DISS. ETH NO. 22803

EXPLORING RICE GENETIC DIVERSITY AND IDENTIFICATION OF ALLELIC VARIANTS OF RICE BLAST RESISTANCE GENES

A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES ofETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich)

Presented by Kumar Vasudevan

M.Sc. in Biotechnology, Annamalai University, India

Born on 22"d April 1987 Citizen oflndia

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. Wilhelm Gruissem, examiner Dr. Navreet Bhullar, co-examiner Prof. Dr. Beat Keller, co-examiner Prof. Dr. Salome Leibundgut, co-examiner

2015

SUMMARY

Rice blast caused by Magnaporthe oryzae is one of the most devastating and widespread fungal diseases of rice, the staple food crop. Effective and sustainable management of rice blast is important to ensure the availability of sufficient staple for the growing population. Due to fast evolving and highly adaptable nature of the fungus M oryzae, the resistance conferred by resistance genes is frequently broken-down. Therefore, continuous crop improvement and identification of new resistance genes/alleles is essential. In this thesis, new rice blast resistance sources were identified through large-scale screening of rice germplasm, followed by exploration of allelic diversity of two broad-spectrum rice blast resistance genes. The accessions for this study were selected from a total collection of over 120'000 accessions based on their annotated rice blast resistance information in the International Rice Genebank. Based on this information, a set of 4246 geographically diverse rice accessions originating from 13 major rice growing countries was tested for rice blast resistance. A two-step resistance screening protocol was deployed involving natural infection in a rice uniform blast nursery (UBN) and subsequent artificial infections with five single rice blast isolates. The accessions that were resistant to rice blast in the UBN screening showed varied disease responses when tested against each of the five pure blast isolates, suggesting the presence of diverse resistance genes and/or their alleles in these accessions. Additionally, 289 accessions were found resistant against all the five single rice blast isolates, thus exhibiting broad-spectrum resistance. The accessions found resistant in this screening, with broad spectrum resistance as weil as isolate specific blast resistance, were selected as candidate accessions for the isolation of allelic variants of the rice blast resistance genes Pib andPi54. The accessions that were highly resistant in the UBN screening and against at least two ofthe five blast isolates were selected to study the allelic diversity of a broad-spectrum blast resistance gene Pib. Twenty-five new Pib alleles were identified, which possess unique single nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and/or deletions, in addition to the polymorphic residues that are shared between the different alleles. In some of the new Pib alleles, the nucleotide diversity is maximally located within the Leucine Rich Repeats (LRR) domain, whereas for the others, it is weil distributed among the Nucleotide-binding-ARC (adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4) and LRR domains. For studying the allelic diversity of the rice blast resistance gene Pi54, conferring broad spectrum resistance in India, 885 accessions exclusively originated from India were examined. Nine new alleles of Pi54 were identified in this study. DNA sequence analysis of

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the newly identified Pi54 alleles revealed 44 single polymorphic sites, three double deletions and an eight bp deletion. A SNP-rich region was found between a tyrosine kinase phosphorylation site and the nucleotide binding site (NBS) domain, and majority of the sequence polymorphisms were observed in the post-translational modification sites. Together, these newly identified alleles of rice blast resistance genes Pib and Pi54 enrich the genetic resource for rice blast resistance breeding programs as weil as for further understanding of rice-rice blast interactions at the molecular level. As applied for Pib and Pi54, the blast resistant accessions identified in this thesis can be similarly used as candidate

accessions to study the allelic diversity of any major blast resistance genes as weil as for identification ofpreviously unknown resistance loci.

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ZUSAMMENFASSUNG Reisbrand, verursacht durch Magnaporthe oryzae, ist eine der verheerendsten und am weitesten verbreiteten Pilzkrankheiten von Reis, einem wichtigen Grundnahrungsmittel. Ein effektives und nachhaltiges Management des Reisbrandes ist daher von Bedeutung, um die Verfügbarkeit

von

ausreichend

Nahrung

für

eine

wachsende

Weltbevölkerung

sicherzustellen. Aufgrund der schnell evolvierenden und sehr anpassungsfähigen Natur des Pilzes M oryzae wird die Resistenz, welche durch Resistenzgene vermittelt wird, oft gebrochen. Folglich sind eine kontinuierliche Verbesserung der Kulturpflanzen und die Identifikation von neuen Resistenzgenen/-allelen vonnöten. In dieser Doktorarbeit wurden durch ein umfangreiches Screening der genetischen Ressourcen von Reis, gefolgt von der Untersuchung der allelischen Diversität zweier Gene, welche eine Breitband-Resistenz gegenüber dem Reisbrand verleihen, neue Quellen für Reisbrand-Resistenzen ermittelt. Die Akzessionen für diese Studie wurden aus einer Sammlung von über 120'000 Akzessionen ausgesucht, basierend auf annotierten ReisbrandResistenz

