CAPÍTULO 2.3.14.

FIEBRE CATARRAL MALIGNA

RESUMEN La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad aguda, generalizada y habitualmente fatal que afecta a muchas especies de Artiodactyla. Se ha descrito que la enfermedad afecta con mayor frecuencia a especies de la subfamilia Bovinae y la familia Cervidae, pero también se ha comprobado en cerdos domésticos así como en jirafas y especies de antílopes pertenecientes a la subfamilia Tragelaphinae. La FCM se caracteriza por acumulaciones celulares linfoides características en órganos no linfoides, vasculitis e hiperplasia de linfocitos T en órganos linfoides, y puede ser causada por uno de los dos gammaherpesvirus. El herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1), cuyo hospedador natural, el ñu, no se ve afectado en apariencia, causa la enfermedad en bóvidos en regiones de África y en una variedad de especies rumiantes en colecciones zoológicas de todo el mundo. El herpesvirus-2 ovino (OvHV-2), que prevalece en todas las variedades de ovejas domésticas como una infección subclínica, es la causa de la FCM en la mayor parte del mundo. Esta forma de la enfermedad se calificó primeramente como FCM asociada a la oveja. En ambas formas de la enfermedad, los animales que tienen la enfermedad clínica no son fuente de infección, ya que el virus sólo lo excretan los hospedadores naturales, ñues y ovejas, respectivamente. Normalmente, la FCM aparece de forma esporádica y afecta a unos pocos animales, aunque ambos virus pueden provocar epizootias. Existe una gradación marcada en la susceptibilidad hacia la forma OvHV-2 de la FCM que varía desde la resistencia relativa de Bos taurus y B. indicus, pasando por el búfalo de agua y muchas especies de ciervos, hasta los muy susceptibles ciervos del Père David y vacas de Bali. La enfermedad puede presentar un espectro amplio de manifestaciones clínicas que varían desde la forma aguda, en la que se observan cambios mínimos previos a la muerte, hasta los casos más complejos caracterizados por fiebre alta, opacidad bilateral de la córnea, descargas catarrales profusas de ojos y nariz, necrosis del hocico y erosión del epitelio bucal. La infectividad sólo puede recuperarse a partir de los animales con la forma AIHV-1 de la FCM empleando técnicas que mantienen la viabilidad de las células hospedadoras, mientras que la forma OvHV-2 nunca se ha recuperado a partir de los animales afectados. Normalmente el diagnóstico se consigue observando los cambios histopatológicos característicos, aunque la detección del ADN vírico en cualquiera de las formas de la enfermedad se ha convertido en la opción preferida. Identificación del agente: El AIHV-1 se puede recuperar a partir de los animales afectados clínicamente utilizando leucocitos de sangre periférica o suspensiones celulares preparadas a partir de ganglios linfáticos o bazo, pero la viabilidad celular debe conservarse durante el proceso ya que la infectividad no se puede recuperar de células muertas. También se puede recuperar el virus a partir de los ñues, o de leucocitos de sangre periférica o de suspensiones celulares de otros órganos. Probablemente la mayoría de los cultivos en monocapas de origen rumiante son susceptibles y desarrollan efecto citopático (ECP), aunque se han usado extensamente los cultivos celulares de tiroides de bovino para recuperar el virus. Los aislados primarios producen de forma típica un ECP multinucleado en el cual se puede identificar el antígeno vírico mediante inmunofluorescencia o inmunocitoquímica empleando antisueros adecuados o anticuerpos monoclonales. El agente OvHV-2 nunca se ha identificado formalmente, aunque las líneas celulares linfoblásticas propagadas a partir de animales infectados contienen el ADN específico del OvHV-2. El ADN vírico se ha detectado en el material clínico procedente de casos de FCM causada tanto por el AIHV-1, como por el OvHV-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa, y éste se ha convertido en el método elegido para el diagnóstico de la forma OvHV-2 de la enfermedad.

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Capítulo 2.3.14. — Fiebre catarral maligna

Pruebas serológicas: El ñu infectado, el hospedador natural, desarrolla de forma estable anticuerpos contra el AIHV-1, que se pueden detectar en una variedad de ensayos, entre ellos, de neutralización vírica, de inmunoelectrotransferencia, de enzimoinmunoensayo, de inmunofluorescencia y de inmunocitoquímica. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos de los animales afectados clínicamente es limitada y no desarrollan anticuerpos neutralizantes, de modo que la detección depende del empleo de ensayos de inmunofluorescencia o de inmunoelectrotransferencia. Los anticuerpos contra el OvHV-2 sólo se han detectado empleando el AIHV-1 como fuente de antígeno. De forma invariable, las ovejas domésticas producen anticuerpos que se pueden detectar mediante inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia. Frecuentemente se pueden detectar los anticuerpos en las vacas con FCM mediante inmunofluorescencia, en tanto que en animales afectados de forma más grave, tales como los ciervos, no siempre están presentes los anticuerpos. El enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) más recientemente desarrollado parece tener una sensibilidad y especificidad igual o mayor que otras pruebas. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: No se han desarrollado vacunas contra esta enfermedad.

A. INTRODUCCIÓN La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad generalmente fatal de vacas y muchas otras especies de Artiodactyla, que tiene lugar después de una infección, bien con el herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1) o bien con el herpesvirus-2 ovino (OvHV-2). El ñu (Connochaetes spp. de la subfamilia Alcelaphinae), el hospedador natural del AIHV-1, no sufre enfermedad clínica después de la infección. De la misma forma, la infección de la oveja doméstica, el hospedador natural del OvHV-2, no se asocia con ninguna reacción clínica. La enfermedad causada por el AIHV-1 se limita a aquellas áreas de África en las que están presentes los ñues y a las colecciones zoológicas en cualquier otro sitio, y en un principio se calificó como FCM derivada del ñu. La forma OvHV-2 de la enfermedad tiene lugar en cualquier parte del mundo donde se practique la cría de ovejas, y se ha descrito como FCM asociada a ovejas (SA). Ambas formas de la enfermedad pueden presentar un espectro amplio de manifestaciones clínicas, aunque los cambios histopatológicos característicos son muy similares en todos los casos.

