ÖNORM EN 14130 Ausgabe: 2003-09-01 Normengruppe N Ident (IDT) mit EN 14130:2003

ICS 67.050

Lebensmittel – Bestimmung von Vitamin C mit HPLC

Foodstuffs – Determination of vitamin C by HPLC Produits alimentaires – Dosage de la vitamine C par CLHP

Die Europäische Norm EN 14130 hat den Status einer Österreichischen Norm.

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Die ÖNORM EN 14130 besteht aus • diesem nationalen Deckblatt sowie • der offiziellen deutschsprachigen Fassung der EN 14130:2003.

Fortsetzung EN 14130 Seiten 1 bis 12

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Fachnormenausschuss 205 Lebensmitteluntersuchungsverfahren

Preisgruppe 11

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EUROPÄISCHE NORM

EN 14130

EUROPEAN STANDARD NORME EUROPÉENNE

Juni 2003

ICS 67.050

Deutsche Fassung

Lebensmittel - Bestimmung von Vitamin C mit HPLC Foodstuffs - Determination of vitamin C by HPLC

Produits alimentaires - Dosage de la vitamine C par CLHP

Diese Europäische Norm wurde vom CEN am 21.April 2003 angenommen. Die CEN-Mitglieder sind gehalten, die CEN/CENELEC-Geschäftsordnung zu erfüllen, in der die Bedingungen festgelegt sind, unter denen dieser Europäischen Norm ohne jede Änderung der Status einer nationalen Norm zu geben ist. Auf dem letzen Stand befindliche Listen dieser nationalen Normen mit ihren bibliographischen Angaben sind beim Management-Zentrum oder bei jedem CEN-Mitglied auf Anfrage erhältlich. Diese Europäische Norm besteht in drei offiziellen Fassungen (Deutsch, Englisch, Französisch). Eine Fassung in einer anderen Sprache, die von einem CEN-Mitglied in eigener Verantwortung durch Übersetzung in seine Landessprache gemacht und dem ManagementZentrum mitgeteilt worden ist, hat den gleichen Status wie die offiziellen Fassungen.

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CEN-Mitglieder sind die nationalen Normungsinstitute von Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, der Slowakei, Spanien, der Tschechischen Republik, Ungarn und dem Vereinigten Königreich.

EUROPÄISCHES KOMITEE FÜR NORMUNG EUROPEAN COMMITTEE FOR STANDARDIZATION COMITÉ EUROPÉEN DE NORMALISATION

Management-Zentrum: rue de Stassart, 36

© 2003 CEN

B-1050 Brüssel

Alle Rechte der Verwertung, gleich in welcher Form und in welchem Verfahren, sind weltweit den nationalen Mitgliedern von CEN vorbehalten.

Ref. Nr. EN 14130:2003 D

EN 14130:2003 (D)

Inhalt Seite

Vorwort........................................................................................................................................................................ 2 1

Anwendungsbereich ..................................................................................................................................... 3

2

Normative Verweisungen ............................................................................................................................. 3

3

Kurzbeschreibung......................................................................................................................................... 3

4

Chemikalien ................................................................................................................................................... 3

5

Geräte ............................................................................................................................................................. 5

6

Durchführung ................................................................................................................................................ 6

7

Auswertung.................................................................................................................................................... 7

8

Präzision ........................................................................................................................................................ 8

9

Untersuchungsbericht .................................................................................................................................. 9

Anhang A (informativ) Beispiel für ein Chromatogramm ..................................................................................... 10 Anhang B (informativ) Präzisionsdaten.................................................................................................................. 11 Literaturhinweise...................................................................................................................................................... 12

Vorwort Dieses Dokument (EN 14130:2003) wurde vom Technischen Komitee CEN/TC 275 „Lebensmittelanalytik — Horizontale Verfahren” erarbeitet, dessen Sekretariat vom DIN gehalten wird. Diese Europäische Norm muss den Status einer nationalen Norm erhalten, entweder durch Veröffentlichung eines identischen Textes oder durch Anerkennung bis Dezember 2003, und etwaige entgegenstehende nationale Normen müssen bis Dezember 2003 zurückgezogen werden. Die Anhänge A und B sind informativ. WARNUNG — Bei der Anwendung dieser Europäischen Norm ist es möglich, dass gefährliche Substanzen, Arbeitsgänge und Geräte angewendet werden. Diese Norm erhebt nicht den Anspruch, dass alle mit ihrer Anwendung verbundenen Sicherheitsprobleme angesprochen werden. Es liegt in der Verantwortung des Anwenders dieser Norm, geeignete Vorkehrungen für den Arbeits- und Gesundheitsschutz zu treffen und vor der Anwendung festzulegen, welche einschränkenden Vorschriften gelten.

