EFEITO DA VARIAÇÃO DA FONTE DE NITROGÊNIO E CARBONO SOBRE AS ATIVIDADES DE CELULASES PRODUZIDAS PELO FUNGO MYCELIOPHTHORA THERMOPHILA I-1D3B A PARTIR DE FERMENTAÇÃO SUBMERSA G.F.A. da SILVA, A. C. S. GOMES e J. C. THOMEO Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP IBILCE, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Departamento de Engenharia de Alimentos E-mail para contato: [email protected] RESUMO – Celulases são enzimas com a terceira maior produção mundial, responsáveis pela hidrólise da celulose, principal componente da parede celular vegetal. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade de endoglucanase (CMCase) e relacioná-la à cinética de crescimento do fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b por fermentação submersa. O cultivo ocorreu variando as fontes de carbono (utilizando-se como substratos bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo) e nitrogênio (peptona, sulfato de amônia e peptona+sulfato (1:1) a 45ºC. A primeira amostra foi retirada em 12h e as seguintes a cada 24 horas até completar 120 horas. Para determinação de biomassa constatou-se que farelo de trigo apresentou maior ganho de massa comparado a bagaço de cana de açúcar. Apesar de os tratamentos utilizando peptona apresentarem maior picos de biomassa estes foram os meios de menores produções de CMCase. Farelo de trigo apresentaram melhores resultado de atividade enzimática comparado a bagaço de cana de açúcar, onde a produção máxima de CMCase (5,5 U/mL) ocorreu em 48h de cultivo em farelo de trigo e peptona+sulfato (1:1), a produção máxima utilizando bagaço de cana como fonte de carbono apresentou-se as 120h de fermentação para todos fontes de nitrogenio. A produção das enzimas foram fortemente influenciada pela fonte de carbono e fontes de nitrogênio, onde a combinação Peptona+sulfato (1:1) apresentou resultados mais satisfatórios.

1. INTRODUÇÃO Os fungos são reconhecidos como agentes da decomposição de matéria orgânica em geral e celulose, em particular, que produzem uma variedade de enzimas hidrolíticas essenciais para suportar o seu crescimento, seja como saprófitas ou patógenos (ARCHER e WOOD 1994). Os fungos filamentosos são um dos grupos mais ativos e eficientes entre esses microorganismos, apresentando diversas vantagens em função do grande potencial de secreção de enzimas celulósicas (ÖGEL et al.,

2001; GOMES et al., 2007b). A celulase é uma enzima utilizada na hidrólise da celulose resultando em açúcares fermentescíveis (BHAT M, BHAT S, 1997). Podem ser obtidas através de alguns insetos, moluscos, nemátodos e protozoários e microrganismos os quais são fontes preferenciais de celulases, devido à ampla diversidade bioquímica e facilidade de manipulação genética (YEOMAN et al, 2010). O principal obstáculo para a aplicação abrangente da celulase na indústria é o alto custo de produção da enzima. Apontada como um dos fatores que mais afetam o rendimento e o custo de produção das mesmas, destaca-se a fonte de carbono utilizada no cultivo dos microrganismos (GAO et. al., 2008). O substrato ideal deve ser barato, de fácil processamento, disponível em grande quantidade e, sua composição deve ser adequada tanto para a hidrólise quanto para a produção das enzimas celulolíticas (JUHÁSZ et al., 2005). Diversos subprodutos agroindustriais como, farelo de trigo, sabugo e talos de milho, polpa de frutas, resíduos de tubérculos, cascas de sementes e farelos residuais da obtenção de óleos, podem ser explorados por meio de fermentação submersa (FSm) ou fermentação em estado sólido (FES) para produção de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas uma vez que contêm, além de fonte de carbono, diversos nutrientes essenciais para o crescimento microbiano como fósforo, nitrogênio e potássio (DOGARIS et al., 2009; ÖGEL et al., 2001). Os resíduos agrícolas contêm de 20 a 60% de celulose, 20 a 30% de hemicelulose e 15 a 30% de lignina. Desta forma, a utilização do bagaço de cana de açúcar para produção de enzimas, é uma alternativa para as indústrias de biotecnologia obterem enzimas de baixo custo (MENEZES, 2009), podendo ajudar a minimizar o problema da poluição ambiental (PANDEY ET AL., 2000). No entanto, a produção de enzimas por FES ainda é sujeita a muito empirismo, de modo que estudos sistemáticos de como as fontes dos nutrientes majoritários carbono, nitrogênio e fósforo, podem contribuir para a produção de biomassa e, consequentemente, na síntese das enzimas. Esse trabalho visa identificar a influencia de diferentes fontes de carbonos e nitrogênio e de suas concentrações na produção de celulases e de biomassa do fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b. Os resultados obtidos darão subsídios à prospecção de substratos para cultivo em estado sólido deste microrganismo, identificando um balanço ideal de nutrientes que possam potencializar a produção de celulase.