•

Cambios clínicos y patológicos

Los signos clínicos de la FCM son muy variables y van desde una forma peraguda a una crónica en la que, en general, las manifestaciones más evidentes aparecen en los casos más prolongados. En la forma peraguda o bien no se detectan signos clínicos, o bien se puede desarrollar depresión seguida de diarrea o disentería durante 12-24 horas antes de la muerte. En general, el inicio de los signos se asocia con la aparición de fiebre, lagrimeo seroso abundante y exudado nasal, que progresa hasta descargas mucopurulentas profusas. Los animales pueden estar inapetentes y se puede reducir la producción de leche. De forma característica, desarrollan opacidad bilateral progresiva de la córnea, que comienza en la periferia. En algunos casos aparecen lesiones en la piel (caracterizadas por ulceración y exudación), que pueden formar costras endurecidas asociadas con la necrosis de la epidermis, y frecuentemente están restringidas al perineo, las ubres y pezones. La salivación asociada con la hiperemia puede ser un signo temprano, que progresa hasta provocar erosiones en la lengua, el paladar duro, las encías y, de manera característica, las porciones distales de las papilas bucales. Los ganglios linfáticos superficiales se pueden infartar y las articulaciones de los miembros se pueden inflamar. Es posible que presenten signos nerviosos tales como hiperestesia, falta de coordinación, nistagmo y presión de cabeza en ausencia de otros signos clínicos o como parte de un síndrome característico más amplio. Existe un amplio espectro de susceptibilidad a la enfermedad inducida por el OvHV-2, que varía desde Bos taurus y B. indicus, que son relativamente resistentes, pasando por muchas especies de ciervos y el búfalo de agua (Bubalus bubalis), que son más susceptibles, hasta la extremadamente susceptible vaca de Bali (Bos javanicus) y el ciervo del Père David (Elaphurus davidianus). Las especies más resistentes tienden a experimentar una infección más prolongada y lesiones complejas, mientras que en las especies más susceptibles el curso de la enfermedad tiende a ser más corto y los signos clínicos menos dramáticos. Recientemente se han confirmado informes de varios países, y en particular de Noruega, en el sentido de que la enfermedad afecta a los cerdos domésticos (10). Los signos son muy similares a los que se observan en vacas afectadas por la forma aguda.

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Una forma leve de la enfermedad descrita en 1930 se consideró con cierto escepticismo debido a que se podía confirmar sólo mediante cambios histológicos observados en el examen post mortem. Sin embargo, investigaciones recientes llevadas a cabo con métodos moleculares y serológicos, parece que confirman que unos pocos animales infectados se pueden recuperar, tanto después de reacciones clínicas leves como después de otras bastante graves (11).

•

Patología

Los cambios patológicos conjuntos reflejan la gravedad de los signos clínicos, pero, generalmente, son extensos y pueden implicar la mayoría de sistemas orgánicos. Las erosiones y las hemorragias pueden presentarse a lo largo del tracto intestinal, y, en los casos más agudos, se pueden asociar con contenidos intestinales hemorrágicos. En general, los ganglios linfáticos están hipertróficos, aunque la extensión de su participación varía en cada animal. Con frecuencia, los ganglios linfáticos aparecen firmes y blancos al diseccionarlos, mientras que en otros casos, en particular los submandibulares y retrofaríngeos, pueden estar hemorrágicos e incluso necróticos. A menudo se observan en el tracto respiratorio las acumulaciones catarrales, las erosiones y la formación de una membrana diftérica. Frecuentemente, en el tracto urinario, están presentes hemorragias equimóticas características del revestimiento epitelial de la vejiga, mientras que el córtex renal puede estar afectado con múltiples focos blancos elevados, de 1–5 mm de diámetro y a veces rodeados por una zona delgada hemorrágica. Los cambios histológicos son la base para confirmar los casos de FCM y se caracterizan por degeneración epitelial, vasculitis, hiperplasia y necrosis de los órganos linfoides, y acumulaciones intersticiales extensas de células linfoides en órganos no linfoides. Las lesiones epiteliales pueden presentarse en todas las superficies epiteliales y se caracterizan por erosión y ulceración, con infiltración frecuente de células linfoides intraepiteliales y subepiteliales, que pueden estar asociadas con vasculitis y hemorragias. Generalmente, está presente la vasculitis y puede ser notable en el cerebro, afectando a venas, arterias, arteriolas y vénulas. Se caracteriza por infiltración de células linfoides de la túnica adventicia y media, con frecuencia asociada con degeneración fibrinoide. El lumen, puede estar “pavimentado” por células linfoides y, a veces, en los casos graves, las acumulaciones subendoteliales y el daño endotelial por las células linfoides pueden conducir a la oclusión del vaso. La hiperplasia de los ganglios linfáticos se caracteriza por una expansión de las células linfoblásticas del paracórtex, mientras que las lesiones degenerativas se asocian generalmente con los folículos. Frecuentemente, el edema con inflamación linfoide afecta al tejido perinodal. Es típica la acumulación intersticial de las células linfoides en los órganos no linfoides, en particular en el córtex renal y las áreas periportales del hígado, y, en el caso del riñón, puede ser muy extensa. En el cerebro puede observarse una meningoencefalitis no supurativa acompañada de manguito perivascular linfocítico y un incremento marcado en el número de células del líquido cerebroespinal. Las lesiones macroscópicas en la córnea se reflejan histológicamente por la infiltración de células linfoides que se origina en el limbo y que progresa hacia el centro, con desarrollo de edema y erosión en los casos más avanzados. También se puede presentar vasculitis, hipopion e iridociclitis. Las características patológicas de la FCM causadas por cualquiera de los agentes son esencialmente similares. Sin embargo, además del examen histológico, los métodos disponibles para el diagnóstico de la enfermedad inducida por el AIHV-1 o el OvHV-2 son muy diferentes y por ello se consideran por separado.

