Fluoreszenzspektroskopische Charakterisierung der Transportfunktion von P-Glykoprotein
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von Andrea Netter
aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
27. Juli 2007
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Carola Kryschi
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Ulrich Nickel
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................... 3
VERWENDETE ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE........................................ 6
1 EINLEITUNG........................................................................................................ 8 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
Problemstellung und Zielsetzung .......................................................................... 9 Aufbau der Zellmembran..................................................................................... 10 Der Membrantransport ........................................................................................ 11 Das P-Glykoprotein ............................................................................................. 12 Arzneimittelforschung ......................................................................................... 15 Fluoreszenzspektroskopie.................................................................................... 16
2 MATERIAL UND METHODEN....................................................................... 21 2.1 Permanente Zellkultur ......................................................................................... 21 2.1.1 Caco-2 Zelllinie .................................................................................................. 21 2.1.2 Steriles Arbeiten ................................................................................................. 22 2.1.3 Zellkultivierung .................................................................................................. 22 2.1.4 Kryoservierung ................................................................................................... 23 2.1.5 Zellzählung ......................................................................................................... 23 2.1.6 Trypanblaufärbung ............................................................................................. 24 2.1.7 Thiazolylblaufärbung.......................................................................................... 25 2.2 Vorbereitung der Experimente, TEER-Wertbestimmung ................................... 26 2.3 Spektroskopische Messungen.............................................................................. 28 2.3.1 UV/Vis-Absorptionsmessungen ......................................................................... 28 2.3.2 Fluoreszenzspektroskopische Messungen .......................................................... 29 2.3.2.1 Fluoreszenzspektroskopische Messungen des Transports........................... 29 2.3.2.2 Fluoreszenzspektroskopische Messungen bei in-situ Experimenten........... 30 2.4 Immuncytochemie ............................................................................................... 30 2.5 Verwendete Geräte .............................................................................................. 31
3 ERGEBNISSE...................................................................................................... 32 3.1 3.2 3.3
Immuncytochemie mit Caco-2 Zellen ................................................................. 32 Messung des transepithelialen Widerstandes ...................................................... 33 Zellproliferation................................................................................................... 34
3
3.4 Puffertest.............................................................................................................. 35 3.5 Experimente mit Sulforhodamin B-Natriumsalz................................................. 37 3.5.1 Farbstofftoxizität von Sulforhodamin B-Natriumsalz ohne und mit Inhibitor... 38 3.5.2 Absorptionsspektrum von Sulforhodamin B-Natriumsalz ................................. 41 3.5.3 Transportmessungen mit Sulforhodamin B-Natriumsalz ................................... 42 3.5.3.1 Transportmessung ohne Inhibition .............................................................. 42 3.5.3.2 Transportmessung mit dem Inhibitor PSC-833 ........................................... 44 3.5.4 CLSM-Transportbeobachtung von Sulforhodamin B-Natriumsalz ................... 45 3.6 Experimente mit Rhodamin 123................................................................................ 52 3.6.1 Farbstofftoxizität von Rhodamin 123 ohne und mit Inhibitor............................ 52 3.6.2 Absorptionsspektum von Rhodamin 123 ........................................................... 54 3.6.3 Transportmessungen mit Rhodamin 123............................................................ 54 3.6.3.1 Transportmessung ohne Inhibition .............................................................. 55 3.6.3.2 Transportmessung mit dem Inhibitor PSC-833 ........................................... 57 3.6.4 CLSM-Transportbeobachtung von Rhodamin 123 ............................................ 58 3.7 Experimente mit Rhodamin 6 G................................................................................ 64 3.7.1 Farbstofftoxizität von Rhodamin 6 G ohne und mit Inhibitor............................ 65 3.7.2 Absorptionsspektum von Rhodamin 6 G ........................................................... 67 3.7.3 Transportmessungen mit Rhodamin 6 G............................................................ 67 3.7.3.1 Transportmessung ohne Inhibition .............................................................. 68 3.7.3.2 Transportmessung mit Inhibitor PSC-833................................................... 70 3.7.4 CLSM-Transportbeobachtung von Rhodamin 6 G ............................................ 71 3.8 Bestimmung der scheinbaren Permeationskoeffizienten..................................... 78 3.9 Der Transporterproteindetektor ........................................................................... 81 3.9.1 Aufbau des Transporterproteindetektors ............................................................ 81 3.9.2 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion von Rhodamin 6 G.................. 85 3.9.2.1 In-situ Detektion von Rhodamin 6 G (Omnichrome-Laser) ....................... 85 3.9.2.2 Proliferationszeitabhängiger Rhodamin 6 G-Transport .............................. 94 3.9.2.3 Scheinbare Permeationskoeffizienten von Rhodamin 6 G .......................... 96 3.9.3 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion von Daunomycin..................... 99 3.9.3.1 Absorptionsspektrum von Daunomycin .................................................... 100 3.9.3.2 In-situ Detektion von Daunomycin (Omnichrome-Laser) ........................ 100 3.9.3.3 Proliferationszeitabhängiger Daunomycin-Transport ............................... 106 3.9.3.4 Scheinbare Permeationskoeffizienten von Daunomycin........................... 107 3.9.4 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion (Coherent Laser) ................... 109 3.9.4.1 In-situ Detektion von Daunomycin (Coherent-Laser)............................... 110 3.9.4.2 In-situ Detektion von Rhodamin 6 G (Coherent-Laser)............................ 112 3.9.4.3 In-situ Detektion von Rhodamin 123 (Coherent-Laser)............................ 114 3.9.4.4 Bestimmung der scheinbaren Permeationskoeffizienten........................... 115
4 ZUSAMMENFASSUNG................................................................................... 116 5 SUMMARY........................................................................................................ 118 6 AUSBLICK ........................................................................................................ 120
4
7 ANHANG ........................................................................................................... 121 7.1 7.2 7.3
Chemikalien....................................................................................................... 121 Lösungen ........................................................................................................... 121 Medien ............................................................................................................... 123
8 LITERATURVERZEICHNIS ......................................................................... 126
DANKSAGUNG ................................................................................................... 130
5
VERWENDETE ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE A
Absorption
Abb.
Abbildung
Abbn.
Abbildungen
ADP
Adenosindiphosphat
AMG
Arzneimittelgesetz
ATP
Adenosintriphosphat
c
Konzentration, Lichtgeschwindigkeit
c0
Anfangskonzentration
Caco-2
Tumorzelllinie, Colon Karzinom
CLSM
konfokales Fluoreszenzmikroskop
cm2
Quadratzentimeter
d
Schichtdicke
dl
Deziliter
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E
Energie
ε
molarer dekadischer Absorptionskoeffizient
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
Φ
Fluoreszenzquantenausbeute
FCS
fetales Kälberserum
G
Zentrifugalbeschleunigung
g
Gramm
Γ
Emissionsrate
h
Stunde, Plancksches Wirkungsquantum
HCl
Salzsäure
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethan Sulfonsäure
HOMO
höchstes, besetztes Atomorbital
I
Intensität des austretenden Lichtes
6
I0
Intensität des einfallenden Lichtes
IE
Internationale Einheiten [Stoffmenge/Zeit]
knr
Rate der strahlungslosen Übergänge zu S0
kDa
Kilodalton
l
Liter
LUMO
niedrigstes, unbesetztes Atomorbital
λ
Wellenlänge
M
molar
MDR
multidrug resistance
meq/l
milliequivalents per liter
mg
Milligramm
µg
Mikrogramm
min
Minuten
ml
Milliliter
µl
Mikroliter
mM
millimolar
mm
Millimeter
mm2
Quadratmillimeter
ms
Millisekunden
µM
mikromolar
MTT
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium Bromid
NA
Avogadrokonstante
ν
Frequenz
ῦ
Wellenzahl
ng
Nanogramm
nm
Nanometer
ns
Nanosekunden
Papp
scheinbarer Permeationskoeffizient
PBS
Phosphatpufferlösung
P-Gp
P-Glykoprotein
7
ps
Pikosekunden
PSC-833
Inhibitor Valspodar (Novartis)
Q
Quantenausbeute
R
Widerstand
s
Sekunden
SDS
Natriumdodecylsulfat
t
Zeit
τ
Lebensdauer
Tab.
Tabelle
TEER
transepithelialer Widerstand
U/min
Umdrehungen pro Minute
V
Volumen
v
Schwingungsquantenzahl
8
1 EINLEITUNG
1 EINLEITUNG 1.1 Problemstellung und Zielsetzung Der gerichtete Stofftransport spielt in vielfacher Hinsicht im lebenden Organismus eine bedeutende Rolle. Zum einen werden auf diese Weise Zellgleichgewichte aufrechterhalten, zum anderen der Arzneimitteltransport und die Ausscheidung gewährleistet. Bei Substanzen wie Cytostatika (Vinca-Alkaloide, Anthrazykline), HIVProteaseinhibitoren (Saquinavir, Ritronavir), Immunsuppressiva (Cyclosporin A), Calciumantagonisten (Verapamil) und Herzglykosiden (Digoxin) erfolgt der Transport über einen bestimmten, apikal lokalisierten Effluxtransporter, das P-Glykoprotein[1-8]. Dieser wird unter Anderem mittels radioaktiv markierter Substanzen untersucht[1,
4,
6,
9-21]
. Des Weiteren wurden mehrere Fluoreszenzfarbstoffe
eingesetzt, durch die der P-Gp-induzierte Transport unter verschiedenen Gesichtspunkten verifiziert wird[3, 5, 9, 16-20, 22-41]. In dieser Arbeit wurden mehrere Fluoreszenzfarbstoffe, die in ihrer Grundstruktur
ein
Rhodamingerüst
besitzen,
und
das
fluoreszierende
Chemotherapeutikum Daunomycin untersucht. Zuerst erfolgten die Tests analog zu den Untersuchungen mittels radioaktiv markierter Substanzen in 1 h-Intervallen und anschließend im neu etablierten in-situ System. Damit ist es möglich, die Zeitintervalle nahezu beliebig kurz zu wählen und ohne Störung des Systems eine vielfache Anzahl von Messwerten zu erhalten. Das
Ziel
dieser
Arbeit
bestand
darin,
die
Transportkinetik
von
fluoreszierenden Substraten über eine konfluente Zellmonolage kontinuierlich zu messen, so dass keine Probenentnahmen erforderlich sind und damit Volumenfehler vermieden
werden.
Das
dafür
entwickelte
Messgerät
basiert
auf
der
fluoreszenzspektroskopischen Detektion von geeignet ausgewählten Substraten, deren aktiver Transport von Membranproteinen vermittelt wird. Der Einsatz von fluoreszierenden Substraten anstelle von radioaktiv markierten Substraten, die konventionell
in
der
Arzneimittelforschung
9
zur
Charakterisierung
von
1 EINLEITUNG
Proteintransporterfunktionen verwendet werden, erspart aufwändige Maßnahmen im Rahmen der Strahlenschutzverordnung. Ein weiterer Vorteil der Methode sind die geringeren Kosten der meisten Fluoreszenzfarbstoffe im Vergleich zu radioaktiv markierten Substanzen.
1.2 Aufbau der Zellmembran Die Zelle ist durch eine doppelschichtige Zellmembran von der Umgebung separiert, die selektiv permeabel ist. Deshalb ist es möglich, in der Zelle ein konstantes inneres Milieu zu schaffen und zu erhalten. Die Zellmembran ist primär nur für Wasser, Ionen und hydrophile Stoffe undurchlässig. Um den Stoffwechsel der Zelle aufrecht zu erhalten, werden Nährstoffe (z.B. Glucose) durch die Zellmembran aufgenommen und die Stoffwechselprodukte werden ausgeschleust. Die Zellmembran muss bestimmte Transportsysteme enthalten, um ihrer biologischen Aufgabe gerecht zu werden[42].
Abb. 1: Modell einer Zellmembran[43].
Das Fluid-Mosaik-Modell in Abb. 1 zeigt den schematischen Aufbau einer Zellmembran. Amphiphatische Phospholipide und Steroide bilden eine Lipiddoppelschicht, wobei sich die unpolaren Bereiche der Lipide im Inneren der Doppelschicht gegenüberliegen, während ihre polaren Kopfgruppen nach außen
10
1 EINLEITUNG
gerichtet sind. In diese Lipiddoppelschicht sind in unregelmäßigen Abständen globuläre Proteine eingebettet. Sie werden durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Membranlipiden und hydrophoben Domänen festgehalten. Manche Proteine ragen auf einer der beiden Seiten aus der Membran heraus, einige erstrecken sich über ihre gesamte Dicke. Die Proteine sind nicht symmetrisch in der Doppelschicht ausgerichtet, wodurch eine funktionelle Asymmetrie erhalten wird. Die einzelnen Lipid- und Proteinuntereinheiten in der Membran bilden ein flüssiges Mosaik analog zur smektischen Phase von Flüssigkristallen. Das bedeutet, dass sie innerhalb der Membran Plätze tauschen können. Grund dafür sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen der Lipid- und Proteinmoleküle[43].
1.3 Der Membrantransport In Zellen, die einen gerichteten Transport ermöglichen, da sie eine apikale und basale Membran ausbilden, wie z.B. Darmzellen, existieren verschiedene Wege für den Substrattransport.
Abb. 2: Transportwege durch ein einschichtiges Epithel[44].
Wie in Abb. 2 dargestellt, wird zwischen parazellulärem und transzellulärem Weg unterschieden. Der parazelluläre Einstrom hydrophiler Substrate erfolgt durch passive Diffusion zwischen zwei benachbarten Zellen. Da die Zellen durch Tight Junctions verbunden sind, werden so nur kleine Moleküle transportiert.
11
1 EINLEITUNG
Der transzelluläre Transport kann über mehrere Wege erfolgen. Der als erstes dargestellte, intermembranale Transport ist nur bei hydrophoben Substanzen möglich. Der zweite Weg ist die Diffusion des Substrates durch die Zelle, die nur erfolgen kann, wenn das Substrat weder mit der Membran noch im Intrazellulärraum mit der Umgebung wechselwirkt. Im Falle der Transcytose dringt die Substanz in abgeschnürten Vesikeln durch die Zellschicht. Zuerst erfolgt die Endocytose, die mit der Eindiffusion des Substrates in eine abgeschnürte Vesikel verbunden ist. Das Substrat erreicht den Intrazellulärraum. Nachdem die Vesikel auf der gegenüberliegenden Seite mit der Zellmembran verschmolzen ist, wird das Substrat durch die Exozytose freigesetzt. Weiterhin kann der Transport durch die apikal oder basal lokalisierten In- oder Effluxtransporter erfolgen. Letzterer Transport kann gegen einen Konzentrationsgradienten gerichtet sein, wenn die dafür erforderliche Energie beispielsweise durch die Spaltung von ATP in ADP und Phosphat erhalten wird. Auf diese Weise werden aktiv Konzentrationsgefälle aufrechterhalten oder Toxine aus der Zelle herausgeschleust[45].
1.4 Das P-Glykoprotein Das Membranprotein P-Glykoprotein gehört zu den apikal lokalisierten Effluxtransportern und wird durch das auf dem langen Arm des Chromosoms 7 liegenden MDR 1-Gen codiert. Es schleust unter ATP-Verbrauch Xenobiotika aus der Zelle. Dadurch wird der Transport in absorptiver Richtung (apikal nach basal) gehemmt, und die Bioverfügbarkeit möglicher Wirkstoffe wird herabgesetzt. Das Phänomen der multidrug resistance tritt in Tumorzellen (z.B. Caco-2 Zellen) auf, in denen P-Gp überexprimiert ist. Wenn Chemotherapeutika P-Gp-Substrate sind, werden diese aus den Zellen herausgeschleust, bevor sie wirken können[2, 44, 46].
12
1 EINLEITUNG
Abb. 3: Transport von Zellgiften durch ein in der Membran sitzendes P-Gp.
P-Gp wird nicht nur in Tumorzellen exprimiert, sondern auch in gesunden Geweben mit Ausscheidungsfunktion, wie Leber, Niere und Darmmukosa, der BlutHirn-Schranke und in der Plazenta. P-Gp stellt einen Schutzmechanismus vor natürlich vorkommenden Toxinen dar, die mit der Nahrung aufgenommen werden[2]. Es scheint zudem am Hormontransport beteiligt zu sein, da es in den Nebennieren, im Uterus und der Plazenta exprimiert wird und Cortisol, Corticosteron und Aldosteron transportiert[44, 46]. P-Gp gehört zur Superfamilie der ABC–Transporterproteine. ABC bedeutet ATP–bindende Cassette und steht für eine 27 kDa schwere ATPase, die als identischer Bestandteil des Moleküls das gemeinsame Merkmal der gesamten Familie darstellt. Das 170 kDa schwere Membranprotein ist phosphoryliert sowie glykolysiert und besteht aus 1280 Aminosäuren. Es ist aus zwei homologen Hälften mit je sechs Transmembransegmenten und einer ATP–Bindungsstelle aufgebaut. Die beiden Hälften werden über ein flexibles Polypeptidbindeglied verbunden. Elektronenmikroskopische
Strukturanalysen
ergaben
einen
zylinderförmigen
Aufbau mit einem Durchmesser von 10 nm und einer Höhe von 8 nm. Mit einer mittleren Stärke der Lipidmembran von 4 nm ist das halbe Molekül in der Membran assoziiert. P-Gp hat eine zentrale Pore von etwa 5 nm Durchmesser und bildet eine wässrige Kammer in der Membran, die zur extrazellulären Seite geöffnet ist[46]. P-Gp hat ein sehr breites Substratspektrum. Daher existieren nur wenige Strukturmerkmale, die für alle Substrate zutreffen. Diese sind in der Regel organische Moleküle mit einem Gewicht von unter 200 Da bis fast 1900 Da. Die
13
1 EINLEITUNG
molekulare
Struktur
enthält
häufig
aromatische
Gruppen,
aber
auch
nichtaromatische lineare oder zirkuläre Substrate werden transportiert. Die meisten Moleküle sind ungeladen oder schwache Basen. Außerdem werden saure Substanzen (Methotrexat oder Phenytoin) transportiert. Die meisten sind relativ hydrophob und amphiphil. Fluoreszierende Verbindungen wie Sulforhodamin BNatriumsalz, Rhodamin 123, Rhodamin 6 G und Daunomycin agieren ebenfalls als Substrate. Die Substratbindestellen wurden an den Transmembrandomänen 5, 6, 11 und 12 lokalisiert. Der Transportmechanismus ist bisher unverstanden. Drei mögliche Mechanismen werden im Folgenden näher erläutert: das Porenmodell, der hydrophobe Staubsauger und das Flippasemodell[47].
Abb. 4: P-Gp 3 D Darstellung. Die Ziffern geben die unterschiedlichen Transportwege an: 1 Porenmodell, 2 Flip-Flop, 3 hydrophober Staubsauger.
Das Porenmodell bezieht sich auf die vorgeschlagene 3 D–Struktur, bei der eine wassergefüllte Pore erkennbar ist. Hier werden die Substrate direkt in den Extrazellulärraum transferiert. Das zweite Modell schlägt eine Flippaseaktivität des P-Gp vor. Beim Flippasemodell werden die Xenobiotika von der inneren zur äußeren Membranseite befördert. Da die meisten P-Gp Substrate positiv geladen sind, binden sie an die negativ geladenen Phospholipidkopfgruppen der Membran. Danach insertieren die Substrate zuerst in der inneren Hälfte der Zytoplasmamembran und werden anschließend durch das P-Gp in die äußere Hemimembran geklappt.
14
1 EINLEITUNG
Ein alternativer Mechanismus wird mittels des hydrophoben Staubsaugers erklärt. Es wurde vorgeschlagen, dass P-Gp seine Substrate aus der Zellmembran saugt. Charakteristisch für dieses Models ist, dass es den Transport der hydrophoben Substrate erklärt, die sich in der Membran anlagern und dann von den P-Gps wie von einem Staubsauger aus der Membran gesaugt werden können[47].
1.5 Arzneimittelforschung Sämtliche Arzneimittel, die vom Bundesgesundheitsamt zugelassen werden, sind durchschnittlich 15 Jahre auf ihre Wirksamkeit und Verträglichkeit getestet. Die Arzneimittelentwicklung erfolgt in mehreren Phasen. Am Anfang steht die Suche nach geeigneten Wirkstoffen und deren Toxikologie (Screening). In Laboratorien werden Substanzen unterschiedlicher Herkunft (d.h. aus Pflanzen, Bakterien und anderen natürlichen Quellen) geprüft, ob sie pharmakologisch wirksam sind. In der Praxis werden die Experimente in Zellkulturen oder in isolierten tierischen Organen durchgeführt. In der präklinischen Phase erfolgen erste Untersuchungen am Tier. Es wird beispielsweise getestet, wie der Körper den Wirkstoff metabolisiert oder die Substanz die Organfunktionen beeinflusst. Insbesondere interessieren die Toxizität und die teratogenen (erbgutschädigenden) oder mutagenen (erbgutverändernden) Eigenschaften eines zukünftigen Wirkstoffes. Die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen ermöglichen es, die Wirkung auf den Menschen und das Risiko hinsichtlich der Erstanwendung beim Menschen einzuschätzen. Die rechtlichen Grundlagen für die präklinischen Studien sind das Arzneimittelgesetz (AMG) und die Arzneimittelprüfrichtlinien. Anschließend folgt die klinische Phase, die in vier Abschnitte unterteilt ist. In Phase I wird der Wirkstoff erstmals beim gesunden Menschen angewendet und auf seine Unbedenklichkeit und Verträglichkeit getestet. Dafür wird die Dosis sukzessive gesteigert und dabei beobachtet, inwiefern sich Sicherheitsparameter wie Blutdruck, Herz- und Atemfrequenz und die Körpertemperatur ändern. Zusätzlich werden Krankheitssymptome oder Unfälle dokumentiert, um später zu überprüfen,
15
1 EINLEITUNG
ob ein kausaler Zusammenhang zwischen dem Symptom bzw. Unfall und dem Wirkstoff besteht. Weiterhin wird die Pharmakokinetik untersucht. Sie beschreibt, wie der Körper den Wirkstoff umsetzt und liefert damit Angaben zur Aufnahme des Wirkstoffes, seiner Verteilung im Körper, des Abbaus und der Ausscheidung. In der ersten Phase ist die Zahl der Studienteilnehmer mit weniger als 100 klein. In der zweiten Phase wird der Wirkstoff erstmalig (bis zu 1000) erkrankten Personen verabreicht. Dabei wird überprüft, wie sich der neue Wirkstoff auf den kranken Mensch im Vergleich zum gesunden Menschen auswirkt. Die Zahl der Versuchspersonen wird mit bis zu 1000 klein gehalten, um ein mögliches Risiko zu minimieren. Nach Abschluss der Phase II und erneuter Nutzen-Risiko-Abwägung wird mit Phase III begonnen. Diese dient dazu, die Wirksamkeit des Medikaments statistisch zu bewerten und die Sicherheit zu überprüfen. Dafür werden klinische Untersuchungen an mehreren 1000 Patienten durchgeführt. Nach Beendigung der Phase III wird ein Bericht, das Zulassungsdossier, erstellt, in dem die Erkenntnisse über die neue Substanz zusammengefasst sind. Dieser Bericht dient dem Bundesgesundheitsamt als Grundlage für die Entscheidung, das Arzneimittel für den Markt zuzulassen. Im Anschluss an die Zulassung folgt die Phase IV, in der weitere Informationen zur Sicherheit, aber auch für die Wirksamkeit erarbeitet werden.
