Tag keine Risse oder sonstige Schäden aufzeigten wurden bei 100 K eingefroren und anschließend auf der Hausanlage oder an den beamlines X11 (DESY, Hamburg, Deutschland) oder X06SA (SLS, Villigen, Schweiz) vermessen. Die Datensätze wurden mit der Software APRV, die auf dem Programmpaket XDS basiert, prozessiert und skaliert (Kap. 3.5.6). Durch Analyse von Differenzpattersonfunktionen (Kap. 3.5.7 und 3.5.8) wurden erfolgreiche Derivate identifiziert. Letztendlich stellten sich die Datensätze der mit dem [Ta6Br12]+-Cluster versetzten Kristalle (TaBr, 24 h Tränkzeit) als für die Phasierung ausreichend gut heraus. Zusätzlich zu den DerivatDatensätzen konnte noch ein nativer Datensatz mit einer Auflösung von 2.1 Å aufgenommen werden. Die Kristalle konnten der Raumgruppe P6322 zugeordnet werden und der Solvensgehalt betrug 61% mit einem Monomer pro asymmetrischer Einheit. Aktivitätsmutanten wurden basierend auf dem C2-I(K20E) Konstrukt hergestellt und die Mutante C2-I(K20E-S361R) wegen ihrer veränderten Aktivität kristallisiert und analysiert. Auch hier konnte ein nativer Datensatz mit hoher Auflösung aufgenommen werden. Die Zellparameter entsprachen denen der C2-I(K20E) Mutante. Von den Kristallen der Oberflächenmutante C2-I(Q77R) konnte ebenfalls ein nativer Datensatz von guter Auflösung aufgenommen werden. Versuche auch von dieser Kristallform ein Schweratomderivat zu erhalten schlugen fehl. Das Phasenproblem wurde schließlich über die Methode des molekularen Ersatzes gelöst. Die Raumgruppe konnte zu C2221 bestimmt werden. In der asymmetrischen Einheit befanden sich sechs Monomere und der Solvensgehalt betrug 54%. Desweiteren wurden noch Kokristallisations- und soak-Experimente mit beiden Kristallformen durchgeführt um das Substrat NAD+ zu binden. Die Auswertung der Daten ergab jedoch, dass das Substrat nicht ausreichend in den Kristallen gebunden werden konnte, um im Röntgenexperiment nachgewiesen werden zu können.

74

Tabelle 11 Parameter und Statistiken der Datensätze von C2-I

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

75

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4.1.5

Strukturlösung von C2-I(K20E)-TaBr

Analyse der Daten, Schweratomsuche und Phasierung Die Analyse der SAD-Daten des Ta-Derivates von C2-I(K20E) (Tabelle 11) erfolgte mit dem Programm XPREP (Kap. 3.5.8). Dabei wurden die anomalen Differenzen auflösungsabhängig abgeschätzt, um eine Beurteilung der Güte der Daten zu ermöglichen. Das dabei ermittelte Signal-zu-Rausch-Verhältnis des anomalen Signals sowie die Korrelationskoeffizienten der anomalen Differenzen sind in Tabelle 12 aufgeführt. Es ergaben sich sehr gute Statistiken bis zur maximalen Auflösung des Datensatzes. Durch die Güte des Signals bis zur einer Auflösung besser als 3.0 Å war es möglich den TaBr-Cluster in seine einzelnen Ta-Atome aufzulösen. Aufgrund seiner Geometrie ergibt sich eine charakteristische Abschwächung des anomalen Signals zwischen 4 und 3 Å. Dadurch ist eine Auflösung jenseits der 3 Å nötig, um das vollständige Potential dieser Verbindung für die Phasierung nutzen zu können. Bei der Schweratomsuche mit dem Programm SHELXD konnten insgesamt 12 Schweratompositionen gefunden werden, die jeweils eindeutig zwei verschiedenen Clustern zugeordnet werden konnten. Die Verfeinerung der Schweratomparameter sowie die Phasierung erfolgte anschließend mit dem Programm SHARP. Tabelle 12

Anomales Signal-zu-Rausch-Verhältnis des C2-I-SAD Datensatzes

Auflösung

Tabelle 13

50

8.0

6.0

5.0

4.0

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6.

2.4

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

8.0

6.0

5.0

4.0

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.4

2.4

2.2

12

12

5.5

2.0

2.1

2.5

2.5

2.4

2.2

1.9

1.6

1.8

Statistiken der SAD-Phasierung von C2-I Auflösungsbereich [Å]

76

19 – 2.15

phasing power (anomal – azentrisch)

1.96

Rcullis (anomal – azentrisch)

0.60

FOM (azentrisch)

0.34

FOM nach Dichtemodifikation

0.82

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Dichtemodifikation, Modellbau und Strukturverfeinerung Die initialen Phasen aus SHARP wurden durch Dichtemodifikation soweit verbessert, dass sich eine klare und gut interpretierbare Elektronendichtekarte ergab. Es wurde die Dichtemodifikation durch SOLOMON und DM, wie sie in autoSHARP implementiert ist genutzt, als auch mit RESOLVE gearbeitet. Die resultierenden Dichtekarten waren von vergleichbarer, sehr guter Qualität, so dass der anschließende automatische Modellbau mit ARP/wARP bzw. RESOLVE zu nahezu vollständigen Modellen führte. Das aus RESOLVE resultierende Modell wurde manuell um die noch fehlenden Segmente ergänzt und falsch gebaute Regionen wurden. Die Verfeinerung des Modells wurde mit dem Programm REFMAC5 durchgeführt. In die verbliebene positive Differenzdichte wurden Solvensmoleküle an chemisch sinnvollen Postionen eingebaut, wobei Wassermoleküle automatisch mit ARP/wARP hinzugefügt und manuell validiert wurden. 4.1.6

Strukturlösung von C2-I(Q77R)

Phasierung Dichtemodifikation und Modellbau Da mit der verfeinerten Struktur von C2-I(K20E) ein geeignetes Suchmodell zur Verfügung stand, hat sich bei dieser Kristallform eine Phasierung durch molekularen Ersatz angeboten. Jedoch befinden sich bei dieser Kristallform 48 Kopien des Moleküls in der Elementarzelle und somit ist das zu erwartende Signal-zu-Rausch-Verhältnis sehr gering. Aufgrund dessen stellte sich die Suche nach passenden Rotations- bzw. Translationslösungen als schwierig heraus. Mit den bis dato üblichen Programmen AMORE und MOLREP konnten keine Lösungen gefunden werden. Erst mit dem Programm PHASER, das konsequent das Prinzip des maximum-likelihood auf das Problem des Molekularen Ersatzes anwendet, konnte eine eindeutige Lösung gefunden werden. Hierbei wurde jeweils mit einem Monomer gesucht, wobei die beste Lösung aus den vorigen Lauf als richtig angenommen und beim folgenden festgehalten wurde. So wurden nach und nach alle 6 Monomere platziert (Tabelle 14). Anschließend wurde eine Dichtemodifikation mit iterativen automatischen Modellbau mit dem Programm RESOLVE unter Zuhilfenahme der NCS durchgeführt. Dadurch wurde eine erheblich verbesserte Dichte erhalten und die Verzerrung der Phasen in Richtung Ausgangsmodell eliminiert. Die fehlenden Teilstücke des Modells wurden mit dem Programm COOT ergänzt. Das Modell wurde mit dem Programm REFMAC5 unter Berücksichtigung der NCS verfeinert.

77

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Tabelle 14

Statistiken der Strukturlösung durch molekularen Ersatz von C2-I(Q77R) Kopie

Rotation LLG

a

4.1.7

a

Translation

Z-score

LLG

Z-score

1

103

8.8

202

16.0

2

355

8.4

664

32.7

3

749

6.9

1244

42.0

4

1424

8.1

1933

47.5

5

1917

7.0

2018

50.9

6

1086

7.5

245

54.9

log likelihood gain

Qualität der Modelle von C2-I

Die globalen Indikatoren für die Modellqualität waren für alle Modelle von C2-I gut. Die Werte für R und Rfree bewegten sich in für die jeweiligen Auflösungen üblichen Bereichen. In Tabelle 15 sind die Statistiken der verfeinerten Modelle für alle drei relevanten Strukturen von C2-I zusammengefasst. Die geometrischen Parameter Bindungslänge und -winkel (Tabelle 15) sowie die Torsionswinkel (Abbildung 20) lagen in akzeptablen Bereichen.

Abbildung 20 Ramachandran Diagramme der C2-I Modelle C2-I(K20E) (A) und C2-I(Q77R) (B). Die Positionen aller Aminosäuren sind durch Kreuze (Glycine), Dreiecke (Proline und pre-Proline) und Quadrate (alle anderen Aminosäuren) gekennzeichnet. Energetisch günstige Regionen sind mit dunklen Farben gekennzeichnet.

78

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Tabelle 15

Verfeinerungsstatistiken von C2-I(K20E) und C2-I(Q77R) C2-I K20E

K20E-S361R

Q77R

19 – 2.1

47 – 1.75

40 – 2.3

Proteinatome

3474

3606

20'631

Solvensatome

327

529

596

Ligandenatome

160

116

279

18.7 / 23.8 (7)

16.7 / 19.7 (4)

20.0 / 25.8 (2)

28

18

37

0.020

0.020

0.015

1.82

1.78

1.60

günstiger Bereich [%]

97.4

98.1

96.1

erlaubter Bereich [%]

2.3

1.9

3.7

verbotener Bereich [%]

0.2

0

0.2

Auflösungsbereich [Å]

Rcryst / Rfree (test set)[%] Mittlere B-Faktoren [Ų] rms-Abweichungen a Bindungslängen [Å] Bindungswinkel [°] Ramachandran-Torsionswinkel

a b

4.1.8

b

im Vergleich zu den Standardgeometrien nach Engh & Huber (1991) Definition gemäß Lovell et al. (2003)

Strukturbeschreibung

Sekundärstruktur Die Sekundärstrukturelemente von C2-I wurden für die Modelle beider Kristallformen mit DSSP und STRIDE bestimmt. Die Ergebnisse sind nahezu gleich und eine Zusammenfassung in Abbildung 21 dargestellt.

Abbildung 21 Sequenz und Sekundärstruktur von C2-I. Jeder zehnte Rest ist mit einem Punkt markiert. Das Dreieck markiert die Domänengrenze.

79

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Tertiärstruktur Die Kristallstruktur von C2-I weist die typische Faltung Aktin modifizierender ADPribosyltransferasen auf. Das Enzym ist in zwei Domänen organisiert. Die N-terminale Domäne umfasst die Reste 2-222 die C-terminale Domäne die Reste 222-431. Die beiden Domänen weisen eine sehr ähnliche Faltung auf, was durch eine Überlagerung gezeigt werden kann. Hierbei ergeben sich 138 äquivalente Reste innerhalb des üblichen 3 Å Ausschlusskriteriums, von denen 18% identisch sind. Diese Verwandtschaft weist auf eine ursprüngliche Genduplikation hin (Schulz, 1980, Han et al., 1999). Des weiteren stimmt die Faltung beider Domänen mit der in allen ADP-ribosylierenden Enzymen beobachteten überein. Hierbei handelt es sich im besonderen um die vier zentralen β-Stränge mit dem charakteristischen 90° Winkel zwischen den beiden mittleren Strängen (Abbildung 22). NAD+ wird immer in derselben Position relativ zu diesem Faltblatt gebunden (Müller-Dieckmann et al., 2002).

Abbildung 22 Stereodarstellung des Bändermodells der enzymatischen Komponente C2-I. Die Farben der Nund C-terminalen Domäne sind blau bzw. grün. Die vier strukturell hoch konservierten β-Stränge sind hellgrün eingefärbt. Die bei der Translokation involvierte Helix α1 ist rot, das Segment, das bei der Bindung an die pre-Pore C2-IIa beteiligt ist, golden. Die Kristallisationsmutanten K20E und Q77R sind durch blaue und die Mutante S361R durch eine rosafarbene Kugel gekennzeichnet. NAD+ wurde durch eine Überlagerung mit den homologen Strukturen von IotaA (rot) und VIP2 (schwarz) auf das zentrale β-Strang Quartett modelliert. Einige für die Katalyse und NAD+-Bindung wichtige Reste wurden eingezeichnet.

80

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Kristallpackung Die für die Kristallisation von C2-I wichtigen Oberflächenmutanten K20E bzw. Q77R sind in den jeweiligen Kristallformen an großen Kontakten beteiligt. Die K20E-Mutante hat in ihrer Kristallform fünf Kontakte von jeweils 1220 Å, 1021 Å, 791 Å, 116 Å und 113 Å. Die Mutation K20E sitzt im drittgrößten Kontakt und ist in Abbildung 23 gezeigt. Die Q77R-Mutante ist dichter gepackt und besitzt eine 6-fache NCS. Die Kontaktflächen zwischen den NCS-verwandten Molekülen betragen 1250 Å, 847 Å und 63 Å. Die Mutation Q77R ist an zwei der kristallographischen Kontakten beteiligt, wobei der erste mit 690 Å den größten nach den NCS Kontakten darstellt (Abbildung 24). Der zweite Kontakt an dem die Mutante Q77R beteiligt ist hat eine Größe von 327 Å und ist damit der viert größte. Für die Kristallisation dieser Mutante hat sich außerdem die Anwesenheit von Kobalt-Ionen als wichtig erwiesen. Diese sind in der Struktur von drei Histidinen aus drei NCS-Kopien und einem Wassermolekül komplexiert. In Abbildung 25 ist ein Ausschnitt aus der Elementarzelle gezeigt in dem die Cobalt-Ionen und die Histidine eingezeichnet sind.

Abbildung 23 Stereodarstellung des Kristallkontaktes mit der Oberflächenmutante K20E. Ein Ausschnitt der Kette des Ausgangsmodells (grün) und seiner am Kontakt beteiligten Aminosäuren (hellgrau) sind gezeigt. Die am Kontakt beteiligten Reste des kristallographisch symmetrieverwandten Moleküls sind in gelb und dunkelgrau eingezeichnet. Die mutierte Aminosäure Glu20 ist orange eingefärbt.

81

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Abbildung 24 Stereodarstellung des Kristallkontaktes mit der Oberflächenmutante Q77R. Ein Ausschnitt der Kette des Ausgangsmodells (grün) und seiner am Kontakt beteiligten Aminosäuren (hellgrau) sind gezeigt. Die am Kontakt beteiligten Reste des kristallographisch symmetrieverwandten Moleküls sind in gelb und dunkelgrau eingezeichnet. Die mutierte Aminosäure Arg77 ist orange eingefärbt.

Abbildung 25 Stereodarstellung eines Ausschnittes aus der Elementarzelle von C2-I(Q77R). In grün und dunkelgrün sind die sechs NCS verwandten Moleküle einer asymmetrischen Einheit als Linienmodell eingezeichnet. Die Kobalt Atome sind pink, die an der Kobaltbindung beteiligten His243 rot und die Arg77 in orange als KugelStab-Modelle eingezeichnet.