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO B1. Herpesvirus-1 alcelafino Esta forma de la enfermedad se presenta en las regiones de cría de ganado bovino del éste de África donde los pastores utilizan áreas en las que pastan ñues, y en áreas del sur de África donde pastan juntos ñues y vacas. Sin embargo, la enfermedad también puede afectar a una variedad de otras especies de rumiantes en colecciones zoológicas de todo el mundo y así, aparte del antílope de las subfamilias Alcelaphinae e Hippotraginae, es aconsejable considerar a todos los rumiantes como susceptibles. La mayoría de pruebas de laboratorio cuentan con un aislado atenuado (WC11), que se ha sometido a muchos pases de laboratorio y se emplea como fuente de antígeno vírico y de ADN (13). La publicación reciente de la secuencia nucleotídica completa del virus virulento de un número bajo de pases (C500) constituirá la base de estudios futuros de este virus (4).

1.

Identificación del agente

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•

Animales afectados clínicamente

a)

Aislamiento La característica más notable de la FCM inducida por el AIHV-1 es la falta de antígeno vírico detectable o de citología específica de herpesvirus en las lesiones. Así, la confirmación de la infección depende de la recuperación vírica. Generalmente, la infectividad está asociada estrictamente a las células y, por tanto, el aislamiento se puede conseguir sólo a partir de suspensiones celulares o bien de leucocitos de sangre periférica, de ganglios linfáticos o bien de otros tejidos afectados. Las suspensiones celulares se preparan en el sobrenadante de cultivos de tejidos, aproximadamente 5 × 106 células/ml, y se inoculan en monocapas de cultivos celulares preestablecidos. Se utilizan extensamente células de tiroides de bovino, pero probablemente la mayoría de cultivos celulares en monocapa primarios o de un número bajo de pases de origen rumiante proporcionará un sustrato celular adecuado para el aislamiento vírico. Después de 36–48 horas de incubación, se debería cambiar el medio de cultivo y observar las monocapas al microscopio (40×) para comprobar si existen signos evidentes de efectos citopáticos (ECP). Estos aparecen de modo característico como focos multinucleados en las monocapas, después se retraen progresivamente hasta formar unos cuerpos densos con procesos citoplásmicos que pueden separarlos. A este proceso le sigue el recrecimiento de las monocapas normales. Un ECP puede tardar hasta 21 días en hacerse visible y rara vez se presenta antes del día 7. La infectividad en esta fase tiende a estar muy asociada a las células y, de este modo, cualquier pase posterior o almacenamiento debe emplear métodos que aseguren el mantenimiento de la viabilidad celular. Se debería determinar la especificidad del aislado utilizando antisueros específicos o anticuerpos monoclonales (MAbs) en pruebas de fluorescencia o inmunocitoquímicas.

b)

ADN vírico De forma característica, en los tejidos afectados se puede detectar muy poco ADN vírico, por tanto, es necesario amplificar el genoma vírico mediante cultivo convencional o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se ha publicado un mapa de restricción de la cepa de laboratorio estándar (WC11) empleando los enzimas de restricción HindIII, EcoRI, BamHI y SmaI y se ha clonado la mayoría del genoma (2). Tales clones se pueden utilizar para identificar y caracterizar otros gammaherpesvirus aislados de bovinos. Se han generado los datos de secuencia del aislado WC11 del AIHV-1 y se han identificado los cebadores adecuados para utilizarlos en la prueba de PCR (7). Sin embargo, no se considera ninguno apropiado para utilizarlo como ayuda diagnóstica. Además, se ha publicado el genoma completo del aislado virulento C500 (4).

•

Hospedadores naturales

Prácticamente todos los ñues están infectados con el AIHV-1 a los 6 meses de vida, lo que provoca la extensión del virus como una epizootia intensa durante el periodo perinatal. Se asume que las especies Connochaetes taurinus taurinus, C.t. albojubatus y C. gnu están infectadas por el mismo virus. La infección parece persistir también en la mayoría de grupos de ñues de colecciones zoológicas. Sin embargo, es posible que la infección pueda estar ausente en animales que se hayan mantenido aislados durante la juventud o que vivan en grupos pequeños. La infección natural se ha detectado con éxito mediante ensayos de hibridación en secciones de pulmón de ñues azules jóvenes en Sudáfrica (12). En rara ocasión se contemplará el aislamiento vírico. Después de la infección existe un breve periodo de tiempo en el que se excreta el virus en una forma libre de células y se puede aislar a partir de frotis nasales. También se puede aislar el virus en ese momento a partir de leucocitos, pero en los animales mayores es menos probable el éxito a menos que el animal esté inmunodeprimido por estrés o por una intervención farmacológica. Además, se puede aislar el virus estableciendo cultivos de tejidos a partir de animales que son aparentemente normales y se ha logrado en cultivos en monocapa, tanto de riñón como de células de tiroides, procedentes de animales adultos. Otros antílopes grandes de las subfamilias Alcelaphinae y Hippotraginae también están infectados con gammaherpesvirus que están muy relacionados desde el punto de vista antigénico, pero no existe evidencia de que puedan transmitirse a otras especies y causar la FCM.

2.