1.6 Fluoreszenzspektroskopie Lumineszenz ist die Emission von Licht, die erfolgt, nachdem eine Substanz vom angeregten Zustand in den Grundzustand gelangt. Abhängig von der Art des angeregten Zustandes, wird die emittierte Strahlung in eine der zwei Kategorien eingeordnet: die Fluoreszenz und die Phosphoreszenz[48, 49]. Die Energie eines absorbierten Photons ist über die Gleichung definiert: E=h×ν =h×c/λ Die Beziehung zwischen der Wellenlänge λ und der Wellenzahl ῦ lautet: ῦ=ν/c=1/λ
16
1 EINLEITUNG
Aus diesen beiden Gleichungen ergibt sich der Zusammenhang zwischen der Wellenzahl und der Energie: E=h×c×ῦ Das Elektron besitzt im angeregten Singulettzustand den umgekehrten Spin im Vergleich zum Elektron im Grundzustand. Der Übergang ist Spin-erlaubt und erfolgt schnell, wobei ein Photon emittiert wird. Die Emissionsraten der Fluoreszenz liegen im Bereich von 108 s-1. Daraus ergeben sich typische Fluoreszenzlebensdauern im Bereich von ns bis ps, die der durchschnittlichen Zeit zwischen der Anregung und der Rückkehr in den Grundzustand entsprechen. Bei der Phosphoreszenz erfolgt der Übergang in den elektronischen Grundzustand S0 auf einer Zeitskala von 103 s-1 bis 100 s-1, da das Elektron im Triplettzustand die gleiche Orientierung wie das Elektron im Grundzustand hat, und dieser Übergang deshalb Spin-verboten ist.
Abb. 5: Jablonski-Termschema[48].
Der Singulett-Grundzustand, erster und zweiter angeregter Zustand werden mit S0, S1 und S2 beschrieben. Da das Jablonski-Termschema eine stark vereinfachte Darstellung der elektronischen Zustände und der Schwingungszustände ist, wird nur für jeden elektronischen Zustand eine Schwingung mit ihren Obertönen (v = 0, 1, 2) berücksichtigt. Weiterhin vernachlässigt diese Darstellung Prozesse wie beispielsweise Elektronentransfer und Löschen sowie Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel. Die Übergänge zwischen den einzelnen Zuständen werden durch 17
1 EINLEITUNG
vertikale Linien dargestellt, die die Art der Lichtabsorption veranschaulichen. Diese erfolgt in einem Zeitfenster von 10-15 s. Da die Kernbewegungen drei Größenordnungen langsamer sind, ändert sich die Kernkonfiguration während des elektronischen Überganges nicht. Dieses Phänomen wird Franck-Condon-Prinzip genannt. Licht wird nur von Molekülen, die sich im elektronischen Grundzustand S0 befinden, absorbiert. Da die Energiedifferenz zwischen dem S0- und S1-Zustand zu groß für eine thermische Anregung ist, kann dieser Übergang nur nach Lichtabsorption stattfinden. Moleküle in höher angeregten Schwingungszuständen relaxieren in den Schwingungsgrundzustand von S1. Dieser Prozess wird Schwingungsrelaxation genannt, der auf einer Zeitskala von 10-12 s bis 10-14 s erfolgt. Der strahlungslose Übergang vom S1- in den S0-Zustand oder dem S2- in den S1-Zustand
ist die innere
Konversion, die
mit der
Abgabe
von
Schwingungsquanten an die Umgebung verbunden ist. Die innere Konversion vom S1- zum S0-Zustand ist ein direkter Konkurrenzprozess zur Fluoreszenz und kann Zeitkonstanten zwischen 10-12 s bis 10-8 s haben. Die Fluoreszenz erfolgt auf derselben Zeitskala und ist eine spontane Emission, die mit der strahlenden Deaktivierung des S1-Zustandes assoziiert ist.
Abb. 6: Darstellung eines Absorptions- und Fluoreszenzspektrums mit den entsprechenden Elektronenübergängen[48].
Absorptions- und Fluoreszenzspektren können spiegelsymmetrisch sein. Diese Symmetrie tritt auf, wenn die elektronische Anregung die Kerngeometrie
18
1 EINLEITUNG
kaum beeinflusst, und die Energiedifferenz zwischen den Schwingungsniveaus im S1-Zustand denen des S0-Zustandes entspricht. Folglich ist die Schwingungsstruktur im Absorptions- und Fluoreszenzspektrum identisch. Charakteristisch für das Fluoreszenzspektrum ist die Stokes-Verschiebung der emittierten Strahlung im Vergleich zum Absorptionsspektrum (s. Abb. 6). S1-angeregte Moleküle, die eine Spinumkehr erfahren, erreichen den ersten Triplettzustand T1. Die Emission aus diesem Zustand in den Grundzustand wird Phosphoreszenz genannt und ist im Vergleich zur Fluoreszenz bathochrom verschoben, was eine geringere Energiedifferenz widerspiegelt. Der strahlungslose isoenergetische Übergang von S1- nach T1-Zustand heisst Intersystem Crossing. Da der Übergang vom T1-Zustand zum Singulettzustand Spin-verboten ist, ist die Phosphoreszenzlebensdauer
mehrere
Größenordnungen
größer
als
die
Fluoreszenzlebensdauer. Moleküle, die schwerere Atome als Kohlenstoff enthalten, zeigen eine höhere Übergangswahrscheinlichkeit für das Intersystem Crossing. Dieser sogenannte Schweratomeffekt verstärkt die Spin-Bahn-Kopplung. Fluoreszierende Substanzen sind meist aromatische Moleküle. Zu ihnen gehören Coumarine, die als fluoreszierende Marker in Enzymassays verwendet werden, so wie auch Fluorescein- und Rhodamin-Farbstoffe, um eine Auswahl aus den am häufigsten verwendeten Substanzen zu nennen. Sie besitzen ein ausgedehntes π-Elektronen-System. In fluoreszenzspektroskopischen Messungen wird die Fluoreszenzintensität gegen die Wellenlänge oder die Wellenzahl aufgetragen. Ein Fluorophor wird durch die Fluoreszenzlebensdauer und die Fluoreszenzquantenausbeute charakterisiert. Die Quantenausbeute wird aus der Zahl der emittierten Photonen relativ zur Zahl der absorbierten Photonen berechnet. Die Lebensdauer grenzt den Zeitrahmen ein, in dem das Fluorophor mit der Umgebung wechselwirken kann.
19
1 EINLEITUNG
Abb. 7: Vereinfachtes Jablonski-Diagramm[48].
In diesem vereinfachten Jablonski-Diagramm werden vor allem die Prozesse, die für die Rückkehr in den Grundzustand S0 verantwortlich sind, veranschaulicht. Die Vorgänge, die zur Relaxation in den Schwingungsgrundzustand von S1 führen, werden nicht dargestellt. Γ ist die Emissionsrate des fluoreszierenden Moleküls und knr bezeichnet die Rate des strahlungslosen Übergangs zu S0. Die Vorgänge, die über Γ und knr definiert werden, führen dazu, dass das Elektron aus dem LUMO in das HOMO gelangt. Der Bruchteil der fluoreszierenden Moleküle, die durch Emission von Photonen in den S0-Zustand übergehen, und damit die Quantenausbeute ergeben, wird durch folgende Gleichung beschrieben: Q = Γ/ (Γ + knr) Die Lebensdauer τ des in dem Diagramm gezeigten Moleküls ist τ = 1 / (Γ + knr) Wenige Moleküle emittieren die Photonen exakt bei t = τ, wobei die Lebensdauer der Mittelwert der Zeit ist, die die Moleküle im angeregten Zustand verbringen.
20
2 MATERIAL UND METHODEN
2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Permanente Zellkultur 2.1.1 Caco-2 Zelllinie Die in dieser Arbeit verwendete Zelllinie wurde aus dem Colonkarzinom eines 72jährigen Kaukasiers gewonnen. Es sind adhärente Epithelzellen, die auf geeigneten Oberflächen eine konfluente Monolage bilden. Ihre Verdopplungszeit beträgt etwa 80 h. Nach dem Passagieren lagern sich die Zellen innerhalb weniger Stunden an, was mikroskopisch verfolgt werden kann. So ist erkennbar, wie die Zellen mehr und mehr ihre kugelige Form verlieren, wenn sie adhärieren.
Abb. 8: adhärente Caco-2 Zellen.
Die Größe von Caco-2 Zellen wird mittels Neubauerzählkammer über mikroskopische Aufnahmen bestimmt. Im mittleren Bereich der Zählkammer befinden sich Quadrate mit einer Seitenlänge von 40 µm. Durch Ausmessen der verschiedenen Zellen ergibt sich im Mittel eine Zellgröße von 18,1 µm.
21
2 MATERIAL UND METHODEN
Abb. 9: Caco-2 Zellen in der Neubauerzählkammer.
2.1.2 Steriles Arbeiten Wenn mit Zellen gearbeitet wird, muss vollständige Keimfreiheit gewährleistet sein[50]. Alle Geräte, Materialien und die Werkbank werden sterilisiert, was entweder durch Autoklavieren oder durch Reinigung mit 70%iger Ethanollösung bzw. mit Spitacid erfolgt. In der Werkbank wird zusätzlich nach jedem
Arbeitsgang
die
Arbeitsfläche
mit
UV-Licht
bestrahlt.
Alle
Verbrauchsmaterialien (z.B. Pipetten) werden steril geliefert.
2.1.3 Zellkultivierung Die Zellen werden vor Beginn mikroskopisch auf Kontaminationen, die z.B. durch Bakterien erfolgen können, untersucht. Zuerst wird das vorhandene Zuchtmedium von der Zellkultur abgesaugt. Zur Entfernung des restlichen Mediums werden die Zellen mit PBS gewaschen. Um die Zellen von der Oberfläche abzulösen, werden sie mit Trypsin/EDTA-Lösung 10 min im Brutschrank inkubiert, wodurch
der
Ablösungsprozess
beschleunigt
wird.
Die
Wirkung
der
Trypsin/EDTA-Lösung wird aufgehoben, indem nach der Inkubation im Brutschrank auf die Zellen Medium zugegeben wird. Die Zellsuspension wird aus der Zellkulturflasche in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt. Diese werden mit einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 189 G (1000 U/min) 10 min bei 22°C zentrifugiert. Danach wird das überstehende Gemisch aus Medium und Trypsin/EDTA-Lösung vom Pellett abgesaugt. Bevor die Zellen ausgesät werden,
22
2 MATERIAL UND METHODEN
wird die Zellzahl mit der Neubauerzählkammer bestimmt. Dann werden die Zellen in frischem Zuchtmedium resuspendiert und in neue Zellkulturflaschen gesät.
2.1.4 Kryoservierung Die Behandlung der Zellen vor dem Einfrieren erfolgt analog zum im vorangegangenen Abschnitt beschriebenen Zellkultivierung. Im Gegensatz dazu werden die Zellen jedoch nicht in Zellkulturmedium, sondern in einem speziellen Einfriermedium, das DMSO enthält, resuspendiert und in Gefrierröhrchen gefüllt. Der Einfriervorgang der Zellsuspension erfolgt bis zu einer Temperatur von –80°C schrittweise
im
Isopropanoltank,
um
die
durch
die
Kristallisation
des
Lösungsmittels verursachte Membranschädigung zu minimieren. Danach werden die Gefrierröhrchen in einen Tank mit flüssigem Stickstoff überführt, in dem sie langfristig gelagert werden können.
2.1.5 Zellzählung Die Zellzahl wird mit einer Neubauerzählkammer bestimmt.
Abb. 10: Neubauerzählkammer modifiziert nach[51].
In der Neubauerzählkammer befinden sich zwei quadratische Vertiefungen mit einer Tiefe von 0,100 mm. Jede Vertiefung beinhaltet ein Zählnetz mit neun Großquadraten. Jedes Großquadrat besitzt eine Fläche von 1,000 mm2. Die jeweils
23
2 MATERIAL UND METHODEN
in den Ecken des Zählnetzes liegenden Großquadrate sind wiederum in 16 Quadrate unterteilt. Die Kantenlänge dieser Quadrate beträgt 0,250 mm. Zur Ermittlung der Zellzahl werden 4 Großquadrate ausgezählt und die Werte gemittelt. Die Gesamtzellzahl errechnet sich nach folgender Formel: Gesamtzellzahl = ml (Zellsuspension) × Mittelwert × 10.000
2.1.6 Trypanblaufärbung Zur Untersuchung der Zellvitalität wird der Farbstoff Trypanblau eingesetzt, der selektiv nur tote Zellen anfärbt. Grund dafür ist die beschädigte Zellmembran, die der Farbstoff ungehindert passieren kann. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der sich in seiner anionischen Form sehr leicht an Proteine binden kann. Daher ist die Farbstoffaufnahme stark vom pH-Wert der Lösung abhängig. Die maximale Aufnahme findet bei einem pH-Wert von 7,5 statt. Außerdem sind die Färbezeit, die Temperatur sowie die Farbstoffkonzentration stets konstant zu halten, da der Farbstoff selbst cytotoxisch ist und eine Variation der Konzentration die Vergleichbarkeit der Ergebnisse einschränken würde. Bei diesem Test soll möglichst ohne Serumzusatz im Medium gearbeitet werden, da sich die Anzahl der gefärbten Zellen mit zunehmender Serumkonzentration deutlich vermindert, und damit eine nicht vorhandene Zellvitalität vorgetäuscht wird. In der Untersuchung werden gleiche Volumina der Trypanblaulösung und der Zellsuspension vermischt und mit der Neubauerzählkammer ausgezählt. Die blauen und schwach blau gefärbten Zellen werden bei der Zahl der toten Zellen berücksichtigt[50]. Den Prozentsatz an lebenden Zellen errechnet man wie folgt:
%lebendeZellen =
ungefärbteZellen × 100 ungefärbte + gefärbteZellen
24
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1.7 Thiazolylblaufärbung 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium Bromid (MTT) wird zur Aktivitätsmessung der mitochondrialen Dehydrogenase lebender Zellen verwendet. Unabhängig davon, ob die Zellen momentan DNA synthetisieren oder nicht, wird in lebenden Zellen das gelbe MTT zum blauen MTT-Formazan umgewandelt. So kann durch die Farbtiefe zum Einen auf die Zellzahl, zum Anderen auf die Vitalität der Zellen geschlossen werden. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zur Färbung mittels Trypanblau besteht darin, dass hier Zellen, deren Membran intakt ist, die aber keinen Stoffwechsel mehr besitzen, nicht fälschlicherweise zu den vitalen Zellen gerechnet werden können[50]. Für diese Methode werden die Zellen, die in eine 96-Wellplatte eingesät wurden und bereits eine konfluente Monolage gebildet haben, mit 50 µl MTT versetzt. Danach erfolgt eine einstündige Inkubation im Brutschrank. Dabei diffundiert
das
schwach
gelbe
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-
tetrazolium Bromid (MTT) in den Intrazellulärraum. Sein Tetrazoliumring wird durch die Dehydrogenasen der Mitochondrien aufgebrochen, und es entsteht das blaue MTT-Formazan.
N N N
N S
H N
N
N N
CH3
S
N
CH3 N
H3C CH3
MTT
MTT-Formazan
Abb. 11: MTT-Verstoffwechselung.
Die Zellen werden, nachdem die auf ihre Toxizität zu untersuchende Farbstofflösung abgesaugt wurde, durch mehrfaches Waschen mit Pufferlösungen
25
2 MATERIAL UND METHODEN
von Rückständen der Lösungen und dem restlichen, nicht umgewandelten MTT befreit. Damit soll verhindert werden, dass Farbstoffe, die im gleichen Spektralbereich wie das MTT-Formazan absorbieren, das Ergebnis verfälschen. Im nächsten Schritt werden die Zellmembranen nach der Zugabe von 125 µl SDS lysiert. Somit wird das in der Zelle durch die Stoffwechselaktivität der mitochondrialen Dehydrogenase gebildete blaue MTT-Formazan freigesetzt. Die Absorption der Formazanlösung wird mittels Elisa Reader photometrisch bestimmt, der eine beliebige Wellplatte computergesteuert vermessen kann. Die Absorption der Formazanlösung wird bei 570 nm detektiert. Je geringer die Toxizität der zu untersuchenden Lösung war, um so geringer ist die Differenz der gemessenen Absorptionen zwischen den Vergleichswells, in denen nur Zellkulturmedium oder Puffer zugesetzt wurde, und der Probe, die eine bestimmte Konzentration der zu untersuchenden Substanz enthält. Für diese Untersuchungen werden mindestens drei Wells gleich behandelt, um Auswirkungen der Fehler, die während der Experimente entstehen können, durch Mittelung möglichst klein zu halten.
2.2 Vorbereitung der Experimente, TEER-Wertbestimmung Zur Vorbereitung der Transportmessungen werden die Zellen auf eine Polycarbonatmembran gesät. Dafür werden sterile Transwellplatten der Firma Corning verwendet, deren Wachstumsfläche 1 cm2 pro Well beträgt.
Abb. 12: Transwell-System. Links: schematischer Aufbau eines einzelnen Wells, rechts: handelsübliche Systeme auf der Basis normierter Mikroplatten.
26
2 MATERIAL UND METHODEN
Apikal wird 500 µl Suspension gegeben, die ca. 200.000 Zellen enthält. Basal werden 1500 µl Medium zugegeben. Die Platte wird 10 Tage im Brutschrank kultiviert. Währenddessen adhärieren die Zellen und bilden eine konfluente Monolage aus. Um ein gleichmäßiges Zellwachstum zu ermöglichen, wird das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag gewechselt. Zur Überwachung der Zellproliferation wird jeden zweiten bis dritten Tag der transepitheliale Widerstand mit der Millicell-ERS-Elektrode gemessen. Wenn der Widerstand im Vergleich zu einem Well, in dem keine Zellen eingesät wurden, um mindestens 200 Ω höher liegt, wird von einer konfluenten Zellmonolage ausgegangen. Bei Caco-2 Zellen muss der Gesamtwiderstand 300 Ω überschreiten, damit das der Fall ist[10, 17, 20, 38, 52-54]. Der Widerstand wird mit der Millicell-ERS-Elektrode gemessen, die vor Beginn der Messungen jeweils 15 min in 70%igem Alkohol sterilisiert und danach in
Zellzuchtmedium
equilibriert
wird,
während
sich
die
zu
messende
Transwellplatte in der Reinraumwerkbank auf Raumtemperatur abkühlt.
Abb. 13: Messanordnung zur Bestimmung des transepithelialen elektrischen Widerstands im Transwell-System.
Nach der Widerstandsmessung wurde das Zellkulturmedium von den Wells abgesaugt und Krebs–Ringer–Puffer B 2 zugegeben, um das Zellkulturmedium vollständig zu entfernen.
27
2 MATERIAL UND METHODEN
Für die Experimente aus Kap. 3.5.3, 3.6.3 und 3.7.3 wurden nach dem vorher erstellten Plan je 800 µl des Krebs–Ringer–Puffers oder des in diesem Puffer gelösten Fluoreszenzfarbstoffes auf der apikalen oder basalen Seite zugegeben. Die 20 µl Proben für die Fluoreszenzdetektion wurden nach den festgelegten Zeitintervallen jeweils auf der gegenüberliegenden Seite entnommen. Bei apikaler Farbstoffzugabe erfolgte die Probenentnahme basal. Wurde die Farbstoff-PufferLösung basal zugegeben, so wurden die Proben apikal entnommen. Für die in Kap. 3.9.2.1, Kap. 3.9.3.2, Kap. 3.9.4.1, Kap. 3.9.4.2 und Kap. 3.9.4.3
beschriebenen
Messungen
erfolgte
die
Vorbereitung
der
Caco-2
Zellmonolagen anolog zu den vorher erwähnten Experimenten. Die Messungen für die fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detekionen werden gesondert diskutiert, da sie Bestandteil der während dieser Dissertation durchgeführten Entwicklung des Transporterproteindetektors sind.
2.3 Spektroskopische Messungen
2.3.1 UV/Vis-Absorptionsmessungen Zur Bestimmung der Absorption von Farbstofflösungen wurde die zu untersuchende Farbstofflösung in eine Quarzküvette pipettiert. Die Aufnahme der Spektren erfolgte mit dem UV/Vis-Absorptionsspektrometer (Perkin Elmer, Lambda 2) bei Raumtemperatur. Dabei wurde die Absorption der Lösung gegen die Wellenlänge aufgetragen. Die Absorption A lässt sich mit der folgenden Formel berechnen[49]: A = log10
I0 = ε ×c×d I
Im Lambert-Beerschen Gesetzt ist I0 die Intensität des in das Medium einfallenden Lichtes und I die Intensität des aus ihm austretenden Lichtes. ε steht für den molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten. Die molare Konzentration wird mit c benannt. d symbolisiert die durchstrahlte Schichtdicke.
28
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3.2 Fluoreszenzspektroskopische Messungen Im Gegensatz zu den häufig durchgeführten Experimenten mit radioaktiv markierten Substanzen, erfolgte bei den eingesetzten Substraten die Erfassung der P-Gp-Aktivität
und
des
daraus
resultierenden
Farbstofftransports
fluoreszenzspektroskopisch. Dafür wurde erst ein Absorptionsspektrum des zu untersuchenden Farbstoffes gemessen. Für Fluoreszenzmessungen, die zur Konzentrationsbestimmung durchgeführt wurden, wurde die Probe im Bereich des Absorptionsmaximums angeregt und das Fluoreszenzspektrum wurde detektiert. Durch Integration der erhaltenen Spektren wurde die Fluoreszenzintensität der einzelnen Proben bestimmt. Durch den Vergleich mit der Fluoreszenzintensität der Ausgangslösung wurde der prozentuale Substrattransport ermittelt.
2.3.2.1 Fluoreszenzspektroskopische Messungen des Transports Zur Fluoreszenzbestimmung wurden ca. 10 µl der Probe in eine spezielle, für dieses
Volumen
geeignete
Küvette
(Starna,
16.10-F
Q)
pipettiert.
Die
Fluoreszenzspektren wurden bei Raumtemperatur mit dem Fluorospektrometer (Jobin Yvon, FluoroMax-P) aufgenommen. Danach erfolgte die mehrfache Reinigung der Küvette mit destilliertem Wasser und reinem Ethanol. Die Fluoreszenzmessung wurde mit Polarisatoren durchgeführt, die in einem Winkel von 55° (magischer Winkel) zueinander stehen. Dadurch wurde die Fluoreszenzintensität erhöht und sowohl senkrecht- als auch parallelpolarisierte Fluoreszenzstrahlung detektiert. In Abhängigkeit vom Farbstoff wird die Probe mit Licht der geeigneten Wellenlänge angeregt, und das Fluoreszenzspektrum wird aufgenommen. Die Einstellung der Spaltbreiten für die Anregungs- und Emissionsstrahlung richtet sich nach der Fluoreszenzintensität des jeweiligen Farbstoffs.
