RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski) , MIECZYS£AW K. B£ASZCZYK (SGGW Warszawa), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki), DANUTA DZIER¯ANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski) , WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), MIROS£AW KAÑTOCH (Pañstwowy Zak³ad Higieny), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski) , ANTONI RÓ¯ALSKI (Uniwersytet £ódzki), BOHDAN STAROŒCIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), BOGUS£AW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdañski), EL¯BIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii) , STANIS£AWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Pañstwowy Zak³ad Higieny), GRZEGORZ WÊGRZYN (Uniwersytet Gdañski), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastêpca), BOHDAN STAROŒCIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) Adresy redakcji Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (0 22) 554 13 05/304, fax (0 22) 554 14 04 e-mail: [email protected]; [email protected] Sekretarz Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (0 22) 628 08 22, (0 22) 621 13 51 e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie) Adres Redaktora dzia³u Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstañców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax: (091) 46 616 51, 52, lub fax: (091) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected] Stali recenzenci: JERZY D£UGOÑSKI (Uniwersytet £ódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków) , JÓZEF KUR (Politechnika Gdañska), EUGENIUSZ MA£AFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wroc³awiu) CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOW¥ POMOC¥ KOMITETU BADAÑ NAUKOWYCH Index Copernicus ICV = 3,06 (2006); Pismo indeksowane w EMBASE/Excerpta Medica Na ok³adce: Mikrofotografia fluoroscencyjna cytoszkieletu aktynowego komórek nab³onkowych linii Int407 zainfekowanych szczepem Bacillus subtilis wydzielaj¹cym hemolizynê listeryjn¹ (fot. Jaros³aw Wiœniewski, Instytut Mikrobiologii UW). Projekt ok³adki: Jerzy Grzegorkiewicz P O L S K I E T O WA R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nak³ad 1150 + 15 egz.,

Objêtoœæ 10 arkuszy wyd.,

Papier offser 80 g

Sk³ad i druk: Zak³ad Wydawniczy Letter Quality, 01-216 Warszawa, Brylowska 35/38, tel. 0 22 631 45 18, 0 607 217 879, e-mail: [email protected]

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 3– 4 http://www.pm.microbiology.pl

Zmar³ prof. dr Uli Schwarz (10.06.1934 – 21.12.2006) W grudniu ubieg³ego roku zmar³ prof. dr Uli S c h w a r z – d³ugoletni dyrektor Instytutu Maksa Plancka w Tybindze, (M.P.G. Institut für Virusforschung, Tübingen – obecnie Max-Planck Institut für Entwicklungsbiologie) oraz w ostatnich latach swego ¿ycia, ju¿ po przejœciu na emeryturê, dyrektor Shanghai Institute for Advanced Studies Chinese Academy of Sciences. Nazwisko profesora U. S c h w a r z a zwi¹zane jest w sposób szczególny z Polsk¹ – w latach 70-tych, a¿ do pocz¹tków transformacji ustrojowej, inicjowa³ oraz utrzymywa³ bardzo œcis³¹ wspó³pracê naukow¹ z kilkoma uczelniami w Polsce (Uniwersytetem w Gdañsku, Uniwersytetem Warszawskim oraz UMCS-em). W wyniku tego, wielu m³odych polskich uczonych korzysta³o ze stypendiów naukowych lub kontraktów, finansowanych z funduszy niemieckich, g³ównie Towarzystwa Naukowego Maksa Plancka. Profesor zawsze rezerwowa³ w swej pracowni miejsce dla goœci z Polski – oprócz Niemców i Polaków pracowali tam te¿ m³odzi Amerykanie, Anglicy czy te¿ Hiszpanie. Uli S c h w a r z odwiedza³ kilkakrotnie nasz kraj, wyg³aszaj¹c wyk³ady oraz uczestnicz¹c w seminariach b¹dŸ konferencjach naukowych. Jego obecnoœæ w Polsce dawa³a nam poczucie ³¹cznoœci intelektualnej z uczonymi europejskimi. W tych czasach by³o to wartoœci¹ niezwykle cenn¹. Zainteresowania naukowe U. S c h w a r z a koncentrowa³y siê g³ównie na badaniach budowy, syntezy oraz funkcji biologicznej jednego z polimerów œciany komórkowej Escherichia coli – mureiny. Do cenniejszych Jego osi¹gniêæ w tym zakresie zaliczyæ mo¿na prace nad charakterystyk¹ hydrolaz mureiny (identyfikacja, oczyszczanie, w³aœciwoœci biologiczne, rozmieszczenie topograficzne w komórce), szczególnie interesowa³a Go wtedy (lata 70-te) transglikozylaza. Analizuj¹c fragmenty mureiny E. coli trawione endopeptydaz¹ prof. U. S c h w a r z wraz z wspó³pracownikami (zespo³y z Tybingi oraz prof. N. N a n n i n g i z Amsterdamu) stwierdzili, i¿ ³añcuchy cukrowe w cz¹steczce polimeru wykazuj¹ w komórce orientacjê perpendicularn¹. Kolejne badania Profesora koncentrowa³y siê na bia³kach wi¹¿¹cych penicylinê PBP E. coli. W Zak³adzie Biochemii M.P.G, Tübingen (jego szefem by³ do koñca ¿ycia U. Schwarz) opracowano w roku 1980 oryginaln¹ metodê identyfikacji bia³ek PBP. W zaproponowanej procedurze znakowan¹ penicylinê zast¹piono 125I-ampicylin¹, zabieg ten skraca³ okres detekcji PBP. Ukoronowaniem badañ nad PBP by³y prace dotycz¹ce roli biologicznej bia³ek PBP4, PBP5 i PBP2 E. coli. U. S c h w a r z wraz z wspó³pracownikami wykazali, i¿ nadprodukcja PBP5 (D-alanino karboksypeptydazy) lub

inaktywacja PBP2, przestawiaj¹ syntezê mureiny z typu elongacyjnego do syntezy typu kulistego. Autorzy postulowali, ¿e aktywnoœæ PBP5 i PBP2 s¹ niezbêdne komórce E. coli, odpowiednio w procesach wzrostu (elongacji) oraz jej podzia³u. W po³owie lat 70-tych Profesor zainicjowa³ w kierowanym przez siebie Zak³adzie badania z zakresu neurofizjologii – pierwotny zamys³ badañ polega³ na próbach znalezienia w homogenacie komórek siatkówki oka – bia³ek, które mog³yby pe³niæ rolê markerów, pozwalaj¹cych na przeœledzenie procesu ró¿nicowania. Ten nurt zainteresowañ utrzyma³ Profesor do koñca ¿ycia (ostatnia publikacja wspó³autorstwa U. S c h w a r z a z dziedziny neurofizjologii ukaza³a siê w 2006 r). W pocz¹tkach lat 80-tych Uli S c h w a r z jako przedstawiciel M.P.G wyjecha³ do Chin, gdzie kilka miesiêcy pracowa³ w Szanghajskim Instytucie Biochemii i Biologii Komórki Chiñskiej Akademii Nauk. Wraz z profesorem Z h u a n g X i a o h u i za³o¿y³ na miejscu Goœcinne Laboratorium Maksa-Plancka. Celem inwestycji M.P.G w Chinach by³a pocz¹tkowo chêæ pomocy m³odym naukowcom Kraju Œrodka w rozwijaniu wspó³czesnej biochemii. Chodzi³o g³ównie o doraŸn¹ pomoc laboratoryjn¹ – oraz jak s¹dzê – transfer do Chin europejskich technologii i zachodnich standardów. W dalszej kolejnoœci powsta³ Shanghai Institute For Advenced Studies Chinese Academy of Scientes (SIS), którego dyrektorem zosta³ prof. dr Uli S c h w a r z. Instytut (informacja z witryny internetowej Instytytu) ma odpowiadaæ na najbardziej istotne, egzystencjonalne problemy wspó³czesnoœci – jego zadaniem miêdzy innymi jest integracja uczonych ró¿nych specjalnoœci z wielu pañstw. Stanowiæ ma te¿ forum dyskusyjne na którym omawiane s¹ podstawowe problemy zwi¹zane z postêpem nauki i cywilizacji (s¹ nimi dla przyk³adu zagro¿enia wynikaj¹ce z degradacji œrodowiska, biosfery, redukcji biodywersji itp.) Jedna z form dzia³alnoœci Instytutu polega na organizowaniu cyklicznych dyskusji okr¹g³ego sto³u. Temat ostatniej odbytej w pocz¹tkach grudnia 2006 roku zosta³ sformu³owany jako „The Larger City as an Ecological System”. W ¿yciu prywatnym Profesor by³ cz³owiekiem niezwykle kulturalnym, przedsiêbiorczym o du¿ej wiedzy oraz poczuciu humoru. By³ towarzyski, wspaniale gotowa³ i by³ prawdziwym znawc¹ win oraz serów. By³ optymist¹, bliŸnich stara³ siê traktowaæ jak przyjació³. Œmieræ Profesora jest szczególnie bolesna dla Jego uczniów, znajomych i przyjació³. Jerzy Hrebenda

4

MIROS£AWA W£ODARCZYK, GRA¯YNA RUDZICZ

Prof. Dr. Uli Schwarz died (10.06.1934 – 21.12.2006) Prof. Dr. Uli S c h w a r z – for many years director of the Max Planck Institute in Tuebingen (M.P.G. Institut für Virusforschung, Tübingen, now renamed ‘Max-Planck Institut für Entwicklungsbiologie’) and during the last few years, already after retiring, director of the Shanghai Institute for Advanced Studies, Chinese Academy of Sciences – died of a heart attack in December last year. Professor U. S c h w a r z and Poland were bound together by special ties – between the 1970s and the beginning of political transformation in Poland, he initiated and maintained a very close scientific cooperation with different universities across the country (University of Gdañsk, Warsaw University and UMCS). Thanks to him, many young Polish researchers were granted fellowships and received funding from German foundations, mainly the Max Planck Society. In Professor’s laboratory, there were always places reserved for Polish guest students, who had a chance to work hand in hand with young German as well as American, British and Spanish researchers. Uli S c h w a r t z visited our country a few times giving lectures and taking part in various seminars and conferences. His presence in Poland always gave us a sense of intellectual bond between European and Polish researchers. This feeling was of great value to us, especially in the difficult times of political upheaval. Scientific interests and research of U. S c h w a r z centred mainly on the structure, synthesis and biological function of one of the polymers found in the cell wall of Escherichia coli, i.e. murein. His major achievement in this field was the characterization of hydrolases acting on murein (identification, purification, biological properties and topographical distribution in cells). At that time (1970s) he was particularly interested in murein transglycosylases. By analyzing endopeptidase-digested fragments of murein from E. coli, Prof. U. S c h w a r z together with his colleagues (from the research groups working in Tübingen as well as prof. N. N a n n i n g i’ s group from Amsterdam) found that the position of sugar chains in the polymer is perpendicular. Further research focused on penicillin binding proteins (PBPs) of E. coli. In 1980 in the Institute of Biochemistry M.P.G., Tübingen, (headed by U. S c h w a r t z till his death) a new and original method for identification of PBPs was developed. In the proposed procedure labeled penicillin was replaced with 125I-ampicillin, which significantly shortened the time required for detection of PBPs. The crowning achievement of U. S c h w a r z was his work on the biological function of PBP4, PBP5 and PBP2 in E. coli. Professor together with his research group showed that overproduction of PBP5 (D-alanine

carboxypeptidase) or inactivation of PBP2 changes the pattern of murein synthesis from the elongation type to spherical type. This effect led authors to the conclusion that PBP5 and PBP2 are necessary for growth (elongation) and division of E. coli cells. In the mid 1970s, Prof. U. S c h w a r t z broadened the scope of research conducted in the Institute he directed to neurophysiology – the initial idea was to analyze homogenated cells obtained from retina in search for proteins that could serve as markers of the process of cell differentiation. Professor remained interested in this topic until the end of his life (the last article dealing with this issue U. S c h w a r t z published as a co-author in 2006). In the early 1980s, Uli S c h w a r t z went to China as a representative of M.P.G., where he worked in the Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, for a few months. Together with prof. Z h u a n g X i a o h u i, Professor established the Max-Planck Guest Laboratory. Initially, the purpose of the M.P.G.’s investment in China was its eagerness to help young researchers from the “Middle Kingdom” in developing modern biochemistry. The chief concern was the provision of temporary laboratory help and also – I believe – the transfer of European technologies and Western standards to China. Later, the Shanghai Institute for Advanced Studies, Chinese Academy of Sciences (SIS), headed by Uli S c h w a r z, was founded. The Institute’s role (the information comes from the Institute’s website) is to give answers to the most pressing existential questions of modern times. One of its objectives is to encourage cooperation between scientists of various specializations from different countries. The Institute should also function as a forum enabling researchers to exchange their views on the major problems connected with the advancement of science and civilization (such as the repercussions of degradation of the environment and biosphere, the reduction of biodiversity, etc.). Another form of activity in which the Institute is engaged is the organization of round-table discussions. Last such discussion entitled “The Larger City as an Ecological System” took place at the beginning of December 2006. In his private life, Professor was a remarkably cultured and resourceful man, a man of profound knowledge and great sense of humour. He was sociable and optimistic, always trying to be on friendly terms with other people. He was also a brilliant cook and a connoisseur of wines and cheeses. Professor’s death is a truly difficult and painful experience, especially for his students, acquaintances and friends. Jerzy Hrebenda

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 5– 19 http://www.pm.microbiology.pl

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA Marta Pop³awska1,2, Jaros³aw Dziadek2

1 Uniwersytet

£ódzki, ul. Banacha 12/16, 93-237 £ódŸ, e-mail: [email protected], tel. (42) 635 45 00 2 Centrum Biologii Medycznej, Polska Akademia Nauk, ul. Lodowa 106, 93-232 £ódŸ, e-mail: [email protected], tel. (42) 272 36 10 Wp³ynê³o we wrzeœniu 2006 r.