82

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

4.1.9

Vergleich mit bekannten ADP-Ribosyltransferasen

Die nächsten Verwandten von C2-I deren Strukturen bekannt sind, sind die Enzym­ komponenten IotaA (Tsuge et al., 2003) und VIP2 (Han et al., 1999) der Toxine Iota und VIP. Beide besitzen dieselbe zwei-Domänen Struktur, wie C2-I. In allen drei Enzymen ist die relative Orientierung der N- und C-terminalen Domäne zueinander mit einer Abweichung von weniger als 5° sehr ähnlich. Die domänenweise strukturelle Überlagerungen zwischen diesen drei Proteinen zeigte eine durchschnittliche Zuordnung von 341 Resten innerhalb des üblichen 3 Å Ausschlusskriteriums, was 82% der durchschnittlichen Kettenlänge von 415 Resten entspricht. Desweiteren zeigen die Sequenzen durchschnittlich 28% identische Reste im eins zu eins Vergleich. Eine Auszählung der identischen Reste ergibt, dass sich 20% in der C-terminalen und nur 10% in der weniger konservierten N-terminalen Domäne befinden. In Anbetracht der nahen strukturellen Verwandtschaft der beiden Domänen ist es denkbar, dass NAD+ auch an die N-terminale Domäne von C2-I bindet. Jedoch sind nur die Reste Arg299, Phe 358 und Glu389, welche wichtige Kontakte mit der Nikotinamidseite von NAD+ ausbilden in allen drei Enzymen konserviert wohingegen die äquivalenten Reste in der N-terminalen Domäne (Val102, Asn167, Ser184) nicht konserviert sind. Dieser Unterschied und die generell höhere Konservierung in der C-terminalen Domäne (Abbildung 26) bestätigen, dass sich die gemeinsame katalytische Funktion der drei Enzyme in der C-terminalen Domäne befindet und dass die Bindung von NAD+ an die N-terminale Domäne sehr unwahrscheinlich ist. Da es nicht möglich war, das Substrat durch Kokristallisation oder Tränkexperimente im Kristall zu binden, wurde die NAD+ Position durch die Überlagerung der vier zentralen βStränge mit den bekannten Komplexen von NAD+ mit IotaA bzw. VIP2 abgeleitet. Die Abweichungen zwischen den jeweiligen NAD+ Molekülen aus IotaA und VIP2 betragen weniger als 2 Å für den Nikotinamidteil und weniger als 5 Å für den Adeninteil. Die erhaltene Position stimmt mit den bis jetzt durchgeführten Mutationsstudien überein (Barth et al., 1998).

83

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Abbildung 26 Strukturbasiertes Sequenz alignment von C2-I mit den verwandten Toxinen VIP2 und IotaA. Die Sekundärstruktur ist von C2-I und bis auf 310-Helices laufend nummeriert. Die Farben korrespondieren zu Abbildung 22. Die Domänengrenze ist zwischen β8 und α7 und markiert (▼). Jeder zehnte Rest von C2-I ist mit einem Punkt (●) markiert. Konservierte Reste sind in gelb hervorgehoben. Das N-terminale Methionin von C2-I fehlt.

4.1.10

Aktivitätsmutante C2-I(K20E-S361R) und Enzymaktivität

Die Struktur der C2-I(K20E-S361R) wurde wegen ihrer erhöhten Aktivität gegenüber α-Aktin bestimmt. Die Analyse zeigte, dass die Struktur sich von C2I(K20E) bis auf die S361R Mutation nicht unterscheidet. Das eingefügte Arg361 nimmt eine definierte Struktur ein, wie sie schon bei IotaA beobachtet werden konnte. Arg361 kann eine definierte Salzbrücke mit dem Diphosphate des NAD+ ausbilden. Zur Bestimmung der Aktivität wurde die enzymatische Komponente C2-I auf ihre ADP-Ribosyltransferase Aktivität gegenüber α-Aktin aus Hasenskelettmuskeln und einer Mischung aus β- und γ-Aktin aus dem Zytoplasma humaner Thrombozyten getestet. Außerdem wurde

die

Glykohydrolaseaktivität

bestimmt.

Die

gemessenen

Daten

wurden

zur

korrespondierenden Aktivität von IotaA in Bezug gesetzt (Tabelle 16). Die Ergebnisse bestätigen, dass C2-I fast ausschließlich β/γ-Aktin modifiziert und kaum α-Aktin, wohingegen das homologe Enzym IotaA beide Aktin-Isoformen modifiziert. Interessanterweise sind die Transferase- und die Hydrolaseaktivität von C2-I viel kleiner als die von IotaA. Desweiteren sind die Modifikationsraten von α-Aktin generell kleiner als von β/γ-Aktin. Die Mutante C2-I(K20E-S361R) führt das Arginin ein, das sowohl bei IotaA als auch bei den meisten anderen ADP-Ribosyltransferasen an dieser Position vorhanden ist. Diese Hybridmutante zeigt α- und β/γ-Aktin Transferase- und Hydrolaseaktivität zwischen C2-I und IotaA (Tabelle 16).

84

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Alle drei Aktinisoformen werden am Arg177 ribosyliert (Nummerierung nach β/γ-Aktin). β- und γ-Aktin unterscheiden sich lediglich am N-Terminus voneinander, welcher weit weg vom Arg177 ist. Abgesehen vom N-Terminus unterscheidet sich α- von β/γ-Aktin in 19 einzelnen Positionen. Während der Reaktion wird der 1'-Kohlenstoff des NAD+ an die Guanidiniumgruppe von Arg177 addiert, wodurch ein eindeutiger Interaktionspunkt zwischen den beiden Enzymen definiert ist. Bei näherer Betrachtung um diesen Punkt anhand der Strukturen von α- bzw. β/γAktin (PDB Zugangscodes 1ESV und 2BTF) zeigt sich eine recht große Interaktionsfläche. Die relative Orientierung der beiden Oberflächen wurde durch manuelles docking etabliert und zeigte eine gute Komplementarität der Kontaktflächen (Abbildung 27). Von den 19 oben genannten Austauschen zwischen den Aktin-Isoformen befinden sich lediglich die Positionen 176 (Met in α-Aktin, Leu in β/γ-Aktin), 272 (Ala, Cys) und 279 (Tyr, Phe) auf der Interaktionsoberfläche um Arg177. Keiner dieser Unterschiede kann den Faktor 400 der C2-I Aktivität mit β/γ- im Vergleich zu der mit α-Aktin erklären (Abbildung 27). Daher ist es wahrscheinlich, dass dieser ungewöhnliche Unterschied durch eine bis jetzt unbekannte posttranslationale Modifikation des α-Aktins hervorgerufen wird und der Austausch S361R hilft, sich dieser anzupassen.

Abbildung 27 Stereodarstellung von C2-I (mit NAD+ aus IotaA) und β/γ-Aktin (oben, PDB-Zugangscode 2BTF) in der vorgeschlagenen Reaktionsgeometrie. Beide Modelle sind gegenüber dem Betrachter um 32° geöffnet, so das die Interaktionsflächen sichtbar sind. Die gepunktete Linie zwischen dem C1'-Kohlenstoff des NAD+ und dem zu modifizierenden Arg177 des Aktins zeigt den Ribosyltransfer. Die drei α- gegen β/γ-Aktin Austausche auf der Interaktionsfläche und die Mutante S361R von C2-I sind rosa eingefärbt und markiert (schwarz).

85

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Tabelle 16

Enzymatische Aktivität von C2-I, C2-I(S361R) und IotaA Transferase Aktivität [%]a α-Aktin

β/γ-Aktin

Glykohydrolase Aktivität [%]a

C2-I, Wildtyp

0.01

4

0.04

C2-I(S361R)

0.11

43

IotaA, Wildtyp

21

0.21

100

a

0.41

a

Alle Daten sind relative kcat-Werte. Der kcat Wert von IotaA bei der Modifikation von β/γ-Aktin war 0.63 s-1.

4.1.11

Expression und Reinigung der Transportkomponente C2-II

Die Kultivierung C2-II produzierender E. coli erfolgte wie unter Kap. 3.2.2 beschrieben im 2 L Maßstab in Erlenmeyerkolben. Ausgehend von einem bereits etablierten Protokoll (H. Hochmann, pers. Mitteilung) wurde die Präparation von einer Reinigung über Sepharose-beads auf eine Reinigung ausschließlich mit Säulen umgestellt. Außerdem wurde noch ein Reinigungsschritt mit einer IEC an Mono-Q durchgeführt. Bei der Reinigung wurde immer eine schwache Bande bei einer geringfügig kleineren Molekularmasse als C2-II im SDS-Gel beobachtet, die durch Aminosäuren-Sequenzierung (E. Schiltz, persönliche Mitteilung) als DnaK (E. coli heatshock protein) identifiziert werden konnte (Abbildung 28). Nach der Reinigung (Kap. 3.2.2) lag die Gesamtausbeute an homogenen Protein üblicherweise bei 3 mg aus 2 L Kulturmedium. Vor der Kristallisation wurde C2-II gegen das 500fache Volumen an deion. Wasser dialysiert. Zur Lagerung wurde das Protein auf ca. 5 mg/mL konzentriert und eingefroren.

Abbildung 28 SDS-PAGE ausgesuchter Fraktionen der Reinigung von C2-II durch IEC mit dem starken Anionenaustauscher Mono-Q. Deutlich zu erkennen ist die schwache Verunreinigung durch DnaK. Bahn 1 Molekularmassenstandard Bahn 2 – 10 Verschiedene Fraktionen des C2-II peaks

86

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

4.1.12

Kristallisation von C2-II

Erste Kristallisationsversuche von C2-II wurden mit einer Proteinkonzentration von 3 mg/mL durchgeführt. Dabei wurden 1 µL Protein- mit 1 µL Reservoirlösung gemischt und nach der sitting-drop-Methode gegen 70 µL Reservoirlösung äquilibriert. Eine initiale Bedingung wurde mit den Crystal Screens I+II gefunden, die dann mit einem (NH4)2SO4-screen unter Zugabe von 5% Isopropanol verfeinert wurde. Die resultierenden Kristalle wuchsen bis zu einer Länge von 250 µm und einer Breite von 150 µm. Es konnte gezeigt werden, dass die schwache Verunreinigung mit DnaK, die nach der IEC teilweise verblieben ist, sich nicht negativ auf die Kristallisation auswirkte und deshalb auf weitere Reinigungschritte verzichtet werden konnte.

Abbildung 29 Kristalle von C2-II (A) Typischer Kristall aus verfeinerter Kristallisationsbedingung mit 5% Isopropanol (B) Kristall gleicher Raumgruppe mit anderen Habitus aus verfeinerter Bedingung mit 5% Isopropanol und 3% Ethanol

Tabelle 17

Kristallisationsbedingung für C2-II Proteinkonzentration a

3 mg/mL

Reservoirlösung

100 mM NaAcetat, pH 4.6 1.5 M (NH4)2SO4 5% Isopropanol, 3%Ethanol

Tropfengröße b

6 µL

Temperatur

20 °C

a b

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens Gleiche Volumen Reservoir- und Proteinlösung wurden gemischt

87

ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4.1.13

Datensammlung

Zur röntgenographischen Untersuchung der Kristalle bei 100 K wurden diese vor dem Einfrieren 1-3 min in eine Lösung bestehend aus 2 M (NH4)2SO4 mit zusätzlichen 30% Glycerin als cryo protectant getaucht (Kap. 3.4.4). Zur Derivatisierung mit Schwermetallen wurden zu den Tropfen, in denen sich Kristalle mit ausreichender Größe befanden direkt Schwermetallverbindungen gegeben. Kristalle, die nach einer Stunde bis einem Tag keine Risse oder sonstige Schäden aufzeigten wurden bei 100 K eingefroren und anschließend auf der Hausanlage oder an den beamlines X11 (DESY, Hamburg, Deutschland) oder X06SA (SLS, Villigen, Schweiz) vermessen. Die Datensätze wurden mit der Software APRV, die auf dem Programmpaket XDS basiert, prozessiert und skaliert (Kap. 3.5.6). Durch Analyse von Differenzpattersonfunktionen (Kap. 3.5.7 und 3.5.8) wurden die Derivate analysiert. Es konnten jedoch bis jetzt keine erfolgreichen Derivate gefunden werden. Jedoch konnte ein nativer Datensatz mit einer Auflösung von 3.1 Å aufgenommen werden. Die Kristalle konnten der Raumgruppe P43212 zugeordnet werden und der Solvensgehalt betrug 52% mit einem Monomer pro asymmetrischer Einheit. Tabelle 18

Parameter und Statistiken von C2-II C2-II Wellenlänge λ [Å]

0.9795

Strahlungsquelle

SLS, X06SA

Raumgruppe Zellparameter

P43212 a

a = b = 104.4 Å, c = 153.2 Å

Auflösungsbereich [Å] b Unabhängige Reflexe Multiplizität Vollständigkeit [%] b Rsym [%]

b

I/σ b Wilson B-Faktor a b

88

b

40 – 3.1 (3.22 – 3.13) 15'486 (1240) 9.5 99.6 (100) 7.5 (44.2) 21.5 (5.7) 68

mit VM = 2.6 ų/Da, was einem Solvensgehalt von 52% entspricht die Angaben für die letzte Schale sind in Klammern

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

4.1.14

Strukturlösung von C2-II

Phasierung und Modellbau Da sich kein geeignetes Derivat zur Phasierung finden ließ, wurde auf die Methode des molekularen Ersatzes zurückgegriffen. Hierzu wurde das Modell des Protective Antigen (PA) des Anthrax Toxins benutzt. Anhand der etablierten Struktur von PA wurde ein Suchmodell für C2-II erstellt und in die fünf Domänen C2-II20 (Reste 1-181 mit einer Masse von 20 kDa), D1' (182-262), D2 (263-486), D3 (487-591) und D4 (592-721) unterteilt. Mit den Domänen D1', D2 und D3 wurde der erste Lauf des Molekularen Ersatzes durchgeführt, da diese die höchste Sequenzidentität ausweisen. Anschließend wurde mit Domäne C2-II20 weiter gesucht. Durch diese Prozedur konnte ein klares Signal für alle vier Domänen erhalten werden (Tabelle 19). Für die Domäne D4 wurde jedoch kein signifikantes Signal erhalten. Dies spiegelt die fehlende Sequenzidentität dieser Domäne wider. Somit konnte diese Domäne nicht zugeordnet werden. Ihre Präsenz im Kristall wurde aber durch Analyse mittels SDS-PAGE bestätigt. Durch die begrenzte Auflösung und die fehlende NCS konnte keine Phasenverbesserung durch Dichtemodifikation erreicht werden. Dies machte einen korrekten Neubau des Modells unmöglich, was sich auch in den Verfeinerungsstatistiken niederschlug. Hierfür wurde das Programm BUSTER/TNT benutzt, da es durch seine besondere Skalierungmethode in der Lage ist, das Fehlen von Modellteilen zu kompensieren. Tabelle 19