29
2 MATERIAL UND METHODEN
2.3.2.2 Fluoreszenzspektroskopische Messungen bei in-situ Experimenten Die Messanordnung für den Transporterproteindetektor wird in Kap. 3.9 und Kap. 3.9.1 detailliert beschrieben, da die Entwicklung und die Optimierung dieses Systems ein wichtiger Teil der vorliegenden Arbeit sind. Die Fluoreszenzfarbstoffe in der Lösung werden direkt mit einem Laser geeigneter Wellenlänge angeregt, ohne dass es erforderlich ist, das System durch die Entnahme einzelner Proben zu stören. Dadurch können die Messwerte in einer ms-Zeitskala aufgenommen werden, was die zeitliche Auflösung der Messung der Farbstofftransportdynamik entsprechend erhöht.
2.4 Immuncytochemie Zuerst wurden die Caco-2 Zellen auf Transwellmembranen gesät. Sobald eine konfluente Monolage gebildet war, wurde die Färbung durchgeführt werden. Dafür wurden die Zellen im ersten Schritt mit -20°C kaltem Methanol 2-5 min fixiert. Danach erfolgte die Rehydrierung und und das dreimalige, 10 min Waschen mit PBS. Im Anschluss wurden die primären Antikörper (Sigma, Monoclonal AntiP Glycoprotein (MDR-1), Clone F4, Isotype: Mouse IGG1, Mouse Ascites Fluid) auf die konfluenten Monolagen gegeben und diese 45 bis 60 min inkubiert. Dann wurden die Zellen durch Absaugen der primären Antikörperlösung und erneutes, dreimaliges, 10 min Waschen mit PBS auf den nächsten Schritt vorbereitet, in dem die sekundären Antikörper (dianova, CyTM2-conjugated AffiniPure Goat AntiMouseIgG (H+L) (minimal cross-reaction to Human, Bovine, Horse, Rabbit and Swine Serum Proteins)) in PBS zugegeben wurden. Nach 45 bis 60 min Inkubation wurde wieder analog zu den bereits beschriebenen Arbeitsschritten dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die konfluente Zelllage mit destilliertem Wasser getränkt und ca. eine Stunde getrocknet. Zur mikroskopischen Untersuchung wurden die Transwellmembranen auf Objektträger gebracht, Moviol aufgetragen und mit Deckgläsern versehen. Zur Abdichtung und Fixierung der Proben wurde ein
30
2 MATERIAL UND METHODEN
wasserfester Lack aufgetragen. Die eigentliche Messung erfolgte mittels konfokaler Fluoreszenzspektroskopie.
2.5 Verwendete Geräte Brutschrank Brutschrank Wasserbad Zentrifuge Inverses Mikroskop Reinraumwerkbank UV/Vis-Spektrometer Fluorometer Elisa Reader Laser (λ = 514 nm) Laser (λ = 488 nm) Laser (λ = 488 nm) In-situ-Spektrometer Widerstandsmessung Laserintensitätsmessung Fluoreszenzmikroskop
Heraeus Binder, CB 150 Julabo, SW-20C Heraeus, Omnifuge 2.0 RS Hund, Wilovert S Clean Air, NSF 49 BS 5726 Perkin Elmer, Lambda 2 Jobin Yvon, FluoroMax-P Dynatech Laboratories, Dias Omnichrome, 532 Omnichrome, 643 Coherent, Sapphire 488-100 CDRH Ocean Optics, Fiber Optic Spectrometer USB 2000 Millipore, Millicell-ERS Voltcraft Plus, Digital Multimeter VC-920 Zeiss, CLSM
Tab. 1: Übersicht der verwendeten Geräte.
31
3 ERGEBNISSE
3 ERGEBNISSE 3.1 Immuncytochemie mit Caco-2 Zellen Das
in
der
Zellmembran
lokalisierte
P-Gp
wurde
mit
einem
Fluoreszenzfarbstoff markiert[10, 54]. Dieser wurde an einen sekundären Antikörper gekoppelt, der mit dem vorher auf den P-Gps fixierten primären Antikörper in bindende Wechselwirkungen trat. Die Farbstoff-Fluoreszenz im konfokalen Fluoreszenzmikroskop wurde bei λ = 488 nm angeregt und die mikroskopischen Messungen mit 40-facher Vergrößerung durchgeführt.
Abb. 14: Detektion der Fluoreszenz von markierten P-Gps in Caco-2 Zellen.
Abb. 14 zeigt die grüne Fluoreszenz der sekundären Antikörper, die, wie bereits beschrieben, an das P-Gp gebunden wurden. Dadurch ist die Zellstruktur der Caco-2 Monolage ersichtlich, die auf einer Polycarbonatmembran gebildet wurde. Im Intrazellulärraum wurde keine Fluoreszenz detektiert, da die P-Gps nur in der Zellmembran lokalisiert sind. Über die Quantität der exprimierten Transportproteine
32
3 ERGEBNISSE
kann aufgrund dieser Messmethode jedoch keine Aussage getroffen werden, da keine Kalibrierung möglich ist.
3.2 Messung des transepithelialen Widerstandes Der transepitheliale Widerstand von Caco-2 Zellmonolagen wurde in Abhängigkeit von der Proliferationszeit gemessen. Dafür wurden Caco-2 Zellen auf Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 0,4 µM gesät und täglich der
Widerstand [Ω ]
Widerstand mittels Millicell-ERS detektiert. 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 0
2
4
6
8
10
12
t [Tage]
Abb. 15: Transepithelialer Widerstand gegen die Zeit aufgetragen. Schwarz: Well ohne Zellen, rot: Grenzwert (∆ R = 200 Ω), grün: 50.000 Zellen/Well, blau: 100.000 Zellen/Well, cyan-farben: 200.000 Zellen/Well, magenta-farben: 300.000 Zellen/Well.
Der transepitheliale Widerstand gibt Information darüber, wie viele Zellen pro Well in den Experimenten eingesät werden, und zu welchem Zeitpunkt von einer für die Transportversuche erforderlichen Zellmonolage ausgegangen werden kann. Die in Abb. 15 gezeigten Messergebnisse sind als Widerstand über die Zellschicht gegen die Zeit aufgetragen. Diese zeitabhängigen Widerstandswerte geben die dargestellte Proliferationskurve wieder. Wurden 50.000 Zellen pro Well (grüne Kurve) eingesät, so erhöhte sich der gemessene Widerstand erst nach dem 6. Tag. In dem hier genutzten Zeitraum wurde 33
3 ERGEBNISSE
kein Grenzwert erreicht. Demnach bildete sich keine für die Versuche geeignete Zellmonolage aus. Wenn 100.000 Zellen pro Well (blaue Kurve) eingesät wurden, nahm der Widerstand nach dem 4. Tag zu. Nach dem 8. Tag nähert er sich einem Maximalwert an. Ähnlich verhielten sich die Kurvenverläufe für 200.000 Zellen pro Well (cyan-farbene Kurve) und 300.000 Zellen pro Well (magenta-farbene Kurve). Hier stieg der Widerstand bereits nach dem zweiten Tag an und erreichte nach dem 9. Tag einen Maximalwert. Da der Maximalwert der magenta-farbenen Kurve unter dem der cyan-farbenen Kurve lag, wurde für die folgenden Transportmessungen die Anfangszellzahl von 200.000 Zellen pro Well festgelegt. Mit dieser Zellzahl kann innerhalb von 10 Tagen eine stabile, konfluente Zellmonolage generiert werden. Folglich wurde diese Zellzahl für die Transportmessungen eingesät.
3.3 Zellproliferation Im folgenden Diagramm ist die Proliferationskurve der Caco-2 Zelllinie dargestellt. Dafür wurden in einer 96-Wellplatte 10.000 Zellen pro Well eingesät und eine 8-fach-Bestimmung durchgeführt. Die Zellproliferation wurde durch die MTT-Verstoffwechselung in einem Zeitraum von 12 Tagen überwacht. Die Verstoffwechselung besteht darin, dass der gelbe MTT-Farbstoff durch die mitochondriale Dehydrogenase zum blauen MTT-Formazan metabolisiert wird. Mit steigender Zellzahl (Proliferation) pro Well nimmt die MTT-Verstoffwechselung und damit die Konzentration des gebildeten blauen MTT-Formazan-Farbstoffes zu. Die Absorption im gelben Spektralbereich steigt direkt zur Konzentration an. Die relative Konzentrationszunahme des blauen MTT-Formazan-Farbstoffes wird UV/Vis-Absorptionsspektroskopisch mit dem Elisa Reader bei 570 nm gemessen. Für die Probenpräparation werden die Zellen nach der Inkubation und der Entfernung der verbliebenen MTT-Lösung mit SDS/HCl-Lösung lysiert, wobei Formazan freigesetzt wird.
34
3 ERGEBNISSE
0,7
Absorption
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
2
4
6
8
10
12
t [Tage]
Abb. 16: Proliferationskurve der Caco-2 Zelllinie. Rot: idealisierter Kurvenverlauf, schwarz: gemittelte Messwerte.
In Abb. 16 sind in schwarz die gemessenen Werte und in rot die idealisierte Zellproliferation[50] dargestellt. Die beobachteten Abweichungen werden damit erklärt, dass während der Durchführung des Experiments nicht jedes Well 100%ig gleichbehandelt werden konnte, und keine beliebige Zahl von Messwerten zur Verfügung stand. In der stationären Phase (Tag 0 bis 3) wuchsen die Zellen nur langsam, da sie zunächst auf der Polycarbonatmembran adhärieren was mit einem Anpassungsvorgang an die veränderte Umgebung verbunden ist. In der darauf folgenden Phase vermehren sich die Zellen exponentiell (Tag 4 bis 7). Ab dem 8. Tag wurde ein Plateauwert erreicht. Dieser Wert ist von der Größe der Wachstumsoberfläche pro Well und der Zelllinie abhängig, da sich hier eine konfluente Monolage gebildet hat, und die Zellzahl deshalb nicht weiter zunehmen konnte.
3.4 Puffertest In Abb. 17 ist die Zellvitalität in verschiedenen Lösungen, die mittels MTTVerstoffwechselung gemessen wurde, dargestellt. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, da Zellkulturmedien Aminosäuren enthalten, die im sichtbaren
35
3 ERGEBNISSE
Bereich absorbieren und fluoreszieren und so die Fluoreszenzmessungen verfälschen
würden.
Damit
konnte
das
Zellkulturmedium
nicht
für
fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen eingesetzt werden. Verschiedene Krebs-Ringer-Pufferlösungen wurden hergestellt, und ihre Zellverträglichkeit in einem Zeitrahmen von 24 h geprüft.
0,25
Absorption
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
24
25
t [h]
Abb. 17: Zellvitalität in Zellkulturmedium und verschiedenen Pufferlösungen. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: CBFHH-Puffer, blau: B 1-Puffer, cyan-farben: B 2-Puffer.
Aus Abb. 17 ist ersichtlich, dass die Zellvitalität in der Reihenfolge Medium–B2–CBFHH–B1 abnimmt, wobei der Puffer B 2 im Zeitraum von bis zu vier Stunden die geringste Toxizität zeigte und deshalb nachfolgend wie auch CBFHH genauer untersucht wurde. Nach 24 h ist der Grenzwert für diese Messungen erreicht, wie die Abnahme der zur Stoffwechselaktivität proportionalen Absorption zeigt. Da die Versuche in einem Zeitraum von maximal fünf Stunden durchgeführt werden sollen, wurden im Folgenden in diesem Zeitfenster Medium mit den Pufferlösungen B 2 und CBFHH verglichen (s. Abb. 18).
36
3 ERGEBNISSE
0,18 0,16
Absorption
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 1
2
3
4
5
6
7
t [h]
Abb. 18: Zellvitalität in Zellkulturmedium und verschiedenen Pufferlösungen. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: CBFHH-Puffer, blau: B 2-Puffer.
An Abb. 18 wird deutlich, dass die Zellen in dem Puffer B 2, ausgenommen ist der 5 h-Wert, eine höhere Vitalität besitzen als in der CBFHH-Pufferlösung. Die Vermutung aus dem ersten Puffertest (s. Abb. 17), dass B 2 der geeigneteste Puffer ist, wird durch diese Ergebnisse bestätigt. Daher wurde der Puffer B 2 in allen Transportmessungen eingesetzt.
3.5 Experimente mit Sulforhodamin B-Natriumsalz Sulforhodamin B-Natriumsalz ist ein Farbstoff, der das Grundgerüst der Rhodamin-Farbstoffe besitzt. Der Farbstoff ist wasserlöslich und kann dadurch gut in Pufferlösungen, wie sie in den Experimenten verwendet werden, eingesetzt werden.
37
3 ERGEBNISSE
SO3Na
SO3
Et
N
O
Et
Et
N Et
Abb. 19: Strukturformel von Sulforhodamin B-Natriumsalz.
Abb. 19 zeigt die Strukturformel von Sulforhodamin B-Natriumsalz. Das substituierte Rhodamin-Gerüst weist an der Diethylaminogruppe eine positive Ladung und an der Sulfonsäuregruppe eine negative Ladung auf.
3.5.1 Farbstofftoxizität von Sulforhodamin B-Natriumsalz ohne und mit Inhibitor Die Substanz PSC-833 wird verbreitet als P-Gp Inhibitor eingesetzt[3, 12, 14, 15, 23, 25, 29, 55-59]
.
Abb. 20: Struktur des P-Gp Inhibitors PSC-833.
38
3 ERGEBNISSE
In Abb. 20 ist der von Novartis entwickelte P-Gp Inhibitor PSC-833 dargestellt, der hier in sämtlichen Experimenten eingesetzt wurde. Diese Substanz wird der zweiten Generation von P-Gp Inhibitoren zugeordnet. Zur ersten Generation gehören z.B. Verapamil oder Cyclosporin A. Für diese Substanzen wurden jedoch zur P-Gp Inhibierung in menschlichem Gewebe hohe und dadurch toxisch wirkende Substanzkonzentationen benötigt, wodurch sie sich für weitere Anwendungen disqualifizierten. Zur dritten Generation der P-Gp Inhibitoren zählen Tariquidar und Zosuquidar. Tariquidar wurde in klinischen Studien mit Substraten wie z.B. Paclitaxel untersucht[60]. Für die hier durchgeführten Experimente wurde ausschließlich PSC-833 verwendet,
da
dieser
Inhibitor
als
nicht
fluoreszierende
Substanz
die
fluoreszenzspektroskopischen Detektionen nicht beeinflusst.
0,30
Absorption
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
24
25
t [h]
Abb. 21: Toxizitätsvergleich zwischen unterschiedlich konzentrierten Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösungen im Vergleich zum Zellkulturmedium. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: 1 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung, blau: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung, cyan-farben: 100 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung, magenta-farben: 1 mM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung. In Abb. 21 ist die optische Absorptionsänderung aufgrund der MTTVerstoffwechselung in Abhängigkeit von der Zeit und der Sulforhodamin B39
3 ERGEBNISSE
Natriumsalz-Konzentration dargestellt. Damit wird die toxische Wirkung des Farbstoffes auf die Caco-2 Zellen untersucht. Die gemessenen Absorptionswerte variieren nahezu unabhängig von der eingesetzten Konzentration und der An- bzw. Abwesenheit des Inhibitors innerhalb der ersten vier Stunden um maximal 0,02. In der Messung nach 24 h liegen die Absorptionswerte im Bereich von 0,24 bis 0,28. Das zeigt, dass die Zellproliferation sogar in Sulforhodamin B-Natriumsalz enthaltenden Lösungen erfolgt. Der Farbstoff bewirkte in den vorliegenden Konzentrationen keine Hemmung der
Absorption
mitochondrialen Dehydrogenase.
0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
5
22
23
24
t [h]
Abb. 22: Toxizitätsvergleich von 100 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösungen ohne und mit 1 µM Inhibitor PSC-833 mit B 2. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: 100 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung, blau: 100 µM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 22 ist der Vergleich von Puffer B 2 und 100 µM Suforhodamin BNatriumsalz-Lösungen ohne und mit 1 µM Inhibitor PSC-833 in einem Zeitintervall von 1 h bis 23 h dargestellt. Aus Abb. 21 wurde der Schluss gezogen, dass Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösungen unabhängig von ihrer Konzentration keine
40
3 ERGEBNISSE
Toxizität besitzen. Daraufhin wurde überprüft, ob das auf Lösungen übertragbar ist, denen zusätzlich der Inhibitor PSC-833 in einer Konzentration von 1 µM zugesetzt wird. Die Absorption befand sich unabhängig von der Gegenwart des Inhibitors, in der Größenordnung der Zellabsorption ohne Farbstoff.
3.5.2 Absorptionsspektrum von Sulforhodamin B-Natriumsalz
1.0
Absorption
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 500
600
700
Wellenlänge [nm]
Abb. 23: Absorptionsspektrum einer 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung im Puffer B 2.
Abb. 23 zeigt das gemessene Absorptionsspektrum von Sulforhodamin BNatriumsalz im Puffer B 2. Der Farbstoff absorbiert im sichtbaren Bereich von 480 nm bis 600 nm. Die gewählte Anregungswellenlänge für Fluoreszenzspektren lag bei 530 nm. So war es möglich, das vollständige Fluoreszenzspektrum aufzunehmen. Würde in der Nähe des Absorptionsmaximums angeregt, so müsste aufgrund der Überlappung mit dem Fluoreszenzspektrum die Auswertung auf die langwellige Flanke des Fluoreszenzspektrums beschränkt werden. Das würde zu größeren Ungenauigkeiten in der Bestimmung der Fluoreszenzintensität führen.
41
3 ERGEBNISSE
Die Fluoreszenzspektren des Sulforhodamin B-Natriumsalzes wurden mit Polarisatoren (0°/55°) im Bereich von 550 nm bis 800 nm aufgenommen. Die gewählten Spaltbreiten wurden sowohl für die Anregung als auch für die Detektion auf 10 nm eingestellt.
3.5.3 Transportmessungen mit Sulforhodamin B-Natriumsalz Die Transportexperimente wurden vergleichbar mit den, in der Literatur beschriebenen, Forschungsarbeiten durchgeführt[1,
11]
. Anstelle der radioaktiv
markierten Substanzen wurde der fluoreszierende Farbstoff Sulforhodamin BNatriumsalz eingesetzt. Ferner wurden die Transportexperimente in B 2-Puffer durchgeführt. Ein Ziel dieser Transportmessungen war, die Substrat-Eigenschaften von Sulforhodamin B-Natriumsalz für P-Gp zu charakterisieren. Insbesondere interessierte der Einfluss des Inhibitors PSC-833 auf die Transportkinetik von Sulforhodamin B-Natriumsalz.
3.5.3.1 Transportmessung ohne Inhibition Der von P-Gp vermittelte Transport einer 100 µM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung in B 2-Puffer wurde fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Dafür
wurde
in
einer
Wellplatte
eine
Dreifachbestimmung
der
Fluoreszenzintensitäten durchgeführt, die erhaltenen Werte gemittelt und gegen die Zeit aufgetragen. Die für dieses Experiment verwendeten Caco-2 Zellen wurden 10 Tage vor den Fluoreszenz-Messungen in die Transwellplatten eingesät und bildeten in diesem Zeitraum eine Monolage aus. Die Konfluenz der Monolage wurde unmittelbar vor der Durchführung der Experimente durch die Widerstandsmessung kontrolliert.
42
Transport [%]
3 ERGEBNISSE
24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
t [h]
Abb. 24: Prozentualer Sulforhodamin B-Natriumsalz–Transport (c = 100 µM) mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
In Abb. 24 ist der prozentuale Transport von Sulforhodamin B-Natriumsalz gegen die Zeit aufgetragen. Die rote Kurve bezeichnet die Zunahme der apikal vorliegenden Farbstoffkonzentration. Der Transport von basal nach apikal erfolgte aktiv durch die in der apikalen Zellmembran lokalisierten P-Gps unter ATPVerbrauch. Nach einer Stunde wurden 3% der Farbstofflösung im apikalen Volumen detektiert. Vier Stunden nach der Zugabe der Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung stieg der Messwert für den apikalen Transport auf 23%. Die passive Diffusion des Farbstoffes von der apikalen zur basalen Zelloberfläche ist durch die schwarze Messung dargestellt. Sie liegt unterhalb der roten Kurve, da die Diffusion in beide Richtungen, der aktive Transport aber nur von basal nach apikal auftrat. Eine Stunde nach der Farbstoffzugabe wurden basal ca. 3% der Farbstofflösung nachgewiesen. Nach vier Stunden wurden für den Transport ins basale Volumen 16% gemessen. Hier wird deutlich, dass sich der apikal-nachbasale Transport asymptotisch einem Grenzwert nähert. Der grün dargestellte Nettotransport wurde aus der Differenz des basal-nach-apikalen- und des apikalnach-basalen-Transports berechnet. Offensichtlich liegen die Messwerte oberhalb von Null und erreichen nach vier Stunden einen Wert von 7%. Das legt den Schluss 43
3 ERGEBNISSE
nahe, dass Sulforhodamin B-Natriumsalz ein P-Gp Substrat ist. Um den Substratcharakter zu überprüfen, wurde im folgenden Experiment der etablierte PGp Inhibitor PSC-833 zugesetzt und dessen Auswirkung auf den Substrattransport detektiert.
Transport [%]
3.5.3.2 Transportmessung mit dem Inhibitor PSC-833 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 1
2
3
4
5
t [h]
Abb. 25: Prozentualer Sulforhodamin B-Natriumsalz–Transport (c = 100 µM) mit 1 µM PSC-833 mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
Abb. 25 zeigt den prozentualen Transport von Sulforhodamin B-Natriumsalz in Abhängigkeit von der Zeit. Der Farbcode wurde analog zur Abb. 24 verwendet. Die Werte des basal-nach-apikalen Transports sind nicht nur deutlich kleiner als die entsprechenden Werte für die Messung ohne PSC-833 (s. Abb. 24), sondern liegen auch unter den Transportwerten für die apikal-nach-basale Richtung. Grund dafür war der Zusatz des P-Gp Inhibitors, der den Durchtritt des Farbstoffes durch die Caco-2 Monolage kompetitiv hemmte. Deshalb werden nach einer Stunde 1% des Farbstoffes apikal detektiert und der Transportwert nach vier Stunden erreichte nur 8%. Der Transport, der durch passive Diffusion von der apikalen zur basalen Seite
44
3 ERGEBNISSE
erfolgte, betrug nach einer Stunde 8%. Nach vier Stunden stieg der gemessene Sulforhodamin B-Natriumsalz-Transport auf 19%. Der Nettotransport, der sich aus der Differenz des basal-nach-apikalen- und des apikal-nach-basalen-Transports ergibt, ist negativ und damit kleiner als der Nettotransport aus den Messungen ohne PSC-833. Mit diesem Ergebnis wird die Annahme, dass Sulforhodamin BNatriumsalz eine P-Gp Substrat ist, bestätigt.