1. G³ówne bia³ko zaanga¿owane w proces podzia³u komórkowego – FtsZ. 2. Regulacja tworzenia pierœcienia Z. 3. Inne bia³ka zaanga¿owane w tworzenie przegrody miêdzykomórkowej i proces podzia³u komórkowego. 4. Proces podzia³u komórkowego drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium Bacterial cell division proteins. The fellowship of the ring Abstract: Cell division in bacteria takes place at the midcell and occurs after DNA has been duplicated and segregated into two nucleoids. The division process starts with the localization of FtsZ at the center of the cell and formation of a septal ring structure called Z-ring. Once the septum is fully formed, the Z-ring disappears and the daughter cells separate. An ordered assembly of other proteins follows this process (eg. FtsA, ZipA, FtsK, FtsQ, FtsL, FtsB, FtsW, FtsI, FtsN). FtsZ is a highly conserved protein that is found in most of the major groups of bacteria. FtsZ is a structural homolog of tubulin; like tubulin, purified FtsZ binds and hydrolyses GTP and assembles in vitro into filaments, sheets and other structures. One important inhibitory system, the Min system, is crucial for the precise positioning of the Z-ring. In E. coli this system consist of the FtsZ assembly inhibitor, MinC protein, and the MinD and MinE proteins which move from one cell pole to the other. Because MinC is associated with the relocating MinD protein, FtsZ assembly is inhibited at the cell poles. Another important regulatory system is nucleoid occlusion. Like Min system, nucleoid occlusion negatively regulates Z-ring assembly. Acting independently of the Min system nucleoid occlusion prevents the assembly of the Z ring on top of unreplicated chromosomal DNA. Several positive and negative regulators of Z ring assembly are known eg. ZipA, EzrA, ClpX, SulA, Noc proteins. The lack of FtsA, ZipA and FtsN cell division proteins suggests that the mechanisms of cell division are likely to be different in Mycobacterium as compared with E. coli. FtsZ and FtsQ are essential cell division proteins in Mycobacterium smegmatis and M. tuberculosis. The C-termini of M. tuberculosis FtsZ and FtsW carries a string of amino acid residues that are absent in their E. coli counterparts. FtsZ and FtsW of M. tuberculosis are binding partners and that binding involves a cluster of aspartate residues in the C-tail of FtsZ. 1. The main cell division protein – Fts 2. Regulation of the Z-ring localization 3. Other cell division proteins 4. Cell division process in Mycobacterium sp. S³owa kluczowe: bia³ko FtsZ, bia³ka podzia³u komórkowego, Mycobacterium, podzia³ komórki bakteryjnej Key words: FtsZ protein, Mycobacterium sp., cell division process

1. Wstêp Proces podzia³u komórkowego jest jednym z podstawowych przejawów ¿yciowych komórek zarówno pro- jak i eukariotycznych. W wyniku podzia³u powstaj¹ dwie komórki potomne identyczne pod wzglêdem posiadanego materia³u genetycznego z komórk¹ macierzyst¹. Powstawanie komórek potomnych jest zatem poprzedzone podwojeniem informacji genetycznej czyli replikacj¹ DNA, a nastêpnie jego rozdzieleniem miêdzy nowo powstaj¹cymi komórkami. Wówczas rozpoczyna siê proces formowania przegrody miêdzykomórkowej, któremu towarzyszy zjawisko cytokinezy. Po wytworzeniu przegrody (septy) w miejscu jej powstania nastêpuje stopniowe wpuklanie os³on komórkowych, co w konsekwencji prowadzi do rozdzielenia komórek potomnych [21, 26].

W komórce bakteryjnej po zakoñczeniu ka¿dej rundy replikacyjnej chromosomy s¹ z³¹czone i w kolejnym etapie musz¹ ulec rozdzieleniu. Mechanizm rozdzia³u chromosomów do komórek potomnych nie jest do koñca poznany. Mo¿e on polegaæ na: ● po³¹czeniu nukleoidów z b³on¹ cytoplazmatyczn¹ i ich mechanicznym rozdzielaniu w czasie wzrostu komórki, ● wzajemnym odpychaniu nukleoidów, ● dzia³aniu specyficznych bia³ek zaanga¿owanych w ten proces np. bia³ek Spo0J, Soj, SMC (np. Bacillus subtilis) bia³ek ParA i ParB Caulobacter crescentus [7, 26, 27, 38, 45, 47, 60, 64]. Spo0J lub ParB wi¹¿¹ siê w sposób specyficzny z sekwencjami parC (14–16 nukleotydowe sekwencje palindromowe) zlokalizowanymi wokó³ regionu oriC tworz¹c kompleks, w sk³ad którego

6

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

Rys. 1. Kolejnoœæ przy³¹czania siê bia³ek do powstaj¹cej przegrody miêdzykomórkowej

tak¿e wchodzi bia³ko Soj (lub ParA) [27, 45, 46, 60]. Bia³kowe kompleksy przemieszczaj¹ siê nastêpnie razem z nowosyntetyzowanymi regionami oriC w okolice biegunów komórki co prowadzi do rozdzielnia chromosomów [45, 60]. Bakteryjne bia³ka SMC (structural maintenance of chromosome) zaanga¿owane s¹ w proces kondensacji DNA, uczestnicz¹ w zapewnieniu prawid³owej organizacji chromosomu bakteryjnego (superskrêcenie) oraz jego segregacji po zakoñczeniu replikacji DNA [86, 91]. Bia³ka SMC B. subtilis „wspó³pracuj¹” w komórce z innymi bia³kami – ScpA i ScpB. Szczegó³owe badania wskazuj¹, ¿e bia³ko ScpB wi¹¿e siê z SMC poprzez bia³ko ScpA oraz, ¿e SMC jest w tym kompleksie bia³kiem wi¹¿¹cym DNA [91]. W chromosomie E. coli brak jest genów parA, parB oraz sekwencji homologicznych do parC, które

obecne s¹ w genomach innych drobnoustrojów. W segregacji chromosomów w komórkach E. coli uczestnicz¹ bia³ko SeqA i produkt genu mukB [11]. Bia³ko MukB (1484 aminokwasów – aa) jest zaanga¿owane w proces kondensacji DNA, oprócz MukB w tym procesie uczestnicz¹ tak¿e bia³ka MukE i MukF [91]. Bia³ko SeqA uwa¿ane jest za g³ówny negatywny regulator procesu inicjacji replikacji DNA w komórkach E. coli, od niedawna jest tak¿e zaliczane do specyficznych czynników transkrypcyjnych E. coli [91]. Z danych literaturowych wynika tak¿e, ¿e bia³ko SeqA prawdopodobnie tworzy dwa kana³y bia³kowe, przez które przechodz¹ chromosomy potomne po zakoñczeniu procesu replikacji DNA [11]. Ponadto w rozdzia³ chromosomów zaanga¿owane jest prawdopodobnie bia³ko uczestnicz¹ce tak¿e w procesie podzia³u komórkowego – FtsK [27, 55, 64, 95]. Wœród organizmów prokariotycznych modelem badawczym, u którego proces podzia³u komórkowego zosta³ najlepiej poznany jest E. coli. W komórce E. coli zidentyfikowano co najmniej 15 bia³ek, które s¹ niezbêdne do prawid³owego przebiegu procesu podzia³u komórkowego (Rys. 1) [55, 64, 93]. Bia³ka te przy³¹czaj¹ siê do nowo powstaj¹cej przegrody komórkowej w œciœle okreœlonej kolejnoœci, w sposób sekwencyjny czyli zale¿ny od siebie. Nieobecnoœæ któregokolwiek z tych bia³ek hamuje podzia³ komórki poprzez hamowanie przy³¹czania kolejnych elementów [22]. W komórkach E. coli istniej¹ dwa wyj¹tki w sekwencyjnym sposobie przy³¹czania siê bia³ek zaanga¿owanych w proces podzia³u komórkowego do powstaj¹cej przegrody: ● ZipA, FtsA – oba wymienione bia³ka przy³¹czaj¹ siê do tworz¹cej siê przegrody miêdzykomórkowej w sposób zale¿ny od bia³ka FtsZ ale niezale¿ny od siebie [33–37, 51] ● FtsL i FtsB (YgbQ) – oba bia³ka przy³¹czaj¹ siê do tworz¹cej siê przegrody w sposób zale¿ny od bia³ka FtsQ oraz bia³ek bior¹cych udzia³ we wczeœniejszych etapach procesu podzia³u komórkowego [8–10]. Ponadto w procesie podzia³u komórkowego E. coli bierze udzia³ szereg innych bia³ek np. bia³ka chaperonowe kodowane przez geny groEL i hscA, produkty genów mrcA i mrcB, które koduj¹ bia³ka wi¹¿¹ce penicyliny PBP 1a i 1b zaanga¿owane w póŸniejsze etapy biosyntezy peptydoglikanu [21, 47, 64]. 2. G³ówne bia³ko zaanga¿owane w proces podzia³u komórkowego – FtsZ Bia³kiem pe³ni¹cym kluczowa rolê w procesie podzia³u komórki bakteryjnej jest bia³ko FtsZ obecne w wiêkszoœci organizmów prokariotycznych oraz cha-

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

rakteryzuj¹ce siê wysokim stopniem konserwatywnoœci sekwencji aminokwasowej [21, 55, 64, 71]. Spoœród organizmów których genom zosta³ zskwencjonowany genu ftsZ nie zidentyfikowano w komórkach Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae – bezwzglêdnie wewn¹trzkomórkowych bakterii oraz Aeropyrum pernix i Ureaplasma urealyticum [28, 31, 55, 64]. FtsZ obecne jest tak¿e w komórkach roœlin i prawdopodobnie pe³ni istotn¹ rolê w procesie podzia³u chloroplastów (cpFtsZ) [54, 81]. Gen koduj¹cy chloroplastowe FtsZ zlokalizowany jest w j¹drowym DNA, ale posiada sekwencjê sygna³ow¹ umo¿liwiaj¹c¹ transport tego bia³ka do chloroplastów [76]. Homologów genu ftsZ nie odnaleziono natomiast w genach mitochondrialnych co wskazuje na inny mechanizm podzia³u tych organelli komórkowych [76]. Bia³ko kodowane przez gen ftsZ (filament forming temperature – sensitive) uwa¿ane jest za strukturalny homolog eukariotycznej tubuliny [2, 13, 20, 21, 57, 68]. Oba bia³ka zawieraj¹ konserwatywn¹ bogat¹ w reszty glicynowe pêtlê tzw. tubulin signature nucleotide-binding motif o sekwencji aminokwasowej – GGGTGTG (FtsZ) oraz GGGTGSG (tubulina) (Rys. 2) [20, 21, 24, 55]. Ponadto stwierdzono, ¿e ponad 50 aminokwasów le¿¹cych w bezpoœrednim s¹siedztwie pêtli wykazuje wysoki stopieñ homologii w obu bia³kach [20, 24]. FtsZ, podobnie jak tubulina, wi¹¿e i hydrolizuje GTP

7

co prowadzi do jego polimeryzacji, w wyniku tego procesu powstaj¹ protofilamenty, których struktura przypomina mikrotubule [13, 20, 24, 31]. Oba bia³ka wykazuj¹ podobn¹ odpowiedŸ na dzia³anie hydrofobowych barwników – podczas gdy bis-anilino-naftaleno sulfonian (bis-ANS) hamuje polimeryzacjê obu bia³ek, pokrewny barwnik ANS nie wywo³uje tego efektu [97]. Ponadto wykazano, ¿e inhibitory gromadzenia tubuliny takie jak: thiabendazole, 2-metylobenzimidazol powodowa³y tak¿e wyd³u¿anie komórek E. coli i cyjanobakterii co sugeruje, ¿e dzia³aj¹ one tak¿e hamuj¹co na gromadzenie bia³ka FtsZ [97]. W warunkach in vitro najbardziej powszechnie stosowane inhibitory tubuliny: kolchicyna, kolcemid czy winblastyna nie wp³ywaj¹ ma gromadzenie siê i polimeryzacjê bia³ka FtsZ [97]. Poznanie struktury bia³ka FtsZ pochodz¹cego z termofilnej bakterii Methanococcus janaschii i bydlêcej tubuliny udowodni³o du¿e podobieñstwo obu bia³ek, zarówno na poziomie sekwencji aminokwasowej jak i budowy strukturalnej [55, 83]. Ostatnie prace udowodni³y podobieñstwo budowy i funkcji dwóch regionów obecnych zarówno w tubulinie jak i bia³ku FtsZ [20, 30, 58]. Pierwszy z tych regionów to pêtla T3 odpowiedzialna za oddzia³ywanie z grup¹ (-fosforanow¹ GTP, drugi region to pêtla T7, która wchodzi w bezpoœredni kontakt z kolejnym monomerem