Statistiken der Strukturlösung durch molekularen Ersatz von C2-II Domäne

Rotation LLG

Translation

Z-score

LLG

Z-score

D1', D2, D3

7.25

3.05

29.25

6.81

C2-II20

35.46

2.74

64.09

7.26

a

4.1.15

a

log likelihood gain

Qualität des Modells von C2-II

Die globalen Indikatoren für die Modellqualität waren für das C2-II Modell nicht zufriedenstellend. Die R-Faktoren sind für den Auflösungsbereich der Daten sehr hoch und spiegeln die Tatsache wieder, dass erhebliche Teile des Modells fehlen. Durch das vorhandene model-bias war es nicht möglich, fehlerhafte Teile des Modells zu erkennen und neu zu bauen. Die Ramachandran-Analyse der Modells zeigt entsprechend schlechte Statistiken für das Modell. Somit sind anhand dieses Modells lediglich Aussagen über die relative Anordnung der Domänen möglich. 89

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 20

Verfeinerungsstatistiken von C2-II C2-II Auflösungsbereich [Å]

40 – 3.1

Proteinatome

3977

Solvensatome

0

Ligandenatome

0

Rcryst / Rfree (test set)[%]a

41.3 / 43.3 (5)

rms-Abweichungen b Bindungslängen [Å]

0.004

Bindungswinkel [°] Ramachandran-Torsionswinkel

1.02 c

günstiger Bereich [%]

58.5

erlaubter Bereich [%]

39.9

verbotener Bereich [%]

1.6

a

R-Faktoren nach BUSTER/TNT im Vergleich zu den Standardgeometrien nach Engh & Huber (1991) c Definition gemäß Lovell et al. (2003) b

4.1.16

Strukturbeschreibung der Transportkomponente C2-II

C2-II kann in fünf Domänen aufgeteilt werden. Die erste Domäne C2-II20 ist über einen loop mit der Domäne D1' verbunden, welcher durch Trypsin geschnitten werden kann. Dadurch wird C2-II20 vom Rest des Protein gelöst. Domäne D1' beinhaltet ein Kalziumbindemotiv, das hoch konserviert ist. Die Domänen D2 und D3 sind an der Heptamerbildung des proteolytisch aktivierten Proteins beteiligt, wobei Domäne D3 den Innenraum der Pore bildet. Die Domäne D4 bildet den Rezeptor-bindenden Teil aus (Abbildung 30). 4.1.17

Vergleich mit Transportkomponenten anderer Toxine

Eine BLAST Suche nach Sequenzhomologen zeigte eine signifikante Verwandtschaft zwischen C2-II und den Transportkomponenten von C. difficile, C. perfringens, C. spiroforme, Brevibacillus laterosporus, B. thuringiensis und dem Anthrax Toxin. Hiervon ist bis jetzt nur die Struktur der Anthrax Toxin Transportkomponente PA bekannt (Petosa et al., 1997). Für eine Quantifizierung der Sequenzunterschiede wurde der Vergleich auf C2-II, PA des Anthrax Toxins, IotaB aus C. perfringens und VIP1 aus B. thuringiensis beschränkt, da die anderen drei Sequenzen eine hohe Verwandtschaft mit einem dieser vier Proteine haben.

90

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

Vergleiche innerhalb dieser Vierergruppe zeigten einheitliche Variationen entlang der Polypetidkette. Die Ergebnisse von sechs domänenweisen eins-zu-eins Vergleichen zwischen den verschiedenen Sequenzen ergaben, dass die durchschnittliche Identität 21%, 48%, 34%, 30% und 5% für die fünf Domänen C2-II20, D1', D2, D3 und D4 betrugen. In allen einzelnen Vergleichen wurde nur eine geringe Abweichung von diesen Durchschnittswerten festgestellt, was für eine nennenswerte Konsistenz zwischen den vier Strukturen spricht. Abbildung 31 zeigt ein alignment zwischen C2-II und PA: Während die Domänen C2-II20, D1', D2 und D3 mäßige bis gute Homologie zeigen, ist die Domäne D4 sehr verschieden. Dies kann mit der unterschiedlichen Rezeptorspezifität erklärt werden (Santelli et al., 2004, Eckhardt et al., 2000). Bei einer Überlagerung der C2-II Struktur mit der PA Struktur auf die größte Domäne D2 zeigt sich eine Verschiebung der Domänen C2-II20, D1' und D3 um 6.4 Å, 3.8 Å, 3.6 Å und eine entsprechende Rotation um 17°, 15° und 17°. Diese Änderungen zeigen das Ausmaß der Domänenumordnung zwischen den Transportkomponenten der beiden Toxine. Noch größere Änderungen können für die Domäne D4 erwartet werden. Sekundärstrukturvorhersagen für die D4 Sequenzen von C2-II, IotaB und VIP1 zeigen fast ausschließlich β-Stränge. Dies stimmt gut mit der beobachteten Sekundärstruktur der Domäne 4 von PA überein. Somit ist es wahrscheinlich, dass sie alle eine Immunoglobulin-ähnliche Faltung besitzen (Santelli et al., 2004).

Abbildung 30 Stereodarstellung der Transportkomponente C2-II als Bändermodell. Die Domänen C2-II 20 (rot), D1'(grün), D2 (orange) und D3 (blau) sind eng verwandt mit den entsprechenden Domänen der Transport­ komponente PA des Anthrax Toxins. Die gepunkteten Teilstücke haben keine definierte Struktur. Die C-terminale Domäne D4 ist durch eine graue Kugel dargestellt, die an die entsprechende Stelle wie sie im Anthrax Toxin vorliegt gesetzt wurde. Die vertikale schwarze Linie ist die zentrale Achse des möglichen Heptamers von C2-IIa abgeleitet von der pre-Pore die von PA63 ausgebildet wird (Petosa et al., 1997).

91

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Abbildung 31 Alignment von C2-II mit der verwandten Transportkomponente PA des Anthrax Toxins. Unstrukturierte Abschnitte sind klein geschrieben. Die Sekundärstrukturelemente sind bis auf 310-Helices durchnummeriert. Domänengrenzen (▼) und die proteolytischen Schnitte in den Aktivierungs-loops (,) sind markiert. Konservierte Reste sind grau unterlegt. Ebenfalls in den Transportkomponenten VIP1 und IotaB konservierte Reste sind markiert (*).

4.1.18

Modell der C2-IIa pre-Pore und C2-I Translokation

Es wurden mehrere hochaufgelöste Strukturen des monomeren PA bei verschiedenen pH Werten bestimmt, die alle die gleiche Faltung zeigten (Petosa et al., 1997; Santelli et al., 2004). Des weiteren wurde die Struktur der heptameren pre-Pore, die durch das PA63 Fragment (Domänen 1', 2, 3 und 4) gebildet wird, bei pH 8.5 bestimmt (Petosa et al., 1997). Bei der Bildung der pre-Pore beträgt die Verschiebung und Rotation der Domänen 1', 3 und 4 von PA gegen die größte Domäne 2 nur geringfügige 1 Å und 4° und ist deshalb vernachlässigbar. Somit lässt sich durch Überlagerung der kanalformenden Domäne D2 von C2-II auf die korrespondierende Domäne 2 von PA63 ein Modell der C2-IIa pre-Pore bestehend aus D1', D2 und D3 erstellen (Abbildung 32). Es konnte gezeigt werden, dass das Segment 29-86 von C2-I für das Binden an die C2-IIa prePore nötig ist (Barth et al., 2002). Diese Segment beinhaltet die Helices α2 bis α5, wie sie auch in Abbildung 22 markiert sind. Die korrespondierende docking Schnittstelle ist sehr 92

4.1 Ergebnisse und Diskussion zum Toxin C2 aus Clostridium botulinum

wahrscheinlich identisch mit der von PA, welche in der gut konservierten Domäne 1' liegt, wie mit Mutagenese-Reihenuntersuchungen am PA gezeigt wurde (Cunningham et al.,. 2002; Lacy et al., 2005). Dieser Bereich ist in Abbildung 32 markiert. Vor der proteolytischen Aktivierung wird dieser von C2-II20 abgedeckt. Die Translokation von C2-I durch die Pore ist abhängig von der Präsenz des Segments 1-28 (Barth et al., 2002), welches Helix α1 beinhaltet. Diese Helix enthält fünf Lysin- und Argininreste und fünf Glutamatreste ohne Gesamtladung bei neutralen pH, jedoch mit steigend positiver Gesamtladung bei niedrigen pH Werten. Ähnliche Anordnungen finden sich auch bei VIP2 und IotaA. Außerdem zeigt sich bei einem Vergleich zwischen der niedrig pH Struktur und der bei normalen pH von C2-I, dass sich die Helices α1 und α2 um ca. 2 Å bewegen während die sechs N-terminalen Reste an sich hoch mobil sind. Dies bestätigt den Vorschlag, dass der Nterminus und vor allem Helix α1 als positiv geladener Bolzen fungieren, der durch den pHGradienten und/oder durch die Differenz im elektrischen Potential zwischen Endosom und Zytosol durch die von C2-IIa geformte Pore getrieben wird und somit den Transport des gesamten C2-I Moleküls initiiert.

Abbildung 32 Stereodarstellung des C2-IIa Heptamers Modells. Das Modell wurde durch Überlagerung mit der vorhandenen Struktur der PA63 pre-Pore des Anthrax Toxins erstellt. Die Domänen sind wie in Abbildung 30 eingefärbt. Die erwartete docking Schnittstelle ist gelb gefärbt.

93

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4.2 4.2.1

Ergebnisse und Diskussion zum Elastase : Scyptolin-A-Komplex Probenvorbereitung der Elastase

Zur Reproduktion der aus der Literatur bekannten Kristallisationsbedingungen (Mattos et al., 1994) von Elastase wurde lyophilisierte Elastase aus Schweinepankreas bei Serva bestellt. Das gelieferte Produkt war von ausreichender Reinheit, so dass nach dem Auflösen in Natriumacetatpuffer und Konzentration dieser Lösung (Kap. 3.2.3) sich die aus der Literatur bekannten Kristalle reproduzieren ließen (Wright et al., 2001). Scyptolin-A wurde aus S. hofmanni isoliert (AK Weckesser, Uni Freiburg) und in Methanol zu 33 µL/mL gelöst. 4.2.2

Kristallisation von Elastase : Scyptolin-A-Komplexen

Zwar ließen sich die Elastasekristalle reproduzieren, jedoch konnte der Inhibitor nicht durch soaking Experimente in den Kristallen gebunden werden (S. Jelakovic, persönliche Mitteilung). Daraufhin wurde eine 18 mg/mL Elastase-Lösung mit einem 1.5 M Überschuss an Scyptolin-A für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde mit dem aus der Literatur bekannte Natriumsulfat screen als auch mit dem Crystal Screens I-II (Hampton Research) nach neuen initialen Bedingungen gesucht. Die besten Kristalle ergaben sich aus dem Natriumsulfat screen und hatten einen neuen Habitus. Sie können als hexagonale Platten beschrieben werden, deren Kantenlänge bei 200 x 200 x 20 µm³ lagen (Abbildung 33). Die typische Wachstumsdauer betrug 3 Tage.

Abbildung 33

94

Kristall des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes.

4.2 Ergebnisse und Diskussion zum Elastase : Scyptolin-A-Komplex

Tabelle 21

Kristallisationsbedingung Elastase : Scyptolin-A Proteinkonzentration a

18 mg/mL

Puffer der Proteinlösung

10 mM Natriumacetat, pH 5.0

Reservoirlösung

0.42 M Na2SO4

Tropfengröße b

10

Temperatur

20 °C

a b

4.2.3

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens Gleiche Volumen Reservoir- und Proteinlösung wurden gemischt

Datensammlung

Zur röntgenographischen Untersuchung der Kristalle bei 100 K wurden diese vor dem Ein­ frieren für 5 min in eine Lösung bestehend aus 0.025 M Na2SO4 mit zusätzlichen 50% Glyzerin als cryo protectant getaucht (Kap. 3.4.4). Die Kristalle wurden bei 100 K im cryo-Strom der Hausanlage schockgefroren und anschließend vermessen. Die Datensätze wurden mit XDS und XSCALE (Kabsch, 1998) ausgewertet und skaliert (Kap. 3.5.6). Es konnte ein Datensatz mit einer Auflösung von 2.8 Å aufgenommen werden und die Raumgruppe wurde zu P622 mit zwei Molekülen pro asymmetrischer Einheit bestimmt. Tabelle 22

Parameter und Statistiken des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes Elastase Wellenlänge [Å]

1.542

Strahlungsquelle

Hausanlage image plate, Cu Kα

Raumgruppe

P622

Zellparameter a

a = b = 155.9 Å, c = 91.0 Å

Auflösungsbereich [Å] b Unabhängige Reflexe Multiplizität

b

30 – 2.8 (2.86 – 2.80) 16'453 (999) 8.3

Vollständigkeit [%] b

99 (100)

Rsym [%] b

13.3 (39)

I/σ b

13.6 (5.5)

a b

mit VM = 3.2 ų/Da, was einem Solvensgehalt von 61% entspricht die Angaben für die letzte Schale sind in Klammern

95

ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4.2.4

Strukturlösung des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes

Die Phasierung der gemessenen Daten geschah durch die Methode des molekulare Ersatzes unter Verwendung des Programms MOLREP mit einer schon bekannten Struktur der Elastase aus der Proteindatenbank (ID: 1ELB), bei der sämtliche Liganden und Wassermoleküle entfernt worden waren,. Hierbei konnten die zwei Moleküle in der asymmetrischen Einheit mit den beiden höchsten peaks der Rotationsfunktion in der Translationsuche gefunden werden. Nach einer rigid body Verfeinerung wurde ein simulated annealing Lauf mit dem Programm CNS mit einer Starttemperatur von 2500 K unter Berücksichtigung der NCS durchgeführt, um model bias zu entfernen. In der anschließend berechnete Differenzdichte konnte der Inhibitor Scyptolin-A eindeutig identifiziert und eingebaut werden. Das Modell wurde manuell korrigiert und die Verfeinerung mit CNS durchgeführt, wobei aufgrund der geringen Auflösung nur zwei Gruppen (Haupt und Seitenketten) für die B-Faktor Verfeinerung benutzt wurden. 4.2.5

Qualität des Modells

Die Qualitätsindikatoren Rcryst und Rfree befanden sich nach Ende der Verfeinerung in für die gegebene Auflösung guten Bereichen. In Tabelle 23 sind die Statistiken des verfeinerten Modells des

Elastase : Scyptolin-A-Komplexes

zusammengefasst.