2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Microrganismos Foi utilizado o fungo filamentoso termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b pertencente ao Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Aplicada – IBILCE/UNESP. Este foi mantido em Agar-Sabouraud-Dextrose (ASD) em temperatura ambiente, sob óleo mineral. Para utilização, a cultura do fungo foi repicada em erlenmeyers contendo ASD, que foram mantidos por 96 horas a 45 ºC. As condições do ensaio fermentativo foram as otimizadas por Zanelato (2011).

2.2 Meios de cultivo O fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b foi cultivado por fermentação submersa com os seguintes substratos (p/p): bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo como fonte de carbono e peptona (PEP), sulfato de amônia (SULF) e peptona/sulfato (P+S) (1:1) como fonte de nitrogênio. O bagaço de cana foi lavado e seco em estufa a 60°C durante 48 horas, separado em peneira granulométrica na fração1mm.

2.3 Solução nutriente Para as fermentações submersas, foi utilizado o meio nutriente composto por (g/L): KH2PO4 (2,0), (NH4)2SO4 (1,4), uréia (0,3), MgSO4·7H2O (0,3), CaCl2 (0,1), peptona (1,0), tween 80 (2,0), glicose (0,04), solução de sais (1,0) carboximetilcelulose de baixa viscosidade (Sigma, USA). O pH do meio foi ajustado para 5,0 com solução de NaOH ou HCl.

2.4 Pré-inóculos Para cada fermentação foi feito um pré-inóculo, em frasco erlenmeyer de 250 mL, contendo 50 mL de meio nutriente ASD inclinado. O microrganismo foi inoculado na superfície deste meio, por estrias, e incubado a 45oC, por 96horas. Após este período, o micélio foi suspendido em 250 mL de solução nutriente (descrita no item 2.3), sendo 2mL da suspensão utilizada como inóculo.

2.5 Processos fermentativos As fermentações submersas foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 125 mL, contendo 20 mL do meio nutriente descrito no item 2.3 e uma alíquota de 2,0 mL da solução do pré-inóculo (descrito no item 2.4) e meio de cultivo correspondente às misturas citadas no (item 2.2), O cultivo ocorreu a 45ºC, durante 5 dias. A primeira amostra foi retirada em 12h e as seguintes a cada 24 horas. Para obtenção da solução enzimática bruta, o meio fermentado foi filtrado a vácuo, em filtro de papel. O filtro contendo o material fermentado foi seco a 100oC até peso constante e a biomassa seca foi utilizada como indicadora do crescimento microbiano. O filtrado foi centrifugado a 12000 xg por 30 minutos a 10ºC, o sobrenadante foi utilizado como solução enzimática bruta.

2.6 Determinação da atividade de Endoglucanase (CMCase) A atividade de endoglucanase foi determinada pelo método proposto por Ghose (1987), sendo as amostras constituídas por 0,1 mL de solução enzimática e 0,9 mL de suspensão a 4% de carboximetilcelulose (CMC – Sigma C5768) como substratos em tampão acetato (0,1 M, pH 5,0). A reação foi mantida a 60°C por 10 minutos e, então, interrompida pela adição de 1,0 mL do reagente DNS (ácido1-3- dinitrosalicílico) para a quantificação dos açúcares redutores liberados, como proposto por MILLER (1959). Em seguida, essa solução foi mantida em água em ebulição por 10 minutos, sendo a reação interrompida com o abaixamento súbito da temperatura em banho de gelo. Posteriormente, foram adicionados 8,0 mL de água destilada à solução e, em seguida, foi feita a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 540 nm, a atividade foi calculada com base na curva

padrão de glicose. Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1,0 µmol de glicose por minuto de reação por mL de extrato enzimático.