Rys. 2. Porównanie sekwencji aminokwasowej " i $ tubuliny oraz bia³ka FtsZ Methanococcus janaschii. Zaznaczono region konserwatywny

8

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

FtsA, ZipA FtsEX FtsK FtsQ FtsL, FtsB FtsW Ftsl FtsN AmiC

Kolejnoœæ przy³¹czania bia³ek do tworz¹cej siê przegrody komórkowej

Pierœcieñ FtsZ

Rys. 3. Schemat polimeryzacji bia³ka FtsZ i tworzenia pierœcienia Z

buduj¹cym mikrotubule lub polimer FtsZ. Dodatkowo wykazano, ¿e obecnoœæ asparaginy w obrêbie pêtli T7 jest niezbêdna do hydrolizy GTP, a miejsce aktywne odpowiedzialne za ten proces tworzone jest poprzez po³¹czenie dwóch monomerów FtsZ [20, 30, 58]. W komórce E. coli ok. 75% bia³ka FtsZ obecne jest w postaci multimerów zbudowanych z ró¿nej liczby podjednostek [58, 70, 77]. Morfologia polimerów tworzonych przez bia³ko FtsZ w warunkach in vitro jest uzale¿niona od warunków w jakich odbywa siê polimeryzacja [58, 70]. W obecnoœci GTP bia³ko FtsZ tworzy cienkie protofilamenty, a dynamika polimeryzacji jest uzale¿niona od dostêpnoœci GTP [57]. Badania z wykorzystaniem analogu GTP guanylylo-("$-metyleno-difosfonian), zwi¹zku który jest równie¿ hydrolizowany przez FtsZ, wykaza³y ¿e powsta³e protofilamenty mog¹ nastêpnie tworzyæ polimery wy¿szego rzêdu w obecnoœci jonów Mg2+, Ca2+ lub DEAE dekstranu [56, 57, 72]. Podobn¹ reakcjê obserwowano kiedy FtsZ polimeryzowa³o w obecnoœci bia³ka ZipA. Bia³ko to bezpoœrednio oddzia³uje z FtsZ i stymuluje jego polimeryzacjê [30, 35, 50, 51]. W oparciu o dostêpn¹ wiedzê zaproponowano model polimeryzacji bia³ka FtsZ, który bardzo przypomina model polimeryzacji tubuliny [2, 13, 57, 58, 70]. GTP ulega inkorporacji pomiêdzy po³¹czone monomery bia³ka FtsZ, które zawieraj¹ tzw. koniec „+” z miejscem wi¹zania nukleotydów (nucleotide binding site) i koniec „–” z pêtl¹ T7. Po³¹czone podjednostki FtsZ doprowadzaj¹ do szybkiej hydrolizy GTP, który obecny jest w utworzonym przez po³¹czone podjednostki miejscu aktywnym. Polimer FtsZ jest stabilny tak d³ugo jak d³ugo monomer zawieraj¹cy zwi¹zany GTP jest obecny na koñcu „–”. Wykazano tak¿e, ¿e FtsZ polimeryzuje tworz¹c pojedyncze protofilamenty, które nastêpnie s¹ ³¹czone w strukturê przypominaj¹c¹ wst¹¿kê. Taka struktura – mieszanina pojedynczych proto-

filamentów hydrolizuje GTP w warunkach fizjologicznych (stê¿enie KCl 350 mM, pH 7,5) w stosunku 5 cz¹steczek GTP/min/FtsZ [2, 13, 57, 58, 70]. Badania z wykorzystaniem bia³ka fuzyjnego FtsZ: GFP oraz analiza lokalizacji rekombinowanego bia³ka w komórce wykaza³y, ¿e tylko ok. 30% komórkowego bia³ka jest zaanga¿owane w budowanie pierœcienia Z; pozosta³a czêœæ FtsZ obecna jest w cytoplazmie [54]. W czasie podzia³u komórkowego bia³ko FtsZ gromadzone jest w centralnej czêœci komórki gdzie w sposób GTP-zale¿ny ulega polimeryzacji tworz¹c obr¹czkowat¹ strukturê zwan¹ pierœcieniem Z (Z-ring), który wyznacza miejsce tworzenia przysz³ej przegrody oddzielaj¹cej komórki potomne (Rys. 3) [48, 54, 55]. Pierscieñ Z jest struktur¹ niestabiln¹, przy braku GTP w komórce bardzo szybko dochodzi do depolimeryzacji bia³ka FtsZ [24, 30, 31, 57]. Wykazano, ¿e w proces polimeryzacji zaanga¿owana jest domena N-koñcowa bia³ka FtsZ chrakteryzuj¹ca siê wysokim stopniem konserwatywnoœci sekwencji aminokwsowej, domena C-koñcowa jest natomiast odpowiedzialna za oddzia³ywanie z pozosta³ymi bia³kami zaanga¿owanymi w proces podzia³u komórkowego [24, 31, 55]. W komórkach E. coli obecnych jest od 5000 do 20 000 cz¹steczek FtsZ, poziom zawartoœci komórkowego bia³ka FtsZ ma istotne znaczenie dla przebiegu procesu podzia³u komórkowego [30, 55, 57]. Dowodem kluczowej roli jak¹ pe³ni bia³ko FtsZ w podziale komórki jest fakt, ¿e ju¿ jego niewielki niedobór w komórce uniemo¿liwia powstawanie pierœcienia Z, a tym samym uniemo¿liwia powstawanie przegrody miêdzykomórkowej. Prowadzi to do zaburzenia morfologii komórek i powstania d³ugich filamentów komórkowych [24, 30, 55, 78]. W strukturze FtsZ wyró¿niono 3 regiony: ● d³ugi N-terminalny odcinek o wysokiej konserwatywnoœci sekwencji AK (tzw. region NTR).

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

W oparciu o strukturê krystaliczn¹ bia³ka region NTR dodatkowo podzielono na dwie domeny N-terminaln¹ o w³aœciwoœciach GTP-azy oraz C-koñcow¹ o nie znanej dot¹d funkcji. Stwierdzono, ¿e region NTR jest niezbêdny do oddzia³ywania FtsZ:FtsZ. ● tzw. region spejserowy ró¿nej d³ugoœci wykazuj¹cy du¿y stopieñ zmiennoœci ● krótki C-koñcowy, który jest niezbêdny do oddzia³ywania bia³ka FtsZ z innym bia³kiem uczestnicz¹cym w procesie podzia³u komórkowego [55, 70]. J e n k i n s i wsp. (2002) zidentyfikowali w genomie bakterii Prosthecobacter dejongeii geny koduj¹ce bia³ka BtubA i BtubB [40, 41]. Sekwencja aminokwasowa tych bia³ek wykazuje 35% (BtubA) i 37% (BtubB) homologii z eukariotyczn¹ tubulin¹ a tylko 8–11% homologii z sekwencj¹ aminokwasow¹ bia³ka FtsZ. Ponadto w genomie Prosthecobacter dejongeii nie wykazano obecnoœci genu koduj¹cego bia³ko FtsZ pe³ni¹cego kluczow¹ rolê w procesie podzia³u komórkowego [40, 41]. S o n t a g i wsp. sklonowali geny btuba i btubb oraz uzyskali ich ekspresjê w komórkach E. coli [73]. Badania in vitro wykaza³y, ¿e bia³ko BtubB tworzy pierœcieñ w obecnoœci GTP lub GDP, natomiast dodanie drugiego bia³ka stymuluje powstawanie d³ugich filamentów. Najprawdopodobniej bia³ka te s¹ funkcjonalnymi odpowiednikami FtsZ [73]. 3. Regulacja powstawania pierœcienia Z W komórkach o pa³eczkowatym kszta³cie formowanie przegrody miêdzykomórkowej rozpoczyna siê zazwyczaj dok³adnie w jej centralnej czêœci miêdzy dwoma biegunami [48]. Za prawid³ow¹ lokalizacjê pierœcienia Z w centralnej czêœci komórki odpowiedzialne s¹ dwa mechanizmy: ● wykluczenie nukleoidowe – „nucleoide occlusion” ● system MinCDE. Pierwszy z nich zaproponowany przez W o l d r i n g h’ a i wsp. zak³ada, ¿e obecnoœæ nukleoidu hamuje tworzenie pierœcienia Z [90]. W komórce o wyd³u¿onym kszta³cie istniej¹ trzy miejsca wolne od DNA. S¹ to bieguny komórki oraz jej œrodek po zakoñczeniu rundy replikacyjnej i rozdzieleniu chromosomów. Je¿eli w komórce nie funkcjonuje wykluczenie nukleoidowe przegroda miêdzykomórkowa mo¿e powstawaæ pomiêdzy nierozdzielnymi chromosomami co w rezultacie mo¿e doprowadziæ do przeciêcia chromosomów. Inaktywacja wykluczenia nukleoidowego w komórce mo¿e byæ wywo³ana np. dekondensacj¹ DNA [27, 61, 80, 90]. W literaturze ostatnich lat opi-

9

sano dwa bia³ka zwi¹zane z dzia³aniem tego systemu. S¹ to bia³ka SlmA E. coli i Noc B. subtilis [5, 23]. Dane eksperymentalne sugeruj¹, ¿e bia³ka te wp³ywaj¹ na topologiê gromadzenia siê bia³ka FtsZ w centralnej czêœci komórki, stanowi¹ tzw. punkty kontrolne (checkpoint), zapobiegaj¹c przeciêciu nierozdzielnych chromosomów przez powstaj¹cy pierœcieñ Z. Bia³ka SlmA i Noc nie wykazuj¹ podobieñstwa sekwencji aminokwasowej, ale oba maj¹ zdolnoœæ wi¹zania siê do wielu miejsc w DNA. W komórkach E. coli system min obejmuje trzy bia³ka MinC, MinD, MinE kodowane przez geny minC, minD, minE wchodz¹ce w sk³ad operonu minCDE [42, 55, 61, 64]. System tez zosta³ tak nazwany, poniewa¿ komórki mutanty E. coli w obrêbie genów koduj¹cych bia³ka systemu maj¹ postaæ minikomórek. W takich komórkach podzia³y zachodz¹ w niew³aœciwej czêœci komórki, najczêœciej na jej biegunie. W wyniku nieprawid³owo przebiegaj¹cego procesu podzia³u komórkowego mog¹ powstawaæ komórki pozbawione nukleoidu [42, 55, 61]. Bia³ko MinC jest dimerem sk³adaj¹cym siê z dwóch odmiennych domen po³¹czonych elastycznym odcinkiem ³¹cznikowym [6]. Jego C-terminalna domena umo¿liwia dimeryzacjê i odpowiada za tworzenie kompleksu z wykazuj¹cym aktywnoœæ ATP-azow¹ bia³kiem MinD zakotwiczonym w b³onie komórkowej [39, 49, 82, 99]. Bia³ka MinC i MinD wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ tworz¹c kompleks MinCD, który negatywnie reguluje gromadzenie siê bia³ka FtsZ w centralnej czêœci komórki [6, 39, 49]. Kompleks MinCD jest inhibitorem gromadzenia siê i polimeryzacji bia³ka FtsZ. Ostatni element tego systemu bia³ko MinE jest dimerem [52, 53]. N-koñcowa domena monomerowej jednostki bia³ka odpowiada za kontakt z kompleksem MinCD, natomiast domena C-terminalna umo¿liwia dimeryzacjê MinE [55]. Konstrukcja bia³ka fuzyjnego MinE:GFP umo¿liwi³a poznanie lokalizacji MinE w komórce [78]. Bia³ko MinE tworzy strukturê pierœcieniopodobn¹ zlokalizowan¹ w centralnej czêœci komórki tzw. MinE ring (pierœcieñ MinE). Prawdopodobnie bia³ko to znosi hamuj¹ce dzia³anie kompleksu MinCD w swoim bezpoœrednim s¹siedztwie umo¿liwiaj¹c gromadzenie siê i polimeryzacjê bia³ka FtsZ prowadz¹c¹ do powstania w centralnej czêœci komórki pierœcienia Z [55, 78]. Uzyskanie bia³ek fuzyjnych MinC-GFP oraz MinD-GFP pozwoli³o zrozumieæ rolê tych bia³ek w regulacji tworzenia siê pierœcienia Z. W sposób eksperymentalny stwierdzono, ¿e w E. coli kompleks MinCD oscyluje pomiêdzy biegunami komórki, a czas potrzebny na przebycie tego dystansu wynosi od 10 do 60 sekund [55, 67]. Przemieszczanie siê bia³ek MinCD miêdzy przeciwleg³ymi biegunami komórki jest uzale¿nione od bia³ka MinE, które usuwa kompleks z centralnej czêœci komórki w stronê