Die

geometrischen

Parameter

Bindungslänge und -winkel als auch die Torsionswinkel lagen in akzeptablen Bereichen. Tabelle 23

Verfeinerungsstatistiken des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes Elastase:Scyptolin-A Auflösungsbereich [Å]

30 – 2.8

Proteinatome

3644

Solvensatome

105

Ligandenatome

136

Rcryst / Rfree (test set)[%]

21.9 / 25.8 (10)

Mittlere B-Faktoren [Ų]

24.5

rms-Abweichungen a Bindungslängen [Å]

0.007

Bindungswinkel [°] Ramachandran-Torsionswinkel

a b

96

1.35 b

günstiger Bereich [%]

94.0

erlaubter Bereich [%]

5.6

verbotener Bereich [%]

0.4

im Vergleich zu den Standardgeometrien nach Engh & Huber (1991) Definition gemäß Lovell et al. (2003)

4.2 Ergebnisse und Diskussion zum Elastase : Scyptolin-A-Komplex

4.2.6

Struktur des Elastase : Scyptolin-A-Komplexes

Die (Fo-Fc)-Differenzdichte zeigte eine eindeutige Bindekonformation des Inhibitors (Abbildung 35). Die Elektronendichte war bei einer Konturhöhe von 3 σ durchgehend und vom Protein getrennt, was eine kovalente Bindung des Inhibitors ausschließt. Die zwei kristallographisch unabhängigen Elastase-Inhibitor Komplexe im Kristall wurden während der Verfeinerung über eine NCS miteinander in Beziehung gesetzt. Hierdurch verbesserte sich die Modellqualität merklich, führte jedoch auch dazu, dass jegliche Unterschiede zwischen den Komplexen stark abgeschwächt wurden. Die resultierende mittlere Abweichung zwischen allen Atomen war 0.025 Å für die Proteine und 0.021 Å für die Inhibitoren. Im Folgenden wird deshalb nicht mehr zwischen den beiden Kopien unterschieden. Die Inhibitormoleküle stehen über die lokale zweizählige Achse in Kontakt scheinen sich aber nicht in ihrer Bindung zum Enzym zu beeinflussen. Hierdurch lässt sich aber erklären, warum die Kristallisationsversuche mit Scyptolin-B (Abbildung 34) fehlschlugen, da die zusätzliche Substitution am Thr2-Oγ des Scyptolin-B zum Zusammenstoß mit dem jeweiligen anderen Inhibitormolekül führen würde.

Abbildung 34 Kovalente Strukturen der Cyanopeptolidine Scyptolin-A mit R = H und Scyptolin-B mit R = NButyroyl-Alanyl. Alle Aminosäurereste haben L-Konfiguration; Das Oligopeptid ist wie üblich durchnummeriert. Ahp steht für 3-Amino-6-hydroxy-2-pideridon. Zwischen Thr6 und cmTyr (3'-chloro-N-methyl-Tyr) ist cisPeptidbindung. Die Lacton-Zyklisierung klassifiziert das Molekül als Depsipeptid. Die angegebenen Elastase subsites S1 bis S4 platzieren die spaltbare Bindung zwischen Leu und Ahp.

97

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Abbildung 35 Stereodarstellung der Scyptolin-A-Bindung an Schweinepankreas Elastase. (A) Bändermodell der Elastase mit der initialen (Fo-Fc)-Elektronendichtekarte von Scyptolin-A bei einer Konturhöhe von 3 σ. Das finale Modell von Scyptolin-A ist in die Dichte gezeichnet. Die Seitenketten der katalytischen Triade sind als Referenz eingezeichnet (rosa). (B) Oberflächendarstellung der Elastase mit gebundenen Scyptolin-A. Die katalytische Triade unter der Oberfläche ist eingezeichnet und der mögliche nukleophile Angriff der Serins ist mit einer gestrichelten Linie (rot) eingezeichnet. Der Inhibitor mit seiner starren zyklischen Struktur sitzt perfekt in der Tasche des aktiven Zentrums.

Wie schon in Abbildung 34 und detaillierter in Abbildung 35 gezeigt benutzt Scyptolin-A die ersten vier N-terminalen Aminosäurereste um an die subsites S1 bis S4 der Elastase zu binden. Hierbei ergeben sich Hauptketten-Wasserstoffbrücken, wie bei einem antiparallelen β-Faltblatt. An der subsite S1 füllt der Leu4-O das Oxyanionenloch und interagiert hierbei mit den Amiden der Reste 201, 202 und 203. Trotzdem gab es keine Hydrolyse, wie an der durchgehende (F o-Fc)Dichte des 19-gliedrigen Rings zu sehen ist. Weitere Wasserstoffbrückenbindungen gibt es zwischen Ala1-O des Inhibitors und Arg226-Nε der Elastase und zwischen Thr6-Oγ des Inhibitors und Thr44-Oγ. Weiterhin gibt es ein auffallendes Wassermolekül, das über Wasserstoffbrücken mit Thr2-Oγ, Thr3-O, und cmTyr7-O verbunden ist. Dieses Wasser hat 98

4.2 Ergebnisse und Diskussion zum Elastase : Scyptolin-A-Komplex

Gln200-Nε des Enzyms als vierten Bindungspartner und ist in einer idealen tetragonalen Geometrie gebunden. Somit könnte es eine weitere Versteifung des Ringes bewirken. Die Butyroyl-Gruppe und der Chlor Substituent liegen in einer unpolaren Umgebung. Die Größe und Form von Scyptolin-A erlauben eine enge Bindung in die Tasche des aktiven Zentrums (Abbildung 35). Inhibitionsstudien an der Elastase zeigten einen IC50-Wert von 0.16 µM für Scyptolin-A und B (Matern et al., 2001). Die Seitenkette von Thr2 zeigt in das Solvens, so dass Scyptolin-B genauso gut an Elastase binden kann wie Scyptolin-A. Der IC50-Wert für Trypsin war 100 mal höher, obwohl der Bindungsmodus von Scyptolin-A ohne Probleme auf das strukturell verwandte Trypsin übertragen werden kann. Allerdings können zwei Wasserstoffbrücken des Nterminalen Arms von Scyptolin-A mit Trypsin nicht ausgebildet werden und das Leu4 des Inhibitors kann nicht in die Spezifitätstasche des Trypsins binden, die für Lysin oder Arginin vorgesehen ist. Diese Unterschiede können erklären, warum Scyptolin-A kein effizienter Trypsin-Inhibitor ist. 4.2.7

Vergleich mit anderen bekannten Elastase-Inhibitor-Strukturen

Der Elastase : Scyptolin-A-Komplex zeigt, dass die subsites S1 bis S4 am wichtigsten sind, wohingegen die subsites S1', S2' usw. auf der anderen Seite der Schnittstelle nicht so einfach definiert werden können. Der gleiche Unterschied wurde auch schon für andere Elastase : Inhibitor-Komplexe berichtet (Mattos et al., 1994; Wilmouth et al., 1997; Wright et al., 2001). Hierunter waren auch Bindestudien mit einem Elastase-inhibierenden Casein Protein, welches auch die subsites S1 bis S4 besetzt und eine Esterbindung mit dem Enzym ausbildet (Abbildung 36). In dieser Struktur gibt es auch ein Wassermolekül an einer für die Esterhydrolyse (Wright et al., 2001) passenden Position (In Abbildung 36 eingezeichnet). Dieses „hydrolytische Wasser“ ist an derselben Position, wie der Ahp-Rest in dem 19-gliedrigen Ring von Scyptolin-A (Abbildung 36). Dies zeigt, dass die Ringstruktur der Scyptoline einen wichtigen Teil des aktiven Zentrums besetzt und so die Hydrolyse verhindert. Weitere Elastase : Inhibitor-Komplex-Strukturen wurden für das Streptomyces Peptidderivat FR901277 (Nakanishi et al., 2000) und für den entworfenen Inhibitor FR136706 (Kinoshita et al., 2003) berichtet. Diese beiden Inhibitoren füllen auch die Tasche des aktiven Zentrum aus, wobei sie chemische Strukturen aufweisen, die merklich von der des Scyptolin-A abweichen und somit eine andere Herangehensweise der Elastase-Inhibition aufzeigen. Die Bindestruktur von Scyptolin-A an Elastase sollte mit der des Cyanopeptolin A90720A an dem strukturell verwandten Rinderpankreas-Trypsin (Lee et al., 1994) verglichen werden. Eine 99

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Überlagerung der Inhibitoren zeigt eine nahezu identische Konformation des 19-gliedrigen Rings inklusive des Ahp Restes und der zwei internen Wasserstoffbrücken, obwohl die Reste Leu4, Thr6 und cmTyr7 von Scyptolin-A durch Arg, Leu und mTyr in A90720A ausgetauscht sind. Der Austausch von Leucin zu Arginin vor der Spaltstelle spiegelt natürlich den Unterschied in der Spezifität zwischen Elastase und Trypsin wider. Der N-terminale Arm von A90720A besteht aus einem D-Leu, das durch (R)-Glyzerat-3-Sulfat am Stickstoff blockiert ist. In beiden Fällen ist der 19-gliedrige Ring intakt geblieben, da keine Esterbindung mit dem Serin des aktiven Zentrums der Enzyme ausgebildet wurde. Folglich zeigen die beiden Cyanopeptoline eine eng verwandte Ringstruktur mit gleicher Inhibitionsgeometrie, obwohl sie an verschiedene Enzyme binden (Lee et al., 1994).

Abbildung 36 Stereodarstellung der Bindestruktur von Scyptolin-A an Elastase überlagert mit der des Elastaseinhibierenden Peptides Val-Glu-Pro-Ile. Val-Glu-Pro-Ile ist von β-Casein (Wright et al., 2001) abgeleitet und bildet eine Esterbindung mit dem katalytischen Ser203 aus (grün). Die Casein Peptid Struktur zeigt die vier subsites S1 bis S4, die das Substrate binden und dabei ein antiparalelles β-Faltblatt ausbilden. Außerdem enthält sie ein Wassermolekül an einer Position, die sich zur Esterspaltung eignet (grün). Die vier N-terminalen Aminosäurereste von Scyptolin-A besetzen die subsites S4 bis S1 der Elastase. Das interne Wassermolekül, das die Ringstruktur von Scyptolin-A stabilisiert, ist eingezeichnet.

100

4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex

4.3 4.3.1

Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex Expression und Reinigung der blLAP

Sowohl die Reinigung der blLAP als auch die Präparation von Microginin-FR1 wurden in Zusammenarbeit mit Manuel Kraft vom Institut für Biologie II, Mikrobiologie, Universität Freiburg durchgeführt. blLAP wurde hierbei nach einem aus der Literatur (Rich et al., 1984) bekannten Protokoll aus Rinderaugen gewonnen.

Abbildung 37 Elutionsprofil der Reinigung von blLAP durch GPC an Sephadex S200. Durchgezogene Linie: UV-Absorption bei 280 nm Wellenlänge.

Abbildung 38 Bahn 1 Bahn 2 Bahn 3 Bahn 4 Bahn 5 Bahn 6 Bahn 7 Bahn 8

SDS-PAGE ausgesuchter Fraktionen der Reinigung von blLAP durch GPC an Sephadex S200. Molekularmassenstandard Fraktion 60 (120 – 122 mL) Bahn 9 Fraktion 74 (148 – 150 mL) Fraktion 62 (124 – 126 mL) Bahn 10 Fraktion 76 (152 – 154 mL) Fraktion 64 (128 – 130 mL) Bahn 11 Fraktion 78 (156 – 158 mL) Fraktion 66 (132 – 134 mL) Bahn 12 Fraktion 80 (160 – 162 mL) Fraktion 68 (136 – 138 mL) Bahn 13 Fraktion 82 (164 – 166 mL) Fraktion 70 (140 – 142 mL) Bahn 14 Fraktion 84 (168 – 170 mL) Fraktion 72 (144 – 146 mL) Bahn 15 Fraktion 86 (172 – 174 mL)

101

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Hierbei wurden aus den gekühlten Rinderaugen die Linsen präpariert und in einer NaCl Lösung aufgelöst. Nach einer (NH4)2SO4-Fällung konnte die Reinigung mit einer GPC über Sephadex S200 abgeschlossen werden. Die erhaltenen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE überprüft und solche, die blLAP enthielten vereinigt und auf 7 mg/mL konzentriert. Bis auf die GPC wurde die Präparation durchgeführt. Microginin-FR1 wurde ebenfalls durch M. Kraft aus Microcystis aeruginosa isoliert und gereinigt. Es lag anschließend als gelbliches Pulver vor. Zur Kristallisation wurde dieses in verschiedenen Lösungsmitteln gelöst.

4.3.2

Kristallisation von blLAP : Microginin-FR1-Komplexen

Zur Kristallisation wurde eine blLAP Lösung von 7 mg/mL mit in DMSO gelösten Microginin-FR1 für 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend zentrifugiert. Diese Lösung wurde als 10 µL Tropfen gegen eine Reservoirlösung, die 50% MPD enthielt, nach der hangingdrop Methode äquilibriert. So wurden innerhalb einer Woche Kristalle in Form von hexagonalen Stäben erhalten, die eine Kantenlänge von 600 x 250 x 250 µm³ hatten.

Abbildung 39

102

Kristall des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes.

4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex

Tabelle 24

Kristallisationsbedingung blLAP : Microginin-FR1 Proteinkonzentration a

7 mg/mL + 5 mM Microginin-FR1

Puffer der Proteinlösung

50 mM Tris-HCl, pH 7.8 200 mM NaCl 50 µM ZnSO4

Reservoirlösung

Proteinpuffer + 50% MPD

Tropfengröße b

10 µL

Temperatur

20 °C

a b

4.3.3

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens Keine Mischung von Proteinlösung und Reservoir

Datensammlung

Der für die röntgenographische Untersuchung bei 100 K erforderliche cryo-Schutz war durch die Kristallisationsbedingung schon gegeben. Somit konnten die Kristalle direkt aus dem Tropfen in flüssigen Stickstoff eingefroren werden. Es wurde ein Datensatz am BESSY aufgenommen und die Raumgruppe zu P6322 bestimmt (Tabelle 25). Tabelle 25

Parameter und Statistiken des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes Wellenlänge λ [Å]

0.9184

Strahlungsquelle

BESSY B14.1

Raumgruppe Zellparameter

P6322 a

a = b = 130.0 Å, c = 120.8 Å

Auflösungsbereich [Å] b Unabhängige Reflexe Multiplizität b Vollständigkeit [%] b Rsym [%]

b

I/σ b Wilson B-Faktor a b

4.3.4

b

35 – 1.73 (1.80 – 1.73) 62'705 (6822) 6.0 (5.4) 99.4 (98.1) 6.9 (47) 18.9 (3.5) 23.1

mit VM = 2.8 ų/Da, was einem Solvensgehalt von 56% entspricht. Die Angaben für die letzte Schale sind in Klammern.