Pruebas serológicas

•

Animales afectados clínicamente

La respuesta de anticuerpos de los animales afectados clínicamente es limitada, sin desarrollo de anticuerpos neutralizantes. En los casos clínicos la presencia de anticuerpos se puede demostrar de forma estable mediante inmunofluorescencia o la prueba de la inmunoperoxidasa (IPT) empleando como sustrato cultivos celulares infectados con el aislado vírico WC11. A pesar de que se han descrito otros métodos de detección de

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anticuerpos, ninguno ha demostrado ser satisfactorio. El primer método desarrollado fue un enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) diseñado para detectar anticuerpos dirigidos frente al OvHV-2 (9) y que utiliza un MAb (15-A) que tiene como diana un epítopo, al parecer conservado en todos los virus de la FCM.

•

Hospedadores naturales

Después de la infección de los ñues parece que se desarrollan anticuerpos de forma estable y se pueden identificar mediante pruebas de neutralización que emplean el aislado libre de células WC11, o mediante inmunofluorescencia, utilizando de nuevo el aislado WC11 e IgG anti-bovina, que se sabe que reacciona con la IgG de ñu. La cepa vírica Minnesota de la FCM, que no se distingue de la cepa WC11 del AIHV-1, se utiliza para la producción de antígeno para el CI-ELISA. Hasta ahora no ha habido intentos para estandarizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o la IPT, pero los dos métodos descritos a continuación se ofrecen a modo de ejemplo. La validación del CI-ELISA continúa en curso.

a)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta La prueba IFI es menos específica que la de neutralización vírica (NV), y puede utilizarse para demostrar diversas variedades de antígenos “tempranos” y “tardíos” en las monocapas de células infectadas por el AIHV-1. Los anticuerpos que reaccionan en la prueba IFI o en la IPT se desarrollan en vacas y en conejos infectados de forma experimental durante el periodo de incubación, y más tarde en el curso clínico de la enfermedad, aunque las reacciones cruzadas con algunos otros herpesvirus bovinos, así como el OvHV-2, reducen el valor diagnóstico diferencial. Algunas veces, la detección de tales anticuerpos de reacción cruzada es útil para confirmar un diagnóstico de la SA-FCM. •

Preparación de portas fijados

Se inoculan cultivos celulares con el AIHV-1 (cepa WC11) cerca de o recién alcanzada la confluencia (véase Sección B1.2.c.). Se deberían procesar en paralelo, como control, cultivos no inoculados. Después de unos 4 días (cuando se espere que aparezcan los primeros signos de ECP, pero antes de declarar visible un ECP) se tratan los cultivos como se indica seguidamente: se elimina el medio, se extraen las células con una solución de tripsina-EDTA y se centrifugan aproximadamente a 800 g durante 5 minutos, se elimina el sobrenadante y se resuspenden las células en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por cada botella de plástico de cultivo celular de 800 ml. Se realiza una prueba depositando unas pequeñas cantidades de la suspensión celular en dos pocillos de un porta multiprueba recubierto de politetrafluoroetileno; se secan al aire y se fijan con acetona. Estos pequeños depósitos revelan con un suero estándar positivo y la anti-IgG conjugada para la especie apropiada. Se examina la incidencia de las células positivas y negativas bajo el microscopio de luz ultravioleta. Se ajusta la suspensión celular mediante la adición de células no infectadas y/o PBS hasta alcanzar la concentración adecuada que dará lugar a una capa única de células cuando se extiendan sobre el porta, con células positivas claramente definidas sobre un fondo de células negativas. Se deposita una pequeña cantidad de la suspensión celular positiva ajustada y de las suspensiones control negativo en portas multiprueba según el modelo deseado, y se secan al aire. Se fijan con acetona durante 10 minutos. Se lavan, se secan y se conservan con gel de sílice dentro de un contenedor hermético a –70°C. Un procedimiento alternativo, que es más fácil de evaluar, consiste en preparar monocapas de células infectadas y no infectadas en tubos de Leighton o en portas compartimentalizados. Las monocapas celulares se infectan a partir de 150 a 200 DICCT50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) del virus que se diluye en el medio de cultivo celular. Los portas infectados y no infectados se fijan con acetona y se conservan, como se ha indicado anteriormente, a –70°C. •

Procedimiento de la prueba

i)

Los portas se rehidratan durante 5 minutos con PBS, se lavan con agua destilada y se secan al aire.

ii)

Los sueros se diluyen 1/20 en PBS. Las muestras que den un fondo alto de tinción se pueden volver a probar a diluciones mayores. Se aplican los sueros diluidos a una pequeña cantidad de células positivas, por la presencia del virus de la FCM y a otra pequeña cantidad de células control negativo para cada muestra. Se incluyen controles de suero positivo y negativo. Lo ideal es que la prueba se valide volviendo a titular el control positivo para determinar su punto final.

iii)

Se incuban a 37°C durante 30 minutos en una cámara húmeda.

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iv)

Se eliminan los líquidos sobrantes. Los portas se lavan mediante dos cambios de PBS, durante 5 minutos cada uno.

v)

Se lavan con PBS durante 1 hora con agitación y, seguidamente, los portas se secan al aire.

vi)

Se aplica IgG anti-bovina de conejo conjugada a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una dilución de trabajo predeterminada.

vii)

Se incuban a 37°C durante 20 minutos, se elimina el líquido de los portas y se lavan dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez.

viii) Se tiñen de contraste con azul de Evans 1/104 durante 30 segundos y se lavan con PBS durante 2 minutos. Se sumergen en agua destilada, se secan y se montan en PBS/glicerol (50/50). ix)

b)

Se examinan por microscopía de fluorescencia para detectar uniones específicas de anticuerpos a las células infectadas.

