Gentherapie Aktuelle Methoden und Forschungsergebnisse

Prof. Theo Dingermann Institut für Pharmazeutische Biologie Biozentrum Max-von Laue-Str. 9 60438 Frankfurt am Main [email protected] 01/20/11

Freitag, 21. Januar 2011

Arzneimittel

… sind Stoffe oder Stoffgemische unterschiedlicher chemischer Komplexität, die mit Biomolekülen interagieren, • um deren Überaktivität zu hemmen = Inhibitoren • um deren Aktivität zu steigern = Aktivatoren oder … sind Stoffe, • die eine fehlende Aktivität ersetzen = Substitutions-Wirkstoffe 2

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Arzneimittel

… können chemisch unterschiedlich komplex sein.

Sie können relativ klein sein (Inhibitoren oder Aktivatoren) …

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Arzneimittel

… können chemisch unterschiedlich komplex sein.

… oder sie können sehr groß sein (Substitutions-Wirkstoffe)

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Arzneimittel

Warum können Arzneimittel nicht auch Informationseinheiten sein,

die die Zelle in Substitutions-Wirkstoffe umwandelt?

Gentransfer-Vektoren 5

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Anno 1981 "Gentherapie" anno 1981 bei Drosophila melanogaster

Gerry Rubin 6

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Inhalt

Regulatorische Aspekte

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Somatischer- vs. Keimbahn-Gentransfer Somatischer Gentransfer

Keimbahn Gentransfer

Eingebrachte Information Eingebrachte Information wird nur in der behandelten kann an Folgegenerationen weitergegeben werden. Zelle realisiert.

Nur der somatische Gentransfer gilt bei der Anwendung am Menschen als ethisch. Ein Keimbahn-Gentransfer ist bei Menschen streng verboten (Embryonenschutzgesetz § 5) 8

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Definition Somatischer Gentransfer (Gentherapie) • Transfer von DNA in somatische, humane Zellen zu therapeutischen Zwecken. • Ziel ist die Beeinflussung pathophysiologischer Prozesse, um Krankheiten vorzubeugen, zu heilen, zu lindern, bzw. die Diagnostik zu verbessern.

Somit sind Gentransfer-Vektoren für eine somatische Gentherapie Arzneimittel! 9

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Arzneimittel § 2 Abs.1 AMG Arzneimittel sind Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper 1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen, 2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen, 3. vom menschlichen oder tierischen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen, 4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.

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Note for Guidance… ...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99) Art des GentransferArzneimittels

Beispiele

a) nackte Nukleinsäuren

natürliche oder synthetische Nukleinsäure im Allgemeinen eingebunden in entsprechende Plasmide oder Kassetten (ausschließlich Antisense-Oligonukleotide) mit oder ohne Adjuvans

b) komplexierte Nukleinsäuren oder nicht-virale Vektoren

(i) siehe oben, aber mit komplexierten (z.B. Transferrin) oder anderen Polymeren (z.B. DEAE-Dextran, Polylysin) (ii) wie (i), aber verkapselt oder assoziiert (z.B. in Liposomen) (iii) wie oben, aber auf Kolloidpartikeln 11

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Note for Guidance… ...on the Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99) Art des GentransferArzneimittels

Beispiele

c) virale Vektoren

Normalerweise replikationsinkompetente Viren, einschließlich Adenovirus, Retrovirus, Adenoassoziiertes Virus, Herpes-simplex-Virus, in einigen Fällen replikationskompetente Viren (z.B. Vaccinia-Virus)

d) genetisch modifizierte Zellen

allogene oder xenogene Zellen oder Bakterienzellen mit einem neuen Nukleinsäureabschnitt

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12. AMG-Novelle (2004) § 4 Abs. 9 AMG "Gentransfer-Arzneimittel sind zur Anwendung am Menschen bestimmte Arzneimittel im Sinne des § 2 Abs. 1, die zur genetischen Modifizierung von Körperzellen durch Transfer von Genen oder Genabschnitten bestimmte nackte Nukleinsäuren, virale oder nichtvirale Vektoren, genetisch modifizierte menschliche Zellen oder rekombinante Mikroorganismen, letztere ohne mit dem Ziel der Prävention oder Therapie der von diesen hervorgerufenen Infektionskrankheiten eingesetzt zu werden, sind oder enthalten."

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Andere gesetzliche Vorschriften Gentechnik-Gesetz (GenTG) Die Herstellung von Gentherapie-Vektoren bedingt in der Regel die (vorübergehende) Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen, die nur in so genannten gentechnischen Anlagen erfolgen darf. Das bedeutet, dass die Herstellung der Gentransfer-Vektoren und ggf. auch die Ex-vivo-Modifizierung von Patienten-Zellen in einer gentechnischen Anlage unter GMP-Bedingungen erfolgen muss.

Allerdings... ...unterliegt die Anwendung von gentechnisch veränderten Zellen am Menschen ausdrücklich nicht dem GenTG (§ 2 Abs. 2).