Strukturaufklärung des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes

Die Phasierung erfolgte durch die Methode des molekularen Ersatzes, wobei lediglich eine rigid body Verfeinerung der bereits bekannten Struktur (PDB-ID: 1BLL, Kim et al., 1993) nötig 103

ERGEBNISSE UND DISKUSSION war, da sich die Raumgruppe und Zellparameter im Vergleich zur Ausgangsstruktur nicht geändert haben. Zum Entfernen des model bias wurde ein simmulated annealing Lauf mit dem Programm CNS bei einer Starttemperatur von 2500 K durchgeführt. Anschließend wurde eine initiale Elektronendichtekarte mit RESOLVE im prime-and-switch Modus berechnet. Nach manuellen Korrekturen und Ergänzungen wurde das Modell mit REFMAC5 verfeinert und der Inhibitor in die resultierende (Fo-Fc)-Elektronendichte gebaut. Die Koordinaten und Bibliotheken des Inhibitors wurden mit dem PRODRG-Server erstellt. Wassermoleküle wurde automatisch mit COOT eingefügt. 4.3.5

Qualität des Modells

Die globalen Qualitätsparameter Rcryst und Rfree des Modells zeigten am Ende der Verfeinerung sehr gute Werte. Die Ramachandrananalyse ergab gute Statistiken (Tabelle 26). Tabelle 26

Verfeinerungsstatistiken des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes Auflösungsbereich [Å]

35 – 1.73

Proteinatome

3'922

Solvensatome

575

Ligandenatome

294

Rcryst / Rfree (test set) [%]

14.3 / 17.3 (5)

Mittlere B-Faktoren [Ų]

38

rms-Abweichungen

a

Bindungslängen [Å]

0.020

Bindungswinkel [°]

1.652

Ramachandran-Torsionswinkel b

a b

4.3.6

günstiger Bereich [%]

92.8

erlaubter Bereich [%]

7.2

verbotener Bereich [%]

0.0

im Vergleich zu den Standardgeometrien nach Engh & Huber (1991) Definition gemäß Lovell et al. (2003)

Struktur des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes

blLAP ist ein Homohexamer mit D3-Symmetrie (Abbildung 42). Durch die C- und Nterminalen Domänen werden zwei große Kontakte an den zweizähligen Achsen gebildet, durch die ein starker Zusammenhalt des Hexamers gewährleistet ist. Die C-terminale Domäne bildet einen weiteren Kontakt an der dreizähligen Achse aus. Die aktiven Zentren sind um eine zentrale 104

4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex

Kavität im Zentrum des Hexamer angeordnet. Sie sind durch die N-terminale Domäne abgeschirmt, jedoch durch sechs Kanäle zugänglich, die groß genug sind, um eine ungefaltete Peptidkette durchzulassen. Durch diese Topologie kann das Enzym nur ungefaltene Peptide spalten, da gefaltene Peptide oder Proteine nicht bis zur zentralen Kavität vordringen können. Der Ahda-Ala Teil von Microginin-FR1 passt sehr gut in die Tasche des aktiven Zentrums und bindet mit voller Besetzung, wie an den kristallographischen B-Faktoren zu sehen ist, die mit denen der umliegenden Resten übereinstimmen. Der Decansäure-Rest von Ahda liegt in einer geräumigen Erweiterung des aktiven Zentrums, die von den Resten Leu269, Met270, Asp365, Ala451, Met 454 und Thr455 begrenzt wird. Diese Erweiterung ist zum größten Teil unpolar, enthält jedoch auf einer Seite das Asp365, was nahe legt, dass eine positive Ladung an dieser Stelle des Inhibitors seine Bindungseigenschaften verbessern würde. Die Aminogruppe von Ahda interagiert mit einem der beiden Zinkionen (Zn1) des aktiven Zentrums, genauso wie mit dem Thr359-O, während die Hydroxylgruppe der Ahda mit dem Zn2 und einem fest gebunden Wasser, das von den Hauptkettenamiden von Glu334 und Gly335 gebunden ist, wechselwirkt. Das 1-Carbonyl der Ahda bildet eine Wasserstoffbrücke mit dem Lys262-Nε aus. Der Alaninrest des Microginins-FR1 bildet Wasserstoffbrücken mit Leu360-O und Gly362-N ähnlich wie ein paralleles β-Faltblatt aus. Ahda und Alanin besetzen die subsites S1 und S1' (Abbildung 40) und dadurch das aktive Zentrum der LAP. Die drei C-terminalen Reste des Inhibitors sind weniger definiert gebunden. Der dritte Rest N-methyl-Leucin bindet mit seinem Carbonylsauerstoff durch ein Wassernetzwerk an Arg366 und Ala363-O. Die verbleibenden zwei Tyrosine von Microginin-FR1 haben relativ hohe BFaktoren. Das erste Tyrosin bindet mit seiner Hydroxylgruppe über Arg425' an Asp365. Die Hydroxylgruppe bildet über Wassermoleküle und auch direkt Wasserstoffbrücken zu den Resten 423 und 424 aus. Trotz ihrer hohen B-Faktoren vermindert sich die Inhibitionsfähigkeit bei der Entfernung dieser beiden Tyrosine merklich (Ishida et al., 2000).

105

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Abbildung 40 Kovalente Struktur des Pentapeptids Microginin-FR1 mit seinen charakteristischen Ahda Rest (Neumann et al., 1997). Das verwandte Dipeptid Bestatin (Umezawa et al., 1976) und das Tetrapeptid Amastatin (Aoyagi et al., 1978) tragen eine modifizierte Ahda als ersten Rest. In Bestatin und Amastatin sind die Atome C5C10 der Ahda durch Phenyl bzw. Isopropyl ersetzt. Die anderen Reste von Bestatin und Amastatin sind -Leu bzw. -Val-Val-Asp. Alle Aminosäuren haben L-Konfiguration. Die Position der Spaltstelle wird durch die subsites S1 und S1' markiert.

Abbildung 41 Stereodarstellung des blLAP : Microginin-FR1-Komplexes. Das finale Modell einer Untereinheit des Enzyms ist als Bändermodell dargestellt. Der Inhibitor ist als Stabmodell dargestellt und von seiner (2Fo-Fc) Elektronendichte bei 0.8 σ umgeben. Die zwei Zinkionen des aktiven Zentrums sind als Referenz eingezeichnet (rosa). Die N-terminale (Reste 1-158) und die C-terminale Domäne (Reste 159-485) sind in gelb bzw. rot eingefärbt. Die dreizählige (grün) und zweizähligen (schwarz) Achsen sind eingezeichnet.

106

4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex

Abbildung 42 Stereodarstellung des blLAP Hexamers. (A) Oberflächendarstellung des Hexamers mit Sicht entlang der dreizähligen Achse. Die Untereinheiten sind einzeln eingefärbt und die Domänen beschriftet. Die zweizähligen Achsen sind schwarz. Die Eingänge zum aktiven Zentrum sind mit rosa Stäben markiert. (B) Das Hexamer als Stabdarstellung mit den gleichen Farben und Achsen wie in A. Es ist auf 6 Å Höhe über der Ebene der zweizähligen Achsen parallel zu dieser aufgeschnitten. Das Microginin ist rosa eingezeichnet und beschriftet (Inh).

4.3.7

Vergleich mit anderen bekannten blLAP-Inhibitoren

Das cyanobakterielle Peptid Microginin-FR1 repräsentiert eine große Gruppe von bekannten Microgininen, die durch den N-terminalen Rest Ahda charakterisiert werden (Okino et al., 1993; Ishida et al., 1997; Sano et al., 2005). Der IC50-Wert von Microginin-FR1 für blLAP (EC 3.4.11.1) wurde zu 1.3 µM bestimmt, was niedriger ist als der Wert von 16 µM für ACE (Neumann et al., 1995). Die IC50-Werte der anderen Microginine für ACE sind in der Größen­ ordnung von 10 µM und größer (Okino et al., 1993; Ishida et al., 2000; Sano et al., 2005). Stärkere Inhibition wurde für die microsomale LAP (EC 3.4.11.2) festgestellt. Microginin-FR1 hat einen IC50-Wert von 6 nM für microsomale LAP aus Schweinenieren während andere Microginine Werte von 16 nM bis 10 µM haben (Okino et al., 1993; Ishida et al. 2000; Sano et al., 2005). Die verwandten Inhibitoren Bestatin und Amastatin zeigen IC50-Werte im micro­

107

ERGEBNISSE UND DISKUSSION molaren Bereich für zytosolische als auch microsomale LAP (Rich et al., 1984; Wilkes et al., 1985).

Abbildung 43 Stereodarstellung des aktiven Zentrums von blLAP mit dem gebundenen Inhibitor MicrogininFR1. Kettenenden sind mit Halos markiert. Die zwei Zinkionen sind grau, die Wassermoleküle sind blau und das Chlorid grün. Reste einer benachbarten Untereinheit sind mit einem Strich markiert. Wassserstoffbrücken sind als schwarze gestrichelte Linien dargestellt. Die Zinkkoordination ist mit roten gestrichelten Linien dargestellt (Abstände 2.0-2.3 Å). Van-der-Waals Kontakte sind grüne gepunktete Linien (alle nicht beschrifteten Distanzen sind zwischen 3.6 Å und 4.6 Å). Die B-Faktoren der Inhibitor Reste Ahda-Ala-mLeu-Tyr-Tyr sind 15, 13, 21, 51 bzw. 81 Ų.

Abbildung 44 Stereodarstellung des gebundenen Microginin-FR1 überlagert mit den Bindestrukturen der Inhibitoren Amastatin (blau) (Kim & Lipscomb, 1993) und L-Leucinephosphonat (rosa) (Sträter & Libscomb, 1995).

108

4.3 Ergebnisse und Diskussion zum blLAP : Microginin-FR1-Komplex

Die inhibierten Enzyme zytosolische LAP, microsomale LAP und ACE sind alle Exopeptidasen mit einem oder zwei Zinkionen im aktiven Zentrum. Trotzdem sind diese Strukturen sehr unterschiedlich (Burley et al., 1992; Natesh et al., 2003; Adlagatta et al., 2006). Bei allen erwähnten Inhibitoren ist der erste Rest mit der Ahda verwandt (Abbildung 40). Dieser bindet an die Metallzentren von zytosolischer und microsomaler LAP, wie in Abbildung 41 und auch schon in der Literatur (Burley et al., 1992; Kim et al., 1993; Sträter et al., 1995; Addlagatta et al., 2006) gezeigt. Die hier vorgestellte Komplex-Struktur mit zytosolischer LAP ähnelt der bisher bekannten Struktur des mit Microgenin verwandten Bestatin an microsomaler LAP (Addlagatta et al., 2006) unterscheidet sich jedoch im Detail.

109

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4.4

Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

4.4.1

Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase

Natives Enzym Die Expression und Reinigung der DHPON-Hydrolase (DHPON-H) wurde in Kooperation mit P. Sachelaru am Institut für medizinische Biochemie der Universität Freiburg durchgeführt. Hierbei wurde das Enzym in E. coli mit einem N-terminalen His-tag bei 30 °C synthetisiert und nach der Lyse an eine Ni-NTA Säule gebunden und anschließend mit einem 0-500 mM Imidazol Gradienten eluiert. Es ergaben sich typische Ausbeuten von 35 mg Protein pro L Kulturmedium. SeMet-DHPON-Hydrolase Für die Herstellung von SeMet-markierten Protein wurde das DHPON-H codierende Plasmid in den Methionin auxotrophen Stamm E. coli B834 (DE3) transformiert und die Zellen in 3 L LeMaster (Hendrickson et al., 1990) Medium kultiviert, das mit 25 mg/L SeMet und 50 µg/mL Ampicillin ergänzt wurde. Die Kultur wurde bei einer OD600 von 0.6 für weitere 10 Stunden mit 0.5 mM IPTG induziert. Die Reinigung wurde wie für das native Protein durchgeführt, außer das 10 mM β-Mercaptoethanol zu allen Puffern gegeben wurde. Vor der Kristallisation wurde noch zusätzlich eine IEC mit dem starken Anionentauscher Mono-Q durchgeführt. Die Präparation ergab eine Ausbeute von 50 mg SeMet-markierten Protein pro L Kultur. Zur Aufbewahrung wurde es auf 12 mg/mL konzentriert und bei 5 °C gelagert. Die vollständige Inkorporation des SeMet wurde durch ESI-MS (C. Warth, Universität Freiburg, Institut für Organische Chemie und Biochemie) bestätigt. 4.4.2

Kristallisation der DHPON-Hydrolase

Natives Enzym Das Protein wurde mit einer Konzentration von 12 mg/mL gegen die im Arbeitskreis zur Verfügung stehenden Kristallisations-screens getestet. Hierbei stellte sich heraus, dass sich in nahezu allen PEG haltigen Bedingungen innerhalb kürzester Zeit nadelförmige Kristalle bildeten (Abbildung 45A). Um die Wachstumsdauer von teils wenigen Minuten zu verlangsamen und damit einen verbesserten Kristallhabitus zu erreichen, wurden PEG sehr hoher Molekularmasse (10'000 und 20'000) eingesetzt um eine geeignete Kristallisationsbedingung zu finden. Hierbei wurde gegen verschiedene pH-Werte als auch gegen verschiedene Konzentrationen des Fällungsmittels getestet. Die eingesetzten PEG führten zu einer deutlichen Verlangsamung des

110

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

Kristallwachstums und einer erheblichen Verbesserung des Kristallhabitus (Abbildung 45B). Da die erhaltenen Kristalle immer noch in großer Zahl vorlagen und kleine Dimensionen besaßen wurden durch so genanntes microseeding größere Kristalle gezüchtet (Abbildung 46). Hierbei wurde ein aus gleichen Teilen Proteinlösung und Reservoirlösung gemischter Tropfen gegen die Reservoirlösung äquilibriert, wobei ein pH des Reservoirs gewählt wurde, bei dem keine eigenständige Nukleation des Proteins stattfindet. Nach einem Tag wurde dann mittels eines Haares aus einem Tropfen mit frisch kristallisierten DHPON-H ein Kristallisationskeim übertragen, indem das Haar kurz unter die Oberfläche des kristallhaltigen Tropfens und dann in den äquilibrierten Tropfen getaucht wurde. Die verfeinerten Kristallisationsbedingungen finden sich in Tabelle 27 wieder.

Abbildung 45 Kristalle der DHPON-Hydrolase. (A) initiale Kristalle, wie sie in diversen PEG haltigen Bedingungen gefunden werden. (B) Kristall in einer verfeinerten PEG 10'000 Bedingung.

Tabelle 27

Kristallisationsbedingung DHPON-Hydrolase Proteinkonzentration a

12 mg/mL

Puffer der Proteinlösung

50 mM Tris-HCl, pH 7.4 200 mM NaCl 0.5 M TCEP

Reservoirlösung

35% PEG 10000 Tris-HCl, pH 8.2 (pH 8.8)b

Tropfengröße c

10 µL

Temperatur

20 °C

a

Konzentration vor dem Ansetzen des Tropfens pH-Wert für initiale Kristalle 8.2, für microseeding 8.8 c Gleiche Volumen von Proteinlösung und Reservoir wurden gemischt b

111

ERGEBNISSE UND DISKUSSION SeMet-DHPON-H Mit dem SeMet markierten Protein konnten die Kristallisationsbedingungen der nativen Kristalle reproduziert werden. Die für die Phasierung genutzten Kristalle wurden ebenfalls durch microseeding gewonnen und glichen im Aussehen und Größe den nativen Kristallen.

Abbildung 46 Kristalle der DHPON-Hydrolase (SeMet). (A) Kristalle entlang einer seeding Straße. (B) Beispiel für einen Kristall, bei dem nur ein Keim in einen voräquilibrierten Tropfen gebracht wurde.

4.4.3

Datensammlung

Zur röntgenographischen Untersuchung der Kristalle bei 100 K wurden diese vor dem Einfrieren zwischen 1-3 min in eine Lösung bestehend aus Reservoirpuffer mit zusätzlichen 10% Glycerin als cryo protectant getaucht (Kap. 3.4.4). Die Kristalle wurden am Synchrotron (BESSY, BL14.1) vermessen. Um eine optimale Wahl der Wellenlängen für das MAD Experiment (Kap. 3.5.8) zu gewährleisten, wurde eine Fluoreszenz-scan um die Selen-Kα vor der eigentlichen Messung durchgeführt. Es wurden drei Datensätze bei verschiedenen Wellenlängen aufgenommen (Tabelle 28). Die Datensätze wurden mit dem Programmpaket XDS prozessiert und skaliert (Kap. 3.5.6). Die Kristalle konnten der Raumgruppe P21 zugeordnet werden und der Solvensgehalt betrug 46% mit vier Monomeren pro asymmetrischer Einheit. Desweiteren wurden noch Kokristallisations- und soak-Experimente mit dem Vorläufer­ molekül des Substrats HPON und dem Reaktionsprodukt DHP durchgeführt. Die Auswertung der Daten ergab jedoch, dass die Substrate nicht ausreichend in den Kristallen gebunden werden konnten, um im Röntgenexperiment nachgewiesen werden zu können.