Prueba de inmunoperoxidasa Se prepara una dilución del AIHV-1 cultivado en células de turbinados de cornetes etmoidales bovinos (BT) que contiene aproximadamente 103 DICCT50 en una suspensión de células BT tripsinizadas en fresco y se inocula en tubos de Leighton con cubreobjetos, 1,6 ml por tubo, o en portas de cuatro cámaras, 1,0 ml por cámara. Los cultivos celulares se examinan a los 4–6 días para detectar posibles ECPs y se fijan con acetona cuando comiencen los signos de ECP. Se quitan las cámaras de plástico, pero no las gomas, a partir de las cámaras de los portas antes de la etapa de fijación y para ésta se emplea acetona (p.ej. UltimAR) que no degrada las gomas. Las células fijadas se conservan a –70°C.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Se prepara diluyente de la IPT (21,0 g de NaCl y 0,5 ml de Tween 20 se adicionan a 1 litro de 0,01 M PBS, pH 7,2) y líquido de lavado (0,5 ml de Tween 20 se añaden a 1 litro de 0,01 M PBS, pH 7,2).

ii)

El suero problema se diluye 1/20 en el diluyente de la IPT y se extienden 150–200 µl sobre un cubreobjetos fijado infectado con el virus o una cámara de un porta.

iii)

Se incuba el cubreobjetos en una cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

iv)

Se sumerge el cubreobjetos tres veces en líquido de lavado.

v)

Se extienden 150–200 µl de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa (1/5000 en diluyente de la IPT) sobre el cubreobjetos o sobre la cámara del porta.

vi)

Se incuba el cubreobjetos o el porta a 37°C durante 30 minutos.

vii)

Se sumerge el cubreobjetos tres veces en líquido de lavado.

viii) Se diluye en sustrato AEC (3-amino-9-etilcarbazol) en agua destilada (5 ml de agua destilada, dos gotas de tampón, dos gotas de peróxido de hidrógeno y 3 gotas de AEC) y se aplica al cubreobjetos o al porta.

c)

ix)

Se incuba en una cámara húmeda a 37°C durante 8–10 minutos.

x)

Se sumerge el cubreobjetos en agua destilada, se seca al aire y se monta en un porta de cristal. Las cámaras del porta compartimentalizado se examinan una vez secas.

xi)

El porta se examina al microscopio óptico. La presencia de un color rojizo-parduzco en el núcleo de las células infectadas indica una reacción positiva.

Neutralización vírica Se han desarrollado pruebas para detectar anticuerpos dirigidos contra el AIHV-1 tanto en el reservorio infectado de forma natural como en los hospedadores indicadores. La primera de éstas es una prueba de NV que emplea el virus libre de células de la cepa WC11 y la segunda prueba utiliza un aislado de antílope (AIHV-2). AIHV-1 y AIHV-2 producen anticuerpos de reacción cruzada y, por tanto, cualquiera de las cepas puede utilizarse en los ensayos. Esta prueba es laboriosa, pero puede llevarse a cabo en placas de microtitulación con líneas celulares o células de un número bajo de pases. Las principales aplicaciones se orientan al estudio del rango y extensión de la infección natural en las especies de vida salvaje, cautivas en los zoológicos y, en menor extensión, en las poblaciones de ovejas. También es útil en los intentos dirigidos al desarrollo de vacunas que, en todos los casos, han tenido un éxito muy limitado. Se pueden inducir anticuerpos de NV de título alto, pero, evidentemente, no son protectores.

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El stock del AIHV-1 (cepa WC11) se replica en cultivos celulares primarios o secundarios de riñón bovino, tiroides bovino, testículo bovino a bajo pase u otro tipo de células permisivas. El virus se conserva en alícuotas a –70°C. El stock se titula para determinar la dilución que dé una 100 DICCT50 en 25 µl bajo las condiciones de prueba.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56 C° en un baño de agua.

ii)

Se realizan diluciones al doble de los sueros problema en el medio de cultivo celular desde 1/2 a 1/16 en una placa de microtitulación para cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano, utilizando cuatro pocillos por cada dilución y volúmenes de 25 µl por cada pocillo. En la prueba también se incluyen sueros control positivo y negativo. No se dispone de sueros estándares, pero deberían prepararse estándares internos positivos y titularse en un rango apropiado.

iii)

Se añaden 25 µl por pocillo del stock del virus WC11 diluido en el medio de cultivo de modo que la dilución calculada proporcione 100 DICCT50 por pocillo.

iv)

Se incuban durante una hora a 37°C. También se incuba el stock vírico residual.

v)

Se vuelve a titular el virus residual en cuatro etapas de dilución a la décima, empleando 25 µl por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilución.

vi)

Se añaden 50 µl por pocillo de suspensión celular de riñón bovino a una densidad de 3 × 105 células/ml.

vii)

Las placas se incuban en atmósfera humedecida y CO2 a 37°C durante 7–10 días.

viii) Las placas se examinan al microscopio para detectar posibles ECPs. Se valida la prueba comprobando de nuevo la titulación (que debería dar un valor de 100 DICCT50 con un rango permisible 30–300) y los sueros control. El suero estándar positivo debería dar un título dentro de 0,3 log10 unidades de su media predeterminada.

d)

ix)

Los resultados del suero problema se determinan por el método de Spearman–Kärber como la dilución del suero que neutraliza al virus en el 50% de los pocillos.

x)

Un suero negativo no debería dar neutralización a la menor dilución probada (1/2 equivalente a la dilución de 1/4 en la etapa de neutralización).