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12. AMG-Novelle §§ 40, 77, 42 AMG Klinische Studien müssen prinzipiell von der zuständigen Bundesoberbehörde genehmigt werden (§ 40). Für die Anwendung von Gentransfer-Arzneimitteln ist die zuständige Bundesoberbehörde das Paul-Ehrlich-Institut in Langen (§ 77). Eine Gentherapie-Studie darf erst begonnen werden, wenn die Bundesoberbehörde schriftlich eine Zustimmung erteilt hat (§ 42).

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Inhalt

Strategien und Indikationen

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Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Genersatztherapie Intakte Kopie eines defekten Gens

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Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Tumorvakzinierung IL2-, TNFα-, GM-CSF-Gen

IL2 TNFα GM-CSF Fibroblast, T-Zelle, Tumorzelle

Tumorzellen werden angelockt und eliminiert 18

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Unterschiedliche konzeptionelle Ansätze Sensibilisierung von Zellen für Sekundärtherapie MultidrugResistenz-Gen

HSV-ThymidinKinase-Gen 19

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Indikationen für Gentherapiestrategien Monogenische Erkrankungen • X-Chromosom gekoppelte SCID • ADA Defizienz (ADA-SCID) • Mucopolysaccharidose • Familiäre Hypercholesterinämie • Cystische Fibrose (Mucoviszidose) • Hämophilie B • Chronische X-Agranulomatose Krebs • Gynäkologische Tumore (Brust, Eierstock, Cervix) • Zentrales Nervensystem (Glioma, Neuroblastoma) • Gastro-Intestinaltrakt (Colon-CA, colorektales CA, Leber-CA) • Urogenitaltrakt (Prostata-CA, Nieren-CA) • Haut (Melanome) • Lungen-CA • Hämatologische Krebserkrankungen 20

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Indikationen für Gentherapiestrategien Virus-Infektion • HIV Andere Erkrankungen • Rheumatische Arthritis • Arterien-Erkrankungen Markierungsexperimente • GvHD-Kontrolle • Hämatologische Krebserkrankungen • Melanome • Neuroblastome • Non-Small-Cell" Lunge- CA • Blasenkrebs

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Somatischer Gentransfer Gentherapie in klinischen Studien

Stand Oktober 2009 22

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Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln

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Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln

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Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln

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Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln

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Somatischer Gentransfer Vorgehensweise bei der Therapie mit Gentransfer-Arzneimitteln

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Methoden zur genetischen Veränderung von Zellen Chemische Methoden • Ca2+-Phosphat-Präzipitation • Liposomen • Nanopartikel

Physikalische Methoden • • •

Mikroinjektion Elektroporation Bioballistik

Biologische Methoden •

Transfektion

Viren

Infektion; Transduktion

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Der ideale Gentherapie-Vektor … ... hat eine hohe Transfektions-/Transduktionseffizienz; ... hat einen hohen Titer (>108 Viruspartikel/ml); ... ist einfach und reproduzierbar herzustellen; ... infiziert proliferierende und ruhende Zellen; ... erlaubt nachhaltige Expression des therapeutischen Gens; ... wird stabil in das Genom der therapierten Zellen integriert; ... unterstützt Regulierbarkeit der Expression; ... ist spezifisch für bestimmte Zelltypen; ... ist nicht immunogen

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Inhalt

Gen-Transfersysteme

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Transfersysteme

Retroviren

Adenoviren

AAV

Liposomen

DNA

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Gentransfer-Vektoren ex vivo

in vivo

stabil/transient

Virale Vektoren Retrovirus

+

?

S

Adenovirus

+/-

+

T

+

?

S

Herpesvirus

+/-

+

?

Vaccinia-Virus

+/-

+

T

Adeno-assoziiertes Virus (AAV)

Nichtvirale Vektoren Liganden/DNA-Konjugate

-

+

T

Adenovirus/DNA-Konjugate

-

+

T

Liposomen

+/-

+

T

Ca-Phosphat-Präzipitation

+/-

-

S

-

+

T

DNA-Injektion

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Somatischer Gentransfer Gentherapie in klinischen Studien

Biologische GentransferMethoden sind deutlich effizienter als physikochemische Transfektionsmethoden

Stand Oktober 2009 33

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Transfersysteme

Retroviren

Adenoviren

AAV

Liposomen

DNA

Retroviren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Aussicht auf langfristige Stabilität Durch Retroviren übertragene Gene integrieren nach dem Zufallsprinzip und können deshalb intakte Gene zerstören

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Aufbau von Retroviren

C-Typ Retrovirus (MLV)

LTR

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Vom Retrovirus zum Gentransfer-Vektor

C-Typ Retrovirus (MLV)

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Problem 1: Ein Gentherapie-Vektor darf nicht selbst replizieren

C-Typ Retrovirus (MLV)

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Problem 2: Ein Gentherapie-Vektor darf nicht mit HERVs rekombinieren

C-Typ Retrovirus (MLV)

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Die Konsequenz aus den Problemen 1 + 2: Man trennt Replikation von Funktion

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Retrovirale Gentransfer-Vektoren Ergebnis: Gentransfer-Vektor Verpackungszelle

Gentransfer-Vektor

Verpackungszelle Freitag, 21. Januar 2011

Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

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Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