112

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

Tabelle 28

Parameter und Statistiken des DHPON-Hydrolase Datensatzes DHPON-Hydrolase Se-Met

Wellenlänge [Å]

peak

inflection

remote

0.97976

0.97993

0.91841

Strahlungsquelle

BESSY BL14.1

Raumgruppe Zellparameter a

P21 a = 90.6 Å, b = 57.0 Å, c = 152.6 Å, β = 103.3°

Auflösungsbereich [Å] Unabhängige Reflexe b,c Multiplizität Vollständigkeit [%] b Rsym [%]

b

I/σ b Wilson B-Faktor

35 – 1.73 (1.80 – 1.73) 175'719 (16'470)

175'660 (16'469)

172'409 (15'944)

3.9

3.9

1.9

99.9 (99.7)

99.9 (99.6)

99.4 (98.4)

7.5 (37.7)

7.0 (37.0)

4.9 (25.3)

12.2 (3.7)

13.3 (3.8)

11.5 (3.3)

33.7

34.2

33.2

a

mit VM = 2.3 ų/Da, was einem Solvensgehalt von 46% entspricht. die Angaben für die letzte Schale sind in Klammern. c Friedel Paare wurden nicht zusammengefasst. b

4.4.4

Strukturlösung der DHPON-Hydrolase

Analyse der Daten, Schweratomsuche und Phasierung Die Analyse der MAD-Daten des SeMet-markierten DHPON-Hydrolase (Tabelle 28) erfolgte mit dem Programm XPREP (Kap. 3.5.8). Dabei wurden die anomalen Differenzen auflösungsabhängig abgeschätzt, um eine Beurteilung der Güte der Daten zu ermöglichen. Das dabei ermittelte Signal-zu-Rausch-Verhältnis des anomalen Signals sowie die Korrelations­ koeffizienten zwischen den Datensätzen sind in Tabelle 29 aufgeführt. Es ergaben sich sehr gute Statistiken bis einer Auflösung von 4.0 Å für alle Datensätze. Der peak-Datensatz zeigte erwartungsgemäß das beste anomale Signal mit guten Statistiken bis zu einer Auflösung von 2.6 Å. Die Schweratomsuche wurde mit dem Programm SHELXD gegen die FA-Werte aller drei Datensätze durchgeführt. Dabei wurden 44 Schweratompositionen gefunden, was elf Selenomethioninen pro Protomer entspricht. Dies entspricht der zu erwartenden Menge an Signalen, wenn das Startmethionin sowie den davor liegenden mitexprimierten T7-tag vernachlässigt wird, da dieser Teil oft unstrukturiert vorliegt. Die Verfeinerung der Schweratomparameter sowie die Phasierung erfolgte anschließend mit dem Programm SHARP. Die sich hierbei ergebenden Statistiken (Tabelle 30) zeigten eine gute Qualität des Derivats. 113

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Tabelle 29

Anomales Signal-zu-Rausch-Verhältnis sowie die Korrelationskoeffizienten des DHPON-Hydrolase MAD Datensatzes 50

8.0

6.0

5.0

4.0

3.5

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2.

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

8.0

6.0

5.0

4.0

3.5

3.0

3.0

2.6

2.4

2.2

2.0

high remote

2.4

2.2

1.8

1.5

1.3

1.1

1.1

1.0

0.9

0.9

0.8

peak

4.1

4.1

3.4

3.0

2.5

2.0

1.8

1.6

1.4

1.1

1.0

inflection

2.3

2.3

1.9

1.6

1.3

1.2

1.1

1.0

1.0

0.9

0.8

high remote / peak

86

89

86

81

73

63

56

47

38

27

18

high remote / inflection

81

86

81

75

65

50

44

36

25

16

7

peak / inflection

93

95

93

90

82

72

64

54

43

31

21

Auflösung

Tabelle 30

Statistiken der MAD-Phasierung der DHPON-Hydrolase peak a

high remote Auflösungsbereich [Å]

inflection a

80 – 2.09

phasing power isomorph - zentrisch

-

1.75

2.30

isomorph - azentrisch

-

2.12

2.76

anomal - azentrisch

1.16

1.54

1.06

isomorph - zentrisch

-

0.48

0.37

isomorph - azentrisch

-

0.50

0.40

0.85

0.64

0.82

Rcullis

anomal - azentrisch FOM zentrisch

0.55

azentrisch

0.63

nach DM

0.76

a

Bei den isomorphen Differenzen wurde der high remote Datensatz als Referenz genutzt.

Dichtemodifikation, Modellbau und Strukturverfeinerung Die initialen Phasen aus SHARP wurden durch Dichtemodifikation soweit verbessert, dass sich eine klare und gut interpretierbare Elektronendichtekarte ergab. Es wurde sowohl die Dichtemodifikation durch SOLOMON und DM, wie sie in autoSHARP implementiert ist, genutzt als auch mit RESOLVE gearbeitet. Die resultierenden Dichtekarten waren von 114

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

vergleichbarer guter Qualität. Mit dem Programm ARP/wARP gelang es trotz der guten Elektronendichtekarte nicht, ein vollständiges Modell der asymmetrischen Einheit automatisch zu erstellen. Deshalb wurde auf das Programm RESOLVE zurückgegriffen, das durch die Möglichkeit eine vorgegebene NCS beim Modellbau zu berücksichtigen in der Lage war, alle vier DHPON-Hydrolase Protomere in die asymmetrische Untereinheit zu bauen. Das aus RESOLVE resultierende Modell wurde manuell um die noch fehlende Abschnitte ergänzt und falsch gebaute Regionen korrigiert. Die Verfeinerung des Modells wurde mit dem Programm REFMAC5 gegen den remote-Datensatz durchgeführt, wobei zwei (A und B) der vier Protomere über NCS restraints verknüpft wurden. In die verbliebene positive Differenzdichte wurden Solvensmoleküle an chemisch sinnvollen Postionen eingebaut, wobei Wassermoleküle automatisch mit COOT hinzugefügt und manuell validiert wurden. 4.4.5

Qualität des Modells der DHPON-Hydrolase

Die globalen Qualitätsparameter Rcryst und Rfree des Modells lagen am Ende der Verfeinerung bei für die gegebene Auflösung guten Werten. Die geometrischen Parameter und die Torsions­ winkel liegen in akzeptablen Bereichen (Tabelle 31). Die mittleren B-Faktoren der Ketten A und B sind mit ~53 Ų deutlich höher als die der anderen Ketten. Eine Analyse der Kristallkontakte zeigt, dass diese beiden Ketten eine durchschnittliche Kontaktfläche von 760 Ų besitzen im Gegensatz zu 1329 Ų für die Ketten C und D, wodurch sie schlechter im Kristall fixiert sind.

Abbildung 47 Ramachandran Diagramm der DHPON-Hydrolase. Die Positionen aller Aminosäuren sind durch Kreuze (Glycine), Dreiecke (Proline und pre-Proline) und Quadrate (alle anderen Aminosäuren) gekennzeichnet. Energetisch günstige Regionen sind mit dunklen Farben gekennzeichnet. Das katalytische Ser217 ist beschriftet.

115

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Tabelle 31

Verfeinerungsstatistiken der DHPON-Hydrolase (remote Datensatz) Auflösungsbereich [Å] Proteinatome

a

11'242

Solvensatome

968

Rcryst / Rfree (test set)[%] Mittlere B-Faktoren Protomere A/B/C/D [Ų] a rms-Abweichungen

30 – 2.1

18.1 / 23.7 (3) 53 / 52 / 36 / 21

b

Bindungslängen [Å]

0.022

Bindungswinkel [°]

1.527

Ramachandran-Torsionswinkel c günstiger Bereich [%]

97.3

erlaubter Bereich [%]

2.7

verbotener Bereich [%]

0.0

a

Die strukturierten Reste der Ketten A, B, C und D sind die Positionen 8-366, 6-365, 15-365 bzw. 7-365. b im Vergleich zu den Standardgeometrien nach Engh & Huber (1991) c Definition gemäß Lovell et al. (2003)

4.4.6

Strukturbeschreibung

Sekundärstruktur Die Sekundärstrukturelemente der DHPON-Hydrolase wurden mit DSSP und STRIDE bestimmt. Die Ergebnisse sind nahezu gleich und in Abbildung 48 dargestellt.

Abbildung 48: Sequenz und Sekundärstruktur der DHPON-Hydrolase. Jeder zehnte Rest ist mit einem Punkt markiert.

116

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

Tertiärstruktur Die DHPON-Hydrolase hat eine Molekularmasse von 40'994 kDa pro Untereinheit. Jede Untereinheit besteht aus einer 110 Reste großen N-terminalen und einer 257-Reste-großen Cterminalen Domäne (Abbildung 49). Die N-terminale Domäne besteht aus den Helices α1 bis α6. Der C-terminale Teil enthält ein neunsträngiges β-Faltblatt, das von α-Helices flankiert ist, und zeigt eine typische α/β-Hydrolase Faltung. (Nardini et al., 1999; Holmquist, 2000). Acht der neun β-Stränge sind parallel.

Abbildung 49 Stereodarstellung einer DHPON-Hydrolase Untereinheit als Bändermodell. Die 110 Aminosäuren lange N-terminale Domäne besteht aus sechs α-Helices (blau). Die C-terminale Domäne zeigt die typischen α/βHydrolase Faltung (rot und orange). Die Verbindung zwischen den β-Strängen β6 und β7 (grün) korrespondiert mit dem Deckel der die aktiven Zentren von α/β-Hydrolasen des meta-cleavage Stoffwechselwegs von aromatischen Verbindungen abdeckt. Die Dimerachse ist in schwarz eingezeichnet. Die Aktivitätsmutanten sind als Stabmodelle eingezeichnet. Die katalytische Triade und das Wasser im Oxyanionenloch sind grün eingezeichnet.

Quartärstruktur und Kristallpackung Die asymmetrische Einheit des Kristalls enthielt vier Proteinketten die mit A, B, C und D bezeichnet wurden. Der Solvensgehalt des Kristalls war mit 46% im normalen Bereich. Die vier Ketten bildeten die zwei C2-symmetrischen Dimere A-B und C-D. Die Dimerkontaktfläche ist circa 1050 Ų groß, während alle anderen Packungskontakte kleiner als 390 Ų und somit zu klein für eine alternative Dimerzuordnung sind. Diese Dimere bestätigen die Dimere, die auch in Lösung gefunden werden, was durch GPC Läufe gezeigt werden konnte (P. Sachelaru, persönliche Mitteilung). Die Summe der Packungskontakte hatte eine Größe von 760 Ų für Dimer A-B und 1330 Ų für Dimer C-D. Hierdurch ergab sich eine losere Packung für Dimer AB, wodurch auch die viel höheren durchschnittlichen B-Faktoren erklärt werden können. Die Untereinheiten des Dimers A-B zeigten eine kompaktere Form als die Untereinheiten des Dimers C-D. Die rmsd Cα Distanz dieser beiden Konformationen beträgt 0.8 Å mit einigen

117

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Abweichungen im 3 Å Bereich (Abbildung 50). Ein Vergleich zwischen den Dimeren A-B und C-D zeigte eine merkliche Abweichung zwischen den N-terminalen Domänen. Im Speziellen waren die Helices α2, α3, und die Spitzen von α4, α5 und α6 verschoben.

Abbildung 50 Abbildung 49.

Stereodarstellung der DHPON-Hydrolase als Bändermodell. Die Farbgebung entspricht der von

Abbildung 51 Stereodarstellung der Überlagerung der beiden im Kristall gefundenen Konformere. Der Übersicht wegen wurde nur ein Protomer pro Dimer dargestellt. Dimer C-D nimmt eine offene (schwarz) und Dimer A-B eine geschlossene (grün) Konformation an. Die Dimer Achse ist schwarz eingezeichnet. Die Unterschiede in der Tasche des aktiven Zentrums werden durch die recht großen Bewegungen der eingezeichneten Seitenketten von Arg18, Trp41, Tyr81, Phe84, Leu85 und Glu153 verursacht. Das Wasser im Oxyanionenloch (rosa) und die katalytische Triade sind als Referenz eingezeichnet.

118

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

4.4.7

Aktives Zentrum

Da das Substrat DHPON instabil ist, konnte es nicht für Tränk- oder Kokristallisations­ experimente genutzt werden, um das aktive Zentrum zu lokalisieren. Außerdem konnte auch kein kristalliner Komplex mit dem Reaktionsprodukt DHP oder mit dem stabilen Vorläufer HPON hergestellt werden. Deshalb wurde angenommen, dass das aktive Zentrum in der Tasche sitzt, die von der katalytischen Triade begrenzt wird, welche als ein charakteristisches Merkmal der α/β-Hydrolase Familie hochkonserviert ist (Nardini et al., 1999; Holmquist, 2000). Bei der DHPON-Hydrolase besteht diese Triade aus den Resten Ser217, His329 und Asp300 und das zugehörige Oxyanionenloch wird durch die Amide 147-N und 218-N in Übereinstimmung mit der Definition in BphD (Horsman et al., 2006) gebildet. In der vorliegenden Kristallstruktur ist in allen vier Untereinheiten das Oxyanionenloch durch ein Wasser besetzt. Dementsprechend wurde ein Modell des Substrates DHPON in das aktive Zentrum gebaut, dessen Carbonylsauerstoff im Oxyanionenloch zu liegen kam, eine günstige räumliche Anordnung zur katalytischen Triade hatte und in die aktive Tasche passte. Um dieses Modell zu bestätigen, wurden verschiedene Aminosäurereste, die Kontakt zum Substratmodell hatten zu Alaninen mutiert und die verbleibende Enzymaktivität gemessen. Die Aktivität der mutierten Enzyme wurden mit einem gekoppelten Test bestimmt, der sich an den Nikotinstoffwechselweg anlehnt (P. Sachelaru, persönliche Mitteilung). Die resultierenden Aktivitäten sind in Tabelle 32 aufgeführt. Der Verlust der Aktivität für die Mutante S217A, welche die katalytische Triade modifiziert, und für die Mutante R18A, die in der N-terminalen Domäne liegt, bestätigen die Lage des aktiven Zentrums. Interessanterweise äußern sich vergleichsweise kleine Änderungen des Proteinrückgrats zwischen den beiden Dimeren als große Änderungen verschiedener Seitenketten in der Umgebung des aktiven Zentrums (Abbildung 51). Die Untereinheiten innerhalb jeden Dimers zeigten im Wesentlichen identische Konformationen, was darauf hindeutet, dass das komplette Dimer und nicht die einzelnen Untereinheiten zwischen der geschlossenen und offenen Form alterniert. Da das Dimerinterface durch die N-terminalen Domänen dominiert ist (Abbildung 50), ist es wahrscheinlich, dass die beiden Dimerkonformationen die Strukturen vor und nach einem induced-fit mit einem gebundenen Substratmolekül darstellen. Aufgrund der Tatsache, dass kein Substratmolekül in dem Kristall gebunden war, kann angenommen werden, dass diese zwei Konformationen intrinsisch stabil sind und die Kristallpackungskontakte dafür verantwortlich sind, dass Dimer A-B die eine und Dimer C-D die andere angenommen hat.

