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Doctoral Thesis

Identification and characterization of pVHL-dependent cell surface proteins in Renal Cell Carcinoma Author(s): Boysen, Gunther Publication Date: 2009 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-005962030

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ETH Library

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Diss. ETH N 18706

Identification and characterization of pVHLdependent cell surface proteins in Renal Cell Carcinoma A dissertation submitted to the Swiss Federal Institute of Technology ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by Gunther Boysen

Dipl.-Humanbiol, Ernst-Moritz-Arndt University, Greifswald, Germany Born 18th of November, 1980 Citizen of Germany

accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Wilhelm Krek (examiner) Prof. Dr. Christian Frei (co-examiner) Prof. Dr. Holger Moch (co-examiner)

Zurich, 2009

Summary

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Summary Sporadic clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) is the most common and most lethal malignancy of the kidney. Diagnosis often occurs by chance and one third of the patients have distant metastasis at the time of diagnosis. Treatment of these patients is limited by the high resistance to standard chemo- and radio therapeutics. During the last decades several cancer research groups have uncovered essential key players of ccRCC initiation and progression. The most prominent being the von Hippel-Lindau protein (pVHL) which triggers a myriad of tumor promoting processes when functionally inactivated. Loss of pVHL function due to gene mutation is a characteristic feature in the majority of ccRCC patients. pVHL acts as a multifunctional protein adapter involved in transcriptional control, protein stability and extracellular matrix (ECM) composition. Based on these insights, novel targeted therapeutical strategies have been developed including monoclonal antibodies and small molecular inhibitors, however response rates among the patients have not improved. Additionally, prognosis of the patient’s clinical outcome and prediction of the response to therapy is far from being precise. Thus, novel specific and reliable molecular markers are required to achieve the goal of an earlier diagnosis and a more effective treatment of ccRCC. In the search for such markers the cell surface proteins are promising target structures since they meet the criteria of being exposed to the environment of the tumor cells. Furthermore, they are often disposed of into the body fluids. The pVHL-regulated cell surface proteome represents a promising resource of potential ccRCC-specific tumor markers. Technical restrictions in analyzing the highly hydrophobic cell surface proteome has so far prevented a global expression screen. In the PhD thesis presented here, a novel strategy based on the specific labeling and isolation of N-glycosylated cell surface proteins combined with tandem mass spectrometry (MS/MS) was applied to identify, functionally characterize and validate the pVHL-regulated cell surface proteome. For this purpose the cell surface protein expression patterns in pVHL-defective ccRCC derived cells and their stable transfectants re-expressing pVHL was compared. This proteomic screen resulted in the identification of 272 cell surface proteins. Quantitative data were derived for 106 of these proteins. pVHL-associated expression was confirmed for 32 proteins. Subsequent transcriptomic validation in

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Summary

RCC subtypes unraveled a specific gene signature, which allows the distinction of VHL negative ccRCC from papillary RCC (pRCC) with intact VHL. Among 188 transcriptionally analyzed genes encoding cell surface proteins, 24 were down regulated and 56 upregulated in ccRCC compared to pRCC. Finally, seven candidates (AXL, CD10, CD13, CD74, CD99, Glut-1, and NRP-1) were subjected to immunohistochemical analysis on a TMA containing 356 RCC. Correlation with clinicopathological data was observed for AXL, CD10 and CD13. In vitro based functional characterization uncovered CD10 as a pVHLHIF-regulated protein in ccRCC, which drives the invasive potential of the tumor cells. The invasive potential of ccRCC derived cells could be diminished by the drug Thiorphan. Furthermore, CD10 serum protein levels were significantly elevated in patients with ccRCC compared to healthy controls or patients bearing other RCC subtypes. It is concluded that CD10 may be both, a promising serum marker candidate and a therapeutic target in ccRCC. Additionally, the remaining 31 proteins represent a platform for further translational medical studies. In conclusion, this proteotranscriptomic strategy may be applicable to identify tumor markers in other cancers.