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Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

Freitag, 21. Januar 2011

Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

Freitag, 21. Januar 2011

Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

Freitag, 21. Januar 2011

Herstellung replikationsdefekter Retroviren Verpackungszelle

Freitag, 21. Januar 2011

Herstellung replikationsdefekter Retroviren Zelle des Patienten

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Eigenschaften retroviraler GentransferVektoren

• • • • • • • • • •

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hohe Transduktionsfrequenz moderate Virustiter (106-107/ml) infizieren nur proliferierende Zellen nicht zelltypspezifisch nur Ex-vivo-Applikation geringe Insertgrößen (< 7,5 kb) Integration kaum Insertionsspezifität oft langanhaltende Expression kaum immunogen

Der erste klinische Gentherapie-Versuch war 1990

Science 270:470 (1995) Science 270:475 (1995) Freitag, 21. Januar 2011

10 Jahre später: erste Erfolge …

Science 288:669 (2000) Freitag, 21. Januar 2011

… aber auch Sicherheitsprobleme

Science 302:415 (2003) Freitag, 21. Januar 2011

Retrovirus MLV inseriert in aktive Gene

Science 300:1749 (2003) Freitag, 21. Januar 2011

Alternative: Lentivirale GentransferVektoren Aufbau von Lentiviren

Lentiviren sind als Gentransfer-Vektoren interessant, weil sie typischerweise auch nicht-proliferierende Zellen infizieren können.

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HIV-basierte Gentherapie-Vektoren Generelle Überlegungen •

• •

einige Akzessorische Proteine sind zwar für die Pathogenität des Virus in vivo essenziell, sind aber für die Replikation in vitro nicht notwendig (Vif, Vpr, Vpu, Nef). Das Protein Tat ist nur notwendig, wenn die Expression des Virusgenoms vom 5'-LTR des Virus gesteuert wird. Rev ist für eine effiziente Herstellung von Viruspartikel (Gentransfer-Vektor) notwendig.

Freitag, 21. Januar 2011

Biologisches Risiko Auch lentivirale Vektoren inserieren in aktive Gene

Science 300:1749 (2003) Freitag, 21. Januar 2011

Transfersysteme

Retroviren

Adenoviren

AAV

Liposomen

DNA

Adenoviren gehören zu den cytolytischen Viren, verursachen aber selten ernste Krankheiten; sie besitzen eine große Aufnahmefähigkeit für fremde Gene Die übertragenen Gene sind nur temporär aktiv; Die Viren lösen Immunreaktion aus.

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Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel • • • • • •

lineare, doppelsträngige DNA mit 36.000 - 38.000 bp. an den beiden 5'-Enden jeweils kovalent ein Molekül "Terminales Protein (TP)", die das Genom „quasi zirkularisieren“. Invertierte Wiederholungssequenzen von 54-166 bp E1A-Protein fungiert als Transkriptionsaktivator der frühen Gene E1B, E2A, E2B, E3 und E4. Adenoviren können in normalen Körperzellen nur replizieren, wenn die Proteine E1A und E1B vorhanden sind. E1A und E1B binden an die Tumorsuppressor-Proteine Rb und p53 und inaktivieren diese.

Freitag, 21. Januar 2011

Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel • • • • • • • • •

hohe Transduktionsfrequenz sehr hohe Virustiter (1011-1012/ml) infizieren auch nicht proliferierende Zellen kaum zelltypspezifisch Ex-vivo- und In-vivo-Applikation möglich große Inserts (8 kb, maximal 30 kb) keine Integration zeitlich begrenzte Expression stark immunogen

Freitag, 21. Januar 2011

Adenovirale Gentransfer-Arzneimittel Dritte Generationsvektoren (gutless-Vektoren)

Gentherapie-Vektor

Verpackungszelle Freitag, 21. Januar 2011

Erste klinische Studien

Nat. Genet. 8:42 (1994) Freitag, 21. Januar 2011

Transfersysteme

Retroviren

Adenoviren

AAV

Liposomen

DNA

Adeno-assoziierte Viren bauen Gene aktiv in Chromosomen ein; Sie verursachen keine ernsten Krankheiten Adeno-assoziierte Viren besitzen eine relativ geringe Aufnahmekapazität

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Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel Adeno-assoziiertes Virus (AAV)

• • • •

nicht humanpathogene Parvoviren besitzen ein einzelsträngiges DNA-Genom von ca. 4.700 Nukleotiden 125 Basen lange Inverse terminale Wiederholungen (ITRs = inverted terminal repeats) an beiden Enden. AAVs gehören zu den "Dependoviren“, d.h. sie benötigen für ihre eigene Replikation andere "Helferviren" wie Adeno- oder Herpesviren.

Freitag, 21. Januar 2011

Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel Aufbau von Gentransfer-Vektoren

Verpackungszelle Freitag, 21. Januar 2011

Adeno-assoziiertes Virus (AAV) Gentransfer-Arzneimittel

• • • • • • • • • •

Freitag, 21. Januar 2011

hohe Transduktionsfrequenz hohe Virustiter (