119

ERGEBNISSE UND DISKUSSION Enzymatische Aktivität von Punktmutanten der DHPON-Hydrolase a

Tabelle 32

Mutante

Relative spezifische Aktivität

Wildtyp

100

R18A

< 0.02

D22A

19

E148A

2

S149A

16

E153A

68

R216A

8

S217A b

< 0.02

b

6

H329A b

8

C330A

95

H332A

42

D300A

a

Die Daten repräsentieren den Durchschnitt von drei unabhängigen Messungen unmarkierter Enzym Mutanten. Die spezifische Aktivität des Wildtyp Enzyms war (2.64 ± 0.15) units/mg. Die mutierten Reste sind in Abbildung 49 gezeigt. b Reste der katalytischen Triade

4.4.8

Vergleich mit anderen bekannten Hydrolasen

Eine BLAST-Suche (Altschul et al., 1997) ergab mehrere mutmaßliche Proteine, die mit der DHPON-Hydrolase verwandt sind. Nahest verwandt ist ein hypothetisches Protein aus Norcardioides sp. (TrEMBL Q3GYI1) mit einer Sequenzidentität von 45%. Mindestens zwei Dutzend anderer Proteine zeigten eine Sequenzidentität von mehr als 25%. Unter ihnen waren Enzyme die den Dipeptidyl-Aminopeptidasen, den Esterasen und den Acyltransferasen zugeordnet werden können. Die Sequenzähnlichkeit mit den etablierten C-C Bindung spaltenden Hydrolasen des meta-cleavage Stoffwechselwegs von aromatischen Verbindungen wie DmpD (Nordlund & Shingler, 1990), TodF (Menn et al., 1991), BphD (Ahmad et al., 1995; Seah et al., 1998; Nandhagopal et al., 2001; Horsman et al., 2006), XylF (Diaz & Timmis, 1995), CumD (Fushinobu et al., 2002), CarC (Jun et al., 2006) und MhpC (Habe et al., 2003) war nicht signifikant. Die bekannten Strukturen von BphD, CumD, CarC und MhpC können jedoch der α/β-Hydrolase Familie zugeordnet werden und sind deshalb entfernt verwandt mit der DHPONHydrolase. Im Gegensatz zu der Oligomerisierung über eine β-Faltblatt Erweiterung, wie in den anderen C-C Bindung spaltenden α/β-Hydrolasen, dimerisiert die DHPON-Hydrolase jedoch über die N-terminale Domäne (Abbildung 49). Ein strukturbasierter Sequenzvergleich mit den C-C Bindung spaltenden α/β-Hydrolasen BphD und MhpC ist in Abbildung 52 gezeigt. CumD und CarC wurden nicht berücksichtigt, da

120

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

sie nahe Verwandte von BphD und MhpC sind und circa 25% identische Reste haben. Den beiden Enzymen BphD und MhpC fehlt die 110 Reste große N-terminale Domäne, die aus den Helices α1 bis α6 besteht und das aktive Zentrum abdeckt. Stattdessen haben sie eine 40 Reste große Insertion zwischen den β-Strängen β6 und β7, die einen Deckel über dem aktiven Zentrum formt, wie er auch in vielen anderen α/β-Hydrolasen zu finden ist. Die Region um das aktive Zentrum ist strukturell und funktionell hochkonserviert mit der katalytischen Triade und dem Oxyanionenloch an identischen Positionen. In der offenen Konformation von Dimer C-D (Abbildung 53A) besitzt die hier beschriebene DHPON-Hydrolase eine wohlgeformte katalytische Triade mit Ser217 in der Rotamer II Position (Emsley & Cowtan, 2004). In der geschlossenen Konformation von Dimer A-B (Abbildung 53B) nimmt Ser217 jedoch die Rotamer Position I ein und bildet eine Wasserstoffbrücke zu dem Wasser im Oxyanionenloch aus anstatt zum His329 der katalytischen Triade. Eine Inspektion von einem Dutzend anderen α/β-Hydrolasen, unter anderen auch das verwandte CumD (Jun et al., 2006), zeigte, dass das katalytische Serin die Rotamer Position III annimmt, wodurch die Hydroxylgruppe in eine bessere Position für einen Angriff auf das C1' gebracht wird (Bürgi & Dunitz, 1983) und die katalytische Triade intakt bleibt, wenn die Imidazolgruppe des His329 nur leicht rotiert wird. Dies legt nahe, dass die gefundenen Rotamere I und II nicht zur Katalyse befähigt sind und dass das native Ser217 eine Konformation nahe an Rotamer III annimmt wie es in Abbildung 53 dargestellt ist.

Abbildung 52 Strukturbasiertes Alignment der DHPON-Hydrolase (Hyd., oberste Zeile) mit BphD in der zweiten Zeile und MhpC in der dritten Zeile. Alle drei Sequenzen fangen an Position eins an. Die Sequenzen von BphD und MhpC entsprechen denen aus der PDB. Kleinbuchstaben zeigen das Fehlen definierter Struktur an. Das kristallisierte DHPON-Hydrolase Konstrukt hatte einen zusätzlichen 12-Reste-großen T7-tag am N-terminus und einen Glu-His6-tag ab Position 366 des C-terminus. Die Sekundärstruktur und die Zählpunkte beziehen sich auf die DHPON-Hydrolase. Hochkonservierte (‡) und gut konservierte (+) Aminosäuren eines Alignments der DHPONHydrolase mit den drei verwandtesten Sequenzen (Q3GYI1, Q3H227, Q2E207) aus einer BLAST Suche sind markiert.

121

ERGEBNISSE UND DISKUSSION 4.4.9

Reaktionsgeometrie und Mechanismus der DHPON-Hydrolase

Die hydrolytische Spaltung von C-C Bindungen findet sich in den Abbau-Stoffwechselwegen verschiedener aromatischer Verbindungen als erster Schritt nach der Ringöffnung in einer metaSpaltungsreaktion wieder. Unter den Enzymen, die diese Reaktion katalysieren, sind die strukturell etablierten BphD, CumD, CarC und MhpC sowie zahlreiche sequenzverwandte Hydrolasen. All diese Enzyme sind β-Ketolasen, die 1,3-Diketone oder 1,5-Dioxyvinyle spalten (Pokorny et al., 1999). Mit dem strukturell etablierten Enzym MhpC sind detaillierte mechanistische Studien durchgeführt worden. Diese zeigen, dass es einen schnellen Ketonisierungsschritt gibt, der das Substrat in seine Diketoform bringt, gefolgt von dem Geschwindigkeit-bestimmenden Schritt der C-C Bindungsspaltung und der Produktfreisetzung (Henderson & Bugg, 1997; Lam & Bugg, 1997; Fleming et al., 2000; Li et al., 2005; Li et al., 2006). Die chemische Struktur von DHPON weist darauf hin, dass solch ein Keton am C2 oder am C6 erzeugt werden kann und in einem 1,3-Diketon bzw. 1,5-Dioxyvinyl resultiert. Die C-C Bindungsspaltung kann als Retro-Friedel-Crafts Acylierung angesehen werden, bei der mit einem Keton am C2 oder C6 beginnend durch eine folgende Protonierung am C3 ein nucleophiler Angriff am Carbonyl C1' begünstigt wird. Dieser Angriff könnte von der katalytischen Triade ausgehen, wobei ein kovalentes Acyl-Enzym Intermediat ausgebildet wird, oder direkt von einem aktivierten Wasser. Um die katalytische Spaltung von DHPON in MAB und DHP zu erklären, wird im Weiteren angenommen, dass die zwei beobachteten Konformationen im Kristall dem Enzym vor (offenes Dimer C-D) und nach der Substratbindung (geschlossenes Dimer A-B) entsprechen. Außerdem wird angenommen, dass das katalytische Serin eine Konformation ähnlich der des Rotamer III wie in CumD (Jun et al., 2006) annimmt. Auf der Basis dieser Annahmen wurde DHPON manuell in die offene Konformation modelliert, wobei das Carbonylsauerstoff O1' im Oxyanionenloch zu liegen kam (Abbildung 53A). Die fixe Position des O1' im Oxyanionenloch und die Aktivitätsdaten der Mutanten (Tabelle 32) definieren die Lage von DHPON und im Speziellen seines Pyridinrestes relativ gut. Anschließend wurde das transiente 1,3-Diketo-Tautomer von DHPON in die geschlossene Konformation des Dimers A-B modelliert (Abbildung 53B). Die Tasche des aktiven Zentrums ist durch die Verschiebung der Reste Arg18, Trp41, Tyr81, Phe84 und Leu85 aus der N-terminalen Domäne geschlossen (Abbildung 51). Im Besonderen formt Arg18 eine Salzbrücke mit Glu148 aus, wodurch eine Kraft auf den Dihydroxypyridinring ausgeübt wird, die eine sp3 Hybridisierung am C3 Atom begünstigt, was wiederum eine Protonierung an diesem C3 erleichtert. Somit wird das Diketonintermediat ausgebildet, wie es schon für MhpC beschrieben 122

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

wurde (Henderson & Bugg, 1997). Folglich kann gesagt werden, dass die N-terminale Domäne und die Dimerisierung wichtig für die mechanische Begünstigung der Katalyse sind, was konsistent ist mit der Tatsache, dass die Dimere entweder in der geöffneten oder in der geschlossenen aber nicht in einer gemischten Konformation vorkommen.

Abbildung 53 Stereodarstellung des aktiven Zentrums der DHPON-Hydrolase mit modellierten Substrat. Wasserstoffbrücken sind als schwarze gestrichelte Linien dargestellt. Andere sterische Interaktionen sind größer als 3 Å und sind als grüne gepunktete Linien dargestellt. Das O1' Atom von DHPON liegt im Oxyanionenloch und fällt mit einem Wasser in jeder der vier Untereinheiten zusammen. (A) Das Substrat DHPON, wie es in die offene Konformation des Dimers C-D modelliert wurde. Die Reste der Untereinheit C sind grün und die der überlagerten Untereinheit D grau. Das Wassermolekül im Oxyanionenloch (blau, transparent) und das vorgeschlagene katalytische Wasser aus Untereinheit D (rot, transparent) sind eingezeichnet. (B) Das an C3 protonierte DHPON als Diketon nach dem mutmaßlichen induced-fit. Die Reste der Untereinheit A sind orange und die der überlagerten Untereinheit B sind schwarz. Die N-terminale Domäne hat das C3 Atom in eine sp3 Konformation gepresst, die die Protonierung von C3 und somit die Hydrolyse ermöglicht. Die zwei deprotonierten/protonierten Atome O2 und C3 von DHPON sind in hellblau markiert. Im Dimer A-B nimmt Ser217 Rotamer I an und bildet einen Kontakt mit dem Wasser im Oxyanionenloch aus. Die anderen beiden Rotamere II (Dimer C-D) und III (CumD) sind in grün bzw. violett dargestellt. Das angreifende Wassermolekül (rot, aus Untereinheit D in (A)) ist sterisch kompatibel mit dem DHPON Modell.

Die chemischen Details der Reaktion können nicht genau bestimmt werden. Den Beobachtungen betreffend MhpC folgend (Dunn et al., 2005) kann angenommen werden, dass

123

ERGEBNISSE UND DISKUSSION das initiale Diketon durch eine Deprotonierung am O2 produziert wird. Dies kann durch Glu148 geschehen, das durch Arg18 unterstützt wird und deshalb sicher in seiner deprotonierten Form vorliegt. Die alternative Deprotonierung am O6 Atom ist unwahrscheinlich, da es keine passende Base in der Umgebung gibt. Das durch Glu148 abstrahierte Proton wird dann auf das C3 transferiert wodurch das Diketonintermediat gebildet wird (Abbildung 54). Das Diketon kann dann durch das Ser217-Oγ der katalytischen Triade angegriffen werden, um ein Hemiketal zu bilden, das schnell in ein Acyl-Enzym Intermediat übergeht und schließlich durch eine aktiviertes Wassermolekül hydrolysiert wird. Obwohl eine kovalente hemiketale Bindung im Kristall von MhpC (Dunn et al., 2005) beobachtet wurde, muss sie nicht unbedingt einen Übergangszustand des Reaktions­ mechanismus' darstellen, vor allem weil kein kovalent gebundener Substrat Rest in Nass­ experimenten detektierbar war (Fleming et al., 2000). In der Gegenwart eines entsprechend positionierten

aktivierten

Wassers

sollte

ein

Acyl-Enzym-Intermediat

instabil

sein

(Abbildung 53B). Im DHPON-Hydrolase-Kristall wurde ein entsprechendes Wasser in Untereinheit D aber nicht in der Untereinheiten A, B und C gefunden. Dieses Wasser ist durch Glu148 aktiviert und könnte das C1' Atom von DHPON angreifen und außerdem das O2 Atom reprotonieren (Abbildung 54). Somit besteht die Möglichkeit, dass das C1' entweder durch Ser217-Oγ von der einen Seite oder ein Wassermolekül von der anderen Seite angegriffen wird. Beide sind zur gleichen Zeit an passender Stelle und in einem günstigen Bürgi-Dunitz Winkel zum Substrat. Das lässt den Schluss zu, dass die katalytische Triade kein Acyl-Enzym Intermediat bildet, sondern lediglich den hydrolytischen Angriff des Wassers unterstützt.

Abbildung 54 Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus. Als erstes entsteht das 1,3-Diketon indem die Base B 1 ein Proton von der 2-Hydroxyl-Gruppe abstrahiert und durch die Säure C3 protoniert wird, wodurch es sp3hybridisiert wird. Das Oε2 von Glu148 könnte beide Rollen übernehmen, B1 und B2, so dass tatsächlich nur ein Proton bewegt würde (orange). Das C1' Atom könnte dann durch Ser217-Oγ der katalytischen Triade angegriffen werden, deren His-Asp Paar als B3 dargestellt ist. Es könnte jedoch auch durch ein durch die 2-Ketogruppe und B 2 aktiviertes Wassermolekül auf der anderen Seite angegriffen werden (Abbildung 53B). Dieses Wasser findet zur selben Zeit wie das Substrat im aktiven Zentrum Platz. Da beide Nukleophile simultan anwesend sind, begünstigen sie ihren nucleophilen Angriff gegenseitig. Falls zuerst eine Acyl-Enzyme Intermediat gebildet wird, das anschließend von dem Wassermolekül geöffnet wird, würde die 2-Ketogruppe ihr Proton vom His329 der katalytischen Triade erhalten (grün), wodurch ein aromatischer Ring als gute Abgangsgruppe entstehen würde. Alternativ unterstützt Ser217-Oγ lediglich den Angriff des aktivierten Wassermoleküls, so dass die 2-Ketogruppe ihr Proton vom Wasser erhält.