3.5.4 CLSM-Transportbeobachtung von Sulforhodamin B-Natriumsalz In diesem Experiment wurde eine 10 µM Sulforhodamin B-NatriumsalzLösung in B 2 auf konfluente Zellmonolagen in einer Petrischale pipettiert. Der Transport von Sulforhodamin B-Natriumsalz in die Caco-2 Zellen wurde mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop bei einer Anregungswellenlänge von λ = 543 nm untersucht. Dafür wurden fluoreszenzspektroskopische Messungen in Gegenwart von
PSC-833
und
in
Abwesenheit
von
PSC-833
unter
verschiedenen
Zellumgebungsbedingungen gemessen. Der Vergleich zwischen den Fluoreszenzintensitätsverteilungen in den verschiedenen mikroskopischen Aufnahmen gab Aufschluss über den Transport von Sulforhodamin B-Natriumsalz.
Abb. 26 : 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 73 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
45
3 ERGEBNISSE
Abb. 26 zeigt die Fluoreszenzintensität einer 10 µM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 73 min nach Zugabe der Farbstofflösung. Die rot leuchtenden Punkte sind Caco-2 Zellen, in denen sich Sulforhodamin B-Natriumsalz stark anreicherte. Die typische Struktur, die durch das Adhärieren der Zellen erfolgt, ist nur schwach zu erkennen. Grund hierfür ist zum Einen die Fluoreszenzquantenausbeute von Sulforhodamin BNatriumsalz (Φ = 0,8), die kleiner ist als die Fluoreszenzquantenausbeuten von Rhodamin 123 (Φ = 0,9) oder Rhodamin 6 G (Φ = 0,98). Zum Anderen erreicht der Nettotransport von Sulforhodamin B-Natriumsalz, wie in Kap. 3.5.3.1 beschrieben, Werte bis maximal 7% (s. Abb. 24). Daher kann angenommen werden, dass nach 73 min
weniger
als
7%
der
Farbstofflösung
zur
intrazellulär
detektierten
Fluoreszenzintensität beitragen.
Abb. 27: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 73 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In Abb. 27 ist die rote Fluoreszenz einer 10 µM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 73 min nach Zugabe der Farbstofflösung dargestellt. Hier ist die Zellstruktur etwas besser zu erkennen, da sich im Vergleich zu Abb. 26 in einer
46
3 ERGEBNISSE
größeren Zellzahl der Farbstoff aufgrund der Inhibitorwirkung im Intrazellulärraum anreicherte. Der Vergleich zwischen Abb. 26 und Abb. 27 ergibt, dass die intrazelluläre Fluoreszenzintensität in Gegenwart von 1 µM PSC-833 größer ist. Der Inhibitor hemmt den Austritt des Farbstoffes aus den Caco-2 Zellen kompetitiv, so dass sich der
Farbstoff
im
Zellinneren
konzentriert,
was
zu
einer
höheren
Fluoreszenzintensität führt. Da sich für diese Aufnahmen die Farbstofflösung auf der Zellschicht befand, was die detektierte Fluoreszenzintensität vergrößern kann, wurde im Folgenden die Farbstofflösung entfernt und erneut die Fluoreszenz detektiert.
Abb. 28: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco2 Zellmonolage 3 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung (CLSM-Aufnahme 76 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Abb. 28 zeigt die Fluoreszenzintensität einer 10 µM Sulforhodamin BNatriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 3 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung. Diese Aufnahme erfolgte 76 min, nachdem die Farbstofflösung zugegeben wurde. Die Gesamtfluoreszenzintensität ist kleiner als in Abb. 26, da nur noch im Intrazellulärraum vorliegendes Sulforhodamin BNatriumsalz zur Fluoreszenz beitrug.
47
3 ERGEBNISSE
Abb. 29: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 2 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, (CLSM-Aufnahme min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In
Abb.
29
ist
die
mikroskopisch
aufgenommene
Fluoreszenz-
intensitätsverteilung einer 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 2 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung abgebildet. Diese Aufnahme erfolgte 75 min, nachdem die Farbstofflösung zugegeben wurde. Im Vergleich zu den Abb. 26 und Abb. 27 nahm die beobachtete Fluoreszenzintesität in Abb. 28 und Abb. 29 ab. Zum Einen ist das damit zu begründen, dass die Farbstofflösung entfernt wurde, zum Anderen, dass die Fluoreszenz 2 min bzw. 3 min danach gemessen wurde. Während dieser Zeiten wurde ein Teil des im Intrazellulärraum vorliegenden Farbstoffes von P-Gp aus der Zelle geschleust.
48
3 ERGEBNISSE
Abb. 30: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco2 Zellmonolage 8 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 81 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
8 min nach der Entfernung der Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung war, wie in Abb. 30 dargestellt, eine weitere Fluoreszenzabnahme zu erkennen. Da der Konzentrationsgradient zwischen dem Zellinneren und der Umgebung durch den Farbstoffausstrom kompensiert wurde, lag nun eine geringere Menge des Fluoreszenzfarbstoffes im Intrazellulärraum vor.
Abb. 31: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 7 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 80 min nach Zugabe der Farbstofflösung). 49
3 ERGEBNISSE
Im Vergleich zu Abb. 28 und Abb. 29 hat die Fluoreszenz in Abb. 30 und Abb. 31 deutlich abgenommen. Durch die Zugabe von 1 ml B 2-Pufferlösung in die Petrischalen wird der Konzentrationsgradient zwischen Intra- und Extrazellulärraum vergrößert und dadurch strömte mehr Sulforhodamin B-Natriumsalz aus der Caco-2 Zellmonolage. Bei diesen Aufnahmen, die 8 min bzw. 7 min nach der Entfernung der Farbstofflösung durchgeführt wurden, ist nicht eindeutig festzustellen, ob durch die Zugabe von 1 µM PSC-833 der Farbstoffausstrom verringert wurde. Der Einfluss des Inhibitors auf die Fluoreszenzintensität wird in später durchgeführten Messungen überprüft.
Abb. 32: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung auf einer konfluenten Caco2 Zellmonolage 37 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 110 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Die Fluoreszenzintensität nahm 37 min nach der Entfernung der Sulforhodamin
B-Natriumsalz-Lösung
weiterhin
ab
(s.
Abb.
32).
Diese
Beobachtung kann durch den kontinuierlichen Farbstoffausstrom aus dem Intrazellulärraum begründet werden.
50
3 ERGEBNISSE
Abb. 33: 10 µM Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage, 21 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 94 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Der Vergleich zwischen den Abbn. 32 und 33 zeigt, dass die Fluoreszenzintensität in der Caco-2 Zellmonolage, die mit PSC-833 versetzt wurde, zugenommen hat. Offensichtlich wirkt der Inhibitor selbst nach der Entfernung der die
Zellen
umgebenden
Farbstofflösung
dem
Farbstoffausstrom
in
den
Extrazellulärraum entgegen. Die Ergebnisse aus der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie bestätigen, dass Sulforhodamin B-Natriumsalz ein Substrat von P-Gp in Caco-2 Zellen ist und als solches in Abhängigkeit von PSC-833 aus den Caco-2 Zellen geschleust wird. Die Aussagen sind aber im Vergleich zu den vorher vorgestellten Ergebnissen aus den Transportexperimenten von Kap. 3.5.3 qualitativ zu sehen, da hier keine Normierung der Messwerte möglich ist.
51
3 ERGEBNISSE
3.6 Experimente mit Rhodamin 123 Ein weiterer untersuchter Fluoreszenzfarbstoff ist Rhodamin 123, der eine höhere Fluoreszenzquantenausbeute (Φ = 0,9) als Sulforhodamin B-Natriumsalz (Φ = 0,8) aufweist. Damit konnte mit kleineren Farbstoff-Konzentrationen, die den physiologisch eingesetzten Konzentrationen besser entsprechen gearbeitet werden. Dieser Farbstoff enthält denselben Chromophor wie Sulforhodamin B-Natriumsalz und ist als Substrat bekannt[3,
5, 9, 16-20, 22, 24-30, 32, 34-41]
, was in den folgenden
Experimenten verifiziert wurde.
O OCh3
Cl
H2N
O
NH2
Abb. 34: Strukturformel von Rhodamin 123.
Abb. 34 zeigt die Strukturformel von Rhodamin 123. Das Rhodamin-Gerüst weist an der Aminogruppe eine positive Ladung auf. Als Gegenion fungiert das Chlorid-Anion.
3.6.1 Farbstofftoxizität von Rhodamin 123 ohne und mit Inhibitor Analog zu den mit Sulforhodamin B-Natriumsalz durchgeführten Puffer- und Toxizitätstests wird im Folgenden die Toxizität von Rhodamin 123 untersucht. Dafür werden verschiedene Konzentrationen des Rhodamin 123-Farbstoffes auf die Caco-2 Zellen gegeben. Der zugegebende Vitalitätsmarker MTT wird in den Caco-2 Zellen von der mitochondrialen Dehydrogenase zum MTT-Formazan umgewandelt. Folglich ist die Cytotoxizität von Rhodamin 123 proportional zur optischen Absorptionsänderung, die durch das MTT-Formazan hervorgerufen wird. 52
3 ERGEBNISSE
0,35 0,30
Absorption
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
24
25
t [h]
Abb. 35: Toxizitätsvergleich zwischen unterschiedlich konzentrierten Rhodamin 123-Lösungen im Vergleich zum Zellkulturmedium. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: Zellkulturmedium mit 1 µM PSC-833, blau: 5 µM Rhodamin 123-Lösung, cyan-farben: 5 µM Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833, magenta-farben: 0,1 µM Rhodamin 123-Lösung, grün: Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833.
Die Untersuchungen zur Toxizität von Rhodamin 123 wurden in einem Zeitfenster von 0 bis 24 h durchgeführt. Wie Abb. 35 zeigt, ist die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase, die mittels MTT-Umwandlung bestimmt wird, in reinem Zellkulturmedium am größten (schwarze Säule). Die Aktivität (rote Säule) nimmt innerhalb von vier Stunden in Anwesenheit des Inhibitors PSC-833 (1 µM) ab. 2 h nach der Zugabe der 0,1 µM Farbstofflösung mit 1 µM PSC-833 nahm die Absorption vom MTT-Formazan im Vergleich zur Lösung ohne Inhibitor zu. Da jedoch in den nachfolgenden Experimenten immer über mindestens drei Messwerte gemittelt wurde, ist dieser Unterschied nicht von Bedeutung. In dem beobachteten Zeitfenster wurde nur eine geringe Toxizität festgestellt, was die Untersuchung des Transports von Rhodamin 123 durch Caco-2 Monolagen in Konzentrationen von 0,1 µM bis 5 µM rechtfertigt.
53
3 ERGEBNISSE
3.6.2 Absorptionsspektum von Rhodamin 123 0,8 0,7
Absorption
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 400
500
600
Wellenlänge [nm]
Abb. 36: Absorptionsspektrum einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung im Puffer B 2.
Rhodamin 123 absorbiert im Spektralbereich von 425 nm bis 540 nm (s. Abb. 36). Die Fluoreszenz des Farbstoffes wurde für die Transportmessungen bei 460 nm angeregt. Die Fluoreszenzintensität wurde durch die Integration der Fluoreszenzspektren bestimmt. Die Fluoreszenzspektren von Rhodamin 123 wurden mit Polarisatoren (0°/55°) von 480 nm bis 700 nm detektiert. Die gewählten Spaltbreiten wurden sowohl für die Anregung als auch für die Detektion auf 9 nm eingestellt.
3.6.3 Transportmessungen mit Rhodamin 123 Die Transportexperimente mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Rhodamin 123
wurden analog zu den in Kap. 3.5.3 zitierten Forschungsarbeiten durchgeführt. Anstelle der radioaktiv markierten Substanzen wurde der fluoreszierende Farbstoff Rhodamin 123 eingesetzt. Ein Ziel dieser Transportmessungen war, die SubstratEigenschaften von Rhodamin 123 für P-Gp in Caco-2 Zellen zu charakterisieren. Insbesondere interessierte der Einfluss des Inhibitors PSC-833 auf die Transportkinetik von Rhodamin 123. 54
3 ERGEBNISSE
3.6.3.1 Transportmessung ohne Inhibition Der von P-Gp vermittelte Transport einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung im Puffer B 2 wurde fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die Dreifachbestimmung der Fluoreszenzintensitäten wurde in einer Wellplatte durchgeführt, die erhaltenen Werte
gemittelt
und
gegen
die
Zeit
aufgetragen.
Die
für
diese
Fluoreszenzmessungen verwendeten Caco-2 Zellen wurden 10 Tage vor der Durchführung der Experimente in die Transwellplatten eingesät und bilden in diesem Zeitraum eine konfluente Monolage aus. Die Konfluenz der Caco-2 Monozelllage
wurde
unmittelbar
vor
den
Experimenten
durch
die
Widerstandsmessung kontrolliert. 45 40 Transport [%]
35 30 25 20 15 10 5 1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
t [h]
Abb. 37: Prozentualer Rhodamin 123–Transport (c = 10 µM) mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
In Abb. 37 ist der prozentuale Transport einer Rhodamin 123-Lösung gegen die Zeit aufgetragen. Die rote Kurve beschreibt die Zunahme der apikalen Farbstoffkonzentration, die nach einer Stunde 15% erreicht hat und nach vier Stunden bis auf 45% ansteigt. Der Transport von basal nach apikal erfolgte aktiv durch die in der apikalen Zellmembran lokalisierten P-Gps unter ATP-Verbrauch. Der apikal-nach-basale Transport ist die passive Diffusion des Farbstoffes (schwarze Kurve). Diese Messkurve liegt unter der des basal-nach-apikalen 55
3 ERGEBNISSE
Transports mit 5% bis 25%. Die grün dargestellte Kurve für den Nettotransport wurde aus der Differenz des basal-nach-apikalen- und des apikal-nach-basalenTransports berechnet. Der hier beobachtete Nettotransport lag mit ca. 10% deutlich über dem Nettotransport von Sulforhodamin B-Natriumsalz. Das wird damit erklärt, dass Rhodamin 123 aufgrund seiner elektrisch positiv geladenen Struktur ein besseres P-Gp Substrat darstellt. Rhodamin 123 besteht aus einem positiv geladenen Rhodamin-Grundgerüst, das mit einem Chlorid-Anion ein Salz bildet. Da die Phospholipidkopfgruppen der Zellmembran negativ geladen sind, wird die Diffusion dieses Farbstoffs zur Zellmembran durch elektrostatische Wechselwirkungen begünstigt. Diese Vorstellung wurde bereits mit dem Flippasemodell beschrieben. Außerdem wird Rhodamin 123 in Konzentrationen, die um eine Größenordnung kleiner sind als die des Sulforhodamin BNatriumsalzes, in den Transportmessungen eingesetzt. Da nur eine bestimmte Molekülzahl pro Zeiteinheit durch die P-Gps transportiert werden kann, ist dieses Verhältnis für eine kleine Substratkonzentration relativ dazu größer, was zu einem höheren Nettotransport im Falle von Rhodamin 123 führt.
56
3 ERGEBNISSE
Transport [%]
3.6.3.2 Transportmessung mit dem Inhibitor PSC-833 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 1
2
3
4
5
t [h]
Abb. 38: Prozentualer Rhodamin 123–Transport (c = 10 µM) mit 1 µM PSC-833 mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
In Abb. 38 ist der prozentuale Transport von Rhodamin 123 gegen die Zeit dargestellt. Der Farbcode wurde analog zur Abb. 37 verwendet. Hier lagen, wie beim inhibierten Transport von Sulforhodamin B-Natriumsalz, die Transportwerte für den basal-nach-apikalen Transport unter denen des apikal-nach-basalen Transports. Von basal nach apikal wurden nur noch 10% bis 20% der vorhandenen Farbstoffmoleküle transportiert, somit 25% weniger Moleküle als ohne Zusatz von 1µM PSC-833. Für die Diffusion von apikal nach basal wurden Transportwerte von 10% bis 45% gemessen, was eine Zunahme im Vergleich zum nicht inhibierten Transport von bis zu 15% bedeutete. Der gemessene Nettotransport, der aus der Differenz des basal-nach-apikalen- und des apikal-nach-basalen-Transports berechnet wurde, liegt beim 1 h-Wert um 0% und nimmt im Laufe des Experiments auf -25% ab. Grund dafür ist der Zusatz des P-Gp Inhibitors, der den Durchtritt des Farbstoffes kompetitiv hemmte.
57
3 ERGEBNISSE
Die Beobachtung, dass sich der apikal-nach-basale Substrattransport mit Inhibitorzusatz verändert, wurde auch bei anderen in der Literatur beschriebenen Substraten bzw. Inhibitoren gefunden[10, 12, 13]. Die in Abb. 37 und Abb. 38 dargestellten Ergebnisse sind nicht direkt mit vorangegangen Forschungsarbeiten vergleichbar, da der Rhodamin 123-Transport mittels Durchflusscytometrie bestimmt wurde[24,
28]
oder die Probenvolumina von
den hier eingesetzten abwichen[23].
3.6.4 CLSM-Transportbeobachtung von Rhodamin 123 In diesem Experiment wurde eine 10 µM Rhodamin 123-Lösung im B 2Puffer auf konfluente Caco-2 Zellmonolagen, die in Petrischalen gebildet wurden, gegeben. Der
Transport
von
Rhodamin
123
wurde
mit
dem
konfokalen
Fluoreszenzmikroskop mit einer Anregungswellenlänge von λ = 488 nm untersucht. Dafür erfolgten fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen in Abwesenheit von PSC833 und in Gegenwart von PSC-833 unter verschiedenen Zellumgebungsbedingungen. Durch den Vergleich der Fluoreszenzintensitätsverteilungen in den verschiedenen mikroskopischen Aufnahmen wurde der bevorzugte Transport von Rhodamin 123 in Caco-2 Zellen festgestellt. Die Experimente, für die Caco-2 Zellmonolagen mit Rhodamin 123 inkubiert, gewaschen und dann mittels CLSM abgebildet wurden, wurden in einer Forschungsarbeit erwähnt[36]. Im Gegensatz dazu wurde in den folgenden Abbildungen der zeitliche Verlauf während der Variation der Umgebungsbedingungen detektiert. So wurde im nachfolgenden Experiment beobachtet, wie der Farbstoff in Abhängigkeit von der Zeit und der die Zellen umgebenden Lösung aufgenommen wurde bzw. aus den Zellen geschleust wurde.
58
3 ERGEBNISSE
Abb. 39: 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 104 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In Abb. 39 ist die Fluoreszenz einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage dargestellt, die 104 min nach Zugabe der Farbstofflösung aufgenommen wurde. Die Struktur der adhärierten Zellen ist deutlich zu erkennen, da der Farbstoff im Intrazellulärraum akkumuliert.
Abb. 40: 10 µM Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 89 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
59
3 ERGEBNISSE
Abb. 40 zeigt die Fluoreszenz einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung, die 1 µM PSC-833 enthält, auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 89 min nach Zugabe der Farbstofflösung. Hier war die Zellstruktur vergleichbar gut zu erkennen. In diesen Aufnahmen trat kein signifikanter Unterschied der Fluoreszenzintensität zwischen dem Experiment ohne (s. Abb. 39) bzw. mit PSC-833 (s. Abb. 40) auf. Da sich die Farbstofflösung auf der Zellschicht befand, was die detektierte Fluoreszenzintensität vergrößern kann, wurde für die folgenden Aufnahmen die Farbstofflösung entfernt und danach erneut die Fluoreszenz detektiert.
Abb. 41: 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 2 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung (CLSM-Aufnahme 106 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Abb. 41 zeigt die Fluoreszenz einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage. Diese Aufnahme erfolgte 2 min nach der Entfernung der Farbstofflösung. Im Vergleich zu Abb. 39 nahm die Fluoreszenz deutlich ab. Der Grund dafür war, dass durch die Entfernung der vorher extrazellulär vorliegenden Farbstofflösung der Konzentrationsgradienten zwischen dem Intra- und Extrazellulärraum durch den Farbstoffausstrom kompensiert wurde.
60
3 ERGEBNISSE
Abb. 42: 10 µM Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 4 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung (CLSMAufnahme 93 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In Abb. 42 ist die mikroskopische Fluoreszenzintensitätsverteilung 4 min nach der Entfernung der Inhibitor-Rhodamin-Lösung dargestellt. Die Zellstruktur ist nach wie vor gut erkennbar, da der Farbstoffausstrom durch die inhibierten P-Gps verzögert wurde und folglich eine hohe Rhodamin 123-Konzetration intrazellulär vorliegt.
Abb. 43: 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 7 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2Puffer (CLSM-Aufnahme 111 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
61
3 ERGEBNISSE
Die Fluoreszenzintensität, die in Abb. 43 detektiert wurde, ist mit der Fluoreszenzintensität aus Abb. 41 vergleichbar. Nachdem die Lösung entfernt wurde, stellte sich in der Inhibitor-freien Rhodamin 123-Lösung innerhalb weniger Minuten ein Gleichgewicht zwischen Intra- und Extrazellulärraum ein.
Abb. 44: 10 µM Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 8 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 97 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Im Gegensatz zum nicht inhibierten Transport (s. Abb. 41 und Abb. 43) nahm die Fluoreszenzintensität erst 8 min nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer stark ab. Da die Pufferlösung keinen Inhibitor enthielt, verringerte sich die absolute PSC-833 Konzentration, was den Ausstrom des Fluoreszenzfarbstoffs begünstigt. Dennoch ist nach wie vor die Struktur der Zellmonolage ausgebildet.
62
3 ERGEBNISSE
Abb. 45: 10 µM Rhodamin 123-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 68 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2Puffer (CLSM-Aufnahme 172 min nach Zugabe der Farbstofflösung). Die in Abb. 45 beobachtete Fluoreszenzintensität entsprach der in der Abb. 43 detektierten Fluoreszenzintensität. Das bestätigt die innerhalb weniger Minuten erfolgende Gleichgewichtseinstellung der Inhibitor-freien Rhodamin 123-Lösung zwischen Intra- und Extrazellulärraum.
Abb. 46: 10 µM Rhodamin 123-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 55 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 146 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
63
3 ERGEBNISSE
In Übereinstimmung mit dem in Abb. 44 dargestellten Ergebnis wird 146 min nach Beginn des Experiments (s. Abb. 46) keine Änderung der Fluoreszenzintensität festgestellt. Demnach erfolgte ebenso nach der Entfernung der FarbstoffInhibitor-Lösung die Gleichgewichtseinstellung zwischen dem Intra- und dem Extrazellulärraum
vergleichbar
mit
der
Gleichgewichtseinstellung
ohne
Inhibitorzusatz (s. Abbn. 43 und 45). Einziger Unterschied zwischen den Aufnahmen des inhibierten (s. Abb. 46) und nicht inhibierten (s. Abb. 45) Transports ist die kleinere Rhodamin 123-Konzentration im Zellinneren nach der Entfernung der Farbstofflösungen für den inhibierten Transport. Eine Erklärung dafür kann eine Strukturänderung der Transportproteine bzw. der Zellmembran sein, die in Gegenwart des Inhibitors nicht aufgetreten ist.
3.7 Experimente mit Rhodamin 6 G Ein weiterer untersuchter Fluoreszenzfarbstoff ist Rhodamin 6 G[5, 28, 32, 34]. Da dieser eine höhere Fluoreszenzquantenausbeute (Φ = 0,98) als Sulforhodamin BNatriumsalz
aufweist,
wurde
erwartet,
dass
hier
mit
kleineren
Farbstoffkonzentrationen reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden. Diese Farbstoffkonzentrationen entsprechen annähernd den physiologisch eingesetzten Konzentrationen. Wie im Rhodamin 123 liegt im Rhodamin 6 G der Chromophor als Kation vor. Ob er aufgrund dieser Eigenschaft ähnliche Transportwerte wie Rhodamin 123 besitzt, wurde im Folgenden untersucht. Ferner wurde überprüft, ob die positive Ladung des Substrates einen Einfluss auf den P-Gp vermittelten Transport besitzt und ob damit das Flippasemodell bestätigt wird.