Enzimoinmunoensayo de inhibición competitiva (CI-ELISA) Primero se desarrolló un CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza un MAb (15-A) dirigido contra un epítopo presente en un complejo de glicoproteínas que parece estar conservado en todos los virus de la FCM. El MAb se preparó contra el aislado Minnesota del virus, que es indistinguible de la cepa WC11 del AIHV-1. La prueba se ha empleado para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes salvajes y domésticos en Norteamérica y se han detectado anticuerpos frente a los siguientes virus patogénicos: AlHV-1, AlHV-2, OvHV-2, CpHV-2 y el herpesvirus de origen desconocido que se observó que causa la FCM clásica del ciervo de cola blanca, así como los virus del grupo de la FCM todavía no descritos como patogénicos, tales como los del antílope del género Oryx, el buey almizclero (Ovibos moschatus) y otros. Recientemente la prueba se ha remodelado para incrementar su sensibilidad (8). Este cambio puede permitir la detección de anticuerpos de corderos recién infectados y de animales en la fase aguda de la enfermedad, que a veces no se detectaban en el formato previo. El CI-ELISA tiene la ventaja de ser más rápido y presenta más rendimiento que la prueba IFI o la IPT. Se dispondrá de datos de validación adicionales cuando se extienda su uso a más laboratorios en otras partes del mundo. Se dispone comercialmente de un juego completo de reactivos para el CI-ELISA, incluyendo placas prerrecubiertas, sueros control y anticuerpos marcados. Se da el siguiente protocolo para que los laboratorios que lo deseen preparen sus propias placas antigenadas. Placas immuno 4 ELISA (Dynatech Lab, Chantilly, Virginia) se cubren a 4°C (39°F) durante 18–20 horas con 50 µl de una solución que contenga 0,2 µg de antígenos víricos semipurificados del la FCM (aislados Minnesota o WC11 del AlHV-1) en 50 mM tampón carbonato/bicarbonato (pH 9,0). Las placas recubiertas se bloquean a temperatura ambiente (21–25°C, 70–77°F) durante 2 horas con 0,05 M PBS que contiene sacarosa al 2%, 0,1 M glicina, seroalbúmina bovina al 0,5% y NaCl al 0,44% (pH 7,2). Después del bloqueo, se vacían los pocillos y seguidamente se secan las placas en un ambiente de baja humedad a 37°C durante 18 horas, se introducen en bolsas de plástico con desecante y se sellan y conservan a 4°C (39°F) (8). El MAb 15-A está conjugado con peroxidasa de rábano picante por la empresa VMRD, que emplea un método estándar con periodato.

•

Procedimiento de la prueba

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i)

Los controles positivos y negativos (suero o plasma) se diluyen 1/5 con tampón de dilución (PBS que contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).

ii)

Se añaden 50 µl de muestras diluidas control o problema a una placa antigenada (cuatro pocillos para el control negativo y dos pocillos para el control positivo). Se deja vacío el pocillo A1 como blanco para el lector de placas.

iii)

Se cubre la placa con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21–25°C, 70 – 77°F).

iv)

Mediante un frasco lavador, se lava la placa tres veces con tampón de lavado (el mismo que el tampón de dilución: PBS que contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).

v)

Se prepara en el momento el conjugado anticuerpo-peroxidasa × 1 diluyendo una parte del conjugado × 100 con 99 partes del tampón de dilución.

vi)

Se adicionan 50 µl del conjugado anticuerpo-peroxidasa a cada pocillo de muestra. Se cubre la placa con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21–25°C, 70–77°F).

vii)

La placa se lava tres veces con tampón de lavado.

viii) A cada pocillo de muestra se adicionan 100 µl de solución de sustrato (TMB Microwell, BioFX Laboratories, Owings Mills, Maryland). Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21– 25°C; 70–77°F). No se elimina la solución de los pocillos. ix)

Se para la reacción añadiendo 100 µl de solución de parada (0.18 M ácido sulfúrico) a cada pocillo. No se elimina la solución de los pocillos.

x)

Se leen las densidades ópticas (OD) mediante un lector de placas de ELISA a 450 nm.

xi)

Se calcula el % de inhibición: 100 –

OD de la muestra (Media) × 100

= % de Inhibición

OD media del control negativo xii)

Interpretación de los resultados: Si una muestra problema provoca una inhibición igual o mayor del 25% se considerará positiva. Si una muestra problema provoca una inhibición menor del 25% se considerará negativa.

xiii) Validación de la prueba: La OD media del control negativo debe caer entre los valores 0,40 y 2,10. La media del control positivo debe producir una inhibición mayor del 25%.

B2. Herpesvirus-2 ovino Esta forma de la enfermedad, que se presenta en vacas y otras especies animales de todo el mundo, normalmente aparece de foma esporádica y afecta sólo a uno o unos pocos animales. Sin embargo, de vez en cuando, se producen incidentes en los que se ven afectados varios animales, lo que parece estar asociado con ciertos rebaños de ovejas que pueden continuar transmitiendo la enfermedad durante unos cuantos años. También se puede transmitir más fácilmente la enfermedad al ciervo rojo (Cervus elaphus) y a otras especies de ciervos, al búfalo de agua (Bubalus bubalis) e incluso con mayor facilidad al ciervo del Père David (Elaphurus davidianus) y a la vaca de Bali (Bos javanicus). El OvHV-2 también causa la FCM en colecciones zoológicas en las que la enfermedad se ha descrito en una variedad de especies entre las que se incluye la jirafa. Se ha descrito la enfermedad en cerdos procedentes de varios países, pero se reconoce con mayor frecuencia en Noruega, donde regularmente se presentan casos que implican a diversos animales. El diagnóstico no puede basarse en los signos clínicos y en el examen patológico global, ya que éstos pueden ser extremadamente variables. El examen histológico de una variedad de tejidos incluye, con frecuencia, riñón, hígado, vejiga urinaria, epitelio bucal, córnea/conjuntiva y cerebro, y ha sido el único método para conseguir un diagnóstico más acertado. Sin embargo, ahora también se puede tratar de detectar anticuerpos dirigidos frente al virus y/o ADN vírico y esto se ha convertido rápidamente en el método elegido. Se debe enfatizar que la causa vírica de la SA-FCM no se ha aislado y que las evidencias del OvHV-2 se basan en: (a) la presencia de anticuerpos en los sueros de todas las ovejas domésticas, que presentan reacción cruzada con los antígenos del AIHV-1 en la prueba IFI y en los de inmunoelectrotransferencia (5), pero no en los de neutralización; (b) el desarrollo de anticuerpos que presentan reacción cruzada con el AIHV-1 en la prueba IFI en una proporción de vacas con la SA-FCM y en todos los cricetos infectados de forma experimental; (c) la detección y clonación del ADN procedente de líneas celulares linfoblásticas derivadas de casos naturales de la SA-FCM que hibrida de modo cruzado con el ADN del AIHV-1, pero que es distinto de él.