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Entsprechend der CEN/CENELEC-Geschäftsordnung sind die nationalen Normungsinstitute der folgenden Länder gehalten, diese Europäische Norm zu übernehmen: Belgien, Dänemark, Deutschland, Finnland, Frankreich, Griechenland, Irland, Island, Italien, Luxemburg, Malta, Niederlande, Norwegen, Österreich, Portugal, Schweden, Schweiz, Slowakei, Spanien, Tschechische Republik, Ungarn und Vereinigtes Königreich.

2

EN 14130:2003 (D)

1

Anwendungsbereich

Diese Europäische Norm legt ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin C in Lebensmitteln mit HochleistungsFlüssigchromatographie (HPLC) fest. Vitamin C ist die Summe von L(+)-Ascorbinsäure und L(+)-Dehydroascorbinsäure.

2

Normative Verweisungen

Diese Europäische Norm enthält durch datierte oder undatierte Verweisungen Festlegungen aus anderen Publikationen. Diese normativen Verweisungen sind an den jeweiligen Stellen im Text zitiert, und die Publikationen sind nachstehend aufgeführt. Bei datierten Verweisungen gehören spätere Änderungen oder Überarbeitungen dieser Publikationen nur zu dieser Europäischen Norm, falls sie durch Änderung oder Überarbeitung eingearbeitet sind. Bei undatierten Verweisungen gilt die letzte Ausgabe der in Bezug genommenen Publikation (einschließlich Änderungen). EN ISO 3696, Wasser für analytische Zwecke — Anforderungen und Prüfungen (ISO 3696:1987).

3

Kurzbeschreibung

Vitamin C wird durch Metaphosphorsäurelösung aus der Probe extrahiert. L(+)-Dehydroascorbinsäure wird zu L(+)Ascorbinsäure reduziert. Der Gesamtgehalt an L(+)-Ascorbinsäure wird mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und UV-Detektion bei 265 nm bestimmt [1], [2].

4

Chemikalien

4.1

Allgemeines

Falls nicht anders angegeben, werden bei der Analyse nur analysenreine Chemikalien und Wasser von mindestens Qualität 1 nach EN ISO 3696 oder doppelt destilliertes Wasser verwendet.

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4.2

Reagenzien und Lösungen

4.2.1

Metaphosphorsäure, ((HPO3)n)

4.2.2

Trinatriumphosphat, Massenanteil w(Na3PO4 · 12H2O) ≥ 98,0 %

4.2.3

Kaliumdihydrogenphosphat, w(KH2PO4) ≥ 99,0 %

4.2.4

L-Cystein oder ein anderes geeignetes Reduktionsmittel, w(C3H7NO2S) ≥ 99,0 %

4.2.5

N-Cetyl-N,N,N-Trimethylammoniumbromid, w(C19H42BrN) ≥ 99,0 %

4.2.6

Methanol (für HPLC), w(CH3OH) ≥ 99,0 %

4.2.7

Metaphosphorsäure-Lösung, Massenkonzentration ρ((HPO3)n) = 200 g/l

200 g Metaphosphorsäure (4.2.1) werden in einem 1-l-Messkolben in Wasser gelöst, und der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösung ist bei Lagerung bei 4 °C einen Monat haltbar. 4.2.8

Metaphosphorsäure-Lösung, ρ((HPO3)n) = 20 g/l

50 ml der Metaphosphorsäure-Lösung (4.2.7) werden in einen 500-ml-Messkolben pipettiert und bis zur Marke mit Wasser aufgefüllt. Diese Lösung wird an jedem Analysentag frisch hergestellt. 4.2.9

Trinatriumphosphat-Lösung, ρ(Na3PO4 · 12H2O) = 200 g/l

200 g Trinatriumphosphat (4.2.2) werden in einem 1-l-Messkolben in Wasser aufgelöst, und der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. 3

EN 14130:2003 (D)

4.2.10 L-Cystein-Lösung, ρ(C3H7NO2S) = 40 g/l 20 g Cystein (4.2.4) werden in einem 500-ml-Messkolben in Wasser gelöst, und der Kolben wird mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die Lösung wird an jedem Analysentag hergestellt. 4.2.11 HPLC-Mobile Phase: Lösung A: 13,6 g Kaliumdihydrogenphosphat (4.2.3) werden in einem Becherglas in 900 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Lösung B: 1,82 g N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (4.2.5) werden in einem Becherglas in 100 ml Methanol (4.2.6) gelöst. Die Lösung wird durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. 900 ml Lösung A werden mit 100 ml Lösung B gemischt. Wenn erforderlich, wird diese Lösung vor Gebrauch entgast. 4.2.12 Stärkelösung (wahlweise), ρ(lösliche Stärke) = 1 g/100 ml 4.2.13 Iodlösung (wahlweise), c(I2) = 0,05 mol/l 4.2.14 Verdünnte Schwefelsäure, c(H2SO4) = 0,1 mol/l