64
3 ERGEBNISSE
COOEt H3C
CH3
EtHN
O
NHEt
Cl
Abb. 47: Strukturformel von Rhodamin 6 G.
Abb. 47 zeigt die Strukturformel von Rhodamin 6 G. Das Rhodamin-Gerüst weist eine positive Ladung auf. Als Gegenion fungiert das Chlorid-Anion.
3.7.1 Farbstofftoxizität von Rhodamin 6 G ohne und mit Inhibitor Analog zu den mit Sulforhodamin B-Natriumsalz und Rhodamin 123 durchgeführten Tests wurde im Folgenden die Toxizität von Rhodamin 6 G untersucht.
Dafür
wird
die
auf
die
Caco-2
Zellmonolagen
gegebene
Farbstoffkonzentration variiert und die optische Absorptionsänderung aufgrund der MTT-Verstoffwechselung in den Caco-2 Zellen gemessen.
65
3 ERGEBNISSE
0,30 0,25
Absorption
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0
1
2
3
4
5
22
23
24
t [h]
Abb. 48: Toxizitätsvergleich zwischen unterschiedlich konzentrierten Rhodamin 6 G-Lösungen im Vergleich zu Zellkulturmedium und B 2-Puffer. Schwarz: Zellkulturmedium, rot: B 2-Puffer, blau: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung, cyanfarben: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833, magenta-farben: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung, grün: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 48 wurde die Toxizität verschiedener Lösungen dargestellt. Die optische Absorptionsänderung aufgrund der MTT-Verstoffwechselung ist in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Je höher der Absorptionswert ist, umso mehr Stoffwechsel-aktive Zellen liegen vor. Wie bereits für die anderen Rhodaminfarbstoffe beobachtet wurde, variieren die Absorptionswerte von Rhodamin 6 G im Zeitraum bis zu vier Stunden um maximal 0,05. Diese Variation wird unabhängig von der Anwesenheit des Inhibitors PSC-833 detektiert. Nach 23 h war deutlich erkennbar, dass die Vitalität der Zellen in den Rhodamin 6 G enthaltenden Lösungen abnahm. Da die Experimente jedoch in einem Zeitfenster bis zu fünf Stunden durchgeführt wurden, spielt die nach 23 h detektierte Toxizität keine Rolle.
66
3 ERGEBNISSE
3.7.2 Absorptionsspektum von Rhodamin 6 G 0,8 0,7
Absorption
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 400
500
600
Wellenlänge [nm]
Abb. 49: Absorptionsspektrum einer 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung im Puffer B 2.
Der Farbstoff Rhodamin 6 G absorbiert in einem Bereich von 440 nm bis 560 nm. Daher wurde die Fluoreszenz von Rhodamin 6 G bei 480 nm angeregt. Damit konnte das vollständige Fluoreszenzspektrum aufgenommen werden. Durch die Integration der Spektren wurde die Fluoreszenzintensität bestimmt. Die Fluoreszenzspektren von Rhodamin 6 G wurden mit Polarisatoren (0°/55°) im Bereich von 510 nm bis 800 nm aufgenommen. Die gewählten Spaltbreiten wurden für die Anregung und die Emission auf 10 nm eingestellt.
3.7.3 Transportmessungen mit Rhodamin 6 G Die Transportmessungen wurden analog zu den in Kap 3.5.3 zitierten Forschungsarbeiten durchgeführt. Hier wurde anstelle von radioaktiv markierten Substanzen der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin 6 G eingesetzt. Ziel dieser Transportmessungen war, die Substrat-Eigenschaften von Rhodamin 6 G für P-Gp in Caco-2 Zellen zu charakterisieren. Ferner wurde der Einfluss des P-Gp Inhibitors PSC-833 auf die Rhodamin 6 G-Transportkinetik untersucht.
67
3 ERGEBNISSE
3.7.3.1 Transportmessung ohne Inhibition Es wurde der von P-Gp vermittelte Transport einer 50 µM Rhodamin 6 GLösung
im
Puffer
B
2
fluoreszenzspektroskopisch
untersucht.
Die
Dreifachbestimmung der Fluoreszenzintensitäten wurde in einer Wellplatte durchgeführt, die erhaltenen Werte gemittelt und gegen die Zeit aufgetragen. Die für diese Transportmessungen verwendeten Caco-2 Zellen wurden 10 Tage vor der Durchführung der Experimente in die Transwellplatten eingesät und bilden in diesem Zeitraum eine konfluente Monolage aus. Die Konfluenz der Caco-2 Monozelllage
wurde
unmittelbar
vor
den
Experimenten
durch
die
Transpot [%]
Widerstandsmessung kontrolliert.
55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1
2
3
4
5
t [h]
Abb. 50: Prozentualer Rhodamin 6 G–Transport (c = 50 µM) mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
In Abb. 50 wurde der prozentuale Rhodamin 6 G-Transport gegen die Zeit aufgetragen. Der mit der roten Kurve dargestellte, P-Gp-induzierte basal-nachapikale Transport stieg in dem beobachteten Zeitraum von 7% nach einer Stunde auf 50% nach fünf Stunden. Der apikal-nach-basale Transport ist die passive Diffusion des Farbstoffs (schwarze Kurve). Diese Messkurve verläuft nahezu
68
3 ERGEBNISSE
parallel zum basal-nach-apikalen Transport. Nach einer Stunde wurden basal 2% und nach fünf Stunden 40% des Substrates detektiert. Die grün dargestellte Kurve für den Nettotransport, der, analog zu den bisherigen Messungen, aus der Differenz des basal-nach-apikalen und des apikal-nach-basalen Transports berechnet wurde, liegt im Bereich von 5% bis 10%. Der hier beobachtete Nettotransport lag mit ca. 10% deutlich über dem Nettotransport
von
Sulforhodamin
B-Natriumsalz
und
folglich
in
der
Größenordnung des für Rhodamin 123 bestimmten Nettotransports. Rhodamin 6 G besteht aus einem positiv geladenen Rhodamin-Grundgerüst, das mit einem Chlorid-Anion ein Salz bildet. Da die Phospholipidkopfgruppen der Zellmembran negativ geladen sind, wird die Diffusion dieses Farbstoffs zur Zellmembran durch elektrostatische Wechselwirkungen begünstigt. Diese Vorstellung wurde bereits mit dem
Flippasemodell
beschrieben.
Außerdem
wird
Rhodamin
6
G
in
Konzentrationen, die um Faktor 0,5 kleiner sind als die des Sulforhodamin BNatriumsalzes, in den Transportmessungen eingesetzt. Da nur eine bestimmte Molekülzahl pro Zeiteinheit durch die P-Gps transportiert werden kann, ist dieses Verhältnis für eine kleine Substratkonzentration relativ dazu größer, was zu einem höheren Nettotransport im Falle von Rhodamin 6 G führt.
69
3 ERGEBNISSE
Transport [%]
3.7.3.2 Transportmessung mit Inhibitor PSC-833 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 1
2
3
4
5
t [h]
Abb. 51: Prozentualer Rhodamin 6 G–Transport (c = 50 µM) mit 1 µM PSC-833 mittels P-Gp in einer konfluenten Monolage aus Caco-2 Zellen. Rot: Transport von basal nach apikal, schwarz: Transport von apikal nach basal, grün: Nettotransport.
In Abb. 51 ist der prozentuale Transport einer 50 µM Rhodamin 6 G-Lösung, die 1 µM des Inhibitors PSC-833 enthält, gegen die Zeit aufgetragen. Der schwarz dargestellte Transport von apikal nach basal liegt nach 1 h bei 10%. Nach fünf Stunden sind 37% des Farbstoffes in das basale Volumen diffundiert. Der mit 1 µM PSC-833 inhibierte, rot dargestellte P-Gp vermittelte Transport von basal nach apikal steigt von 5% auf 30%. Die Schwankungen im Kurvenverlauf sind durch Messfehler zu erklären, die sich aus den durch die Probenentnahme induzierten Volumenfehlern ergeben können. Der aus der Differenz der prozentualen Transportwerte berechnete Nettotransport liegt zwischen -3% und -15%. Wie bereits bei Sulforhodamin B-Natriumsalz und Rhodamin 123 festgestellt wurde, liegt auch für Rhodamin 6 G der inhibierte Nettotransport deutlich unter dem in Abb. 50 dargestellten Nettotransport ohne Inhibitorzusatz. Grund dafür ist, dass der aktive Transport mittels P-Gp ins apikale Volumen wegen des Inhibitors maximal 30% erreicht. Im Gegensatz dazu wird ohne Inhibitorzusatz (s. Abb. 50) 50% des
70
3 ERGEBNISSE
Fluoreszenzfarbstoffes apikal detektiert. Die passive Diffusion wird durch den Inhibitorzusatz nur geringfügig beeinflusst.
3.7.4 CLSM-Transportbeobachtung von Rhodamin 6 G In diesem Experiment wurde eine 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung im B 2Puffer auf konfluente Caco-2 Zellmonolagen gegeben. Diese Monolagen wurden in Petrischalen gebildet. Der Transport von Rhodamin 6 G wurde mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop bei einer Anregungswellenlänge von λ = 488 nm untersucht. Dafür erfolgten die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen unter verschiedenen Zellumgebungsbedingungen. Es wurden Messungen in Abwesenheit von PSC-833 und in Gegenwart von PSC-833 durchgeführt und die Auswirkungen des Inhibitors auf den Farbstofftransport diskutiert. Durch den Vergleich der Fluoreszenzintensitätsverteilungen in den verschiedenen mikroskopischen Aufnahmen wurde der bevorzugte Transport von Rhodamin 123 in Caco-2 Zellen festgestellt.
Abb. 52: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 80 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Die grüne Fluoreszenz der 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung 80 min nach der Farbstoffzugabe ist in Abb. 52 dargestellt. Der Fluoreszenzfarbstoff hat sich im
71
3 ERGEBNISSE
Intrazellulärraum akkumuliert. Deshalb sind die Zellen als grün fluoreszierende Bereiche zu erkennen und die Struktur der adhärenten Zellmonolage wird offensichtlich. Die Zellmembranen bzw. die Bereiche zwischen den adhärenten Caco-2 Zellen fluoreszieren kaum. Grund hierfür ist, dass der Farbstoff nur wenig Zeit benötigt um die Zellmembran zu passieren und deswegen kaum intermembranal vorliegt.
Abb. 53: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage (CLSM-Aufnahme 90 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Abb. 53 zeigt die fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der Caco-2 Zellen 90 min nach der Zugabe einer 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung. Diese Lösung enthält neben dem Fluoreszenzfarbstoff 1 µM PSC-833. Da die P-Gps durch den Inhibitor kompetitiv gehemmt werden, wird der Farbstoffausstrom aus den Caco-2 Zellen in den Extrazellulärraum verringert. Die Diffusion von Rhodamin 6 G ins Zellinnere wird durch das PSC-833 kaum verändert. Im Intrazellulärraum tritt eine höhere Fluoreszenzintensität im Vergleich zu der Aufnahme ohne Inhibitor (s. Abb. 52) auf. Folglich wird in Abb. 53 die Zellstruktur deutlicher abgebildet.
72
3 ERGEBNISSE
Abb. 54: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage min 3 nach dem Entfernen der Farbstofflösung (CLSM-Aufnahme 83 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In Abb. 54 wurde die Fluoreszenz einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage detektiert. Diese mikroskopische Aufnahme entstand 3 min, nachdem die überstehende Rhodamin 6 G-Lösung entfernt wurde. Dennoch ist die detektierte Fluoreszenzintensität mit der Fluoreszenzintensität aus Abb. 52 vergleichbar. Analoges galt für die Abbildung der Zellstruktur. Der Farbstoff ist nach wie vor im Zellinneren lokalisiert. Trotz des Konzentrationsgradienten zwischen dem Intraund dem Extrazellulärraum hat sich die detektierte Fluoreszenzintensität im Zellinneren nicht messbar verringert.
73
3 ERGEBNISSE
Abb. 55: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 3 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung (CLSMAufnahme 93 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
In Abb. 55 ist mikroskopisch die grüne Fluoreszenz aufgenommen, die durch den
Rhodamin
6
G-Farbstoff
hervorgerufen
wird.
Die
detektierte
Fluoreszenzintensität ist größer als die Fluoreszenzintensität in Abb. 54. Grund hierfür ist die Anwesenheit des Inhibitors PSC-833, der nach wie vor das intermembranal lokalisierte P-Gp blockiert. Dadurch wird der Farbstoffausstrom aus den Caco-2 Zellen gehemmt, obwohl im Extrazellulärraum kein Inhibitor mehr vorliegt. Die mikroskopisch aufgenommene Fluoreszenzintensität aus Abb. 55 ist mit der Fluoreszenzintensität aus Abb. 53 zu vergleichen. Das bestätigt, dass sich das Gleichgewicht zwischen Intra- und Extrazellulärraum nach der Entfernung von den Rhodamin 6 G-Lösungen nur langsam neu einstellt. Durch die folgenden Aufnahmen wird diese Beobachtung überprüft.
74
3 ERGEBNISSE
Abb. 56: 10 µM Rhodamin 6 G- Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 6 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 86 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Die in Abb. 56 mikroskopisch gemessene Fluoreszenzintensität kann mit den bisher aufgenommenen Abbildungen, bei denen die 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung zugegeben wurden, verglichen werden. Obwohl nur reine Pufferlösung auf die Zellmonolage pipettiert wurde, hatte die detektierte Fluoreszenz 6 min später nicht signifikant abgenommen. Der Farbstoffausstrom in den Extazellulärraum ist nicht erkennbar, obwohl ein Konzentrationsgradient zwischen dem Zellinneren und der Umgebung besteht. Grund dafür kann sein, dass das Zeitfenster zwischen der B 2Pufferzugabe und der Messung zu klein war und deswegen keine Änderung der Fluoreszenzintensität gemessen wurde.
75
3 ERGEBNISSE
Abb. 57: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 6 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung, nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 96 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
Abb. 57 zeigt die Fluoreszenzintensität einer Monozelllage 6 min nach dem Entfernen der Farbstoff-Inhibitor-Lösung und nach der Zugabe von B 2-Puffer. Im Vergleich zu Abb. 55 hat die Fluoreszenzintensität in Abb. 57 abgenommen. Sobald kein
Inhibitor
mehr
in
der
Lösung
enthalten
war,
diffundierte
der
Fluoreszenzfarbstoff aus den Caco-2 Zellen heraus, da sich die Zahl der durch das PSC-833 inhibierten Zellen verringerte. Folglich stellte sich ein neues Gleichgewicht zwischen dem Intra- und dem Extrazellulärraum ein. Nun ist die Intensität der Fluoreszenz in der Abbildung ohne Inhibitor (s. Abb. 56) und der Abbildung mit Inhibition (s. Abb. 57) vergleichbar stark ausgeprägt.
76
3 ERGEBNISSE
Abb. 58: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 51 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2Puffer (CLSM-Aufnahme 131 min nach Zugabe der Farbstofflösung).
51 min nachdem die Pufferlösung B 2 extrazellulär zugegeben wurde, hat sich die Fluoreszenzintensität nicht verändert (s. Abb. 58). Demnach erfolgte die Gleichgewichtseinstellung zwischen dem Intra- und dem Extrazellulärraum schnell, ohne dass durch diese Messmethode die Intensitätsunterschiede in der mikroskopisch detektierten Fluoreszenz deutlich werden.
Abb. 59: 10 µM Rhodamin 6 G-Lösung mit 1 µM PSC-833 auf einer konfluenten Caco-2 Zellmonolage 44 min nach dem Entfernen der Farbstofflösung und nach der Zugabe von 1 ml B 2-Puffer (CLSM-Aufnahme 134 min nach Zugabe der Farbstofflösung). 77
3 ERGEBNISSE
Die in Abb. 59 dargestellte Fluoreszenzintensität, die 44 min nach der Zugabe von B 2 detektiert wurde, ist mit der Fluoreszenzintensität in Abb. 57 zu vergleichen. Hier wurde die Fluoreszenzintensität 6 min nach der Zugabe des Puffers gemessen. Sobald keine Farbstoff-Inhibitor-Lösung extrazellulär vorlag, diffundierte der Farbstoff aufgrund des Konzentrationsgradienten aus der Caco-2 Zellschicht
und
die
Fluoreszenzintensität
nahm
ab.
Dennoch
ist
im
Intrazellulärraum noch immer Rhodamin 6 G akkumuliert, so dass die Struktur der adhärierten Zellen weiterhin zu erkennen ist. Die Ergebnisse aus den CLSMAufnahmen bestätigen, dass Rhodamin 6 G ein P-Gp Substrat ist. Als solches wird es in Abhängigkeit von dem Inhibitor PSC-833 aus den Zellen geschleust. Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu den vorher beschriebenen Transportmessungen jedoch nicht quantitativ zu sehen, da für die CLSM-Aufnahmen keine Normierung durchführbar ist.
3.8 Bestimmung der scheinbaren Permeationskoeffizienten Zur Berechnung der scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp der Farbstoffe wurde der lineare Bereich aus den Auftragungen des zeitabhängigen Transports verwendet. Die Permeationskoeffizienten Papp wurden nach der folgenden Formel berechnet, die in dieser oder ähnlicher Form in verschiedenen Forschungsarbeiten verwendet wurde[1, 36, 54, 61]: dc V Papp = dt A × c0
c bedeutet die Konzentration, c0 ist die Anfangskonzentration, V stellt das Volumen dar, A ist die Wachstumsoberfläche des Wells und t steht für die Zeit. Die Einheit der in den nachfolgenden Tabellen zusammengefassten scheinbaren Permeationskoeffizienten ist [cm/s].
78
3 ERGEBNISSE
Sulforhodamin Natriumsalz 20 µM 100 µM 500 µM
B- Papp (apikal nach basal) [cm/s] 4,2 × 10-7 4,8 × 10-8 4,4 × 10-10
Papp (basal nach apikal) [cm/s] 2,6 × 10-6 6,4 × 10-7 1,9 × 10-8
Tab. 2: Übersicht der scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von Sulforhodamin B-Natriumsalz-Lösungen.
In Tab. 2 sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten von Sulforhodamin B-Natriumsalz zusammengefasst. Der Papp-Wert für den apikal-nach-basalen Transport beschreibt die Diffusionsgeschwindigkeit des Substrates Sulforhodamin B-Natriumsalz. Sie liegt unabhängig von der Konzentration deutlich unter den PappWerten für den P-Gp vermittelten basal-nach-apikalen Transport. Je kleiner die Substratkonzentration ist, umso größer ist der scheinbare Permeationskoeffizient für den basal-nach-apikalen Transport. Der von Troutman et. al.[36] bestimmte, konzentrationsunabhängige
Transport
für
andere,
strukturverwandte
Fluoreszenzfarbstoffe konnte hier für Sulforhodamin B-Natriumsalz nicht bestätigt werden. Außerdem wurden die Transportuntersuchungen in einem kleineren Konzentrationsbereich durchgeführt, da das Sulforhodamin B-Natriumsalz nur in relativ kleinen Konzentrationen im eingesetzten B 2-Puffer vollständig löslich ist.
Rhodamin 123 1 µM 10 µM 10 µM + 1 µM PSC-833
Papp (apikal nach basal) [cm/s] 1,4 × 10-4 1,7 × 10-4 2,5 × 10-4
Papp (basal nach apikal) [cm/s] 2,6 × 10-4 2,2 × 10-4 1,6 × 10-4
Tab. 3: Übersicht der scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von Rhodamin 123-Lösungen.
In Tab. 3 sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten von Rhodamin 123 dargestellt. Wie bereits für das Sulforhodamin B-Natriumsalz beobachtet, ist der
79
3 ERGEBNISSE
Papp-Wert für den basal-nach-apikalen Transport größer als der Papp-Wert für den apikal-nach-basalen Transport. Die Papp-Werte mit PSC-833 Zugabe verhalten sich dazu entgegengesetzt. Für Rhodamin 123 wurde ohne Inhibition ein positiver, mit Inhibition ein negativer Nettotransport erhalten, der mittels der berechneten PappWerte verifiziert wird. Die Papp-Werte von Rhodamin 123 liegen um Faktor 100 über den Papp-Werten, die für das Sulforhodamin B-Natriumsalz berechnet wurden. Der Grund dafür ist die eingesetzte Farbstoffkonzentration. Ferner unterscheiden sich die beiden Fluoreszenzfarbstoffe geringfügig in ihrer chemischen Struktur, was eine weitere Erklärung für die unterschiedlichen Papp-Werte ist. Wie bereits beschrieben wurde, sind die hier berechneten Papp-Werte für Rhodamin 123 annähernd konzentrationsunabhängig[36]. Die bestimmten Papp-Werte entsprechen den für Rhodamin 123 berechneten Papp-Werten aus der Literatur[38, 45].
Rhodamin 6 G 5 µM 5 µM + 1 µM PSC-833 10 µM 10 µM + 1 µM PSC-833
Papp (apikal nach basal) [cm/s] 1,8 × 10-4 2,8 × 10-4 8,4 × 10-5 1,3 × 10-4
Papp (basal nach apikal) [cm/s] 2,6 × 10-4 2,2 × 10-4 1,0 × 10-4 6,7 × 10-5
Tab. 4: Übersicht der scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von Rhodamin 6 G-Lösungen.
Tabelle
4
fasst
die
berechneten
Werte
des
scheinbaren
Permeationskoeffizienten von Rhodamin 6 G zusammen. Für Rhodamin 6 G ist der Papp-Wert für den nicht inhibierten basal-nach-apikalen Transport größer als der Papp-Wert für den nicht inhibierten apikal-nach-basalen Transport. Gegensätzlich dazu verhalten sich die Papp-Werte für die Experimente mit dem Inhibitor PSC-833. Für Rhodamin 6 G wurde ohne Inhibition ein positiver und mit Inhibition ein negativer Nettotransport berechnet, der durch die in Tab. 4 dargestellten Papp-Werte deutlich wird. Wie bereits bei Rhodamin 123 beobachtet wurde, spielt die eingesetzte Farbstoff-Konzentration für Rhodamin 6 G eine untergeordnete Rolle.
80
3 ERGEBNISSE
Um einen konzentrationsunabhängigen Transport zu postulieren, müssten jedoch zusätzlich zu den verwendeten Substratkonzentrationen deutlich größere FarbstoffKonzentrationen eingesetzt werden. Hier ist jedoch die Löslichkeit der Fluoreszenzfarbstoffe der limitierende Faktor.
3.9 Der Transporterproteindetektor Der Transporterproteindetektor wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation entwickelt und ist ein Messgerät, das die in-situ Detektion der Transportdynamik von fluoreszierenden Substraten über konfluente Zellmonolagen leistet.