10

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

biegunów, dziêki czemu zapewnia powstanie wolnej przestrzeni w centrum komórki gdzie mo¿e rozpocz¹æ siê gromadzenie, polimeryzacja bia³ka FtsZ i tworzenie przegrody miêdzykomórkowej [79, 81]. Ponadto kompleks MinCD przemieszczaj¹c siê po obszarze biegunów komórki nie dopuszcza do gromadzenia siê tam bia³ka FtsZ i powstania przegrody miêdzykomórkowej w nietypowym dla niej miejscu [79, 81, 100]. Wykorzystuj¹c dro¿d¿owy system dwuhybrydowy (Y2H) nie wykazano bezpoœredniego oddzia³ywania pomiêdzy bia³kiem FtsZ a bia³kami MinCDE [98]. Nadprodukcja bia³ek MinC i MinD powoduje zahamowanie podzia³u komórkowego i prowadzi do tworzenia d³ugich filamentów komórkowych, natomiast nadprodukcja bia³ka MinE znosi hamuj¹ce dzia³anie bia³ek MinC i MinD [55, 98]. Prawdopodobnie wspó³dzia³anie wykluczenia nukleoidowego i systemu min zapewnia tworzenie przegrody miêdzykomórkowej w centralnej czêœci komórki [95]. Produkt genu ftsZ stanowi te¿ molekularny cel dzia³ania dla bia³ka SulA (SfiA) nale¿¹cego do du¿ej grupy bia³ek, których synteza jest indukowana uszkodzeniami DNA (system SOS) [6, 15]. SulA przejœciowo zapobiega polimeryzacji FtsZ i w ten sposób zapobiega niepo¿¹danym podzia³om komórki do czasu gdy uszkodzenia DNA zostan¹ naprawione [6, 15]. Istotn¹ rolê w regulacji powstawania pierœcienia Z odgrywa tak¿e bia³ko chaperonowe ClpX B. subtilis (ClpXClpP bia³ka chaperonowe, proteazy nale¿¹ce do bia³ek szoku termicznego) [85]. Oczyszczone ClpX hamuje polimeryzacjê bia³ka FtsZ w warunkach in vitro nie zaburzaj¹c jednak zdolnoœci FtsZ do hydrolizy GTP. Prawdopodobnie bia³ko to dzia³a dopiero po utworzeniu przez FtsZ protofilamentów [85]. L e v i n i wsp. zidentyfikowali w komórkach B. subtilis bia³ko EzrA, które reguluje czêstoœæ i miejsce powstawania pierœcienia Z [32, 44]. Brak funkcjonalnego bia³ka EzrA powodowa³ w komórce powstawanie wielu pierœcieni Z, które by³y zlokalizowane zarówno w jej centralnej czêœci jak i na biegunach [44]. Bia³ko EzrA destabilizuje strukturê pierœcienia Z poprzez bezpoœrednie wi¹zanie siê z koñcami polimerów FtsZ i stymulowanie gwa³townej depolimeryzacji. Ponadto mo¿liwe jest oddzia³ywanie EzrA z innymi bia³kami podzia³u komórkowego, których zadaniem jest stabilizacja struktury Z-ringu. Wykazano eksperymentalnie, ¿e nadekspresja jednego z genów koduj¹cych bia³ko podzia³u komórkowego – FtsL znosi efekt mutacji w genie ezrA [32, 44]. W komórkach B. subtilis nie wystêpuje funkcjonalne bia³ko MinE, jego rolê pe³ni bia³ko DivIVA, a bia³ka MinC i MinD s¹ istotne w procesie hamowania powstawania pierœcienia Z na biegunach komórki ale nie odgrywaj¹ istotnej roli w precyzyjnym wyborze

miejsca tworzenia pierœcienia Z w centralnej czêœci komórki [25]. Dane literaturowe wskazuj¹ tak¿e na udzia³ mechanizmu proteolitycznego w regulacji aktywnoœci bia³ka FtsZ. W procesie tym uczestniczy bia³ko FtsH [3,4]. Bia³ko to zosta³o zidentyfikowane jako ATP zale¿na metaloproteaza wymagaj¹ca do pe³nej aktywnoœci obecnoœci jonów Zn2+. FtsH zakotwiczone jest w b³onie cytoplazmatycznej dwoma regionami transmembranowymi i posiada d³ugi obecny w cytoplazmie C-koniec. Bia³ko to nale¿¹ce do rodziny AAA (ATP-ases associated with a variety of cellular activities) pe³ni w komórce szereg funkcji. Zaanga¿owane jest miêdzy innymi w procesy regulacji odpowiedzi komórki na stres, degradacjê bia³ek zwi¹zanych z b³on¹ cytoplazmatyczn¹, bia³ek z krótkimi niepolarnymi C-koñcami, wp³ywa tak¿e na poziom ekspresji genu koduj¹cego bia³ko Spo0A (B. subtilis) [3, 4]. Dane eksperymentalne wykaza³y, ¿e inkubacja w warunkach in vitro bia³ek FtsZ E. coli i FtsH E. coli prowadzi³a do zale¿nej od ATP i jonów Zn2+ degradacji FtsZ. Brak ATP, obecnoœæ orto fenantroliny (czynnik chelatuj¹cy Zn2+) lub analogu ATP nie ulegaj¹cego hydrolizie (ATP-gS) ca³kowicie hamowa³ aktywnoœæ proteolityczn¹ FtsH E. coli. Ponadto wykazano, ¿e proteaza FtsH E.coli wykazuje aktywnoœæ tak¿e w procesie degradacji bia³ka FtsZ M. tuberculosis H37Rv [4]. Funkcjonalne bia³ko FtsZ jest obecne w komórkach wiêkszoœci patogenów. Fakt ten oraz stwierdzony brak obecnoœci FtsZ w komórkach ssaków spowodowa³, ¿e bia³ko to jest rozpatrywane jako potencjalne miejsce dzia³ania nowych leków przeciwbakteryjnych. Spoœród zwi¹zków poddanych analizie przez S t o k e s’ a i wsp. jeden nazwany PC58538 specyficznie hamowa³ proces podzia³u komórkowego B. subtilis [75]. Komórki poddane dzia³aniu PC58538 charakteryzowa³y siê znacznie wyd³u¿onym kszta³tem czemu towarzyszy³ brak podzia³ów komórkowych. Szczegó³owe badania z wykorzystaniem genu reporterowego gfp wykaza³y, ¿e przy braku PC58538 w centralnej czêœci komórki obserwowano powstawanie pierœcienia Z. Po 10 minutowej inkubacji z PC58538 pierœcieñ Z ulega³ ca³kowitej dezintegracji [75]. 4. Inne bia³ka zaanga¿owane w tworzenie przegrody miêdzykomórkowej i proces podzia³u komórkowego FtsA nale¿y do grupy bia³ek okreœlanych jako actin/ hsp70/sugar kinase family [55]. Uwa¿ane jest za homolog obecnej w komórkach eukariotycznych aktyny, podobnie jak aktyna wykazuje tak¿e w³aœciwoœci ATP-azy [55, 92]. Obecnoœci tego bia³ka nie stwierdzono w komórkach bakterii nale¿¹cych do rodzaju

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

Mycobacterium, Cyanobacterium i Mycoplasma oraz u Archaea [55]. Gen ftsA po³o¿ony jest zwykle w bezpoœrednim s¹siedztwie genu ftsZ (powy¿ej genu ftsZ) w obrêbie regionu dcw – (cell division – cell wall biosynthesis gene cluster) [17]. Wykazano, ¿e w trakcie procesu podzia³u komórkowego FtsA lokalizuje pierœcieñ Z, a lokalizacja ta jest zale¿na od FtsZ. Konstruuj¹c mutanty w C-koñcowej czêœci bia³ka FtsA udowodniono, ¿e aminokwasem pe³ni¹cym kluczow¹ rolê w oddzia³ywaniu FtsA z bia³kiem FtsZ jest tryptofan w pozycji 415 FtsA [94]. E r i c s s o n i wsp. wykazali ponadto, ¿e istotn¹ rolê w oddzia³ywaniu FtsZ:FtsA odgrywaj¹ te¿ 2 aminokwasy zlokalizowane w C-koñcowej czêœci FtsZ – lizyna w pozycji 372 i prolina w pozycji 375 [21, 22]. Centralny region domeny C-koñcowej FtsZ charakteryzuj¹cy siê wysokim stopniem konserwatywnoœci z motywem Pro-X-(Phe/hydrophobic) residue motif inicjuje proces oddzia³ywania FtsZ:FtsA [55, 84]. Bia³ko FtsA bierze udzia³ w procesie podzia³u komórkowego i formowaniu przegrody miêdzykomórkowej ju¿ we wczesnym etapie procesu, gdy¿ u mutantów w obrêbie genu ftsA nie dochodzi³o do wi¹zania do pierœcienia Z kolejnych bia³ek podzia³u komórkowego [51, 55]. Nadal niewiele wiadomo o funkcji jak¹ pe³ni bia³ko FtsA w procesie podzia³u komórkowego, przypuszczalnie odpowiada ono za stabilizacjê struktury pierœcienia Z. Bardzo wa¿ny dla prawid³owego podzia³u komórki jest tak¿e stosunek iloœciowy pomiêdzy bia³kami FtsA i FtsZ wynosz¹cy 1:100 w komórkach E. coli i 1:5 w komórkach B. subtilis [51, 55, 84]. Zidentyfikowane jako bia³ko oddzia³uj¹ce z FtsZ bia³ko ZipA (Z-interacting protein A) jest integraln¹ czêœci¹ b³ony komórkowej z N-koñcow¹ czêœci¹ zakotwiczon¹ w b³onie komórkowej i posiadaj¹ce cytoplazmatyczn¹ domenê C-koñcow¹ [33, 34, 35, 36, 55]. Analiza sekwencji aminokwasowej wykaza³a, ¿e ZipA jest bia³kiem bogatym w proliny i glutaminy [55]. Przy³¹czane jest do pierœcienia Z w sposób zale¿ny od bia³ka FtsZ ale niezale¿ny od bia³ka FtsA [51]. H a n e y i wsp. wykorzystuj¹c dro¿d¿ow¹ metodê dwuhybrydow¹ (Y2H) wykazali, ¿e w oddzia³ywaniu z bia³kiem FtsZ istotn¹ rolê odgrywa Asp w pozycji 373 w domenie C-koñcowej bia³ka ZipA [36]. W procesie podzia³u komórkowego ZipA podobnie jak FtsA prawdopodobnie bierze udzia³ w stabilizacji pierœcienia Z, a dodatkowo umocowuje pierœcieñ Z, bêd¹cy rusztowaniem dla przegrody komórkowej, w b³onie cytoplazmatycznej. Nadprodukcja oraz niedobór ZipA w komórce skutkuje zaburzeniami w przebiegu procesu podzia³u. Prawdopodobnie nadprodukcja bia³ka ZipA w komórce wysyca dostêpne miejsca wi¹zania z pierœcieniem Z i tym samym uniemo¿liwia przy³¹czenie do pierœcienia Z bia³ka FtsA [55, 71].

11

Bia³ka FtsE i FtsX wykazuj¹ du¿¹ homologiê z rodzin¹ bia³ek ABC transporterów – bia³ko FtsE jest komponentem wi¹¿¹cym ATP (ATP-binding cassette) podczas gdy FtsX jest sk³adnikiem membrany [21, 55, 59]. Bia³ka nale¿¹ce do grupy ABC transporterów wykorzystuj¹ energiê z hydrolizy ATP do transportu szerokiej gamy substratów do wnêtrza komórki oraz na zewn¹trz. Zaanga¿owane s¹ miêdzy innymi w usuwanie leków z komórek bakterii oraz komórek ssaków oraz transport jonów do wnêtrza komórki. Charakterystyczn¹ cech¹ budowy bia³ek nale¿¹cych do grupy ABC transporterów jest obecnoœæ dwóch domen NTnucleotide binding domain oraz dwóch domen transmembranowych. ABC transportery dodatkowo posiadaj¹ w swojej budowie tzw. motyw Walkera A i motyw Walkera B, regiony te s¹ zaanga¿owane w wi¹zanie i hydrolizê ATP, a sekwencja aminokwasowa tych regionów charakteryzuje siê stosunkowo wysokim stopniem konserwatywnoœci [59]. Zarówno FtsE jak i FtsX lokalizuj¹ pierœcieñ Z, a lokalizacja ta wymaga obecnoœci w miejscu podzia³u komórkowego bia³ek: FtsZ, FtsA, ZipA. Prawdopodobnie omawiane bia³ka uczestnicz¹ w transporcie jonów niezbêdnych w procesie podzia³u komórkowego [55, 59]. Jednym z wiêkszych bia³ek obecnych w komórce E. coli (1330 aa) jest bia³ko FtsK zaanga¿owane w proces podzia³u komórkowego [55]. Jego przy³¹czenie do miejsca podzia³u komórkowego jest uzale¿nione od obecnoœci FtsZ, FtsA, ZipA i prawdopodobnie FtsE i FtsX [14, 55]. Podczas gdy domena N-koñcowa bia³ka FtsK jest niezbêdna dla prawid³owego przebiegu procesu podzia³u komórki (mutanty FtsK pozbawione funkcjonalnej domeny N-koñcowej mia³y zablokowany podzia³ komórki), jego domena C-koñcowa (wykazuj¹ca w³aœciwoœci ATP-azy) zlokalizowana w cytoplazmie uczestniczy w procesie segregacji chromosomów po replikacji DNA oraz przemieszczaniu DNA z centralnej czêœci komórki do jej biegunów tak aby powsta³a wolna przestrzeñ do uformowania przegrody miêdzykomórkowej [27, 55, 64, 96]. Domena ta wykazuje wysokie podobieñstwo do C-koñcowej czêœci bia³ka SpoIIIE, które obecne jest w komórkach B. subtilis i uczestniczy w procesie rozdzia³u chromosomów do komórek potomnych [23]. Mutacje w genie ftsK prowadz¹ce do zmian w sekwencji aminokwasowej w obrêbie C-koñcowej domeny FtsK w komórkach E. coli prowadz¹ do nieprawid³owego po³o¿enia chromosomów w dziel¹cej siê komórce [27, 55, 64, 96]. Ostatnio sugeruje siê tak¿e, ¿e bia³ko FtsK pomaga „utrzymywaæ” DNA z daleka od centralnej czêœci komórki i miejsca tworzenia siê przegrody miêdzykomórkowej, a tak¿e prawdopodobn¹ rolê tego bia³ka w indukcji komórkowego systemu SOS [15]. Kolejne bia³ka bior¹ce udzia³ w procesie podzia³u komórkowego FtsQ, FtsL, YgbQ (FtsB) s¹ bia³kami

