Arbeitsanleitung - Instruction Manual
Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit (Safety-Line)
V0815
Manual_Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
INHALT EINLEITUNG
1
FUNKTIONSPRINZIP
1
KITBESTANDTEILE
2
LAGERUNG
2
BINDEKAPAZITÄT
2
WICHTIGE HINWEISE
3
Einmalige Vorbereitung des Waschpuffers Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:
3 3
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
4
PRECELLYS BACTERIAL/FUNGAL RNA KIT ISOLIERUNGSPROTOKOLL
6
AUFKONZENTRIERUNG DER RNA
8
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA
8
TROUBLE SHOOTING TIPPS
9
CONTENT INTRODUCTION
1
PRINCIPLE
1
KIT COMPONENTS
2
STORAGE AND STABILITY
2
BINDING CAPACITY
2
BEFORE STARTING
3
Initial preparation of Wash buffer Required equipment and materials to be supplied by the user
3 3
DANGEROUS COMPONENTS
4
PRECELLYS BACTERIAL/FUNGAL RNA KIT PROTOCOL
6
CONCENTRATING THE RNA
8
QUANTIFICATION AND STORAGE OF THE RNA
8
TROUBLESHOOTING
9
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Manual_Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
EINLEITUNG Die Precellys Bacterial/Fungal RNA Kits bieten eine schnelle und einfache Methode, um bis zu 100 µg Gesamt-RNA aus widerstandsfähigen Gram+ Bakterien, Hefezellen, Sporen oder Pilzen zu isolieren. Mit geringem Arbeitsaufwand gestatten sie die Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei je Präparation bis zu 1 x 109 Bakterienzellen oder Sporen, 5 x 107 Hefezellen oder 40 – 100 mg pilzliches Gewebe eingesetzt werden kann. Das Kit wurde speziell für die Verwendung des Homogenisators Precellys® 24 zur schnellen, effektiven und reproduzierbaren Homogenisierung und zum Zellaufschluss von zahlreichen, insbesondere auch widerstandsfähigen Geweben entwickelt. Im Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit enthalten sind 2 ml Schraubdeckelgefäße, gefüllt mit einer optimierten Menge an Aufschlussbeads aus Glass mit einem Durchmesser von 0.5 mm zur effektiven Zelllyse von Zellen und Gewebe. Mit den Precellys Tissue RNA Kits können mehrere Isolierungen parallel in weniger als 60 min durchgeführt werden. Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, wie Phenol oder Chloroform, müssen ebenso wenig durchgeführt werden wie zeitaufwändige Fällungen mit Isopropanol oder Ethanol. Gesamt-RNA, die mit den Precellys Bacterial/Fungal RNA Kits isoliert wurde, kann direkt für alle Arten von Folgeexperimenten, wie RT-PCR, Northern Blotting, poly(A)+-RNA (mRNA) Isolierung, Nuclease Protection Assays und In-vitro Translation weiterverwendet werden. Precellys Bacterial/Fungal RNA Kits enthalten Safety-Line Säulen zur Isolierung hochreiner RNA. Schnappdeckel sorgen bei den Safety-Line Säulen für einen sicheren Verschluss und zusätzlichen Schutz vor Kreuzkontaminationen.
FUNKTIONSPRINZIP Die Precellys Bacterial/Fungal RNA Kits kombinieren die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind®-Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und optimiertes Puffersystem erlaubt die Reinigung von bis zu 100 µg Gesamt-RNA mit Moleküllängen größer als 200 bp. Die aufzuarbeitenden Proben werden im Homogenisator Precellys® 24 homogenisiert und unter denaturierenden und auf das Probenmaterial abgestimmten Bedingungen lysiert. Mit Hilfe einer DNA Removing Säule werden anschließend die DNA Moleküle von der RNA abgetrennt. In einem zweiten Bindungsschritt wird RNA effektiv an die Silikamembran einer PerfectBind-RNASäule gebunden. Zellulärer Debris, Proteine und sonstige Kontaminationen können hier durch Waschen mit speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr hochwertige RNA wird abschließend in RNase-freiem Wasser eluiert.
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KITBESTANDTEILE Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
5 Reinigungen
50 Reinigungen
12-7611-00
12-7611-01
Precellys® Glass Kit 0.5 mm
5
50
DNA Removing Columns
5
50
PerfectBind® RNA Columns
5
50
2 ml Collection Tubes
10
100
RNA Lysis Buffer P-P
2 x 1.5 ml
25 ml
RNA Wash Buffer I
5 ml
50 ml
RNA Wash Buffer II
2 ml
16 ml
RNase-free Water
1 ml
5 ml
1
1
Best.-Nr. Safety-Line Bestandteile
Arbeitsanleitung
LAGERUNG Alle Komponenten des Kits sollten bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Bei einer Umgebungstemperatur von 22 – 25 °C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens 12 Monate ab Lieferung stabil.