Dieses
Messgerät
wurde
für
die
online
Charakterisierung
der
Transportfunktion von Membranproteinen optimiert und nutzt die zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie. Da die in-situ Detektionstechnik die kontinuierliche Messung
der
Pharmakokinetik
von
Transporterproteinen
erlaubt,
werden
beispielsweise systematische Meßfehler aufgrund von Probenentnahmen in der etablierten diskontinuierlichen Fluoreszenztechnik vermieden. Als Fluoreszenzfarbstoffe zur Entwicklung des Transporterproteindetektors wurden Rhodamin 6 G, Daunomycin und Rhodamin 123 eingesetzt. Das fluoreszierende P-Gp Substrat Daunomycin wurde in die Validierung des Systems einbezogen, da es als bekannte, radioaktiv markierte Substanz bereits untersucht wurde[19] und in den folgenden Messungen gezeigt werden soll, dass die fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion der Transportkinetik für eine große Bandbreite von fluoreszierenden Substraten eingesetzt werden kann.
3.9.1 Aufbau des Transporterproteindetektors Im Folgenden ist der Aufbau des Transporterproteindetektors schematisch dargestellt. Die Entwicklung und die Optimierung dieses Messsystems sind ein wichtiger Bestandteil der vorliegenden Dissertation.
81
3 ERGEBNISSE
Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsmessung
Thermostat
Intensitätsmessung
Abb. 60: Schematische Darstellung der fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektion mit einem Laser als Lichtemissionsquelle, dem Transporterproteindetektor, dem Fluoreszenzspektrometer zur Detektion und einem Rechner zur Aufzeichnung der Messdaten.
In Abb. 60 ist der Transporterproteindetektor schematisch dargestellt. Zur Anregung der Fluoreszenz wurden die in Tab. 1 genannten Laser eingesetzt. Der Laserstrahl wird durch ein Glasfaserkabel auf die Küvette geleitet. Senkrecht zur Anregungsgeometrie wird die Fluoreszenzstrahlung mittels Kollimator und Glasfaseroptik eingesammelt. Der Fluoreszenzspektrometer dispergiert und detektiert die Fluoreszenzstrahlung. Dieses Signal wird an den Rechner weitergeleitet,
und
das
Fluoreszenzspektrum
wird
in
den
vorgesehenen
Zeitintervallen aufgezeichnet. Die weiteren in Abb. 60 dargestellten Geräte wurden während der Optimierung des Messsystems ergänzt. Zur Korrektur von Laserintensitätsinstabilitäten wird die Streustrahlung des Laserlichtes mittels einer Diode detektiert. Da diese Messung durch verschiedene Umgebungsparameter (Luftfeuchtigkeit, Substratkonzentration im apikalen Volumen) beeinflusst werden kann, wurde die Laserintensität in den darauf folgenden Experimenten direkt über 82
3 ERGEBNISSE
die Änderung der Spannung gemessen. Der Thermostat, der Luftbefeuchter und die Messung der Luftfeuchtigkeit wie der Temperatur wurden schrittweise in die Experimente aufgenommen.
1: Küvettenhalterung 2: Wasserdampfentwickler
2
3: Kupferheizwendel 4: Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsmesser 1
3
4
Abb. 61: Schematische Darstellung des Transporterproteindetektors mit Küvette, Heizung, Luftbefeuchter und Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsmesser.
Abb. 61 zeigt den thermostatisierten Teil des Transporterproteindetektors. Als Anregungslichtquelle wird ein kontinuierlich arbeitender Laser (z.B. Argonionenlaser oder Saphir-Laser) eingesetzt, dessen monochrome Strahlung mittels einer Glasfaser auf die Probe (rotes Quadrat) fokussiert wird. Die Probe besteht aus einem an der Unterseite abgeschmolzenen Glasröhrchen (Küvette), das mit einem für Tumorzellen geeigneten Puffer befüllt wird. Die Tumorzellen sind als Monolage auf einem Polycarbonat-Membranfilter (Transwell) aufgewachsen, der in das Glasröhrchen derart eingesetzt wird, dass er die Küvette in das Donor- und Akzeptorvolumen unterteilt (s. Abb. 62). Das Donorvolumen (basal) erhält zum Startzeitpunkt der Messung das Substrat mit bekannter Konzentration, das im Puffer gelöst
ist.
Das
Laserstrahlung
Akzeptorvolumen
kontinuierlich
(apikal)
angeregt.
Die
wird
mit
der
Fluoreszenz
monochromen des
über
die
Tumorzellmonolage in basal-nach-apikaler Richtung transportierten Substrates wird
83
3 ERGEBNISSE
mittels eines Kollimators eingesammelt und über einen Glasfaser-angekoppelten Fluoreszenzspektrometer polychromatisch detektiert. Die relative Fluoreszenzintensität wird durch numerische Integration des Fluoreszenzspektrums ermittelt und als Funktion der Transportzeit dargestellt, wobei die Zeitauflösung im Bereich von wenigen Sekunden liegt.
1: Küvettenhalterung: Seitenansicht:
Ansicht von oben:
a
d
c e
b c
a: apikales Volumen b: basales Volumen c: Halterung d: Filter e: Feder
Abb. 62: Schematische Darstellung der Küvettenhalterung als Seitenansicht und Ansicht von oben.
Die vergrößerte Darstellung in Abb. 62 zeigt die Küvettenhalterung als Seitenansicht und als Ansicht von oben. Die Küvette wird durch eine Feder (e) in ihrer Position fixiert. Die Streustrahlung des Anregungslasers wird durch einen geeigneten Filter (d) absorbiert um eine Überlastung des Fluoreszenzspektrometers zu unterbinden. Mit diesem Aufbau ist es möglich, den basal-nach-apikalen und den apikal-nach-basalen Transport zu detektieren. Im Folgenden wurde ausschließlich der basal-nach-apikale Transport gemessen, da dieser in Caco-2 Zellen P-Gp vermittelt erfolgt und so der Einfluss eines Inhibitors verfolgt werden kann.
84
3 ERGEBNISSE
3.9.2 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion von Rhodamin 6 G Zur Vorbereitung der Experimente wurden 200.000 Caco-2 Zellen pro Well auf die Polycarbonatmembranen gesät. Innerhalb von wenigstens 11 Tagen bildete sich eine konfluente Monolage aus. Zur Kontrolle der Konfluenz wurde der Widerstand der Zellschicht vor jedem Experiment gemessen. Sobald der TranswellWiderstand um 200 Ω größer ist als der Widerstand in einem Transwell ohne Caco2 Zellen, wird von der Konfluenz der Zellschicht ausgegangen[10, 17, 20, 38, 52-54]. Nach der Kontrolle des Widerstandes wurde das Zellkulturmedium entfernt. Damit kein Zellkulturmedium auf der Zellschicht zurückbleibt, wurde die Caco-2 Zellmonolage einmal mit dem Puffer B 2 gewaschen. In das basale Volumen wurden 4,5 ml der zu untersuchenden Farbstoff-B 2-Pufferlösung pipettiert. Die vorbereitete Transwellmembran wurde auf die Küvette gesteckt und mit Parafilm umwickelt. In das apikale Volumen werden 800 µl der B 2-Pufferlösung auf die Caco-2 Monolage pipettiert. Nachdem die Küvette in der Küvettenhalterung fixiert war, wurde mit der Messung begonnen. Die Fluoreszenz der reinen Substratlösung wurde als Referenz vor
Beginn
und
nach
Beendigung
des
Experimentes
bestimmt.
Die
Fluoreszenzintensität wurde durch Integration der erhaltenen Spektren berechnet. Diese nimmt in dem eingesetzten Konzentrationsbereich linear mit der Konzentration
zu.
Die
in
Abhängigkeit
von
der
Zeit
gemessenen
Fluoreszenzspektren der apikal vorliegenden Farbstoff-Pufferlösungen werden integriert, und die apikale Farbstoffkonzentration wird zum Zeitpunkt der Messungen berechnet. Der prozentuale Transport wird als Funktion der Zeit dargestellt.
3.9.2.1 In-situ Detektion von Rhodamin 6 G (Omnichrome-Laser) In den folgenden Experimenten wurde der Transport von Rhodamin 6 G in Caco-2 Zellen untersucht. Die Zunahme der apikalen Farbstoffkonzentration wurde fluoreszenzspektroskopisch gemessen. Die passive Diffusion, die in beide Richtungen erfolgt, wurde für Rhodamin 6 G in den Experimenten aus Kap. 3.7.3
85
3 ERGEBNISSE
detektiert. In den Messungen mit dem Transporterproteindetektor wurde die Diffusion von apikal nach basal nicht gemessen, da bereits bewiesen wurde, dass der Nettotransport in Abhängigkeit von dem Inhibitorzusatz positiv oder negativ ist. Der P-Gp vermittelte Substrattransport der Caco-2 Zellen in Gegenwart des Inhibitors wird mit dem Substrattransport in Abwesenheit des Inhibitors PSC-833 verglichen.
40 35
Transport [%]
30 25 20 15 10 5 0 -5 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 63: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
Abb. 63 zeigt den prozentualen, P-Gp vermittelten Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung. Die für die Experimente eingesetzten Caco-2 Zellen stammten aus den Passagen 61 bzw. 62. Es wurde keine Dreifachbestimmung durchgeführt, da es aufgrund der apparativen Gegebenheiten nicht möglich ist, mehrere Messungen simultan auszuführen. Deshalb erfolgten die Experimente in Anwesenheit und in Abwesenheit des Inhibitors 11 Tage bzw. 14 Tage nach dem Einsäen, damit die Zahl der exprimierten P-Gps gleich groß und damit die Messungen vergleichbar sind. Die schwarze Messkurve stellt den apikal-nach-
86
3 ERGEBNISSE
basalen Substrattransport ohne Inhibitor, und die rote Messkurve den apikal-nachbasalen Substrattransport mit 1 µM PSC-833 dar. Die Farbstoff-Fluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von λ = 514 nm angeregt. In dem untersuchten Zeitintervall wurden ohne Inhibition nach fünf Stunden 35% des Fluoreszenzfarbstoffes im apikalen Volumen detektiert. In Anwesenheit des Inhibitors (rote Kurve) wurden nach fünf Stunden 28% des Farbstoffes apikal gemessen. Offensichtlich hemmt PSC-833 kompetitiv den unter Energieverbrauch erfolgenden basal-nach-apikalen Transport. Hier wurde die Transportkinetik in dem bereits untersuchten Zeitintervall durch eine größere Anzahl an Messwerten exakter dargestellt. Die in diesem Experiment beobachteten Schwankungen der Messwerte können aus verschiedenen Gründen auftreten. Zum Einen steht hier aus den oben genannten Gründen ein Messwert pro Zeiteinheit und Substratlösung zur Verfügung, zum Anderen wurde das Experiment unter Laborbedingungen durchgeführt, d.h. die Temperatur lag mit einem Wert 22 °C deutlich unter der Temperatur, die im CO2-Inkubator erreicht wird. Um das Ergebnis zu verifizieren, wurden im Folgenden unter vergleichbaren Bedingungen weitere Experimente durchgeführt. 70 60
Transport [%]
50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 64: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
87
3 ERGEBNISSE
In Abb. 64 ist der prozentuale Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer dargestellt. Der Farbcode wurde analog zu Abb. 63 verwendet. Die Farbstoff-Fluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von λ = 514 nm angeregt. Die hier eingesetzten Caco-2 Zellmonolagen wurden aus der Passage 62 generiert. Die Experimente erfolgten nach einer Proliferationszeit von 28 Tagen bzw. 29 Tagen. In der Literatur wurde beschrieben, dass die Caco-2 Zellmonolagen 7 Tage bis 28 Tage nach dem Einsäen für Messungen eingesetzt wurden[1, 19-23, 31, 37, 38, 52-54, 61, 62]. In den durchgeführten Experimenten wurden Zellmonolagen bis zu 29 Tage nach dem Einsäen verwendet, was durch die Reproduzierbarkeit der Messwerte zu rechtfertigen ist. Sobald die Caco-2 Zellmonolagen länger als 30 Tage kultiviert wurden, war diese nicht mehr gegeben. Im Falle der fluoreszenzspektroskopischen in-situ Messungen wurden stets zwei zeitnahe Experimente miteinander verglichen. 10 Tagen nach dem Einsäen wurde, wie mit der Zellproliferationskurve in Abb. 16 dargestellt ist, eine konfluente Zellmonolage gebildet. Das sagt jedoch nichts darüber aus, ob zu diesem Zeitpunkt die maximal mögliche P-Gp-Konzentration exprimiert ist. Diese nimmt offensichtlich weiterhin zu[44]. Deswegen werden bei dem in Abb. 64 dargestellten Experiment nach fünf Stunden ohne Inhibitor 67% des Rhodamin 6 G-Farbstoffes apikal detektiert (schwarze Kurve). Der apikal-nachbasale Transport mit 1 µM PSC-833 Zusatz (schwarze Kurve) betrug maximal 23%. Er liegt unter dem Wert des in Abb. 63 dargestellten inhibierten Transports. Für diesen wurden nach fünf Stunden 28% des Farbstoffes apikal detektiert.
88
3 ERGEBNISSE
40 35
Transport [%]
30 25 20 15 10 5 0 -5 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 65: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 65 wurde die fluoreszenzspektroskopisch gemessene, apikale Rhodamin 6 G-Zunahme in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Wie in den bereits
beschriebenen
Experimenten
erfolgten
die
Messungen
des
Farbstofftransports von 1 µM Rhodamin 6 G-Pufferlösungen. Die Wellenlänge des Argonionenlasers für die Anregung der Farbstoff-Fluoreszenz ist λ = 514 nm. Die Caco-2 Monolagen aus der Passage 63 wurden am 17. Tag bzw. 18. Tag nach dem Einsäen für die Messungen eingesetzt. Während des Experimentes wurde die Temperatur im Transporterproteindetektor gemessen. Sie lag bei 25°C ± 1°C. Die schwarze Kurve, die den Farbstofftransport ohne Inhibitor zeigt, erreicht nach fünf Stunden einen Wert von 35%. Die rote Kurve für den Rhodamin 6 G-Transport mit 1 µM PSC-833 Zusatz erreicht nach fünf Stunden 26%. Diese Ergebnisse liegen in der Größenordnung des in Abb. 63 dargestellten Transports. Die Zunahme der apikal
detektierten
Farbstoff-Fluoreszenz
erfolgte
im
Vergleich
zu
den
vorangegangenen Experimenten weniger kontinuierlich. Ein Grund dafür ist die Intensitätsinstabilität des zur Fluoreszenzanregung eingesetzten Lasers. Die 89
3 ERGEBNISSE
Laserintensität wurde parallel zum Substrattransport gemessen. Dafür wurde die Streustrahlung mittels einer Diode im Transporterproteindetektor detektiert und das Signal über den digitalen Multimeter an den Rechner weitergeleitet. Die Messkurven des Farbstofftransports folgen der Laserintensitätsmessung, was die Schwankungen in der Messkurve auf die Instabilität der Laserintensität zurückführt. Um künftige Laserintensitätsinstabilitäten auszuschließen, wurde ein geeigneter Laser zur Anregung der Fluoreszenz eingesetzt.
40 35
Transport [%]
30 25 20 15 10 5 0 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 66: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833. Für Abb. 66 wurde die Fluoreszenzzunahme in der apikal vorliegenden Lösung über einer Caco-2 Zellmonolage in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die Anregungswellenlänge des nun eingesetzten Lasers betrug λ = 488 nm. Für diese Messungen wurden Caco-2 Zellen aus Passage 63 verwendet. Die Experimente wurden 22 Tage bzw. 23 Tage nach dem Einsäen der Zellen auf Polycarbonatmembranen durchgeführt. Die schwarze Kurve zeigt den basal-nachapikalen Rhodamin 6 G Transport. Er erreicht nach fünf Stunden einen Wert von 38%. Damit liegt er zwischen den in den vorangegangenen Abbildungen
90
3 ERGEBNISSE
dargestellten Transportwerten. Diese weisen offensichtlich einen Zusammenhang mit dem Zeitraum zwischen Einsäen und Durchführung der Experimente auf. Diese Beobachtung wird in Kap. 3.8.2.3 für nachfolgende Experimente gesondert diskutiert. Für den apikal-nach-basalen Transport in Gegenwart von 1 µM PSC-833 (rote Kurve) wird im apikalen Volumen nach fünf Stunden 20% des Fluoreszenzfarbstoffes kontinuierlich
zu.
detektiert.
Aufgrund
der
Die
Farbstoff-Fluoreszenz
Klimatisierung
des
nahm
Labors
sollte
nicht die
Wahrscheinlichkeit, dass Laserinstabilitäten auftreten, geringer sein als in den vorher
beschriebenen
Experimenten.
Ein
Problem
bei
dieser
Art
der
Laserintensitätsmessung ist, dass die Intensität nicht direkt am Laser detektiert wird und die Messung der Streustrahlung durch die apikale Farbstoffzunahme beeinflusst werden kann. Diese Beobachtung wurde in Kap. 3.9.2.2 erneut aufgegriffen und untersucht. In diesen Experimenten wurden im Transporterproteindetektor Temperaturen von 20,5°C ± 1°C gemessen. Im CO2-Inkubator, in dem die Experimente von Kap. 3.7.3 durchgeführt wurden, betrug die Temperatur 37°C. In der in Abb. 66 dargestellten Messung lag die Temperatur folglich um ca. 17°C darunter. Um festzustellen, ob diese Temperaturdifferenz den Kurvenverlauf stark beeinflusst, wurde der Transporterproteindetektor für die folgenden Experimente thermostatisiert und die Auswirkung der Temperaturerhöhung auf den basal-nachapikalen Farbstofftransport untersucht.
91
3 ERGEBNISSE
70 60
Transport [%]
50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
250
t [min]
Abb. 67: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
Abb. 67 zeigt den Verlauf des basal-nach-apikalen Rhodamin 6 G-Transports in Abhängigkeit von der Zeit und der Gegenwart bzw. Abwesenheit des Inhibitors PSC-833. Für dieses Experiment wurden Caco-2 Zellen aus der Passage 67 eingesetzt. Die Zeit zwischen dem Einsäen der Zellen und der Durchführung der Messung betrug 22 Tage bzw. 23 Tage. Die Anregungswellenlänge betrug λ = 488 nm. Da bei dem in Abb. 66 dargestellten Experiment apikal keine kontinuierliche Zunahme des Fluoreszenzfarbstoffes detektiert wurde, und dafür die Änderung der Umgebungstemperatur die Ursache sein kann, wurde der Transporterproteindetektor für die in Abb. 67 dargestellte Messung mittels Thermostat beheizt. Die Temperatur lag während des Experimentes bei 36,4°C ± 1°C. Die schwarze Meßkurve zeigt die basal-nach-apikale Zunahme der Rhodamin 6 G-Konzentration. Nach 240 min werden apikal 62% des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes detektiert. Dieser Wert liegt in der Größenordnung des in Abb. 64 dargestellten Transports. Als Grund für diesen hohen Messwert ist zum Einen die Proliferationszeit zu erwähnen. Zum Anderen sind bei einer höheren, dem menschlichen Körper besser entsprechenden 92
3 ERGEBNISSE
Temperatur der Zellstoffwechsel und damit die Transportwerte höher. Gleiches gilt für die rote Kurve, die den basal-nach-apikalen Rhodamin 6 G-Transport in Anwesenheit des Inhibitors PSC-833 veranschaulicht. Nach 240 min werden apikal 42% von Rhodamin 6 G gemessen. Die Qualität der Ergebnisse wurde durch die Thermostatisierung während der fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektion der Transportkinetik deutlich verbessert. Daher wird der Transporterproteindetektor für die folgenden Experimente stets thermostatisiert. Ferner scheint sich der basal-nach apikale Farbstofftransport nach 240 min zu sättigen. Um diese Beobachtung zu verifizieren, wurde der P-Gp vermittelte Farbstofftransport im folgenden Experiment über einen Zeitraum von fünf Stunden gemessen.
80 70
Transport [%]
60 50 40 30 20 10 0 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 68: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 68 wurde der prozentuale Transport von Rhodamin 6 G-Lösungen mittels P-Gp exprimierender Caco-2 Zellen in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Die Anregungswellenlänge betrug λ = 488 nm. Die Proliferationszeit betrug 29 Tage bzw. 30 Tage. Im Gegensatz zu den bisher durchgeführten
93
3 ERGEBNISSE
Experimenten wurde in diesen Messungen ein Becherglas mit destilliertem Wasser in den Transporterproteindetektor gestellt um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. Dennoch wurde nach der Messung ein apikaler Volumenverlust festgestellt. Dadurch wird die apikal vorliegende Farbstofflösung höherkonzentriert und folglich eine größere Fluoreszenzintensität gemessen. Damit erscheinen die Werte des prozentualen Transports erhöht. Nach fünf Stunden werden für den basal-nachapikalen
Rhodamin
6
G
Transport
(schwarze
Kurve)
78%
des
Fluoreszenzfarbstoffes detektiert. Für den PSC-833 inhibierten Transport (rote Kurve) werden nach fünf Stunden 55% gemessen. Ferner nähert sich die Farbstoffkonzentration asymptotisch einem Maximum an. Für den Transport ohne Inhibitor wird es nach vier Stunden erreicht. Für den basal-nach-apikalen Transport in Gegenwart des Inhibitors tritt die Sättigung nach 4,5 h ein. Innerhalb der zwei Messreihen, die in einer Abbildung dargestellt wurden, sind die Umgebungsparameter identisch. Für den Vergleich der verschiedenen Messreihenpaare wird die Abhängigkeit von der Proliferationszeit, von der Raumtemperatur
und
von
der
Temperatur
im
Transporterproteindetektor
berücksichtigt.
3.9.2.2 Proliferationszeitabhängiger Rhodamin 6 G-Transport Im Folgenden wurde verglichen, wie sich die Länge des Zeitraumes zwischen dem Einsäen und der Durchführung der Experimente auf den basal-nachapikalen Farbstofftransport auswirkt. Aus den oben genannten Gründen werden dafür ausschließlich die Experimente berücksichtigt, die im klimatisierten Labor mit thermostatisiertem Transporterproteindetektor durchgeführt wurden.