Informationen

der

Internationalen

Reisgenbank.

Ausgehend

von

diesen

Informationen wurden 4246 Akzessionen, welche von unterschiedlichen geographischen Lagen aus 13 wichtigen Reisanbauländern stammen, auf Reisbrand-Resistenz getestet. In einem zweistufigen Resistenzscreening-Protokoll wurden die Reispflanzen zuerst natürlich mittels UBN ("uniform blast nursery")

und anschliessend künstliche mit fünf einzelnen

Reisbrandisolaten infiziert. Die Akzessionen, welche im UBN Screening Resistenz gegenüber Reisbrand aufwiesen, zeigten unterschiedliche Reaktionen auf Infektionen mit jeder der fünf reinen Reisbrandisolate. Das impliziert, dass unterschiedliche Resistenzgene und/oder -allele in diesen Akzessionen vorhanden sind. Ausserdem wurden 289 Akzessionen gefunden, welche resistent gegenüber alle fünf einzelnen Isolate waren, also Breitband-Resistenz aufweisen. Die Akzessionen, die im Screening als resistent identifiziert wurden, sowohl mit Breitband- als auch mit lsolat-spezifischer Reisbrand-Resistenz, wurden als potentielle Kandidaten für die Isolierung von allelischen Varianten der Reisbrandresistenzgene Pib und Pi54 selektiert. Sorten, die sowohl starke Resistenz im UBN Screening als auch gegen mindestens zwei der insgesamt fünf Reisbrandisolate aufwiesen wurden ausgewählt, um die Alleldiversität des Breitband-Resistenzgens Pib zu untersuchen. Hierbei wurden 25 neue Pib-Allele identifiziert, die einzigartige Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Insertionen und/oder Deletionen besitzen, zusätzlich zu den polymorphen Nukleotiden, die den verschiedenen Allelen gemein sind. In einigen der neuen Pib-Allele ist die höchste Nukleotiddiversität in der Leucin-reichen

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Wiederholungs (LRR)-Domäne zu finden, währendem sie bei den anderen Allelen in der Nukleotid-bindenden-ARC- ("adaptor shared by APAF-1, R proteins, and CED-4") und der LRR-Domäne verteilt ist. Für die Analyse der Alleldiversität des Reisbrandresistenzgens Pi54, welches in Indien Breitband-Resistenz verleiht, wurden 885 Akzessionen untersucht, welche ausschliesslich aus Indien stammen. Neun neue Allele des Pi54-Allels wurden in dieser Studie identifiziert. Eine DNA-Sequenzanalyse

dieser

Allele

brachten

44

einzel-polymorphe

Stellen,

drei

Doppeldeletionen und eine acht Hasenpaar-umfassende Deletion zum Vorschein. Eine SNPreiche Region wurde zwischen einer Tyrosinkinase-Phosphorlysierungsstelle und der Nukleotid-bindenden Domäne (NBS) gefunden. Die Mehrheit der Sequenzpolymorphismen wurde an posttranslationalen Modifikationsstellen beobachtet. Zusammengefasst stellen die neu identifizierten Allele der Reisbrandresistenzgene Pib und Pi54 eine Bereicherung der genetischen Ressourcen für die Züchtungsprogramme der

Reisbrandresistenz als auch für das tiefere Verständnis der molekularen Mechanismen der Reis-Reisbrandinteraktion dar. Wie hier für Pib und Pi54 angewendet, kann man die reisbrandresistenten Akzessionen aus dieser Studie auch analog als potentielle Kandidaten zur Untersuchung der allelischen Diversität anderer wichtiger Reisbrandresistenzgene als auch zur Identifizierung bisher unbekannter Resistenzloci verwenden.

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