BINDEKAPAZITÄT Die Bindekapazität der PerfectBind® RNA Columns beträgt rund 100 µg RNA mit Moleküllängen größer als 200 bp. Es sollte nicht mehr als die angegebene Menge an Ausgangsmaterial eingesetzt werden.
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WICHTIGE HINWEISE Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kit vollständig durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien bereit.
Einmalige Vorbereitung des Waschpuffers !
RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung mit absolutem Ethanol verdünnt werden: 5 Reinigungen
2 ml RNA Wash Buffer II mit 8 ml 100 % EtOH mischen.
50 Reinigungen
16 ml RNA Wash Buffer II mit 64 ml 100 % EtOH mischen.
Verdünnter RNA Wash Buffer II sollte bei Raumtemperatur gelagert oder vor seiner Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden. RNA Wash Buffer II sollte nach der Verwendung gut verschlossen werden.
!
Alle Zentrifugationsschritte sollten bei 22 – 25 °C durchgeführt werden.
Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden: ! ! ! ! !
Precellys® 24 Homogenisator Tischzentrifuge für 2 ml Reaktionsgefäße 100 % Ethanol 70 % Ethanol Sterile Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße
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GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit Bestandteile
Signalwort / Symbole
Gefährliche Inhaltsstoffe
H- und P-Sätze
Precellys® Glass Kit 0.5 mm
-
-
-
DNA Removing Columns
-
-
-
PerfectBind RNA Columns
-
-
-
2 ml Collection Tubes
-
-
-
WARNING
guanidinium chloride 25-50%, CAS: 50-01-1
H302, H315, H319, P101, P102, P103, P280, P264, P305+P351+P338, P332+P313, P403, P501
DANGER
Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10- 750 µl die Säule mehrmals beladen. Auch wenn die Probe noch nicht vollständig über die Säule zentrifugiert worden ist, sollte der Zentrifugationsschritt wiederholt werden.
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3. Waschen I 500 µl RNA Wash Buffer I zugeben und für 1 min bei 10000 x g zentrifugieren. Den Säulendurchfluss verwerfen und das Collection Tube weiterverwenden. 4. DNase I Verdau (optional) Da durch die PerfectBind RNA-Technologie die vorhandene DNA größtenteils entfernt wird, ist ein zusätzlicher DNase-Verdau für die meisten Folgeanwendungen nicht erforderlich. Dennoch kann es bei einigen sensitiven RNA-Anwendungen nötig sein, die verbliebene DNA durch DNaseBehandlung zu entfernen. Das folgende Protokoll beschreibt den DNase I-Verdau direkt auf der PerfectBind RNA Column (Bestellnr.: 12-1091-01/02). a. Für jede PerfectBind RNA Column folgenden DNase I Reaktionsmix vorbereiten: DNase I Digestion Buffer RNase-freie DNase I (20 Kunitz units/µl) Gesamtvolumen
73.5 µl 1.5 µl 75 µl
Hinweis: 1. DNase I ist sehr empfindlich gegenüber physikalischer Denaturierung, deshalb DNase ILösung niemals vortexen! Ein Invertieren des Tubes reicht zum Mischen aus. Den DNase I Reaktionsmix immer direkt vor der RNA-Isolation ansetzen. 2. Der DNase I Digestion Buffer ist im RNase-freien DNase I Digest Kit enthalten. Standard DNase Puffer sind nicht für den "on-membrane" Verdau geeignet! b. 75 µl des DNase I Reakionsmixes direkt auf die Membran der PerfectBind RNA Column pipettieren. Der DNase I Verdau kann nicht vollständig ablaufen, wenn ein Teil des Reaktionsmixes an der Wand oder dem O-Ring der Säule haftet. c. Säule bei Raumtemperatur (25 - 30 °C) für 15 Minuten inkubieren. d. Säule in ein neues 2 ml Collection Tube stecken und 400 µl RNA Wash Buffer I zugeben. Säule bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubieren. Anschließend bei 10000 x g für 5 Minuten zentrifugieren und Durchfluss verwerfen. Collection Tube im nächsten Schritt (Schritt 5) weiterverwenden. 5. Waschen II Säule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und 650 µl RNA Wash Buffer II (mit Ethanol versetzt!) zugeben. Für 1 min bei 10000 x g zentrifugieren. Den Säulendurchfluss verwerfen und das Collection Tube weiterverwenden. 6. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) Säule in das geleerte 2 ml Collection Tube stecken und durch Zentrifugieren für 2 Minuten bei 10000 x g vollständig trocknen.