12

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

membranowymi, które lokalizuj¹ przegrodê komórkow¹ [8, 9, 10]. FtsQ jest ma³ym bia³kiem zbudowanym z 276 aminokwasów, posiada krótki odcinek peryplazmatyczny o d³ugoœci 24 aa, fragment transmembranowy o d³ugoœci 25 aa oraz 227 aa domenê cytoplazmatyczn¹ [9, 10]. Sugeruje siê, ¿e bia³ko to mo¿e odgrywaæ wa¿n¹ rolê w biosyntezie peptydoglikanu œciany komórkowej nowo powstaj¹cych komórek. Wystêpuje w iloœci ok. 22 cz¹steczek na komórkê bakteryjn¹ [10]. Ortologów genu ftsQ nie zidentyfikowano w genomach bakterii pozbawionych œciany komórkowej [55]. Za lokalizacjê przegrody miêdzykomórkowej odpowiedzialne s¹ aminokwasy w pozycjach 50–247 a najistotniejszy w tym procesie jest 29 aa odcinek stanowi¹cy zakoñczenie domeny C-koñcowej bia³ka [55]. Funkcjonalnym homologiem bia³ka FtsQ w komórkach B. subtilis jest prawdopodobnie DivIE [23]. Bia³ka FtsL (121 AA) i FtsB (YgbQ) – (zidentyfikowane w komórkach E. coli i Vibrio cholerae) to ma³e bia³ka membranowe [8, 9, 10]. Charakterystyczn¹ cech¹ tych bia³ek jest obecnoœæ sekwencji bogatych w leucyny tworz¹cych tzw. kieszenie leucynowe, które stanowi¹ g³ówn¹ czêœæ bia³ka ok. 60–65 aa na 80 tworz¹cych domenê cytoplazmatyczn¹ bia³ek [8, 9]. Wykazano, ¿e do stabilizacji bia³ka FtsL niezbêdna jest obecnoœæ FtsB. Taka wspó³zale¿noœæ oraz fakt, ¿e oba bia³ka zawieraj¹ potencjalne kieszenie leucynowe a ponadto obserwowana destabilizacja bia³ka FtsL w przypadku nieobecnoœci lub znacznie obni¿onego poziomu FtsB sugeruje, ¿e bia³ka te mog¹ tworzyæ heterodimery lub oligomery. Wykazano ponadto, ¿e do trwa³ej interakcji FtsL i FtsB niezbêdna jest obecnoœæ bia³ka FtsQ [9]. Wymienione trzy bia³ka prawdopodobnie tworz¹ kompleks w warunkach in vivo a ich interakcja ma miejsce przed przemieszczeniem siê bia³ek do czêœci centralnej komórki [9]. Migracja bia³ek FtsL:FtsB do miejsca ich dzia³ania mo¿e mieæ miejsce tylko po utworzeniu kompleksu. Na razie nie jest znana dok³adna rola jak¹ pe³ni¹ bia³ka FtsL i FtsB w procesie podzia³u komórki. Funkcjonalny homolog bia³ka FtsL zidentyfikowano tak¿e w komórkach B. subtilis, które ponadto posiadaj¹ ortolog genu ftsL – divIC, którego produkt bia³kowy jest tak¿e zaanga¿owany w proces podzia³u komórkowego [9, 23, 55]. Wymienione dwa bia³ka mog¹ tworzyæ heterodimer lub oligomer. Brak funkcjonalnego bia³ka FtsL w komórkach B. subtilis powoduje destabilizacje struktury DivIE [23, 55]. Bia³ko membranowe – FtsW jest niezbêdne dla prawid³owego przebiegu procesu podzia³u komórki, jego obecnoœæ stwierdzono u wszystkich gatunków bakterii posiadaj¹cych œcianê komórkow¹ [43, 55]. Nale¿y do bia³ek rodziny SEDS (Shape, Elongation, Division, Sporulation). N- i C-koñcowa domena FtsW zakotwiczona jest w b³onie cytoplazmatycznej, ponadto bia³ko to posiada 10 segmentów transmembrano-

wych i jeden 67 aa (E240-E306) po³o¿ony w periplazmie [43]. Gen ftsW po³o¿ony jest w obrêbie regionu dcw pomiêdzy genami murD i murG [17, 43, 55]. Sekwencja aminokwasowa FtsW E. coli wykazuje wysoki stopieñ homologii z bia³kiem SpoVE obecnym w komórkach B. subtilis oraz bia³kiem RodA E. coli. Wysokie podobieñstwo sekwencji aminokwasowej sugeruje, ¿e bia³ka te mog¹ pe³niæ podobn¹ rolê we wzroœcie komórek (RodA), podziale komórki (FtsW) i sporulacji (SpoVE) [43]. Cech¹ charakterystyczn¹ bia³ek tej rodziny jest fakt, ¿e „wspó³pracuj¹” one ze specyficzn¹ klas¹ bia³ek wi¹¿¹cych penicyliny – PBP B, do których nale¿y bia³ko FtsI. Analiza sekwencji nukleotydowej 19 genomów bakteryjnych wykaza³a, ¿e wszystkie bakterie w genomie których zidentyfikowano gen ftsI posiadaj¹ tak¿e gen ftsW i odwrotnie [55, 63,83]. Pocz¹tkowo s¹dzono, ¿e bia³ko FtsW uczestniczy w stabilizacji pierœcienia Z ale jednoczeœnie nie wykazano bezpoœredniego oddzia³ywania FtsZ i FtsW w komórkach E. coli [55]. Obecnie sugeruje siê, ¿e g³ówn¹ rol¹ jak¹ pe³ni FtsW w procesie podzia³u komórkowego jest rekrutacja bia³ka FtsI [43, 55]. Bia³ko to nale¿y do grupy bia³ek PBP3, jest transpeptydaz¹ niezbêdn¹ do syntezy peptydoglikanu w dziel¹cej siê komórce [55, 56, 87]. Posiada 50-cio aminokwasowy odcinek N-terminalny zakotwiczony w b³onie cytoplazmatycznej, 200 aminokwasow¹ domenê o nie znanej dot¹d funkcji oraz C-termianlny odcinek zbudowany z ok. 300 reszt aminokwasowych posiadaj¹cy sekwencjê charakterystyczn¹ dla rodziny bia³ek wi¹¿¹cych penicylinê, który odpowiada za aktywnoœæ biologiczn¹ tego bia³ka [55, 56, 87]. Zidentyfikowane w komórkach E. coli i Haemophilus influenzae bia³ko FtsN jest prawdopodobnie zaanga¿owane w hydrolizê sk³adników œciany komórkowej co umo¿liwia powstanie przewê¿enia miêdzy powstaj¹cymi komórkami potomnymi w trakcie podzia³u. Niedobór w komórce FtsN skutkuje zaburzeniami w przebiegu procesu podzia³u komórki, a jego nadprodukcja znosi efekty mutacji w genach ftsA, ftsQ, ftsI i ftsK [55]. Bia³ko – AmiC uczestnicz¹ce w koñcowym etapie procesu podzia³u komórkowego jest periplazmatyczn¹ amidaz¹, która hydrolizuje wi¹zania krzy¿owe i pozwala na rozdzielenie komórek potomnych [55]. W ostatnich latach w komórkach B. subtilis zidentyfikowano kolejne bia³ko zaanga¿owane w proces podzia³u komórkowego. Bia³ko to o konserwatywnej w obrêbie bakterii Gram-dodatnich sekwencji aminokwasowej nazwano SepF (septum development). Komórki nie posiadaj¹ce funkcjonalnego bia³ka SepF zdolne s¹ do prze¿ycia ale wykazuj¹ defekt podzia³u komórkowego [93]. Przegroda miêdzykomórkowa w takich komórkach tworzona jest wolno i wykazuje odmienn¹ morfologiê. Badania z wykorzystaniem dro¿-

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

d¿owego systemu dwuhybrydowego udowodni³y, ¿e SepF oddzia³uje z bia³kiem FtsZ, a mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuj¹ca bia³ko fuzyjne SepF:GFP pozwoli³a ustaliæ lokalizacjê SepF w centralnej czêœci komórki w miejscu podzia³u. Po³¹czenie mutacji w genie sepF oraz ezrA mia³o dla komórki efekt letalny, mutacje pojedyncze dotycz¹ce tylko genu sepF – efekt w postaci zaburzenia podzia³u komórki widoczny by³ na póŸniejszym etapie. Funkcja tego bia³ka w procesie podzia³u komórkowego nie zosta³a jeszcze wyjaœniona [93]. Bacillus subtilis nale¿y do drobnoustrojów, które wytwarzaj¹ endospory w niekorzystnych warunkach œrodowiskowych. Spory s¹ bardzo odporne na uszkodzenia fizyczne, chemiczne, mog¹ prze¿ywaæ wiele lat nawet w niekorzystnych warunkach [23, 55]. W komórkach wegetatywnych B. subtilis przegroda miêdzykomórkowa tworzy siê w centralnej czêœci komórki, ale podczas procesu sporulacji ca³a maszyneria bia³kowa jest przenoszona do jednego z biegunów komórki czego wynikiem jest asymetryczny podzia³ komórki [23, 83]. W przejœciu komórki B. subtilis ze wzrostu wegetatywnego na proces wytwarzania spor istotna rolê odgrywa bia³ko Spo0A [45, 55, 83]. Bia³ko to ulega fosforylacji przez kinazy bia³kowe w odpowiedzi na zewn¹trzkomórkowe sygna³y wskazuj¹ce na niekorzystne warunki œrodowiskowe np. brak sk³adników od¿ywczych. W procesie podzia³u komórkowego B. subtilis oprócz bia³ka FtsZ bierze udzia³ 5 innych bia³ek: FtsA, DivIB, FtsL, DivIC, PBP2B [23, 45, 55, 83]. Ponadto wa¿n¹ rolê odgrywaj¹ bia³ka specyficzne dla procesu sporulacji – SpoIIA, SpoIIE, SpoIIGA, SpoIVB oraz SpoIVF, [23, 55, 83]. Prawid³owy rozdzia³ chromosomów zarówno podczas wzrostu jak i sporulacji jest zale¿ny od produktu genu spo0J. Bia³ko to tworzy skupiska umiejscowione na biegunach komórki i prawdopodobnie uczestniczy w prawid³owej organizacji regionu oriC [45]. Do prawid³owego przebiegu procesu rozdzia³u chromosomów niezbêdna jest aktywnoœæ bia³ka SMC, które uczestniczy w tworzeniu prawid³owej struktury chromosomów po zakoñczeniu replikacji. Mutacje w genie smc s¹ przyczyn¹ powstawania nukleoidów nieprawid³owo upakowanych, oraz hamuj¹ proces gromadzenia siê bia³ka Spo0J na biegunach komórki [45]. W komórkach E. coli podobny efekt obserwowany jest w przypadku mutacji w genie mukB [45, 55, 83]. Wiele z genów koduj¹cych bia³ka uczestnicz¹ce procesie podzia³u komórkowego (ftsI, ftsW, ftsA, ftsQ, ftsZ) jest po³o¿onych w s¹siedztwie genów, których produkty bia³kowe uczestnicz¹ w syntezie peptydoglikanu œciany komórkowej w obrêbie regionu dcw (dcw cluster) o d³ugoœci ok. 19,7 kpz [17]. Region ten obejmuje ³¹cznie 16 genów. S¹ w nim ponadto geny mur (synteza mureny), ddl (ligaza alaninowa) oraz rodzina