1.

Identificación del agente

•

Animales afectados clínicamente

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Los intentos para recuperar el virus que causa la enfermedad a partir de casos clínicos han fallado invariablemente. Sin embargo, existen varios informes sobre la recuperación de diferentes agentes víricos procedentes de casos clínicos, ninguno de los cuales ha establecido una relación causal; su aislamiento por supuesto es fortuito o debido a contaminación de laboratorio; sin embargo, se han generado líneas celulares linfoblásticas a partir de vacas y ciervos afectados, algunos de los cuales transmiten la enfermedad después de la inoculación en animales de experimentación (14). Tales líneas celulares contienen secuencias víricas que hibridan con clones del ADN del AIHV-1 (3). Se han clonado diversos fragmentos víricos procedentes de una librería genómica de una de tales líneas que ha sido objeto de caracterización posterior. Para la secuenciación se eligió un subclón que no hibridaba con el AIHV-1 y se descubrió que codificaba una proteína muy similar a la proteína del tegumento del virus Epstein–Barr. En esta secuencia se identificaron los cebadores adecuados para ser utilizados en el ensayo de la PCR y se diseñó un protocolo sensible en el que se amplificó inicialmente un fragmento de 422 pares de bases (bp), seguido de la amplificación de un fragmento interno truncado de 238 bp. Se ha demostrado que esta prueba es capaz de detectar tan sólo 35 equivalentes del genoma vírico y que no se amplifica el producto procedente del AIHV-1 o de otros herpesvirus bovinos (1). Así, esta PCR se considera muy específica y sensible para el AIHV-2 y se emplea en todo el mundo en estudios de la enfermedad de animales afectados clínicamente y del hospedador natural. Esta prueba está emergiendo como una prueba firme que se puede emplear para detectar ADN vírico en leucocitos de sangre periférica de animales afectados clínicamente así como en tejidos frescos y muestras incluidas en parafina recogidas en examen post mortem. Se ha informado acerca del uso de partículas magnéticas para purificar el ADN antes de la amplificación lo que resulta en una mejora adicional de la prueba, pero todavía se tiene que evaluar. También se ha descrito un ensayo de PCR fluorogénico cuantitativo para el OvHV-2 (6) y es probable que en el futuro tenga valor para su aplicación.

•

Reacción en cadena de la polimerasa La extracción del ADN a partir de material clínico se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo definido en un kit de extracción apropiado (p.ej. Quiagen DN easy Tissue Kit). Las reacciones de amplificación se realizan en volúmenes de 50 µl que contengan no más de 2 µg ADN problema en 10 mM Tris HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, gelatina al 0,01% (v/v), sulfuro de dimetilo al 10% (v/v), 200 µm de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Pharmacia), 1 µM de cada cebador y 2 unidades de ADN-polimerasa Taq con 50 µl de aceite mineral (Sigma) para impedir la evaporación. El programa consiste en un preciclo a 99°C durante 3 minutos, después de el cual se añade la mezcla del enzima y los dNTP. A esto le siguen 25 ciclos a 94°C durante 20 segundos, a 60°C durante 30 segundos y a 72°C durante 30 segundos. Una alícuota de 2 µl del producto primario de amplificación, especificado mediante el par cebador 556/755, se transfiere directamente a una nueva mezcla de reacción y se amplifica empleando los pares de cebadores 556/555 bajo condiciones idénticas durante unos 25 ciclos adicionales con una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Los productos finales de la amplificación (10 µl) se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% y fluorescencia con bromuro de etidio. También se amplifican y analizan con cada lote de muestras problema un control positivo conocido y agua destilada.

•

Hospedadores naturales

La oveja doméstica es el hospedador natural del OvHV-2 y se ha demostrado que todos los animales estudiados son seropositivos para el AIHV-1. Es más, parece que algunos corderos se infectan en el útero, lo que hace muy difícil su identificación en los animales no infectados. Frecuentemente los corderos neonatales son la fuente de infección, aunque las ovejas de cualquier edad pueden transmitir la enfermedad. Nunca se ha recuperado el virus a partir de las ovejas, pero el ensayo de PCR desarrollado para detectar el ADN del OvHV-2 en casos clínicos de FCM también se ha empleado para detectar el virus en los leucocitos de sangre periférica de ovejas adultas normales y en secreciones nasales y orofaringe de los corderos durante los primeros meses de vida. De este modo, al igual que parece suceder en la infección de ñues debida al AIHV-1, las ovejas se infectan con el OvHV2 cuando son jóvenes y permanecen así infectadas de forma latente de por vida. Hasta la fecha permanecen a nivel especulativo los factores que predisponen a los hospedadores susceptibles para la propagación y transmisión del virus de la FCM. Además de las ovejas, las cabras domésticas y otros miembros de la subamilia Caprinae presentan anticuerpos que reaccionan frente al AIHV-1 de forma similar al suero de oveja. Esto implica que estas especies se infectan con virus similares al OvHV-2 y se ha hallado que algunas cabras son positivas en un ensayo de PCR para el OvHV-2, aunque no se conoce su papel potencial para causar la FCM.

2.