94
Transport [%]
3 ERGEBNISSE
70 68 66 64 62 60 58 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
t [Tage]
Abb. 69: Prozentualer, nach 4 h detektierter, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen in Abhängigkeit vom Zeitraum zwischen dem Einsäen und der Durchführung der Experimente. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 69 wurde der basal-nach-apikale Transport der 1 µM Rhodamin 6 GLösung in Gegenwart und in Abwesenheit von PSC-833 verglichen. Dazu wurde der nach vier Stunden apikal detektierte Farbstofftransport in Abhängigkeit von der Proliferationszeit der Caco-2 Zellen aufgetragen. Die schwarze Messkurve zeigt den Farbstofftransport der 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung. Die rote Kurve beschreibt die apikal detektierte Rhodamin 6 G Konzentration, die in Gegenwart einer 1 µM PSC833 Lösung gemessen wurde. Die beiden Kurven verlaufen nahezu parallel. Die Messwerte für den inhibierten Transport gehen in die Sättigung. Für den basalnach-apikalen Transport nehmen die Werte kontinuierlich zu. Prinzipiell würde hier ein ähnliches Verhalten wie für den inhibierten Transport erwartet werden. Die Transportwerte für den 16. Tag bzw. 17. Tag nach dem Einsäen stammen aus einer nicht gesondert vorgestellten Messung. Die Transportwerte für den 22. Tag bzw. 23. Tag nach dem Einsäen wurden aus Abb. 67 entnommen. Genauso ist der prozentuale Transport für den 29. Tag bzw. 30. Tag nach dem Einsäen der Caco-2
95
3 ERGEBNISSE
Zellen bereits in Abb. 68 dargestellt. Abb. 69 zeigt, dass die Zahl der in den Caco-2 Zellmonolagen exprimierten Transportproteine in Abhängigkeit von der Zeitspanne zwischen dem Einsäen der Zellen und der Durchführung der Experimente variiert. Je größer die Zeitspanne ist, umso größer ist die Anzahl der exprimierten P-Gps und um so mehr Substrat wird vom Donor- in das Akzeptorvolumen transportiert. Der Inhibitor PSC-833 konkurriert mit dem Substrat um die exprimierten P-Gps. Das ist unabhängig von der Gesamtzahl der P-Gps. Abb. 69 zeigt offensichtlich, dass die Differenz zwischen dem basal-nach-apikalen Transport in Abwesenheit des Inhibitors und dem basal-nach-apikalen Transport in Gegenwart von 1 µM PSC-833 annähernd unabhängig von der Proliferationszeit ist, sofern die beiden zu vergleichenden Messungen mit nur ein bis zwei Tagen Abstand durchgeführt wurden.
3.9.2.3 Scheinbare Permeationskoeffizienten von Rhodamin 6 G Die scheinbaren Permeationskoeffizienten aller fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektionen wurden analog zu Kap. 3.8 mit der folgenden Beziehung berechnet: dc V Papp = dt A × c0
c bedeutet die Konzentration, c0 ist die Anfangskonzentration, V stellt das Volumen dar, A ist die Wachstumsoberfläche des Wells und t steht für die Zeit. Die Einheit der scheinbaren Permeationskoeffizienten ist [cm/s].
96
3 ERGEBNISSE
-3
3,5x10
-3
3,0x10
-3
Papp [cm/s]
2,5x10
-3
2,0x10
-3
1,5x10
-3
1,0x10
-4
5,0x10
0,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 t [Tage]
Abb. 70: Scheinbare Permeationskoeffizienten Papp von Rhodamin 6 G in Abhängigkeit von der Proliferationsdauer. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer, blau: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833 Zusatz.
In Abb. 70 sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von 1 µM Rhodamin 6-Pufferlösungen in Abhängigkeit von der Proliferationszeit dargestellt. Die Berechnungen dafür erfolgten analog zu den Berechnungen aus Kap. 3.8. Die Konzentrationsänderungen in Abhängigkeit von der Zeit wurden aus den graphischen Darstellungen der Experimente abgelesen. Das apikal vorliegende Volumen war 0,8 ml. Die eingesetzte Konzentration bei den Experimenten mit Rhodamin 6 G betrug 1 µM. Schwarz sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten für Rhodamin 6 G-Lösungen ohne Inhibitorzusatz dargestellt. Die blaue Kurve symbolisiert die scheinbaren Permationskoeffizienten für Rhodamin 6 G-Lösungen in Gegenwart von 1 µM PSC-833. Da der Transporterproteindetektor während der Experimente mit Rhodamin 6 G schrittweise optimiert wurde, waren die Umgebungsparameter bei den Messungen nicht identisch. Aus der graphischen Auftragung
kann
daher
keine
eindeutige
Tendenz
der
scheinbaren
Permeationskoeffizienten in Abhängigkeit von der Proliferationszeit bestimmt
97
3 ERGEBNISSE
werden. Deshalb wurden für die folgende Abbildung nur die Experimente mit identischen Umgebungsbedingungen aufgenommen.
-3
3,4x10
-3
3,2x10
-3
3,0x10
-3
2,8x10 Papp [cm/s]
-3
2,6x10
-3
2,4x10
-3
2,2x10
-3
2,0x10
-3
1,8x10
-3
1,6x10
-3
1,4x10
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
t [Tage]
Abb. 71: Scheinbare Permeationskoeffizienten Papp von Rhodamin 6 G in Abhängigkeit von der Proliferationsdauer. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833 Zusatz.
Abb. 71 zeigt die scheinbaren Permeationskoeffizienten von 1 µM Rhodamin 6 G-Lösungen in Abhängigkeit von der Zellproliferationszeit. Für diese Abbildung wurden ausschließlich die fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektionen herangezogen, die im thermostatisierten Transporterproteindetektor durchgeführt wurden. Die schwarze Kurve zeigt die scheinbaren Permeationskoeffizienten der Messungen ohne PSC-833. Hier nimmt der Wert in Abhängigkeit von der Proliferationsdauer zu. Die rot dargestellten scheinbaren Permeationskoeffizenten, die für Rhodamin 6 G-Lösungen in Gegenwart von 1 µM PSC-833 berechnet wurde, verhalten sich ähnlich. Der Kurvenverlauf ist mit dem Kurvenverlauf aus Kap. 3.9.2.2 (s. Abb. 69) für den prozentualen Rhodamin 6 G Transport in Abhängigkeit von der Proliferationzeit vergleichbar. Je länger die Proliferationszeit ist, um so mehr P-Gp ist exprimiert und um so größer ist der scheinbare
98
3 ERGEBNISSE
Permeationskoeffizient, der ein Maß für den Substrattransport pro Zeiteinheit darstellt.
3.9.3 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion von Daunomycin
O
OH
O OH CH3
OCH3
O
OH
O
H3C O H2N OH
Abb. 71: Strukturformel von Daunomycin.
In Abb. 71 ist die chemische Struktur des fluoreszierenden Wirkstoffes Daunomycin dargestellt. Diese Substanz wurde für die in-situ Detektionen der P-Gp Transportfunktion eingesetzt, um zu zeigen, dass der Transporterproteindetektor für eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt werden kann.
99
3 ERGEBNISSE
3.9.3.1 Absorptionsspektrum von Daunomycin
0.14
Absorption
0.12
0.10
0.08
0.06 400
500
600
700
Wellenlänge [nm]
Abb. 72: Absorptionsspektrum einer 10 µM Daunomycin-Lösung im Puffer B 2.
Das P-Gp Substrat Daunomycin absorbiert in einem Bereich von 410 nm bis 570 nm. Daher wurde die Fluoreszenz von Daunomycin für die in-situ Messungen mittels Transporterproteindetektor bei 480 nm angeregt. Durch die Integration der aufgenommenen Fluoreszenzspektren wurde die Fluoreszenzintensität bestimmt.
3.9.3.2 In-situ Detektion von Daunomycin (Omnichrome-Laser) Zur Vorbereitung der Messungen wurden 200.000 Caco-2 Zellen pro Well auf die Polycarbonatmembranen gesät. Innerhalb von wenigstens 8 Tagen bildete sich eine konfluente Monolage aus. Zur Kontrolle der Konfluenz wurde vor jedem Experiment der Widerstand der Zellschicht gemessen. Sobald der Transwell-Widerstand um 200 Ω größer ist als der Widerstand in einem Transwell ohne Caco-2 Zellen, kann von der Konfluenz der Zellschicht ausgegangen werden[10, 17, 20, 38, 52-54]. Nach der Kontrolle des Widerstandes wurde das Zellkulturmedium entfernt. Damit kein Zellkulturmedium auf der Zellschicht zurückbleibt, wurde die Caco-2 Zellmonolage einmal mit dem Puffer B 2 gewaschen. In den basalen Volumen wurden 4,5 ml der Farbstoff-B 2-Pufferlösung pipettiert. Die vorbereitete 100
3 ERGEBNISSE
Transwellmembran wurde auf der Küvette befestigt und mit Parafilm umwickelt. In das apikale Volumen werden 800 µl der B 2-Pufferlösung auf die Caco-2 Monolage pipettiert. Unmittelbar nachdem die Küvette in die Küvettenhalterung gestellt war, wurde mit der Messung begonnen. Als Referenz wurde das Fluoreszenzspektrum der reinen Substratlösung vor Beginn und nach Beendigung des Experimentes gemessen. Die Fluoreszenzintensität wurde durch die Integration der erhaltenen Spektren berechnet. Diese nimmt in dem eingesetzten Konzentrationsbereich linear mit der Konzentration zu. Daher werden die gemessenen Fluoreszenzspektren der apikal vorliegenden Farbstoff-Pufferlösungen integriert und danach die apikale Farbstoffkonzentration zum Zeitpunkt der Messungen berechnet. Zur Auswertung wurde der prozentuale Transport in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. In den folgenden Experimenten wurde der Transport von Daunomycin in Caco-2 Zellmonolagen mittels Transporterproteindetektor gemessen. Die Erhöhung der apikalen Farbstoffkonzentration wurde über die Zunahme der Fluoreszenzintensität bestimmt. Da der P-Gp-Substratcharakter von Daunomycin bereits bekannt ist[19, 63], erfolgt die fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion analog zu den Messungen aus Kap. 3.8.2.1. Der basal-nach-apikale Transport durch P-Gp exprimierende Caco-2 Zellen wurde in Anwesenheit und in Abwesenheit des Inhibitors PSC-833 untersucht. Mittels fluoreszenzspektroskopischer in-situ Detektion von Daunomycin wird eine Transportkinetik erstellt, die aufgrund von beliebig kurz wählbaren Zeitintervallen die Realität exakter beschreibt als bisher.
101
3 ERGEBNISSE
25 20
Transport [%]
15 10 5 0 -5 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 73: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 73 ist der prozentuale Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Die Zeit zwischen dem Einsäen der Caco-2 Zellen und den Messungen betrug
23 Tage bzw. 24 Tage. Für dieses
Experiment wurden Caco-2 Zellen aus der Passage 67 eingesetzt. Während des Experimentes wurde die Temperatur im Transporterproteindetektor gemessen. Sie lag bei 35,5°C ± 1,5°C. Die Anregungswellenlänge war λ = 488 nm. Für diese Messungen wurde zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit ein Becherglas mit destilliertem Wasser in den Transporterproteindetektor gestellt. Dennoch wurde nach der Messung genau wie bei den Experimenten mit Rhodamin 6 G ein apikaler Volumenverlust festgestellt, was einen höheren prozentualen Transport suggeriert. Da das Volumen nach der Durchführung der Experimente für die Messreihe in Abwesenheit des Inhibitors und für die Messreihe in Gegenwart des Inhibitors identisch war, sind die Messungen miteinander vergleichbar. Nach fünf Stunden werden für den basal-nach-apikalen Daunomycin Transport (schwarze Kurve) 23% des Substrates detektiert. Für den mittels einer 1 µM PSC-833 Lösung inhibierten Transport (rote Kurve) werden nach fünf Stunden 15% gemessen. Für diese 102
3 ERGEBNISSE
Abbildung wurde der 0 min-Wert als Untergrund von den folgenden Messwerten subtrahiert. Da die Fluoreszenzintensität im apikalen Volumen nach 0 min größer war als in den ersten 15 min der Messung, ergaben sich für diese Zeitspanne negative Werte. Eine Erklärung dafür ist, dass die Inhibitorwirkung in Gegenwart von Daunomycin später einsetzt als für Rhodamin 6 G. Somit wird eine höhere Inhibitorkonzentration erforderlich, um einen zu Rhodamin 6 G analogen Kurvenverlauf (s. Abb. aus Kap. 3.9.2.1) zu erhalten.
8 6
Transport [%]
4 2 0 -2 -4 -6 -8 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 74: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
Für Abb. 74 wurde die Fluoreszenzzunahme im apikalen Volumen einer Caco-2
Zellmonolage
in
Abhängigkeit
von
der
Zeit
gemessen.
Die
Anregungswellenlänge des eingesetzten Lasers betrug λ = 488 nm. Für diese Experimente wurden Caco-2 Zellen aus der Passage 61 verwendet. Die Temperatur im Transporterproteindetektor lag bei 36,2°C ± 1°C. Die Experimente wurden 8 Tage bzw. 10 Tage nach dem Einsäen der Caco-2 Zellen durchgeführt. Für dieses Experiment
wurde
durch
eine
Erweiterung
des
Messsystems
um
den
Wasserdampfentwickler die Luftfeuchtigkeit konstant eingestellt. Dieser bewirkt 103
3 ERGEBNISSE
die Erhöhung der Luftfeuchtigkeit im Transporterproteindetektor und somit eine nahezu optimale Umgebung, die einen Brutschrank simuliert. Damit blieb das apikale Volumen konstant. Es wird somit der tatsächlich erfolgende basal-nachapikale Transport detektiert. Die schwarze Kurve zeigt den basal-nach-apikalen Daunomycin Transport ohne Inhibition. Er erreicht nach fünf Stunden einen Wert von 5%. Der apikal-nach-basale Transport in Gegenwart von 1 µM PSC-833 (rote Kurve) endet bei 0%. Hier wurde, analog zur Abb. 73 der 0 min-Wert subtrahiert. Diese Absolutwerte liegen offensichtlich unter den Transportwerten, die aufgrund von Volumenverlusten gemessen wurden. Ein weiterer Grund für die deutlich kleineren Transportwerte ist die Proliferationszeit der Caco-2 Zellen. Üblicherweise wurden 10 Tage nicht unterschritten. Abb. 74 zeigt den unteren Grenzwert, in dem mit Caco-2 Zellen Transportexperimente durchgeführt werden können. Gründe für die Schwankungen im basal-nach-apikalen Kurvenverlauf sind die bereits genannte Zellproliferationszeit als auch Instabilitäten der Laserintensität während der Messung. Diese wurden während der Experimente mittels Diode und dem digitalen Multimeter aufgezeichnet.
40 35
Transport [%]
30 25 20 15 10 5 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 75: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
104
3 ERGEBNISSE
Abb. 75 zeigt den basal-nach-apikalen Transport einer 10 µM DaunomycinPuffer-Lösung mittels P-Gp exprimierender Caco-2 Zellen in Abhängigkeit von der Zeit. Die Proliferationszeit betrug 16 Tage bzw. 17 Tage. Für diese Experimente wurden Caco-2 Zellen aus der Passage 61 verwendet. Die Temperatur im Transporterproteindetektor betrug 36,25°C ± 1,75°C. Die Anregungswellenlänge des Lasers lag bei λ = 488 nm. Nach fünf Stunden werden für den schwarz dargestellten basal-nach-apikalen Daunomycin Transport 35% des Substrates detektiert. Die rote Kurve zeigt den mit PSC-833 inhibierten Transport. Dieser erreicht nach fünf Stunden 22%. Hier wurde der prozentuale Transport in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen ohne den 0 min-Wert zu subtrahieren. Aus Abb. 75 geht hervor, dass für den inhibierten Transport in den ersten 30 min kleinere Werte als für den 0 min-Wert erhalten werden.
105
3 ERGEBNISSE
3.9.3.3 Proliferationszeitabhängiger Daunomycin-Transport Im Folgenden wurde verglichen, wie sich die Länge des Zeitraumes zwischen dem Einsäen der Caco-2 Zellen und der Durchführung der Experimente auf den basal-nach-apikalen Substrattransport in Abwesenheit und in Gegenwart des
Transport [%]
Inhibitors auswirkt.
22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
t [Tage]
Abb. 76: Prozentualer, nach 4 h detektierter, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung durch Caco-2 Zellen in Abhängigkeit vom Zeitraum zwischen dem Einsäen und der Durchführung der Experimente. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, rot: 10 µM DaunomycinLösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 76 wurde der Vergleich des basal-nach-apikalen P-Gp vermittelten Transports einer 10 µM Daunomycin-Lösung in Gegenwart und in Abwesenheit des Inhibitors PSC-833 aufgetragen. Dazu wurde der nach vier Stunden apikal detektierte Farbstofftransport in Abhängigkeit von der Proliferationszeit abgebildet. Die schwarze Kurve kennzeichnet den Farbstofftransport der 10 µM DaunomycinLösung. Die rote Messkurve ist die apikal detektierte Daunomycin Konzentration, die in Gegenwart einer 1 µM PSC-833 Lösung gemessen wurde. Für Abb. 76 wurden die nach vier Stunden gemessenen Transportwerte der zum Teil bereits
106
3 ERGEBNISSE
gezeigten
Transportexperimente
herangezogen.
Damit
diese
Messwerte
vergleichbar sind, wurde der 0 min-Wert für alle Messungen subtrahiert, bevor die Auftragung in Abhängigkeit von der Proliferationszeit erfolgte. Die Transportwerte für den 8. Tag bzw. 10. Tag nach dem Einsäen wurden aus Abb. 74 entnommen. Analog dazu ist der prozentuale Transport für den 23. Tag bzw. 24. Tag nach dem Einsäen der Caco-2 Zellen bereits in Abb. 73 dargestellt. Die Transportwerte für den 17. Tag bzw. 18. Tag wurden aus zwei Experimenten gemittelt. In Abwesenheit wie in Gegenwart des Inhibitors ist zu beobachten, dass die Messwerte in die Sättigung gehen. Diese Messungen bestätigen die in Abb. 69 dargestellten Ergebnisse, durch die offensichtlich wurde, dass die P-Gp Zahl zunimmt, wenn die Zeit zwischen dem Einsäen der Zellen und den Messungen verlängert wird. Je länger die Proliferationszeit der Caco-2 Zellen wird, desto größer wird die Anzahl der exprimierten P-Gps. In Abhängigkeit davon wird mehr Substrat vom Donor- in das Akzeptorvolumen transportiert. Der Inhibitor PSC-833 konkurriert mit dem Substrat um die exprimierten P-Gps. Diese Tatsache ist unabhängig von der Gesamtzahl der P-Gps. Abb. 76 zeigt, dass die Differenz zwischen dem basal-nachapikalen Transport in Abwesenheit des Inhibitors und dem basal-nach-apikalen Transport in Gegenwart von PSC-833 nur eine geringe Abhängigkeit von der gewählten Zeitspanne zwischen dem Einsäen der Zellen und den Messungen aufweist. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtung sind die Ergebnisse der einzelnen Experimente vergleichbar.
3.9.3.4 Scheinbare Permeationskoeffizienten von Daunomycin Die scheinbaren Permeationskoeffizienten der fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektionen mit 10 µM Daunomycin-Pufferlösung wurden analog zu Kap. 3.8 und Kap. 3.9.2.3 nach der folgenden Formel berechnet: dc V Papp = dt A × c0
107
3 ERGEBNISSE
c bedeutet die Konzentration, c0 ist die Anfangskonzentration, V stellt das Volumen dar, A ist die Wachstumsoberfläche des Wells und t steht für die Zeit. Die Einheit der scheinbaren Permeationskoeffizienten ist [cm/s]. -4
1,6x10
-4
1,4x10
-4
Papp [cm/s]
1,2x10
-4
1,0x10
-5
8,0x10
-5
6,0x10
-5
4,0x10
-5
2,0x10
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
t [Tage]
Abb. 77: Scheinbare Permeationskoeffizienten Papp von Daunomycin in Abhängigkeit von der Proliferationsdauer. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, blau: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833 Zusatz. Abb. 77 zeigt den scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von Caco-2 Zellen in Abhängkeit von der Proliferationsdauer. Die Berechnungen dafür erfolgten analog zu den Berechnungen aus Kap. 3.8 und Kap 3.9.2.3. Die Konzentrationsänderungen in Abhängigkeit von der Zeit wurden aus den graphischen Darstellungen der Messungen abgelesen. Das apikal vorliegende Probenvolumen betrug 0,8 ml. Die eingesetzte Daunomycin-Konzentration für die Transportexperimente war 1 µM. Die schwarze Kurve symbolisiert die scheinbaren Permeationskoeffizienten für Daunomycin-Lösungen ohne den Inhibitor PSC-833. In rot sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten für Daunomycin-Lösungen in Gegenwart von 1 µM PSC-833 dargestellt. Die scheinbaren Permeationskoeffizienten nehmen in Abhängigkeit von der Proliferationsdauer zu. Sie verlaufen wie die Kurven in Kap. 3.9.3.3 (s. Abb. 76) nahezu parallel zueinander. Für alle insitu Detektionen, in denen Daunomycin als P-Gp Substrat eingesetzt wurde, wurde
108
3 ERGEBNISSE
der Transporterproteindetektor thermostatisiert. Somit ist die Vergleichbarkeit der Experimente und der daraus berechneten scheinbaren Permeationskoeffizienten gegeben. Wie bereits in Abb. 76 für die Abhängigkeit des prozentualen basal-nachapikalen Transports beobachtet wurde, nimmt die Zahl der exprimierten P-Gps mit der Proliferationszeit zu. Zur Proliferationzeit proportional steigen die scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp.
3.9.4 Fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion (Coherent Laser) Wie für die bereits beschriebenen Experimente wurden 200.000 Caco-2 Zellen pro Well auf die Polycarbonatmembranen gesät, die eine konfluente Monolage ausbildeten. Zur Kontrolle der Konfluenz wurde vor jedem Experiment der Widerstand der Zellschicht gemessen. Nach der Kontrolle des Widerstandes wurde das Zellkulturmedium entfernt. Damit kein Zellkulturmedium auf der Zellschicht zurückbleibt, wurde die Caco-2 Zellmonolage einmal mit dem B 2Puffer gewaschen. In das basale Volumen wurden 4,5 ml der zu untersuchenden Farbstoff-B 2-Pufferlösung pipettiert. Die vorbereitete Transwellmembran wurde auf die Küvette gesteckt und mit Parafilm umwickelt. In das apikale Volumen werden 800 µl der B 2-Pufferlösung pipettiert. Nachdem die Küvette in die Küvettenhalterung gestellt wurde, wurde mit der Messung begonnen. Die Fluoreszenz der reinen Substratlösung wurde als Referenz vor Beginn und nach Beendigung des Experimentes bestimmt. Die Fluoreszenzintensität wurde durch die Integration der erhaltenen Spektra berechnet. Diese nimmt in dem eingesetzten Konzentrationsbereich linear mit der Konzentration zu. Daher werden die Fluoreszenzspektren der apikal vorliegenden Farbstoff-Pufferlösungen integriert und danach die apikale Farbstoffkonzentration zum Zeitpunkt der Messungen berechnet. Zur Auswertung wurde der prozentuale Transport in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen. Bei den in Kap. 3.9.2.1 und Kap. 3.9.3.2 abgebildeten Experimenten stieg der prozentuale basal-nach-apikale Transport teilweise ungleichmäßig an. Da bisher als möglicher Grund Laserinstabilitäten nicht eindeutig ausgeschlossen werden 109
3 ERGEBNISSE
konnten, wurden weitere fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektionen für Daunomycin, Rhodamin 6 G und Rhodamin 123 durchgeführt. Für diese Messungen stellte Coherent freundlicherweise einen intensitätsstabilisierten Laser zur Verfügung. Die Anregungswellenlänge λ = 488 nm eignete sich gut für die bereits genannten fluoreszierenden Substrate.