4.3 4.3.1

Standardsubstanzen Ascorbinsäure, L(+)-Ascorbinsäure, w(C6H8O6) ≥ 99,7 %

(R)-5-[(S)-1,2-Dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-5-H-furan-2-on 4.3.2

Isoascorbinsäure, D(-)-Ascorbinsäure, w(C6H8O6) ≥ 99,0 %

(R)-5-[(R)-1,2-Dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-5-H-furan-2-on

4.4 4.4.1

Stammlösungen Ascorbinsäure-Stammlösung, ρ(C6H8O6) ≈ 1 mg/ml

Eine auf 0,1 mg gewogene Menge an Ascorbinsäure (4.3.1), z. B. etwa 100 mg wird in einem definierten Volumen, z. B. 100 ml in Metaphosphorsäure (4.2.8) gelöst. Die Lösung wird an jedem Analysentag frisch hergestellt. Die Stabilität der Stammlösung kann durch Zugabe von L-Cystein erhöht werden.

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4.4.2

Isoascorbinsäure-Stammlösung, ρ(C6H8O6) ≈ 1 mg/ml

Eine auf 0,1 mg gewogene Menge an Isoascorbinsäure (4.3.2), z. B. etwa 100 mg wird in einem definierten Volumen, z. B. 100 ml in Metaphosphorsäure (4.2.8) gelöst. Die Lösung wird an jedem Analysentag frisch hergestellt.

4

EN 14130:2003 (D)

4.4.3

Konzentrationsprüfung (wahlweise)

Etwa 150 mg Ascorbinsäure werden genau in einen Erlenmeyerkolben eingewogen und in 10 ml verdünnter Schwefelsäure (4.2.14) und 80 ml Kohlendioxid freiem Wasser gelöst. Nach der Zugabe von Stärke oder Stärkelösung (4.2.12) wird mit Iodlösung (4.2.13) bis zum bestehenbleibenden Farbumschlag titriert. 1 ml Iodlösung entspricht 8,81 mg Ascorbinsäure. Die Reinheit der Standardsubstanz wst wird in Prozent nach Gleichung (1) berechnet.

wst =

V1 ⋅ 8,81⋅100 m

(1)

Dabei ist: V1

das Volumen der Iodlösung, in Milliliter;

m

die Masse der eingesetzten Standardsubstanz, in Milligramm;

8,81

der Umrechnungsfaktor;

100

der Umrechnungsfaktor für das Ergebnis in Prozent.

4.5

Standardlösungen

4.5.1

Ascorbinsäure-Standardlösungen, ρ(C6H8O6) = 5 µg/ml bis 50 µg/ml

0,5 ml bis 5 ml Ascorbinsäure-Stammlösung (4.4.1) werden in einen 100-ml-Messkolben pipettiert, und die Kolben werden mit Metaphosphorsäure (4.2.8) bis zur Marke aufgefüllt. Diese Lösungen werden an jedem Analysentag frisch hergestellt. 4.5.2

Isoascorbinsäure-Standardlösung (wahlweise), ρ(C6H8O6) ≈ 10 µg/ml

1 ml Isoascorbinsäure-Stammlösung (4.4.2) wird in einen 100-ml-Messkolben pipettiert, und der Kolben wird mit Metaphosphorsäure (4.2.8) bis zur Marke aufgefüllt. Die Standardlösung sollte eine Massenkonzentration von 5 µg/ml bis 20 µg/ml Isoascorbinsäure enthalten. Diese Lösung wird an jedem Analysentag frisch hergestellt.

5

Geräte

5.1

Allgemeines

Die üblichen Laborgeräte, Laborglasgeräte und Folgende:

5.2

UV-Spektralphotometer

Geeignet zur Messung der Extinktion bei vorgegebenen Wellenlängen.

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5.3

Hochleistungsflüssigchromatograph

HPLC-System, bestehend aus einer Pumpe, einer Probeninjektionsvorrichtung, einem auf 265 nm eingestelltem Ultraviolett-(UV)-Detektor, und mit einem Auswertesystem, wie z. B. einen Datenintegrator.

5.4 5.4.1

HPLC-Säule Allgemeines

Es dürfen auch andere Teilchengrößen oder Säulenmaße verwendet werden als die, die in der vorliegenden Europäischen Norm festgelegt sind. Die Trennparameter müssen an derartige Materialien angepasst sein, damit vergleichbare Ergebnisse sichergestellt sind. Das Leistungskriterium für geeignete analytische Säulen ist die Basislinienauftrennung von L-Ascorbinsäure und Isoascorbinsäure [3]. 5