124

4.4 Ergebnisse und Diskussion zur DHPON-Hydrolase

Dieser Vorschlag ist konsistent mit der entscheidenden Rolle von Arg18, Glu148 und Ser217, die aus den Aktivitätsdaten der Mutanten (Tabelle 32) hervorgeht. Außerdem erklärt er auch die Abnahme der Aktivität, die für die Mutation von Asp300 und His329 der katalytischen Triade zu Alanin beobachtet wurde. Die Abnahme der Aktivität durch die Mutation von Asp22, Ser149 und Arg216 zu Alanin kann damit erklärt werden, dass sie die feste Umgebung bilden, die benötigt wird, um den mechanischen Druck der N-terminalen Domäne in eine Präferenz für die sp3-Hybridisierung am C3 Atom umzuwandeln.

125

ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK

5

Zusammenfassung und Ausblick

5.1

C2 aus Clostridium botulinum

Der erste Teil dieses Abschnitts beschreibt die Strukturlösung der Toxins C2 aus Clostridium botulinum. Das Toxin gehört zur Klasse der binären Toxine. Über die Transportkomponente C2-II wird die Endozytose und schließlich der Transport der enzymatisch aktiven Komponente C2-I in die Wirtszelle vermittelt. C2-I modifiziert dann in der Zelle vorhandenes globuläres Aktin durch ADP-ribosylierung derart, dass die Polymerisation des Aktins gestört wird. Dies führt letztendlich zur Zerstörung des Zytoskellets und somit zum Zelltod. Sowohl von der Transportkomponente als auch von der enzymatisch aktiven Komponente konnten Kristalle erhalten werden. Bei der enzymatischen Komponente C2-I wurde nach der Mutation von Oberflächenresten zwei röntgentaugliche Kristallformen, eine bei pH 3.0 (K20E) und eine bei pH 6.5 (Q77R) erlangt. Der Datensatz der bei pH 3.0 gewonnenen Kristalle der C2-I Komponente konnte durch ein Ta6Br12 Derivat mit der SAD Methode phasiert werden. Mit dem hieraus erhaltenen Modell gelang anschließend die Phasierung des Datensatzes der pH 6.5 Bedingung. Da der Transport von C2-I in die Wirtszelle durch C2-II durch eine pHVerschiebung ins Saure ausgelöst wird, war ein Vergleich dieser beiden Kristallformen von Bedeutung. Es stellte sich heraus, dass die beiden erhaltenen Modelle, bis auf einige kleinere Abweichung in intrinsisch mobilen loop-Bereichen gleich sind. Hierdurch kann die Annahme widerlegt werden, dass die pH-Verschiebung im Endosom einen destabilisierenden Einfluss auf C2-I hat und somit die Translokation vereinfacht. Vielmehr zeigt sich, dass die strukturelle Integrität von C2-I auch dem sauren Milieu im Verdauungstrakt standhält, in dem es sezerniert wird. Da C2-I im Gegensatz zu seinen Homologen, wie zum Beispiel das Iota Toxin aus Clostridium difficile, nur β- und γ-Aktin modifiziert aber nicht α-Aktin, wurden anhand von Strukturvergleichen Aktivitätsmutanten geplant, die die Modifikation von α-Aktin durch C2-I ermöglichen sollten. Aufgrund der Tatsache, dass sich α-Aktin von β/γ-Aktin in nur wenigen einzelnen Aminosäuren unterscheidet, wurde erwartet, dass sich die Aktivität von Iota Toxin durch einen einzelnen Aminosäurenaustausch am C2-I übertragen lässt. Tatsächlich wurde eine Mutante (S361R) von C2-I gefunden, die nun in der Lage ist α-Aktin zu modifizieren, jedoch liegt die Aktivität niedriger als die des Iota Toxins. Desweiteren lassen sich die Unterschiede zwischen der Modifikationsrate von α-Aktin und β/γ-Aktin nicht mit den geringen Unterschieden zwischen diesen Aktin-Isoformen, im Besonderen im Bereich der Modifikationsstelle, erklären. Eine mögliche Ursache für den Unterschied könnte eine noch nicht bekannte posttranslationale

126

5.1 C2 aus Clostridium botulinum

Modifikation am α-Aktin sein. Zur genauen Klärung könnte eine rekombinante Expression der Aktine beitragen, bei der dann entsprechende Hybridmutanten hergestellt werden und die mögliche Unterschiede bei der Modifikation durch C2-I oder das Iota Toxin bestimmt werden. Die von der nicht aktivierten Transportkomponente C2-II erhaltenen Kristalle streuten im Röntgenexperiment bis 3.2 Å Auflösung. Da kein Schweratomderivat erhalten werden konnte, wurde durch die Methode des molekularen Ersatzes auf der Basis des bekannten Modells des Protective Antigen aus Bacillus Anthracis phasiert. Die hieraus resultierende Phasen unterlagen aber einem sehr starken model-bias, das sich aufgrund der schlechten Datenqualität und der fehlenden nicht kristallographischen Symmetrie nicht entfernen ließ. Dies machte die weitere Verfeinerung des Modells unmöglich, und es lassen sich am vorhandenen Modell lediglich sehr grobe Aussagen bezüglich der Struktur treffen. Deshalb sollte bei diesen Projekt nach weiteren Schweratomderivaten gesucht werden oder die bis jetzt fehlgeschlagenen Expression als SeMetmarkiertes Protein weiter optimiert werden, da die Anzahl der vorhandenen Methionine durchaus eine erfolgreiche Phasierung verspricht. Hierzu sollte das gesamte Expressionssystem überarbeiten werden, da das momentan vorhandene System keine merkliche Überexpression zeigt. Bei entsprechenden Ausbeuten wären dann auch Kristallisationsexperimente mit dem aktivierten und oligomerisierten C2-IIa denkbar. Darüber hinaus bieten sich durch die Größe und Geometrie cryo-EM Studien am Komplex von C2-IIa und C2-I an.

5.2

Die Proteaseinhibitoren Scyptolin-A und Microginin-FR1

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Komplexstrukturen zweier peptidischer Inhibitoren mit ihren jeweiligen Zielenzym gelöst und analysiert. Die durch den Arbeitskreis J. Weckesser aus Cyanobakterien isolierten Peptide zeigen oftmals inhibitorische Wirkung auf Proteasen im µmol bis nmol Bereich und sind daher als Leitstrukturen für die Wirkstoffsynthese interessant. Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl die Struktur des Komplexes zwischen Scyptolin-A und Elastase bestimmt als auch diejenige zwischen Microginin-FR1 und Leucinaminopeptidase. Scyptolin-A zeichnet sich durch seine makrocyclische Struktur aus und beinhaltet eine Reihe modifizierter Aminosäuren. Die wohl Ungewöhnlichste stellt das Ahp (3-Amino-6-hydroxy-2piperidon) dar. Diese sitzt in der Inhibitor-Komplexstruktur dort, wo sonst das katalytisch aktive Wasser liegt und blockiert somit einen für die Katalyse kritischen Teil des aktiven Zentrums. Der Vergleich mit dem Trypsin-Inhibitor A90720A zeigt, dass beide die gleiche Ringstruktur haben und auch der Ahp-Rest an derselben Position liegt. Die Austausche der restlichen Aminosäuren spiegeln

die

Anpassung

an

das

entsprechende

Zielenzym

wider.

Durch

ihren

127

ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK Inhibitionsmechanismus stellen diese Art von Cyanopeptolinen eine neue Klasse von reversiblen Proteaseinhibitoren dar und bieten sich somit als Leitstrukturen für das Wirkstoffdesign an. Microginin-FR1 zeichnet sich durch seine N-terminale lipidische β-Aminosäure Ahda (3Amino-2-hydroxy-decansäure) aus. Neben den Leucinaminopeptidasen (LAPs) wird auch noch ACE (angiotensin-converting-enzyme) inhibiert. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass Microgenin-FR1 die microsomale Leucinaminopeptidasen aus Schweinenieren im nanomolaren Bereich inhibiert und damit bessere Inhibitionseigenschaften für diese LAPs hat als die bekannten LAP-Inhibitoren Bestatin und Amastatin. Da Kristallisationsexperimente mit der microsomalen LAP aus Schwein fehlschlugen, wurde auf die bereits etablierten Kristallisations­ bedingungen der zytosolischen LAP aus Rinderaugen zurückgegriffen. Anhand der erhaltenen Komplexstruktur zeigte sich, dass die Bindung von Microgenin der von Bestatin und Amastatin gleicht, was sich auch durch Inhibitionskonstanten der gleichen Größenordnung zeigt. Die geringe Sequenzidentität zwischen microsomaler und zytosolischer LAP lässt keine Rückschlüsse auf die Bindung von Microgenin-FR1 an die microsomale LAP zu. Auch die erst kürzlich publizierte Struktur einer microsomalen LAP in Komplex mit Bestatin lässt nur vermuten, dass die Ahda der ausschlaggebende Faktor für die erheblich besseren Bindungs­ eigenschaften von Microginin-FR1 an microsomaler LAP ist. Somit sollte für endgültige Klärung dieser Bindung eine Komplexstruktur gelöst werden. Diese Struktur sollte Rückschlüsse für das Design von Inhibitoren zulassen, die spezifisch die medizinisch relevanten microsomalen LAPs als Ziel haben.

5.3

2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans

Im letzten Teil dieser Arbeit wird die Strukturbestimmung der DHPON-Hydrolase aus dem Nikotin-abbauenden Stoffwechselweg von Arthrobacter nicotinovorans beschrieben. Diese Hydrolase katalysiert die Spaltung von 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin in die Komponenten 2,6-Dihydroxy-pyridin (DHP) und γ-N-methyl-aminobutyrat (MAB). Hierbei wird die C-C Bindung zwischen dem Aromaten und der Seitenkette gespalten, was auch als Retro-FriedelCrafts-Acylierung beschrieben werden kann. Die Strukturbestimmung ergab, dass das Enzym eine klassische α/β-Hydrolase Faltung besitzt und auch die typische katalytische Triade aufweist. Im Gegensatz zu den bisher bekannten Strukturen von C-C Bindung spaltenden Enzymen wurde jedoch eine α-helikale N-terminale Domäne gefunden die sowohl bei der Reaktion als auch in der Dimerisierung beteiligt ist. Da es nicht möglich war eine Substratstruktur zu analysieren, wurde ein Modell für die Substratbindung erstellt, das anschließend durch Aktivitätsmutanten überprüft wurde. Anhand der Ergebnisse und der bekannten Position des Oxyanionenlochs 128

5.3 2,6-Dihydroxy-pseudo-oxynikotin-Hydrolase aus Arthrobacter nicotinovorans

konnte ein relativ konkretes Modell der Substratbindung vorgeschlagen werden. Zusätzlich wurden im Kristall zwei verschiedene Zustände des Enzyms gefunden, die als offen und geschlossen bezeichnet werden können. Unter Beachtung der schon von anderen C-C Bindung spaltenden Enzymen bekannten Daten wurde ein Vorschlag für den Reaktionsmechanismus erstellt. Es scheint, dass in dieser Klasse von α/β-Hydrolasen das katalytisch aktive Serin eine andere Rolle als im klassischen Mechanismus der bisher bekannten Hydrolasen mit katalytischer Triade hat. Der Mechanismus läuft nicht über ein Acyl-Enzym Intermediat ab, so dass das Serin lediglich eine unterstützende Rolle bei der hydrolytischen Spaltung einnimmt. Im ersten Schritt wird durch eine Deprotonierung/Protonierung eine gute Abgangsgruppe erzeugt, die dann im anschließenden zweiten Schritt durch den Angriff eines aktivierten Wassers abgespalten wird. Die zwei gefunden Konformationen der DHPON-Hydrolase und die Umgebung im aktiven Zentrum lassen den Schluss zu, dass der erste Schritt durch mechanischen Stress auf das Substrat begünstigt wird. Zur genaueren Aufklärung des Mechanismus könnten Experimente mit markierten Wasser (Deuterium bzw. O18) durchgeführt werden, wie es schon für MhpC getan wurde. Des weiteren würde die Kristallstruktur eines Substrat- oder Inhibitorkomplex einen genaueren Einblick in die Reaktionsgeometrie geben.

129

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140

7 Anhang

7

Anhang

7.1

Eichgraden Gelpermeationschromatographie

7.1.1

HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade (alt)

7.1.2

HiLoad-26/60-Superdex-200 prep grade (neu)

141

ANHANG

7.2

Temperaturfaktoren

7.2.1

Temperaturfaktoren C2-I(K20E)

7.2.2

Temperaturfaktoren C2-I(Q77R)

142

7.2 Temperaturfaktoren

7.2.3

Temperaturfaktoren DHPON-Hydrolase

143

ANHANG

7.3

Cα-Distanzen

7.3.1

Cα-Distanzen C2-I(K20E–Q77R)

7.3.2

Cα-Distanzen DHPONH Dimer: A/C und B/D

144

7.4 Selfrotation

7.4

Selfrotation

7.4.1

Selfrotation C2-I(Q77R)

7.4.2

Selfrotation DHPON-Hydrolase

145

DANKSAGUNG

8

Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde im Arbeitskreis von Prof. Dr. G. E. Schulz am Institut für

Organische Chemie und Biochemie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau angefertigt. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Georg E. Schulz für die Vergabe des interessanten Themas, die Ermöglichung der Kooperationen sowie seine Diskussionsbereitschaft während der gesamten Doktorarbeit. Herrn Prof. Dr. Dr. Klaus Aktories danke ich für die Bereitstellung der Plasmide von C2-I und C2-II. Prof. Dr. Holger Barth, Dr. Gerd Haug und Henrike Hochmann danke ich für ihre stete Diskussionsbereitschaft und gute Zusammenarbeit bei der Charakterisierung und Präparation. Ute Matern, Manuel Kraft und Prof. Dr. Jürgen Weckesser danke ich für die Kooperationen und ihr Engagement im Zusammenhang mit den Inhibitorstrukturen. Paula Sachelaru und Prof. Dr. Roderich Brandsch sei für die anregenden Diskussionen und ihre Anstrengungen beim DHPON-Hydrolase Projekt gedankt. Linda Böhm danke ich ganz herzlich für ihre ständige Hilfsbereitschaft, ihre Ausdauer bei der Erstellung von Manuskripten und ihr stetes Bemühen um die gute Laune im Arbeitskreis. Helmut Hamacher, Ulrike Weiser, Bärbel Dirr und Antonio Espin sei für ihre unersetzliche Arbeit im Hintergrund gedankt. Dem Arbeitskreis danke ich für die gute Arbeitsatmosphäre. Im Besonderen seien hier Dr. Markus Krömer, Dr. Dirk Reinert, Dr. Michael Claus und Dr. Daniel Kloer für die vorzügliche Zusammenarbeit und Diskussionen rund um die Kristallographie und darüber hinaus genannt. Desweiteren danke ich dem „gute-Laune-Duo“ Dr. Dirk Kessler und Dr. Michael Faller für die Bereicherungen des üblichen Laboralltags. Azra Nozinovic und Georg Zocher danke ich für ihr Engagement während ihrer Mitarbeiterpraktika. Meinen Eltern gilt mein Dank für ihre stete Unterstützung während des ganzen Studiums. Und schließlich danke ich meiner Frau Paula für ihre Geduld und Unterstützung während des letzten Jahres. 146