3.9.4.1 In-situ Detektion von Daunomycin (Coherent-Laser) 10,5 10,0
Transport [%]
9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 -20
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200 t [min]
Abb. 78: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Daunomycin-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 10 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Daunomycin-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 78 ist der basal-nach-apikale Transport einer 10 µM DaunomycinPufferlösung in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Dafür wurde die Fluoreszenz des Substrates im apikalen Volumen gemessen und mittels Integration die Fluoreszenzintensität berechnet. Die schwarze Kurve beschreibt den Transport der inhibitorfreien Daunomycin-Pufferlösung. Nach 180 min werden 10,5% des Substrates im apikalen Volumen detektiert. Die rote Kurve zeigt den basal-nachapikalen Transport der 10 µM Daunomycin-Lösung in Gegenwart von einer 1 µM PSC-833-Lösung. Hier werden nach 180 min 9% des Substrates im apikalen
110
3 ERGEBNISSE
Volumen gemessen. Die Temperatur im Transporterproteindetektor lag bei 36,45°C ± 1,85°C. Mittels Wasserdampfentwickler wurde die Luftfeuchtigkeit einem Inkubator
angepasst.
Die
für
diese
fluoreszenzspektroskopischen
in-situ
Detektionen eingesetzten Caco-2 Zellen gehörten der Passage 66 an. Die Experimente wurden 12 Tage bzw. 14 Tage nach dem Einsäen der Caco-2 Zellen durchgeführt. Die Laserintensitätsstabilität wurde mittels Diode und dem digitalen Multimeter über die Spannungsunterschiede gemessen. Zusätzlich wurde die Stabilität des Lasers über die Spannungsmessung direkt am Netzteil des Lasers gemessen, die proportional zur Laserintensität ist. Hier änderte sich die Spannung im Verlauf der Messung um maximal 0,01 V. Diese Laserstabilitätsmessung wurde durchgeführt, um mögliche Fehler, die bei der Messung der Streustrahlung auftreten können, festzustellen. Es treten während der Detektion der Streustrahlung Inhomogenitäten auf, die nur durch die Variation in der zweiten Nachkommastelle bei der direkten Spannungsmessung am Laser verifiziert werden können. Es ist offensichtlich, dass die Messungen mit dem intensitätsstabilisiertem Laser die Ergebnisse aus Kap. 3.9.3.2 bestätigen.
111
3 ERGEBNISSE
3.9.4.2 In-situ Detektion von Rhodamin 6 G (Coherent-Laser) 40 35
Transport [%]
30 25 20 15 10 5 0 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 79: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 1 µM Rhodamin 6 GLösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
In Abb. 79 ist der prozentuale Transport einer 1 µM Rhodamin 6 G-Lösung dargestellt. In Abhängigkeit von der Zeit nimmt apikal die Substratkonzentration zu. Die Anregungswellenlänge lag bei λ = 488 nm. Während der Experimente wurde im Transporterproteindetektor eine Temperatur von 36,4°C ± 1,6°C gemessen. Die Luftfeuchtigkeit wurde mittels Wasserdampfentwickler wie im Brutschrank eingestellt. Die Caco-2 Zellmonolagen wurden aus der Passage 66 generiert. Die Zeitspanne zwischen dem Einsäen der Zellen und den Experimenten betrug 17 Tage bzw. 18 Tage. Die Laserintensität wurde sowohl über die Streustrahlung als auch direkt am Netzteil des Lasers detektiert. In diesen Experimenten änderte sich die Spannung im Verlauf der Messung um maximal 0,006 V. Die Laserintensitätsinstabilitäten konnten in diesen Experimenten vernachlässigt werden. Analog dazu zeigt der Kurvenverlauf des basal-nachapikalen Transports deutlich weniger Unregelmäßigkeiten als für Daunomycin. Die schwarze Kurve stellt den Substrattranport ohne Inhibition dar. Nach fünf Stunden 112
3 ERGEBNISSE
werden apikal 35% des Farbstoffes detektiert. Die rote Kurve zeigt den P-Gp vermittelten Rhodamin 6 G-Transport in Gegenwart von 1 µM PSC-833. Hier wird nach fünf Stunden 30% des Substrates apikal gemessen. Die Kurven verlaufen nahezu parallel. Eine Sättigung wird nicht beobachtet. Das ist von der eingesetzten Farbstoffkonzentration und der Proliferationszeit abhängig. Die in Kap. 3.9.2.2 gemessenen Werte für die Abhängigkeit des basal-nach-apikalen Transports liegen höher als die hier detektierten Werte. Das ist damit zu begründen, dass es im Gegensatz zu den Messungen aus Kap. 3.9.2.2 für dieses Experiment möglich war mittels Wasserdampfentwickler das apikal vorliegende Volumen konstant zu halten. Deswegen wurde die apikale Substrat-Lösung nicht hochkonzentriert und folglich keine höhere Fluoreszenz detektiert. Die in Abb. 79 dargestellten prozentualen basal-nach-apikalen Transportwerte wurden unter optimierten physiologischen Umgebungsbedingungen im Transporterproteindetektor erhalten. Mit diesem Messsystem ist es für Rhodamin 6 G möglich, einen detaillierte Transportkinetik zu erhalten. Rhodamin 6 G eignet sich folglich hervorragend für die Untersuchung der Wirkungen nichtfluoreszierender P-Gp Inhibitoren auf den Substrattransport durch Caco-2 Zellmonolagen.
113
3 ERGEBNISSE
3.9.4.3 In-situ Detektion von Rhodamin 123 (Coherent-Laser) 80 70
Transport [%]
60 50 40 30 20 10 0 -10 0
50
100
150
200
250
300
t [min]
Abb. 80: Prozentualer, von basal nach apikal erfolgender Transport einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung durch Caco-2 Zellen. Schwarz: 10 µM Rhodamin 123Lösung in B 2-Puffer, rot: 1 µM Rhodamin 123-Lösung in B 2-Puffer mit 1 µM PSC-833.
Für Abb. 80 wurde der basal-nach-apikale Transport einer 10 µM Rhodamin 123-Lösung in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die Anregungswellenlänge betrug λ = 488 nm. Die Zellmonolagen wurden von Caco-2 Zellen der Passage 66 gebildet.
Ihre
Konfluenz
wurde,
wie
in
allen
Experimenten
mittels
Widerstandsmessung vor den Messungen überprüft. Die Temperatur im Transporterproteindetektor lag bei 37,0°C ± 1,2°C. Die Zellproliferationszeit betrug 19 Tage bzw. 20 Tage. Die Laserintensität wurde über die Streustrahlung und über die direkte Spannungsmessung am Netzteil des Lasers detektiert. In diesen Experimenten änderte sich die Spannung im Verlauf der Messung um maximal 0,008 V und lag damit geringfügig über der für Rhodamin 6 G gemessenen Spannungsänderung. Die schwarze Messkurve zeigt den basal-nach-apikalen uninhibierten Substrattransport der 10 µM Rhodamin 123-Lösung. Die Kurve nähert sich nach fünf Stunden asymptotisch einem Wert von 75% an. Parallel dazu verläuft die rote Kurve. Diese stellt den Substrattransport in Gegenwart von PSC-
114
3 ERGEBNISSE
833 dar. Sie erreicht nach fünf Stunden 60%. Durch die Inhibition mit einer 1 µM PSC-833 Lösung wird eine um 15% kleinere Rhodamin 123-Konzentration ins apikale Volumen geschleust. In Kap. 3.6.3 wurden für den basal-nach-apikalen Transport maximal 45% des Fluoreszenzfarbstoffes detektiert. Mit Inhibitorzusatz wurden bis zu 20% des Substrates im apikalen Volumen detektiert. Der Unterschied in den Transportwerten lässt sich mit der Zellproliferationszeit begründen. Die Messung, die in Kap. 3.6.3 dargestellt wurde, wurde 10 Tage nach dem Einsäen der Zellen durchgeführt.
3.9.4.4 Bestimmung der scheinbaren Permeationskoeffizienten In der folgenden Tabelle sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten aus den fluoreszenzspektroskopischen in-situ Detektionen aufgetragen, für die der intensitätsstabilisierte Laser zur Fluoreszenzanregung eingesetzt wurde.
Substrat Daunomycin Rhodamin 6 G Rhodamin 123
Konzentration [µM] 10 1 10
Papp ohne PSC-833 [cm/s] 2,3 × 10-5 1,3 × 10-3 4,3 × 10-4
Papp mit PSC-833 [cm/s] 1,2 × 10-5 9,7 × 10-4 3,6 × 10-4
Tab. 5: Übersicht der scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von verschiedenen Substrat-Lösungen.
In Tab. 5 sind die scheinbaren Permeationskoeffizienten Papp von Daunomycin-, Rhodamin 6 G- und Rhodamin 123-Pufferlösungen angegeben. Diese Berechnungen erfolgten analog zu den Berechnungen aus den Kap. 3.8, Kap. 3.9.2.3 und Kap. 3.9.3.4. Als ∆t wurden 1,08 × 104 s gewählt. Die Änderung der Konzentration wurde aus den graphischen Darstellungen der Experimente abgelesen. Das apikal vorliegende Volumen war 0,8 ml. Die eingesetzten Substratkonzentrationen sind aus der zweiten Spalte von Tab. 5 zu entnehmen. Für alle Substrate wurde beobachtet, dass der scheinbare Permeationskoeffizient Papp für
115
3 ERGEBNISSE
den unihibierten basal-nach-apikalen Substrattransport größer ist als der scheinbare Permeationskoeffizient in Gegenwart des Inhibitors PSC-833. Somit werden die Ergebnisse aus den oben genannten Kapiteln für die eingesetzten Substrate bestätigt.
116
4 ZUSAMMENFASSUNG
4 ZUSAMMENFASSUNG
In dieser Dissertation wurden pharmakologische Untersuchungen zur PGlykoprotein Exprimierung, zum Wachstum der Caco-2 Zellen, der Farbstoff- und Inhibitortoxizität, den Transportexperimenten mittels konventioneller Methoden und dem neu etablierten Transporterproteindetektor durchgeführt. Mittels Immuncytochemie wurden die in Caco-2 Zellen exprimierten P-Glykoproteine markiert. Verschiedene Pufferlösungen wurden untersucht, um eine geeignete, nichtfluoreszierende Lösungsmittelumgebung für die Experimente zu finden. Als geeigneter Puffer ist der Krebs-Ringer-Puffer B 2 ausgewählt worden. Die Toxizität der Fluoreszenzfarbstoffe und des Inhibitors PSC-833 wurde durch die MTTVerstoffwechselung in Caco-2 Zellen überprüft. Des Weiteren wurden mittels Widerstands- und der Zellproliferationsmessung sinnvolle Proliferationszeiten und die
für
die
Messungen
optimale
Zelldichte
festgestellt.
Für
die
Transportexperimente wurden die fluoreszierenden Substrate Sulforhodamin BNatriumsalz, Rhodamin 123, Rhodamin 6 G und Daunomycin eingesetzt. Zuerst wurden die Transportexperimente in Abwesenheit und in Gegenwart des Inhibitors PSC-833 durchgeführt, für die die Probenentnahme in 1 h Intervallen erfolgte. Ferner wurde der Farbstofftransport mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie verfolgt. Um eine detaillierte Kinetik unter optimierten Umgebungsbedingungen zu erhalten, wurde schrittweise der Transporterproteindetektor entwickelt. Dieses Messgerät leistet die in-situ Detektion vom Substrattransport über Zellmonolagen, der von P-Gp vermittelt wird. Die in-situ Detektion wird fluoreszenzspektroskopisch als eine online Technik durchgeführt. Vorteil dieser kontinuierlich arbeitenden Messtechnik ist, dass keine Probenentnahmen notwendig sind, die zu systematischen Messfehlern führen. Des Weiteren entfallen die hohen Kosten, da anstelle von radioaktiv markierten Substanzen kostengünstigere Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt wurden. Die zu treffenden Sicherheitsvorkehrungen sind somit weniger zeit- und geldaufwändig. Ferner müssen keine speziell abgeschirmten Laborräume unterhalten werden.
117
5 SUMMARY
5 SUMMARY Multidrug resistance in tumor cells often arises from the overexpression of the plasma transporter P-Gp mediating efflux of a broad variety of chemotherapeutic drugs and antibiotics across the apical membrane of enterocytes. In this work the inhibition of P-Gp by the agent PSC-833 was investigated upon monitoring P-Gp efflux kinetics of rhodamine dyes and the chemotherapeuticum daunomycine across Caco-2 cell membranes. Therefore proliferation studies of Caco-2 cells, immunocytochemistry experiments providing evidence of expressed P-Gp, toxicity studies of the rhodamine dyes and the P-Gp inhibitor PSC-833 as well as and time-resolved fluorescence spectroscopy measurements of the P-Gp mediated transport kinetics were carried out. As highlight a fluorescence spectroscopy device, the so-called transporter protein detector, was developed that allows for time-resolved in-situ monitoring of fluorescent substrates traversing Caco-2 cell monolayers. The main function of the transporter protein detector is focused to the pharmacological application as screening tool for fast characterization of the effect of agents and drugs (e.g. potential inhibitor drugs) on the efflux kinetics of transporter membranes. For the transport studies Caco-2 cells were cultured on a permeable polycarbonate filter until they have formed a confluent monolayer where P-Gp was expressed at the apical cell surfaces. The optimum proliferation time and celldensity of Caco-2 cell monolayers were obtained from proliferation and electric resistance measurements. The rhodamine dyes under study were two positively charged compounds, rhodamine 123 and rhodamine 6 G and a negatively charged one, sulforhodamine B sodium salt. The toxicity of the fluorescent dyes, daunomycine and the inhibitor PSC-833 was examined using the MTT metabolization procedure. Transmembrane transport of the rhodamine dyes in the absorptive and secretory direction was monitored in the presence and absence of PSC-833 by detecting the fluorescence intensity of the dye in the respective receiver compartment. All rhodamine dyes and daunomycine were observed to act as P-Gp
118
5 SUMMARY
substrates. Their apparent permeation coefficients, Papp, were determined with values between 4.4 × 10-10 and 1.0 × 10-4 cm/s. Their effluxes were found to be significantly inhibited by PSC-833. In addition, the transport properties of the fluorescent dyes were investigated by CLSM imaging.
119
6 AUSBLICK
6 AUSBLICK Der Transporterproteindetektor leistet eine Zeitauflösung für die direkte Messung der Transportkinetiken im Bereich von ms und ist damit allen bisher zur Verfügung stehenden Messmethoden überlegen. Aufgrund der präsentierten Ergebnisse und der zitierten Forschungsarbeiten wird deutlich, dass eine große Bandbreite fluoreszierender Substanzen eingesetzt werden kann, sofern sie Substrate des zu untersuchenden Transportsystems sind. Diese Methode ist für sämtliche Zellarten geeignet, die auf einer permeablen Membran konfluente Monolagen bilden. Prinzipiell kann der Substrattransport und seine Inhibition in apikal-nach-basaler und basal-nach-apikaler Richtung untersucht werden. Die fluoreszenzspektroskopische in-situ Detektion kann als schnelle RoutineMesstechnik für das Screening von Wirkstoffen eingesetzt werden, deren Einfluss auf die Transporterfunktion von Membranproteinen bzw. anderen in Zellmembranen lokalisierten Transportsystemen für die Optimierung von Chemotherapien quantitativ erfasst werden muss.
120
7 ANHANG
7 ANHANG 7.1 Chemikalien Reagenzien Thiazolylblau, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium Bromid (MTT) Dimethylsulfoxid Trypanblau Salzsäure 1M Isopropanol Methanol Sulforhodamin B-Natriumsalz Rhodamin 123 Rhodamin 6 G Natriumdodecylsulfat (SDS) NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 Glucose, wasserfrei HEPES EDTA NaHCO3
Firma Fa. Sigma-Aldrich
Fa. Fluka Fa. Sigma-Aldrich Fa. Fluka Fa. Roth Fa. Aldrich Fa. Sigma Fa. Aldrich Fa. Sigma Fa. Merck Fa. Fluka Fa. Fluka Fa. Merck Fa. Merck Fa. Sigma-Aldrich Fa. Sigma Fa. Sigma-Aldrich Fa. Merck
7.2 Lösungen Trypanblaulösung Reagenzien Trypanblaulösung 0,4% Penicillin/Streptomycin
Menge 100,00 ml 5,00 ml
MTT-Lösung Reagenzien MTT PBS
Menge 250,00 mg 50,00 ml
121
7 ANHANG
SDS-Lösung Reagenzien Natriumdodecylsulfat (SDS) 1M HCl H2 O
Menge 10,00 g 1,00 ml 49,00 ml
PBS-Lösung Reagenzien NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4
Menge [mg/l] 8000,00 200,00 1150,00 200,00
CBFHH-Pufferlösung Reagenzien NaCl KCl MgSO4 × 7 H2O KH2PO4 Na2HPO4 × 2 H2O Glucose, wasserfrei HEPES
Menge [g/l] 200,00 40,00 20,00 6,00 5,97 100,00 47,66
B 1-Pufferlösung Reagenzien NaCl KCl NaHCO3 D-Glucose HEPES EDTA
Menge [g/l] 8,99 0,41 2,10 0,90 4,76 7,30
B 2-Pufferlösung Reagenzien NaCl KCl NaHCO3 D-Glucose HEPES
Menge [g/l] 8,99 0,41 2,10 0,90 4,76
122
7 ANHANG
7.3 Medien Antibiotikum Reagenzien Penicillin Streptomycin
Menge 10.000 IE 10.000 µg/ml
GlutaMAX-Lösung Reagenzien L-Alanyl-L-Glutamin NaCl
Menge 200,00 mM 0,85 %
MEM nichtessentielle Aminosäuren (100X) Komponenten L-Alanin L-Asparagin L-Aspartamic Acid L-Glutamic Acid Glycin L-Prolin L-Serin
mg/l 890,00 1320,00 1330,00 1470,00 750,00 1150,00 1050,00
Zuchtmedium, Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM) Komponenten Anorganische Salze CaCl2 × 2 H2O Fe(NO3)3 × 9 H2O KCl MgSO4 × 7 H2O NaCl Na HCO3 NaH2PO4 × 2 H2O Andere Komponenten: D-Glucose Phenolrot HEPES Aminosäuren: L-Arginin × HCl L-Cystin L-Glutamin Glycin
mg/l 264,00 0,10 400,00 200,00 3500,00 3700,00 141,00 4500,00 15,00 5958,00 84,00 48,00 580,00 30,00 123
7 ANHANG
L-Histidin HCl × H2O L-Isoleucin L-Leucin L-Lysin × HCl L-Methionin L-Phenylalanin L-Serin L-Threonin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Valin Vitamin: D-Ca Pantothenat Cholinchlorid Folsäure i-Inositol Niacinamid Pyridoxal HCl Riboflavin Thiamin HCl
42,00 105,00 105,00 146,00 30,00 66,00 42,00 95,00 16,00 72,00 94,00 4,00 4,00 4,00 7,20 4,00 4,00 0,40 4,00
Für das Zuchtmedium werden 430 ml D-MEM mit 50 ml inaktiviertem fetalem Kälberserum, 5 ml Penicillin/Streptomycinlösung, 5 ml GlutaMAX, 5 ml Natriumpyruvat und 5 ml nichtessentiellen Aminosäuren versetzt.
Einfriermedium Für das Einfriermedium werden 4 ml Zuchtmedium ohne Zusätze mit 4 ml inaktiviertem fetalen Kälberserum und 2 ml DMSO (20%iger Gehalt) versetzt. Das Lösungsmittel verhindert die Kristallisation des Wassers und damit die Zerstörung der Zellen während des Gefrierens.
124
7 ANHANG
Zusammensetzung des fetalen Kälberserums[50] Inhaltsstoff Endotoxin Hämoglobin Glucose Natrium Kalium Chlorid Stickstoff (Blutharnstoff) Gesamtprotein Albumin Calcium Anorg. Phosphor Cholesterin Harnsäure Kreatinin Gesamt-Bilirubin Direktes Bilirubin Alkalische Phosphatase Lactatdehydrogenase Glutamat-Oxalat-Transaminase 340 Selen Cortison Insulin Parthyroid Progesteron T3 T4 Testosteron Prostaglandin E Prostaglandin F TSH FSH Wachstumshormon Prolaktin LTH Vitamin A Vitamin E pH
Durchschnittlicher Gehalt 0,356 ng/ml 11,30 mg/dl 125,00 mg/100 ml 137,00 meq/l 11,20 meq/l 103,00 meq/l 16,00 mg/100 ml 3,80 g/100 ml 2,30 g/100 ml 13,50 mg/100 ml 9,80 mg/100 ml 31,00 mg/100 ml 2,90 mg/100 ml 3,10 mg/100 ml 0,40 mg/100 ml 0,20 mg/100 ml 255,00 mU/ml 864,00 mU/ml 130,00 mU/ml 0,026 µg/ml 0,05 µg/100 ml 10,00 µg/ml 1718,00 pg/ml 8,00 ng/100 ml 119,00 ng/100 ml 12,10 ng/100 ml 40 ng/ml 5,91 ng/ml 12,33 ng/ml 1,22 ng/ml 9,50 ng/ml 39,00 ng/ml 17,60 ng/ml 0,79 ng/ml 9,00 µg/100 ml 0,11 mg/10 ml 7,40
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DANKSAGUNG
DANKSAGUNG Diese Dissertation wurde im Institut für Physikalische Chemie am Lehrstuhl I angefertigt. Herrn Prof. D. M. Guldi danke ich für die freundliche Aufnahme in das Institut und die Übergangsfinanzierung. Mein besonderer Dank gilt meiner Doktormutter Frau Prof. C. Kryschi für die Überlassung des interdisziplinären Themas, für ihre gewährte Unterstützung sowie für ihre Anregungen. Für die kollegiale Aufnahme danke ich allen Mitarbeitern. Ich danke Bianca Gabel, Catalin Rusu, Radu Comanici, Stefanie Klein, Carla Cimpean, Volker Kuntermann und Vincent Groenewegen für die freundschaftliche Zusammenarbeit. Ralf Ritthammer danke ich für die gemeinsame Forschungstätigkeit im Rahmen seiner Zulassungsarbeit. Ich danke Friedhold Wölfel und seinen Mitarbeitern aus der Werkstatt für den Bau des in Abb. 61 dargestellten Transporterproteindetektors. Dirk Harnisch danke ich für seine Hilfe und seine Anregungen. Herrn Prof. M. F. Fromm, dem Inhaber des Lehrstuhls für Klinische Pharmakologie und Klinische Toxikologie, danke ich für die Überlassung der Caco2 Zellen und für die Nutzung der Institutsinfrastruktur. Herrn Prof. R. Böcker danke ich für seine Einweisung in den Umgang mit radioaktiv markierten Substraten. Dr. med. Iouri Bachmakov, Dr. rer. nat. Franz Mörl, Beate Endreß und Rastislav Krajcik danke ich für Ihre gewährte Unterstützung bei der Arbeit mit Caco-2 Zellen. Ich bedanke mich bei Prof. C. Koch für seine Erlaubnis, sämtliche Geräte und Lösungen in der Biochemie zu autoklavieren. Der Dr. Hertha und Helmut Schmauser-Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung, die den Erwerb des CO2-Inkubators der Fa. Binder ermöglichte. Der Firma Coherent bin ich für die Überlassung des intensitätsstabilisierten Lasers zu Dank verpflichtet. Ich danke der Firma Novartis für die Überlassung des Inhibitors PSC-833. Besonders möchte ich meinen Eltern danken, die mich immer in jeder Hinsicht unterstützt haben, und meiner Schwester. 130