13

genów mra. W komórkach E. coli geny ftsZ i envA (produkt bia³kowy genu envA uczestniczy w syntezie lipidów) le¿¹ na 3’ koñcu regionu dcw [83]. 5. Proces podzia³u komórkowego drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium O podzia³ach komórkowych pr¹tków nale¿¹cych do rodzaju Mycobacterium wiadomo bardzo niewiele. Na podstawie homologii sekwencji nukleotydowej z genami E. coli stwierdzono w genomie pr¹tków obecnoœæ genów koduj¹cych bia³ka potencjalnie zaanga¿owane w proces podzia³u komórkowego – FtsZ, FtsQ, FtsK, FtsW, FtsE, FtsX, FtsI [55, 83]. Brak jest natomiast homologów genów ftsA, zipA, ftsN [55, 83]. Nie wiadomo czy bia³ka te przy³¹czaj¹ siê do przegrody miêdzykomórkowej w podobnej kolejnoœci jak ma to miejsce w komórkach E. coli oraz czy do prawid³owego przebiegu procesu podzia³u komórki Mycobacterium nie s¹ wymagane dodatkowe inne bia³ka. Eksperymentalnie wykazano w komórkach pr¹tków obecnoœæ bia³ka FtsZ [1, 12, 18, 65]. Stwierdzono, ¿e gen ftsZ koduje funkcjonalne bia³ko uczestnicz¹c w procesie podzia³u komórkowego, a jego iloœæ w komórce jest skorelowana z faz¹ wzrostu hodowli (najwy¿szy poziom bia³ka jest obserwowany w komórkach w fazie logarytmicznego wzrostu) [1, 12, 18]. Ponadto wykazano, ¿e bia³ko FtsZ jest niezbêdne do wzrostu komórek M. smegmatis, mutanty pozbawione funkcjonalnego bia³ka FtsZ nie rosn¹ nawet na bogatym pod³o¿u, nadprodukcja bia³ka skutkuje zaburzeniami w procesie podzia³u komórkowego, powstawaniem d³ugich filamentów komórkowych i ostatecznie liz¹ komórek bakteryjnych [18]. Funkcjonalne bia³ko FtsZ jest równie¿ obecne w komórkach pr¹tków gruŸlicy M. tuberculosis i jest niezbêdne dla prawid³owego przebiegu procesu podzia³u pr¹tków [12, 18, 65]. Ponadto zaobserwowano, ¿e w komórkach M. smegmatis pozbawionych aktywnego bia³ka FtsZ, wprowadzenie funkcjonalnej kopii genu ftsZ M. tuberculosis powoduje, ¿e bia³ko MtFtsZ „zastêpuje” brak bia³ka M. smegmatis [19]. Obecnoœæ heterologicznego bia³ka w komórkach M. smegmatis inicjuje formowanie pierœcienia Z i katalizuje proces podzia³u komórki. C h a u h a n i wsp. badali przebieg procesu podzia³u w komórkach pr¹tków gruŸlicy M. tuberculosis i wykazali, ¿e zwi¹zek o nazwie SRI-3072 jest inhibitorem gromadzenia siê bia³ka FtsZ oraz powoduje zaburzenia struktury pierœcienia Z [12]. W rosn¹cej hodowli M. tuberculosis powstawanie pierœcienia Z widoczne by³o tylko w ok. 11% komórek. Wydaje siê, ¿e niska czêstoœæ powstawanie pierœcienia Z w komórkach pr¹tków gruŸlicy mo¿e odzwierciedlaæ ich powolny wzrost [12].

14

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

Ponadto stwierdzono, ¿e bia³ko FtsZ obecne w komórkach pr¹tków gruŸlicy (M. tuberculosis) charakteryzuje siê bardzo d³ugim czasem polimeryzacji wynosz¹cym ok. 10 min. oraz wolniej przebiegaj¹cym procesem hydrolizy GTP [89]. Podczas gdy polimer FtsZ E. coli w warunkach in vitro osi¹ga prawid³ow¹ budowê ju¿ po 30 sek. po dodaniu GTP, czas potrzebny do budowy polimeru MtFtsZ wynosi ok. 10 min. Szybkoœæ depolimeryzacji obu bia³ek jest równie¿ inna, depolimeryzacja MtFtsZ zachodzi znaczne wolniej (proces ten trwa ok. 1 godz.). Minimalne stê¿enie bia³ka MtFtsZ, niezbêdne do prawid³owego przebiegu procesu polimeryzacji wynosi 3mM. Polimeryzacja wymaga obecnoœci jonów Mg2+ oraz GTP [65, 89]. Mutant ftsZ84 E. coli posiadaj¹cy zredukowan¹ aktywnoœæ GTP-azy (1/10 aktywnoœci bia³ka dzikiego) wykazywa³ 9 razy wolniejsz¹ polimeryzacjê w warunkach in vivo co potwierdza, ¿e dynamika tworzenia pierœcienia Z jest determinowana g³ównie zdolnoœci¹ hydrolizy GTP [74, 89]. Pomimo znacz¹cych ró¿nic w przebiegu procesu polimeryzacji bia³ko FtsZ M. tuberculosis (MtFtsZ) wykazuje du¿e podobieñstwo sekwencji aminokwasowej do bia³ka FtsZ E. coli (EcFtsZ) [74,89]. Podobieñstwo to dotyczy g³ównie N-koñcowej czêœci bia³ka FtsZ, oraz czêœci zaanga¿owanej w oddzia³ywanie FtsZ:FtsZ w obrêbie której sekwencja aminokwasowa obu omawianych bia³ek jest prawie identyczna [74, 89]. Du¿e ró¿nice w sekwencji aminokwasowej obserwowane s¹ natomiast w domenie C-koñcowej bia³ka MtFtsZ w porównaniu do EcFtsZ. Odcinek C-koñcowy bia³ka FtsZ zaanga¿owany jest w proces polimeryzacji i reakcjê hydrolizy GTP [84, 89]. A n a n d i wsp. zastosowali w badaniach bia³ko MtFtsZ z delecj¹ 169 aa od strony C-koñca (MtFtsZ – C169) i mierzyli czas jaki jest potrzebny do polimeryzacji tego bia³ka oraz dzikiego bia³ka MtFtsZ [1]. Badali strukturê powstaj¹cego w warunkach in vitro polimeru po 3 sek., 1 min., 2 min., 4 min. oraz 10 min. po dodaniu GTP. Bia³ko typu dzikiego (MtFtsZ) polimeryzowa³o dopiero po up³ywie 10 min. po dodaniu GTP, podczas gdy MtFtsZ – DC169 tworzy³o stabilne polimery ju¿ po 30 sek. po dodaniu GTP. Struktury utworzone przez zmutowane bia³ko MtFtsZ – DC169 by³y stabilne, widoczne po 10 min. inkubacji, ale powsta³y polimer by³ ok. 1,5 razy cieñszy, ni¿ polimer utworzony przez niezmutowane bia³ko MtFtsZ [1]. Uzyskane przez A n a n d a i wsp. wyniki dowodz¹, ¿e równie¿ w przypadku bia³ka MtFtsZ w procesie polimeryzacji uczestniczy domena C-koñcowa bia³ka, a za znacznie wolniejsz¹ polimeryzacjê mykobakteryjnego bia³ka FtsZ odpowiedzialne s¹ aminokwasy buduj¹ce tê domenê [1]. W oparciu o opisane wyniki R a j a g o p a l a n i wsp. skonstruowali bia³ko MtFtsZ z mutacjami w regionie odpowiedzialnym za wi¹zanie GTP (FtsZ

G103S) oraz w regionie odpowiedzialnym za hydrolizê GTP (FtsZ D210G) a nastêpnie analizowali oba bia³ka w warunkach in vitro i in vivo [65]. Pomiar wi¹zania GTP przez oczyszczone zrekombinowane bia³ka wykaza³, ¿e bia³ko MtFtsZ G103S nie jest zdolne do wi¹zania GTP, podczas gdy bia³ko MtFtsZD210G wi¹¿e GTP z tak¹ sam¹ wydajnoœci¹ jak bia³ko FtsZ „niezmutowane” [65]. Konsekwencj¹ zwi¹zania przez FtsZ GTP jest jego hydroliza, gromadzenie siê bia³ka FtsZ i ostatecznie jego polimeryzcja. Wykazano ponadto, ¿e bia³ko MtFtsZ G103S nie posiada GTP zale¿nej zdolnoœci polimeryzacji natomiast bia³ko MtFtsZD210G polimeryzuje wolniej ni¿ bia³ko „niezmutowane” [65]. Uzyskane przez R a j a g o p a l a n i wsp. wyniki wskazuj¹, ¿e mutacja w genie koduj¹cym bia³ko MtFtsZ, której wynikiem jest zamiana glicyny w serynê w pozycji 103 ca³kowicie znosi zdolnoœæ wi¹zania GTP przez zmutowane bia³ko a w konsekwencji hamuje proces polimeryzacji tego bia³ka [65]. Bia³ko MtFtsZ, produkt genu zawieraj¹cego punktow¹ mutacjê, której wynikiem jest zamiana w bia³ku kwasu asparaginowego na glicynê w pozycji 210 (FtsZ D210G), wi¹¿e GTP wykazuj¹c wysokie powinowactwo do tego zwi¹zku. Jednoczeœnie obserwuje siê znacznie obni¿on¹ zdolnoœæ MtFtsZ do hydrolizy GTP, co sugeruje, ¿e obecnoœæ kwasu asparaginowego mo¿e mieæ kluczowe znaczenie dla prawid³owego przebiegu procesu hydrolizy GTP [65]. Pr¹tki gruŸlicy nale¿¹ do patogenów wewn¹trzkomórkowych, zdolnych do wzrostu i podzia³ów w komórkach makrofagów. Analizuj¹c wzrost pr¹tków w makrofagach zaobserwowano, ¿e komórki M. tuberculosis maj¹ kszta³t d³ugich filamentów i tylko nieliczne z nich posiadaj¹ zlokalizowany centralnie pierœcieñ Z [12]. Zdecydowana wiêkszoœæ komórek pr¹tków posiada³a w centralnej czêœci przypominaj¹c¹ spiralê strukturê zbudowan¹ z bia³ka FtsZ. Poziom komórkowego FtsZ zarówno w hodowli jak i w komórkach M. tuberculosis obecnych w makrofagach jest porównywalny [12]. Fakt ten oraz stwierdzony brak obecnoœci FtsZ w komórkach ssaków spowodowa³, ¿e bia³ko to jest rozpatrywane jako potencjalne miejsce dzia³ania nowych leków przeciwgruŸliczych [12, 55, 69]. W literaturze pojawiaj¹ siê doniesienia dotycz¹ce wykorzystania ró¿nego rodzaju inhibitorów „zjawiska gromadzenia siê i polimeryzacji bia³ka FtsZ” w komórkach pr¹tków gruŸlicy. R e y n o l d s i wsp. do badañ wybrali grupê zwi¹zków które s¹ inhibitorami polimeryzacji ludzkiej tubuliny (2-alkoksykarbonyloaminopirydyna) oraz dodatkowo zsyntetyzowali w oparciu o podobieñstwo struktury leków przeciwmalarycznych z inhibitorami tubuliny zwi¹zki bêd¹ce potencjalnymi inhibitorami polimeryzacji FtsZ [69]. Zwi¹zkami, które selektywnie hamowa³y polimeryzacjê MtFtsZ by³y: 2-karbamoil-pterydyna oraz 3-deazo-pterydyna [69].

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

15

Rys. 4. Sekwencja aminokwasowi bia³ek FtsZ i FtsW M. tuberculosis. Zaznaczono aminokwasy odpowiedzialne za wzajemne oddzia³ywanie tych bia³ek

Zwi¹zki nale¿¹ce do grupy 2-alkoksycarbonylaaminopirydyn by³y tak¿e obiektem badañ W h i t e i wsp. Opisali oni dwa zwi¹zki (SRI-3072 i SRI-7614), których dzia³anie polega³o na hamowaniu polimeryzacji bia³ka MtFtsZ [87]. Ponadto zwi¹zek SRI-3072 wp³ywa³ na zahamowanie wzrostu i obni¿enie liczby pr¹tków gruŸlicy w makrofagach szpiku kostnego i co wa¿ne dzia³a³ specyficznie na hamowanie polimeryzacji bia³ka FtsZ nie dzia³aj¹c na polimeryzacjê tubuliny. Gromadzenie bia³ka MtFtsZ jest równie¿ hamowane przez kolchicynê oraz SRI 7814 (ethyl-6-amino-2-3-dihydro-4-phenyl-1-H-pyrido[4,3b] [1,4]diazepin-8-ylcarbonate). Zwi¹zki te wykazuj¹ tak¿e hamuj¹ce dzia³anie w stosunku do eukariotycznej tubuliny [88]. W komórkach Mycobacterium wykazano bezpoœrednie oddzia³ywanie pomiêdzy bia³kiem FtsZ i bia³kiem FtsW, czego nie obserwujemy w komórkach E. coli [16, 66]. Do interakcji dochodzi miêdzy domenami C-terminalnymi obu bia³ek, a dok³adnie miêdzy resztami asparaginy w pozycjach 367–370 w przypadku bia³ka FtsZ i dodatnio na³adowanymi resztami argininy 428–524 bia³ka FtsW (Rys. 4) [16]. Mutacje w genie ftsZ, prowadz¹ce do powstania bia³ka zawieraj¹cego w regionie 367–370 w miejscu trzech reszt asparaginy trzy reszty alaniny, ca³kowicie znosi³y zdolnoœæ do wzajemnego oddzia³ywania FtsZ:FtsW. Wykorzystuj¹c dro¿d¿ow¹ metodê dwuhybrydow¹ wykazano, ¿e zmiany w sekwencji aminokwasowej w C-koñcowej czêœci bia³ka MtFtsZ polegaj¹ce na usuniêciu 56 aa powoduj¹ zahamowanie wzajemnego oddzia³ywania FtsZ:FtsW [16]. To wzajemne oddzia³ywanie bia³ek s³u¿y byæ mo¿e zakotwiczeniu pierœcienia Z do b³ony cytoplazmatycznej przy braku obecnoœci w komórkach Mycobacterium FtsA i ZipA oraz ³¹czy proces formowania septy z syntez¹ peptydoglikanu [55,

16, 66]. Co ciekawe wzajemne oddzia³ywanie bia³ek FtsZ i FtsW prawdopodobnie ma miejsce tylko w komórkach pr¹tków wolnorosn¹cych. Obserwuje siê stosunkowo niski poziom homologii sekwencji aa pomiêdzy bia³kami FtsW (76%) obecnymi w komórkach M. tuberculosis i M. smegmatis oraz brak hydrofilowego regionu bogatego w reszty argininy w bia³ku FtsW M. smegmatis, regionu który w bia³ku M. tuberculosis odpowiada za oddzia³ywanie z FtsZ. Obecne w komórkach E. coli bia³ko FtsW nie zawiera regionu bogatego w argininy i byæ mo¿e to jest powodem braku wzajemnego oddzia³ywania FtsZ:FtsW [16]. Stwierdzono tak¿e, ¿e nadprodukcja bia³ka FtsQ kodowanego przez gen ftsQ w komórkach M. smegmatis prowadzi do zahamowania podzia³ów komórkowych i filamentacji komórek, ale efekt ten nie jest tak silny jak w przypadku nadprodukcji FtsZ [19]. Uzyskane dane wskazuj¹ na udzia³ bia³ka FtsQ w tworzeniu przegrody komórkowej i oddzia³ywanie z innymi bia³kami tego procesu. Jednym z najwa¿niejszych dowodów potwierdzaj¹cych udzia³ okreœlonego bia³ka w procesie podzia³u komórkowego jest zaobserwowanie lokalizacji przez to bia³ko przegrody komórkowej [18, 19]. Lokalizacjê tak¹ zaobserwowano w komórkach M. smegmatis zawieraj¹cych sklonowany w wektorze plazmidowym gen ftsZ w fuzji z genem koduj¹cym bia³ko znacznikowe GFP (Green Fluorescent Protein). Podobne wyniki uzyskano tak¿e dla bia³ka fuzyjnego FtsQ:GFP, co stanowi bezpoœredni dowód na udzia³ tego bia³ka w procesie podzia³u komórkowego (D z i a d e k i R a j a g o p a l a n – dane nieopublikowane). Ponadto ostatnio wykazano obecnoœæ w genomie M. tuberculosis genów ftsX i ftsE koduj¹cych funkcjonalne bia³ka FtsX (MtFtsX) i FtsE (MtFtsE) [59].