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7. Elution Säule in ein steriles 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen und 30 - 80 µl RNase-freies Wasser auf die Säulenmatrix pipettieren. Säule im Reaktionsgefäß für 3 Minute bei Raumtemperatur inkubieren und danach für 1 Minute bei 6000 x g zentrifugieren. Säule verwerfen und isolierte RNA bei –70 °C lagern.
AUFKONZENTRIERUNG DER RNA Gesamt-RNA, die mit dem Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit aufgereinigt wurde, kann bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu zunächst NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz durch Vortexen sorgfältig mischen und für 10 Minuten bei –20 °C inkubieren. Danach für 15 Minuten bei 10000 x g zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol zugeben und für 2 Minuten bei 10000 x g zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für 2 Minuten lufttrocknen und RNA in 20 µl RNasefreiem Wasser lösen.
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER RNA Um die Konzentration und Reinheit einer RNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 40 µg RNA/ml. Die Konzentration berechnet sich demnach wie folgt: RNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 40 x Verdünnungsfaktor Das A260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit den Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 2.0 entspricht deshalb Gesamt- RNA mit einer Reinheit von 85 % bis 100 %. Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen RNA auch durch Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten RNA-Proben bestimmt werden. Gesamt-RNA, die mit den Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit aufgereinigt wurde, kann in RNasefreiem Wasser für mehrere Jahre bei –70 °C aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum Scheren der RNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt.
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TROUBLE SHOOTING TIPPS Problem
Ursache
Säule verstopft
Unvollständige Lyse
Inkubationszeit mit RNA Lysis Buffer P-P verlängern und/oder Homogenisierungsenergie erhöhen.
Zu große Probenmenge
Lysat auf mehrere Precellysröhrchen und PerfectBind-RNA-Säulen verteilen.
Lysat zu viskos
Lysat mit RNA Lysis Buffer P-P verdünnen und auf mehrere Säulen verteilen.
Schlechte Elution
Elution wiederholen oder Elutionsvolumen erhöhen. Säule vor der Elution für 5 Minuten bei 70 °C inkubieren oder RNAse-freies Wasser auf 70 °C vorheizen.
Unzureichendes Waschen
RNA Wash Buffer II wird als Konzentrat geliefert und muss mit 4 Volumen 100 % Ethanol verdünnt werden.
Degradierte RNA
Zu altes Material
Stets frisches, junges Material verwenden.
Unsachgemäße Bearbeitung
Längere Inkubationen von lysiertem Gewebe ohne vollständiger Zugabe des Lysispuffers sind zu vermeiden. Nach der Isolierung sollte die RNALösung bis zur weiteren Analyse auf Eis gelagert werden.
Keine RNA im Eluat
Schlechte Bindung der RNA an PerfectBindRNA-Säule
Nach der Zugabe von 70 % Ethanol sofort und sorgfältiger mischen.
Wash Buffer nicht mit 100 % Ethanol verdünnt.
RNA Wash Buffer II Konzentrat muss mit 4 Volumenteilen absolutem Ethanol verdünnt werden.
DNA Kontamination
Gemeinsame Aufreinigung von DNA und RNA
Mit RNase-free DNase verdauen und bei 37 oC für 5 min verdauen. Alternativ kann auch der peqGOLD DNase I Digest Kit (Kat. No.12-109101).verwendet werden
Schlechtes A260/280 Verhältnis
Säulenmaterial im Eluat vorhanden
Zentrifugationsgeschwindigkeiten höher als die Angegebenen sind unbedingt zu vermeiden. Das Säulenmaterial kann aus der Probe durch Zentrifugation abgetrennt werden, es beeinträchtigt enzymatische Reaktionen nicht.
Probleme mit nachfolgenden Reaktionen
Verschleppung von Salzen
Es ist darauf zu achten, dass der RNA Wash Buffer bei Raumtemperatur gelagert wird und keine Präzipitate enthält.
Verschleppung von Ethanol
Der Trocknungsschritt mit 2-minütigem Zentrifugieren ist unbedingt einzuhalten.