3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Biomassa seca A maior produção de biomassa seca foi observada no cultivo com farelo de trigo como fonte de carbono e peptona como fonte de nitrogênio (Figura 1), seguido por sulfato de amônia. Em cultivo com bagaço de cana de açúcar, o maior crescimento também foi em presença de peptona. Entretanto, uma vez que os substratos utilizados para sustentação do crescimento microbiano eram materiais lignocelulósico insolúveis, foi possível apenas estimar a biomassa seca, a qual então era composta por biomassa fúngica e o material lignocelulósico.

Figura 1: Crescimento fúngico em fermentação submersa estimado pela quantificação da massa celular seca. a) biomassa Farelo de Trigo b) Bagaço de cana-de-açúcar Ambas as fontes de carbonos combinados com sulfato de amônia apresentaram uma redução do peso seco em alguns pontos, essa redução pode ser atribuída a hidrolise do material celulósico. Apesar de os tratamentos utilizando peptona apresentarem maiores valores de biomassa, estes foram os meios de menores produções de CMCase (Figura 2), comportamento também constatado por Zanchetta (2012). Entretanto, os tratamentos utilizando peptona+sulfato e sulfato de amônia combinado com farelo de trigo apresentaram maiores atividades enzimática e menor aumento da biomassa respectivamente. (Figura 1b, 2a e 2b).

Atividade Enzimática O fungo Myceliophthora thermophila apresentou as maiores produções de CMCase quando foram utilizados farelo de trigo como fontes de carbono, para todas as fontes de nitrogênio. Sendo que a produção máxima de CMCase (5,5 U/mL) ocorreu em 48h de cultivo no tratamento contendo farelo de trigo e P+S (1:1). Esta mistura (Figura 2c) foi a mais favorável para a produção da enzima.

Figura 2: Atividade de CMCase em função do tempo de cultivo para cultivo com bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo com as fontes de nitrogênio a) peptona, b)sulfato de amônia e c) peptona+ sulfato de amônia.

As menores produções ocorreram quando bagaço de cana de açúcar foi utilizado, sendo o máximo atingido em 120 horas de tempo de cultivo. No entanto, seria ideal realizar um tempo de cultivo maior para observar-se a atividade de enzima continuaria a crescer após esse período, como indica a tendência observada na Figura 2. A maior atividade em farelo de trigo em relação ao bagaço de cana foi constatado também por Zanchetta (2012), Silva et al (2005) e Zanelato (2011). Após atingir o máximo, a atividade enzimática apresentou queda, Gomes (2012a) atribui essa queda a possível ação das proteases ou outros inibidores, ou seja, o comportamento das enzimas pode estar relacionado com a possibilidade de produção de proteases após o seu ponto máximo, provocando a hidrólise e consequente diminuição de sua atividade (COURI et al,1993).

CONCLUSÃO O fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b foi capaz de produzir celulase por fermentação submersa, sendo a produção das enzimas fortemente influenciada pela fonte de carbono e fontes de nitrogênio, onde a combinação Peptona+sulfato (1:1) apresentou resultados mais satisfatórios. Quanto à identificação de um balanço ideal de nutrientes, esse estudo estimula a investigação de melhores combinações quantitativas de fontes de nitrogênio. A fonte de carbono que apresentou melhor produção de celulase foi o farelo de trigo, comparado cana de açúcar, principalmente quando combinação com as fontes de nitrogênio peptona+sulfato (1:1). Esse estudo estimula a investigação de um método de melhor quantificação de biomassa seca com a intenção de separação do micélio fúngico e o material lignocelulósico, permitindo assim melhor compreensão da cinética de crescimento do fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b. Os resultados obtidos darão subsídios à prospecção de substratos para cultivo deste microrganismo por cultivo em estado sólido.

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