16

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

Bia³ko MtFtsE w warunkach in vitro wykazuje zdolnoœæ wi¹zania ATP, a obecnoœæ lizyny (K42) zlokalizowanej w obrêbie regionu Walker A jest niezbêdna w tym procesie. Bia³ko MtFtsE mo¿e ponadto czêœciowo zast¹piæ niefunkcjonalne bia³ko FtsE w komórkach E. coli. Znacznie lepsze rezultaty uzyskano kiedy do komórek E. coli pozbawionych funkcjonalnego bia³ka FtsE wprowadzono funkcjonalne mykobakteryjne bia³ka MtFtsE i MtFtsX co wskazuje, ¿e bia³ka te najprawdopodobniej œciœle wspó³pracuj¹ ze sob¹, a wspó³praca ta jest niezbêdna do prawid³owego ich funkcjonowania. Struktura pierwszorzêdowa MtFtsE jest w 50% identyczna z sekwencj¹ aminokwasow¹ FtsE E. coli (EcFtsE) [59]. Badania potencjalnych genów regulatorowych doprowadzi³y do zidentyfikowania w genomie M. smegmatis genu whmD, który koduje homolog bia³ka WhiB Streptomyces coelicolor niezbêdnego w procesie sporulacji [29]. Mutanty S. coelicolor w genie whiB wykazywa³y zaburzenia w procesie gromadzenia bia³ka FtsZ w miejscu podzia³u komórki i formowania pierœcienia Z. G o m e z i B i s h a i wykazali, ¿e bia³ko WhmD jest niezbêdne do ¿ycia komórek M. smegmatis. Komórki z obni¿onym poziomem ekspresji genu whmD wykazywa³y nieodwracaln¹ filamentacjê, rozga³êziony wzrost z ograniczonymi zdolnoœciami budowania przegrody miêdzykomórkowej i zmiany w jej lokalizacji [29]. Nadprodukcja tego bia³ka powodowa³a spowolniony wzrost hodowli M. smegmatis i tworzenie wielu przegród miêdzykomórkowych. Mutanty zarówno charakteryzuj¹ce siê obni¿onym jak i podwy¿szonym poziomem ekspresji genu koduj¹cego WhmD nie wykazywa³y zmian w procesie syntezy kwasów nukleinowych oraz poziomie bia³ka FtsZ. Obserwowane zmiany fenotypowe komórek – mutantów whmD (komórki o wyd³u¿onym kszta³cie) wskazuj¹ na rolê bia³ka WhmD w procesie formowania przegrody miêdzykomórkowej i procesie podzia³u komórkowego [29]. Dok³adna rola tego bia³ka w procesie podzia³u komórek nie zosta³a wyjaœniona. Pr¹tki posiadaj¹ zdolnoœæ do d³ugotrwa³ego prze¿ywania wewn¹trz komórek gospodarza bez wywo³ywania procesu chorobowego [101, 102]. Bakterie zamkniête s¹ w zmianach ziarniniakowatych (granuloma), w których prawdopodobnie panuj¹ warunki beztlenowe, a adaptacja do tych warunków jest wa¿nym etapem procesu zaka¿enia pr¹tkami gruŸlicy [101, 102]. Obecnie nie jest jednoznacznie wyjaœniony mechanizm prze¿ywania pr¹tków w fazie latencji. Brak przyrostu liczby bakterii w tych warunkach mo¿e byæ spowodowany miêdzy innymi zahamowaniem procesów podzia³u komórkowego. Analiza ca³kowitego poziomu ekspresji genów w komórkach mykobakterii w zmianach ziarniniakowatych i w makrofagach (warunki in vivo) nie wykaza³a istotnego obni¿enia po-

ziomu ekspresji genów zaanga¿owanych w proces podzia³u komórkowego [102]. Wydaje siê wobec tego, ¿e ekspresja genów koduj¹cych bia³ka uczestnicz¹ce w podziale komórki jest stabilna tak¿e w fazie latencji, co wskazuje na zdolnoœæ pr¹tków do podzia³u równie¿ w zmianach ziarniniakowatych [102]. Poznanie przebiegu procesu podzia³u komórkowego mo¿e mieæ tak¿e istotne znaczenie w powi¹zaniu z ostatnimi doniesieniami o zdolnoœci pr¹tków gruŸlicy do tworzenia biofilmu [62]. Biofilmy mog¹ odgrywaæ kluczow¹ rolê w osiedlaniu siê bakterii i ochronie przed lekami oraz mechanizmami odpornoœci gospodarza. Prawdopodobnie pr¹tki gruŸlicy M. tuberculosis wytwarzaj¹ biofilm w organizmie podczas infekcji, a zrozumienie i poznanie mechanizmu tworzenia biofilmu, mo¿e otworzyæ nowe mo¿liwoœci walki z gruŸlic¹ i infekcjami spowodowanymi przez inne mykobakterie. O h i j a i wsp. odkryli, ¿e bia³ko zaliczane do bia³ek chaperonowych GroEL1 nadzoruje produkcjê kwasów mykolowych, które s¹ niezbêdne w procesie dojrzewania biofilmu [62]. Zaka¿enie komórek bakteriofagiem Bxb1, którego DNA integruje siê z DNA gospodarza wbudowuj¹c siê w œrodek genu groEL1 powoduje zaburzenie struktury powstaj¹cego bia³ka i jego inaktywacjê [62]. Bakterie bez funkcjonalnego bia³ka GroEL1 wytwarza³y mniej kwasów t³uszczowych oraz nie zachodzi³a w nich synteza kwasów mykolowych, niezbêdnych do wytwarzania biofilmu. Istotnym uzupe³nieniem tej wiedzy wydaje siê byæ dok³adne poznanie i przeœledzenie przebiegu procesu podzia³u komórkowego pr¹tków, co ma szczególne znaczenie w poszukiwaniach nowych leków przeciwgruŸliczych. Liczne badania prowadzone w tym kierunku skierowane tak¿e s¹ na analizê enzymów zaanga¿owanych w proces biosyntezy poszczególnych sk³adników œciany komórkowej gdy¿ zahamowanie tego procesu prowadzi do zwiêkszenia przepuszczalnoœci os³on komórkowych dla leków oraz œmierci komórki [62]. Piœmiennictwo 1. Anand S.P., Rajesvari H., Gupta P., Srinivasan R., Indii S., Ajitkumar P.: A C-terminal deletion mutant of Mycobacterium tuberculosis FtsZ shows fast polymerization in vitro. Microbiology, 150, 1119–1121 (2002) 2. Anderson D., Gueiros-Filho F.J., Erickson H.P.: Assembly dynamics of FtsZ rings in Bacillus subtilis and Escherichia coli and effects of FtsZ-regulating proteins. J. Bacteriol. 186, 5775–5781 (2004) 3. Anilkumar G., Srinivasan R., Prasad S., and Ajitkumar P.: Bacterial cell division protein FtsZ is a specific substrate for the AAA family protease FtsH. Microbiology, 147, 516–517 (2001) 4. Anilkumar G., Srinivasan R., Ajitkumar P.: Genomic organization and in vivo characterization of proteolytic activity of

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

FtsH of Mycobacterium smegmatis SN2. Microbiology, 150, 2629–2639 (2004) 5. Bernhardt T.G., de Boer P.A.: SlmA, a nucleoid-associated, FtsZ-binding protein required for blocking septal ring assembly over chromosomes in E. coli. Moll. Cel. 18, 555–564 (2005) 6. Bi E., Lutkenhaus J.: Cell division inhibitors SulA and MinCD prevent formation of the FtsZ ring. J. Bacteriol. 175, 1118–1125 (1993) 7. Bignell C., Thomas C.M.: The bacterial ParA-ParB partitioning proteins. J. Biotechnol. 91, 1–34 (2001) 8. Buddelmeijer N., Judson N., Boyd D., Mekalanos J.J., Beckwith J.: YgbQ, a cell division protein in Escherichia coli and Vibrio cholerae, localizes in codependent fashion with FtsL to the division site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6316–6321 (2002) 9. Buddelmeijer N., Beckwith J.: A complex of the Escherichia coli cell division proteins FtsL, FtsB, FtsQ forms independently of its localization to the septal ring. Mol. Microbiol. 52, 1315–1327 (2004) 10. Boehring N., Gonzales M.D., and Beckwith J.: Premature targeting of cell division proteins to midcel reveals hierarchies of protein interactions involved in divisome assembly. Mol. Microbiol. 61, 33–45 (2006) 11. Brendler T., Sawitzke J., Sergueev K., Austin S.: A case for sliding seqA tracts at anchored replication forks during Escherichia coli chromosome replication and segregation. EMBO J. 19, 6249–6258 (2000) 12. Chauhan A., Madiraju M.V., Fol M., Lofton H., Maloney E., Reynolds R., Rajagopalan M.: Mycobacterium tuberculosis cell growing in macrofages are filamentous and deficient in FtsZ rings. J. Bacteriol. 188, 1856–1865 (2006) 13. Chen Y., Erickson H.P.: Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280, 22549–22554 (2005) 14. Chen J.C., Beckwith J.: FtsQ, FtsL, and FtsI require FtsK, but not FtsN, for co-localization with FtsZ during Escherichia coli cell division. Mol. Microbiol. 42, 395–413 (2001) 15. Cordell S.C., Robinson E.J., Lowe J.: Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 7889–7894 (2003) 16. Datta P., Dasgupta A., Bhakta S., Basu J.: Interaction between FtsZ and FtsW of Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem. 277, 24983–24987 (2002) 17. Dewar S.J., Dorazi R.: Control of division gene expression in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 187, 1–7 (2000) 18. Dziadek J., Madiraju M., Rutherford S.A., Atkinson M.A.L., Rajagopalan M.: Physiological consequences associated with overproduction of Mycobacterium tuberculosis FtsZ in mycobacterial hosts. Microbiology, 148, 961–971 (2002) 19. Dziadek J., Rutherford S., Madiraju M.V., Atkinson M.A.L., Rajagopalan M.: Conditional expression of Mycobacterium smegmatis ftsZ, an essential cell division gene. Microbiology, 149, 1593–1603 (2003) 20. Erickson H.P.: FtsZ, a tubulin homologue in prokaryote cell division. Trends Cell Biol. 7, 362–367 (1997) 21. Errington J., Daniel A., Scheffers J.: Cytokinesis in bacteria: Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 52–65 (2003) 22. Errington J.: Dynamic proteins and cytoskeleton in bacteria. Nature-Cell Biol. 5, 175–178 (2003) 23. Errington J.: Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis. Nature-Rev. Microbiol. 1, 117–126 (2003)