Niedriger RNAErtrag
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Abhilfe
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INTRODUCTION The Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit provides a rapid and convenient method for the isolation of up to 100 µg of total cellular RNA from hard to lyse Gram+ bacteria cells, yeast cells, spores and fungal tissue. The kit allows processing of single or multiple samples simultaneously with up to 1 x 109 bacteria cells and spores, 5 x 107 yeast cells or 40 - 100 mg of fungal material per reaction. The kit is specially developed for use with the homogenizer Precellys® 24 for a fast, effective and reproducible homogenization and cell disruption of a wide range of samples including hard to lyse tissues. Provided with the kit are 2 ml screw-cap tubes prefilled with optimised amounts of glass beads of 0.5 mm diameter giving best results for the lysis of cells and tissue. The Precellys Bacterial/Fungal RNA Kits are ideal for processing multiple samples in less than 60 min. There is no need for extractions with organic solvents like phenol or chloroform or time consuming steps such as precipitation with isopropyl alcohol or ethanol. RNA purified with the Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit is ready for a wide range of applications such as RT-PCR, Northern blotting, poly(A)+-RNA (mRNA) purification, nuclease protection assays and in vitro translation. The Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit contains PerfectBind spin columns for the isolation of highly purified RNA. The columns can be closed tightly by lids to avoid cross-contamination more effectively.
PRINCIPLE The Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit uses the reversible binding properties of the PerfectBind matrix, a silica-based material, combined with the speed of mini-column spin technology. A specifically formulated buffer system allows the isolation of up to 100 µg of total RNA with fragment sizes greater than 200 bp to bind to the matrix. Samples are first homogenized with the homogenizer Precellys® 24, lysed under appropriate conditions and applied to a DNA Removing Column where DNA binds selectively to the silica membrane. In a second binding step the RNA is effectively bound to the silica membrane of the PerfectBind RNA column. Cellular debris, proteins and other contaminants are washed away by specific buffers. The high quality total RNA is finally eluted in RNase-free water.
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Manual_Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
KIT COMPONENTS Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
5 Preparations
50 Preparations
12-7611-00
12-7611-01
Precellys® Glass Kit 0.5 mm
5
50
DNA Removing columns
5
50
PerfectBind® RNA columns
5
50
2 ml Collection Tubes
10
100
RNA Lysis Buffer P-P
2 x 1.5 ml
25 ml
RNA Wash Buffer I
5 ml
50 ml
RNA Wash Buffer II
2 ml
16 ml
RNase-free Water
1 ml
5 ml
Instruction manual
1
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Order No. Safety-Line Components
STORAGE AND STABILITY All components of the Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit should be stored at room temperature. The components of the kit remain stable at an ambient temperature of 22 – 25 °C for at least 12 months after the date of purchase.
BINDING CAPACITY Each PerfectBind RNA column can bind more than 100 µg of RNA molecules greater than 200 bases. Using more than 1 x 109 bacteria cells or spores, 5 x 107 yeast cells or 100 mg of tissue is not recommended.
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Manual_Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit
BEFORE STARTING Please read the protocol carefully before the first use of the Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit and keep all required materials available before starting the preparation.
Initial preparation of Wash buffer !
RNA Wash Buffer II is delivered as a concentrate and must be diluted with absolute ethanol before use: 5 Preparations
Mix 2 ml RNA Wash buffer II with 8 ml 100 % EtOH.
50 Preparations
Mix 16 ml RNA Wash buffer II with 64 ml 100 % EtOH.
Diluted RNA Wash Buffer II should be stored at room temperature. If stored at lower temperatures, it should be heated to room temperature before use. RNA Wash Buffer II should be closed firmly when not in use. !
All centrifugation steps have to be performed at 22 – 25 °C.
Required equipment and materials to be supplied by the user ! ! ! ! !
Precellys® 24 homogenizer Microcentrifuge for 2 ml tubes 100 % ethanol 70 % ethanol Sterile pipette tips and centrifuge tubes
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DANGEROUS COMPONENTS Precellys Bacterial/Fungal RNA Kit Components
Signal word / symbols
Dangerous components
H and P statements
Precellys® Glass Kit 0.5 mm
-
-
-
DNA Removing Columns
-
-
-
PerfectBind RNA Columns
-
-
-
2 ml Collection Tubes
-
-
-
WARNING
guanidinium chloride 25-50%, CAS: 50-01-1
H302, H315, H319, P101, P102, P103, P280, P264, P305+P351+P338, P332+P313, P403, P501
DANGER
Ethanol 25-50%, guanidinium thiocyanate 10-