Zusammenfassung

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Zusammenfassung Das sporadische klarzellige Nierenzellkarzinom (kNZK) ist der häufigste und letalste Tumor der adulten Niere. Zum Zeitpunkt der oftmals zufällig gestellten Diagnose können bei einem Drittel der Patienten schon Metastasen detektiert werden. Die Behandlung dieser Patienten ist bisher durch eine starke Resistenz gegenüber den gegenwärtigen Chemo- oder Radiotherapeutika wenig erfolgreich. Während der letzten

Jahrzehnte

konnten

verschiedene

Forschungsgruppen

wesentliche

molekulare Ursachen der Initiierung und Progression des kNZK identifizieren. Es konnte gezeigt werden, dass die funktionelle Inaktivierung des von Hippel-Lindau Proteins (pVHL) eine der frühesten molekularen Alterationen in der Mehrheit der Patienten darstellt. pVHL ist ein multifunktioneller Proteinadapter, der in Prozessen wie Transkriptionskontrolle, Regulation der Proteinstabilität und Kontrolle der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM) involviert ist. Basierend auf diesen molekularen Erkenntnissen konnten neue, gezielte therapeutische Strategien entwickelt werden. Diese beinhalten die Anwendung von monoklonalen Antikörpern und molekularen Inhibitoren, welche bisher jedoch kein ausreichendes Ansprechen der Patienten induzieren. Desweiteren sind die Vorhersage der Prognose der Patienten und die Prädiktion des Ansprechens auf Therapien immer noch sehr ungenau. Daher werden neue spezifische und verlässliche molekulare Marker benötigt, die eine frühere Diagnose und eine effektive Behandlung des kNZK ermöglichen. Zelloberflächenproteine sind vielversprechende Zielstrukturen , da sie mit dem umgebenden Millieu der Tumorzelle interagieren, oftmals in Körperflüssigkeiten sezerniert werden und aufgrund ihrer subzellulären Lokalisation gut erreichbar sind. Daher sind die meisten Krebsmedikamente gegen Oberflächenproteine gerichtet. Es ist folglich anzunehmen, dass das pVHL-regulierte Oberflächenproteom eine grosse Quelle spezifischer Tumormarker für das kNZK darstellt. Technische Mängel haben die umfassende Analyse des stark hydrophoben Oberflächenproteoms bisher verhindert. In der hier vorgestellten Doktorarbeit wird eine Strategie aufgezeigt, mit der Bestandteile dieses Subproteoms identifiziert, funktionell charakterisiert und validiert werden können. Der experimentelle Ansatz besteht aus einer neuartigen spezifischen Markierung, Isolierung und Quantifizierung von N-glykosylierten Oberflächenproteinen. Im Anschluss daran erfolgt eine Massenspektrometrie-

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Zusammenfassung

basierte Identifizierung der isolierten Proteine. Diese Startegie wurde auf pVHLdefekte kNZK Zellen und deren pVHL-re-exprimierenden stabilen Transfektanten angewendet. Die massenspektrometrische Analyse resultierte in der Identifizierung von 272 Oberflächenproteinen. Quantitative Daten wurden von 106 dieser Proteine erhoben. Eine mit pVHL-assoziierte Expression wurde für 32 Proteine bestätigt. Die nachfolgende transkriptomische Validierung dieser Proteine in Proben von Patienten mit unterschiedlichen Subtypen NZK ergab eine subtypspezifische Gensignatur. Anhand dieser Signatur konnten Patienten mit VHL negativem kNZK von Patienten mit papillärem NZK (pNZK), in den VHL mehrheitlich intakt ist, unterschieden werden. Unter den 188 transkriptionell validierten Kandidaten waren im kNZK verglichen mit dem pNZK 24 Gene herunterreguliert und 56 verstärkt exprimiert. Letzendlich wurde die Proteinexpression von 7 Kandidaten (AXL, CD10, CD13, CD74, CD99, Glut-1 und NRP-1) immunohistochemisch mittels Gewebechip in 355 NZK untersucht. Eine Korrelation zwischen Proteinexpression und kliniko-pathologischen Parametern konnte für AXL, CD10 und CD13 aufgezeigt werden. In vitro durchgeführte Experimente zur funktionalen Charakterisierung identifizierten CD10 als neues pVHL-HIF-reguliertes Protein im kNZK, welches die Invasivität der Tumorzellen vermittelt. Das invasive Potenzial der Tumorzellen konnte mit Thiorphan, einem chemischen Inhibitor von CD10, reduziert werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der Proteingehalt von CD10 im Serum von Patienten mit kNZK im Vergleich zu gesunden Probanden oder Patienten mit anderen NZK Subtypen signifikant erhöht war. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass CD10 sowohl ein Serummarker als auch eine therapeutische Zielstruktur im kNZK darstellen könnte. Die verbleibenden 31 Proteine stellen eine Grundlage für weiterführenden translationalen medizinischen

Studien

transkriptomische

dar.

Strategie

Letztlich für

die

kann

die

Identifizierung

verschiedenen Tumorentitäten angewendet werden.

hier

vorgestellte

neuer

proteo-

Tumormarker

in