Pruebas serológicas

Sólo se han detectado anticuerpos dirigidos frente al OvHV-2 utilizando el AIHV-1 como fuente de antígeno. Los anticuerpos frente al AIHV-1 se pueden detectar en el 70–80% de las vacas afectadas clínicamente mediante

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procedimientos IFI o IPT, pero en general no están presentes en ciervos afectados o animales que desarrollan la enfermedad en la modalidad aguda o peraguda. Los anticuerpos se detectan mediante una prueba IFI empleando células de cultivo de tejidos infectados con el AIHV-1. Las monocapas celulares que crecen sobre los cubreobjetos exhibiendo ECPs del orden del 10–50% se recogen, se lavan, se fijan con acetona y se utilizan en el ensayo. Los cubreobjetos se montan con DPX, con el lado que contiene las células hacia arriba, sobre portas microscópicos y se tratan con suero normal de caballo al 10% antes de seguir con el procedimiento convencional de la prueba IFI. El procedimiento de la IPT puede llevarse a cabo del mismo modo que en el caso del AIHV-1. El único virus de vaca del que se ha descrito que presenta reacción cruzada con el AIHV-1 es el herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4). Así, el control negativo para esta prueba debería consistir en monocapas infectadas con el BHV-4 de forma similar. Sólo se considerarán positivos los sueros en el caso de que los focos muestren una distribución de antígeno intranuclear característica con poco o ninguna tinción citoplásmica detectada en las células infectadas por el AIHV-1 y ninguna reacción en las células infectadas por el BHV-4. Los sueros que reaccionen con los antígenos de ambos virus se considerarán como resultados no concluyentes. Se ha desarrollado una técnica CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza MAbs (15-A) preparados contra el llamado aislado vírico Minnesota, que es indistinguible del AIHV-1. Se ha empleado esta prueba para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes salvajes y domésticos en Norteamérica y parece que tiene algún éxito. Sin embargo, se aprecia una escasa correlación entre el desarrollo de anticuerpos detectados en el suero de corderos y la adquisición de infección con el OvHV-2, como parece indicar la presencia de ADN vírico detectado por PCR, puesto que se detectó resultado positivo sólo en una parte de las ovejas. Esto muestra un marcado contraste con otros estudios acerca del empleo de la prueba IFI que indican que la mayoría, sino todas las ovejas domésticas, son seropositivas. En un estudio realizado sobre la reacción del suero de oveja hacia las proteínas estructurales del AIHV-1 en ensayos de inmunoelectrotransferencia, la reactividad de los diferentes sueros varió considerablemente, lo que indica que las ovejas individuales responden de modo diferente con respecto al reconocimiento, por parte de los anticuerpos, de los epítopos de reacción cruzada del AIHV.1. De modo que es probable que algunos resultados negativos obtenidos mediante un CI-ELISA se deban a la extrema especificidad de epítopo de tal prueba basada en MAbs que fallan en detectar anticuerpos en una proporción de los sueros. Por tanto, se deberían interpretar con precaución los resultados de tales ensayos. Sin embargo, recientemente se ha descrito una prueba remodelada que puede solventar el problema de la sensibilidad (8) y proporciona una mayor utilidad. La técnica CI-ELISA, como se describe en la Sección B1.2.d, se ha utilizado con éxito para detectar anticuerpos contra el OvHV-2.

B3. Control Hasta la fecha el control depende de la segregación de los hospedadores naturales de las especies susceptibles; el alcance de esa segregación depende de cuáles sean las especies implicadas. En el caso del AIHV-1, parece que los animales afectados por la FCM nunca, o raramente, transmiten la infección, puesto que sólo el hospedador natural puede actuar como fuente de infección. Aparentemente los ñues son transmisores eficaces de la infección de la mayoría de las restantes categorías de rumiantes y que, por tanto, es importante su separación en el caso de poblaciones mixtas. Igualmente, los pastores deben asegurarse de que las vacas están completamente separadas de la zona de los ñues y de los pastos recién utilizados por ellos, en particular en la época de partos de los ñues. En el caso del OvHV-2, el requisito de separar las ovejas depende de la susceptibilidad de las especies implicadas. Así, en el caso del ciervo del Père David y la vaca de Bali, se debe asegurar una estricta separación y evitar el contacto a través de los fomites. Igualmente, en el caso de los ciervos de granja se deben realizar todos los esfuerzos razonables para independizar la gestión de las ovejas y los ciervos, aunque el gamo parece ser más resistente a la FCM. Sólo en raras ocasiones las vacas desarrollan la SA-FCM, y por este motivo generalmente se manejan junto con las ovejas sin tomar precauciones que impidan la transmisión de la enfermedad. Sin embargo, si se producen casos múltiples, es esencial separar el rebaño de ovejas tan lejos como sea posible de las vacas. Como tales rebaños pueden continuar siendo fuentes de infección durante algunos años, se debería considerar la eliminación de estos rebaños mediante su sacrificio. Adicionalmente, la posibilidad de que puedan producirse periodos de incubación muy largos, por encima de 9 meses, obliga a realizar un pronóstico cauteloso en el caso de que se aconseje controlar tales brotes.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO No se ha identificado un régimen de vacunación eficaz. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones emplean aislados del AIHV-1 que se adaptan al cultivo de tejidos y que generalmente son avirulentos. Estudios recientes de los cambios moleculares en el virus han mostrado que, en el curso de la adaptación al cultivo in vitro, se produce una deleción específica en el ADN vírico que parece ser una constante entre los diferentes aislados durante el proceso de atenuación. Así, se ha propuesto que este segmento deleccionado codifica un factor (es) virulento(s). La omisión de este producto en las vacunas probadas previamente puede haber contribuido al

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escaso éxito de estos experimentos. Una secuencia homóloga a esta deleción está presente también en el OvHV-2, lo que sugiere que está conservada y, de este modo, proporciona un peso adicional a la hipótesis de que puede tener un papel importante en la patogénesis de la FCM (4). Por tanto, las estrategias de vacunación futuras deberían considerar la incorporación de estos componentes víricos que pueden proteger frente a ambas formas de la FCM.

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6.

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