17

24. Esue O., Tseng Y., Wirtz D.: The rapid onset of elasticity during the assembly of the bacterial cell-division protein FtsZ. Biochem. Biophys. Res. Comm. 333, 508–516 (2005) 25. Fadda D., Pischedda C., Caldara F., Whalen M.B., Anderluzzi D., Domenici E., Massidda O.: Characterization of divIVA and other genes located in the chromosomal region downstream of the dcw cluster in Streptococcus pneumoniae. J. Bacteriol. 185, 6209–6214 (2003) 26. Figge R.M., Gober J.W.: Cell shape, division and development: the 2002 American Society for Microbiology (ASM) conference on prokaryotic development. Mol. Microbiol. 47, 1475–1483 (2003) 27. Gitai Z., Thanbichler M., Shapiro L.: The choreographed dynamics of bacterial chromosomes. Trends Microbiol. 13, 221–228 (2005) 28. Glass J.I et al. The complete sequences of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum. Nature, 407, 757–762 (2000) 29. Gomez J.E., Bishai W.R.: whmD is an essential mycobacterial gene required for proper septation and cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 8554–8559 (2000) 30. Gonzalez J.M., Jimenez M., Velez M., Mingorance J., Andreu J.M., Vincente M., Rivas G.: Essential cell division protein FtsZ assembles into one monomer-thick ribbons under conditions resembling the crowded intracellular environment. J. Biol. Chem. 278, 37664–37671 (2003) 31. Gueiros-Filho F.J., Losicki R.: A widely conserved bacterial cell division protein that promotes assembly of the tubulin like FtsZ. Genes Develop. 16, 2544–2556 (2002) 32. Haeusser D.P, Schwartz R.L., Smith A.M., Oates M.E., Levin P.A.: EzrA prevents aberrant cell division by modulating assembly of the cytoskeletal protein FtsZ. Mol. Microbiol. 52, 801–814 (2004) 33. Hale C.A., de Boer P.A.: ZipA is required for recruitment of FtsK, FtsQ, FtsL, and FtsN to the septal ring in Escherichia coli. J. Bacteriol. 184, 2552–2556 (2002) 34. Hale C.A., de Boer P.A.: Direct binding of FtsZ to ZipA an essential component of the septal ring structure that mediates cell division in E. coli. Cell, 88, 175–185 (1997) 35. Hale C., Rhee A. C., de Boer P.A.J.: Zip A-induced bundling of FtsZ polymers mediated by an interaction between C-terminal domains. J. Bacteriol. 182, 5153–5166 (2000) 36. Haney S.A., Glasfeld E., Hale C., Keeney D., He Z., de Boer P.: Genetic analysis of the Escherichia coli FtsZ: ZipA interaction in the yeast two hybrid system. J. Biol. Chem. 276, 11980–11987 (2001) 37. Haney S., Mosyak L., Zhang Y., Glasfeld E., Stahl M., Seehra J., Somers W.S.: The bacterial cell division protein Zip A and its interaction with an FtsZ fragment revealed by X-ray crystallography. EMBO J. 19, 3179–3191 (2000) 38. Hiraga S.: Dynamic localization of bacterial and plasmid chromosomes. Annu. Rev. Genet. 34, 21–59 (2000) 39. Hiraga S., Ichinose C., Niki H., Yamazoe M.: Cell cycledependent duplication and bidirectional migration of SeqAassociated DNA-protein complexes in E. coli. Mol. Cell, 1, 381–387 (1998) 40. Hu Z., Lutkenhaus J.: A conserved sequence at the C-terminus of MinD is required for binding to the membrane and targeting MinC to the septum. Mol. Microbiol. 47, 345–355 (2003) 41. Jenkins C., Samudrala R., Anderson I., Hedlund B.P., Petroni G., Michailova N., Pinel N., Overbeek R., Rosati G., Staley J.T.: Genes for the cytoskeletal protein tubulin in the bacterial genus Prosthecobacter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 17049–17054 (2002)

18

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

42. Lackner L.L., Raskin D.M., de Boer P.A.J.: ATP-dependent interactions between Escherichia coli Min proteins and the phospholipid membrane in vitro. J. Bacteriol. 185, 735–749 (2003) 43. Lara B., Ayala J.A.: Topological characterization of the essential Escherichia coli cell division protein FtsW. FEMS Microbiol. Lett. 216, 23–32 (2002) 44. Levin P., Kurster I.G., Grossman A.D.: Identification and characterization of a negative regulator of FtsZ ring formation in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 9642–9647 (1999) 45. Lewis P.J., Errington J.: Direct evidence for active segregation of oriC regions of the Bacillus subtilis chromosome and co-localization with Spo0J partitioning protein. Mol. Microbiol. 25, 945–954 (1997) 46. Lin D. C., Grossman A.D.: Identification and characterization of a bacterial chromosome-partitioning site. Cell, 92, 675–685 (1998) 47. Liu G., Begg K., Geddes A., Donachie W.D.: Transcription of essential cell division genes is linked to chromosomeme replication in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 40, 909–916 (2001) 48. Lutkenhaus J.: The regulation of bacterial cell division: a time and place for it. Curr. Opin. Microbiol. 1, 210–215 (1998) 49. Lutkenhaus J., Sundaramoorthy M.: MinD and role of the deviant Walker A motif, dimerization and membrane binding in oscillation. Mol. Microbiol. 48, 295–303 (2003) 50. Low H., Moncrieffe M.C., Lowe J.: The crystal structure of ZapA and its Modulation of FtsZ polymerization. J. Mol. Biol. 341, 839–852 (2004) 51. Ma X., Sun Q., Wang R., Singh G., Jonitez E., Margolin W.: Interactions between heterologous FtsA and FtsZ proteins at the FtsZ ring. J. Bacteriol. 179, 6788–6797 (1997) 52. Ma L-Y., King G., Rothfield L.: Mapping the MinE Site Involved in Interaction with the MinD Division Site Selection Protein of Escherichia coli. J. Bacteriol. 185, 4948–4955 (2003) 53. Ma L., King G.L., Rothfield L.: Positioning of the MinE binding site on the MinD surface suggests a plausible mechanism for activation of the Escherichia coli MinD ATPase during division site selection. Mol. Microbiol. 54, 98–108 (2004) 54. Margolin W.: Green fluorescent protein as a reporter for macromolecular localization in bacterial cells. Methods, 20, 62–72 (2000) 55. Margolin W.: Themes and variations in prokaryotic cell division. FEMS Microbiol. Rev. 24, 531–548 (2000) 56. Mercer K.L., Weiss D.S.: The Escherichia coli cell division protein FtsW is required to recruit its cognate transpeptidase, FtsI (PBP3), to the division site. J. Bacteriol. 184, 904–912 (2002) 57. Mingorance J., Rueda S., Gomez-Puertas P., Valencia A., Vincente M.: Escherichia coli FtsZ polymers contain mostly GTP and have a high nucleotide turnover. Mol. Microbiol. 41, 83–91 (2001) 58. Mingorance J., Tadros M., Vincente M., Gonzalez J.M., Rivas G., Velez M.: Visualization of single Escherichia coli Ftsz filament dynamics with atomic force microscopy. J. Biol. Chem. 250, 20909–20914 (2005) 59. Mir M., A., Rejeswari H.S., Veeraraghavan U., Ajitkumar P.: Molecular characterization of ABC transporter type FtsE and FtsX proteins of Mycobacterium tuberculosis. Arch. Microbiol. 185, 147–158 (2006) 60. Mohl D.A., Aster J.Jr., Gober J.W.: The chromosome partitioning protein, ParB, is required for cytokinesis in Caulobacter crescentus. Mol. Microbiol. 42, 741–755 (2001)

61. Norris V., Woldringh C., Mileykovskaya E.: A hypothesis to explain division site selection in Escherichia coli by combining nucleoid occlusion and Min. FEBS Letters, 561, 3–19 (2004) 62. Ohija A., Anand M., Bhatt A., Kremer L., Jacobs WR. Jr., Hatfull G.F.: GroEL1: a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in mycobacteria. Cell, 123, 861–873 (2005) 63. Pinho M.G., Errington J.: Dispersed mode of Staphylococcus aureus cell wall synthesis in the absence of the division machinery. Mol. Microbiol. 50, 871–881 (2003) 64. Prozorov A.A.: The bacterial cell cycle: DNA replication, nucleoid segregation and cell division. Microbiology, 74, 375–387 (2005) 65. Rajagopalan M., Atkinson M. A., L., Lofton H., Chauhan A., Madiraju M.V.: Mutations in the GTP-binding and synergy loop domains of Mycobacterium tuberculosis FtsZ compromise its function in vitro and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Comm. 331, 1171–1177 (2005) 66. Rajagopalan M., Maloney E., Dziadek J., Pop³awska M., Lofton H., Chauhan A., Madiraju M.: Genetic evidence that mycobacterial FtsZ and FtsW protein interact, and colocalize to the division site in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol. Lett. 250, 9–17 (2005) 67. Raskin D. M., de Boer P.A.: Rapid pole-to-pole oscillation of a protein required for directing division to the middle of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4971–4976 (1999) 68. Raychaudhuri D., Park J.: Escherichia coli cell-division gene ftsZ encodes a novel GTP-binding protein. Nature, 359, 251–254 (1992) 69. Reynolds R.C., Srivastava S., RossL.J., Suling W.J., White E.L.: A new 2-carbamoyl pteridine that inhibits mycobacterial FtsZ. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14, 3161–3164 (2004) 70. Rivas G., Lopez A., Mingorance J., Ferrandiz M.J., Zorilla S., Minton A.P., Vincente M., Andreu J.M.: Magnesium induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. J. Biol. Chem. 275, 11740–11749 (2000) 71. Rothfield L.: New insights into the developmental history of the bacterial cell division site. J. Bacteriol. 185, 1125–1127 (2003) 72. Scheffers D.J., Driessen A.J.M.: The polymerization mechanism of the bacterial cell division protein FtsZ. FEBS Lett. 506, 6–10 (2001) 73. Sontag C.A., Staley J.T. and Erickson H.P.: In vitro assembly and GTP hydrolysis by bacterial tubulins BtubA and BtubB. J. Cell Biol. 169, 233–238 (2005) 74. Sticker J., Erickson H.P.: In vivo characterization of Escherichia coli ftsZ mutants: effect on Z-ring structure and function. J. Bacteriol. 185, 4796–4805 (2003) 75. Stokes N.R., Sievers J., Barker S., Bennett J.M., Brown D.R., Collins I., Errington V.M., FoulgerD., Hall M., Halsey R., Johnson H., Rose V., Thomaides H.B., Haydon D.J., Czaplewski L.G., Errington J.: Novel inhibitors of bacterial cytokinesis identyfied by a cell-based antibiotic screening assay. J. Biol. Chem. 280, 39709–39715 (2005) 76. Stokes K.D., Osteryoung K.W.: Early divergence of the FtsZ1 and FtsZ2 plastid division gene families in photosynthetic eukaryotes. Gene, 320, 97–108 (2003) 77. Stricker J., Maddox S., Erickson H.P.: Rapid assembly dynamics of the Escherichia coli FtsZ – ring demonstrated by fluorescence recovery after photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 3171–3175 (2002)

BIA£KA PODZIA£U KOMÓRKOWEGO BAKTERII – DRU¯YNA PIERŒCIENIA

78. Sun Q., Margolin W.: FtsZ dynamics during the division cycle of live Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 180, 2050–2056 (1998) 79. Sun Q., Margolin W.: Influence of the nucleoid placement of FtsZ and MinE rings in Escherichia coli. J. Bacteriol. 183, 1413–1422 (2001) 80. Sun Q., Margolin W.: Effects of perturbing nucleoid structure on nucleoid occlusion-mediated toporegulation of FtsZ ring assembly. J. Bacteriol. 186, 3951–3959 (2004) 81. Szeto J., Acharya S., Eng N.F. and Dillon J.A.: The N terminus of MinD contains determinants, which affect its dynamic localization and enzymatic activity. J. Bacteriol. 186, 7175–7185 (2004) 82. Taghbalout A., Ma L., and Rothfield L.: Role of MinD-membrane association in Min protein interactions. J. Bacteriol. 188, 2993–3001 (2006) 83. Trevors J.T.: Evolution of cell division in bacteria. Theory in Biosciences, 123, 3–15 (2004) 84. Wang, X., Huang J., Mukherjee A., Cao C., Lutkenhaus J.: Analysis of the interaction of FtsZ with itself, GTP, and FtsA. J. Bacteriol. 179, 5551–5559 (1997) 85. Weart R. B., Nakano S., Lane B.E., Zuber P., Levin P.A.: The ClpX chaperone modulates assembly of the tubulin-like protein FtsZ. Mol. Microbiol. 57, 238–249 (2005) 86. Wêgrzyn A., Wróbel B., Wêgrzyn G.: Altered biological properties of cell membranes in Escherichia coli dnaA and seqA mutants. Mol. Gen. Genet. 261, 762–769 (1999) 87. Wissel M.C., Weiss D.S.: Genetic analysis of the cell division protein FtsI (PBP3): amino acid substitution that impair septal localization of FtsI and recruitment of FtsN. J. Bacteriol. 186, 490–502 (2004) 88. White E.L., Suling W.J., Ross L.J., Seitz L.F., Reynolds J.: 2-alkoksycarbonylaminopyridines: inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Antimicrob. Chemother. 50, 111–114 (2002) 89. White L., Ross L., Reynolds R., seitz L., Moore G.D., Borhani D.: Slow polyrerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182, 4028–4034 (2000) 90. Woldringh, C. L., E. Mulder, P. G. Huls, and Vischer N.: Toporegulation of bacterial division according to the nucleoid occlusion model. Res. Microbiol. 142, 309–320 (1991)

19

91. Wu L.J.: Structure and segregation of the bacterial nucleoid. Curr. Opt. Gen. Dev. 14, 126–132 (2004) 92. Van den Ent F., Amos L., Lowe J.: Prokaryotic origin of the actin cytoskeleton. Nature, 413, 39–44 (2001) 93. Vincente M., Rico A.I., Martinez-Arteaga R., Mingorance J.: Septum enlightenment: assembly of bacterial division proteins. J. Bacteriol. 188, 19–27 (2006) 94. Yim L., Vandenbussche G., Mingorance J., Rueda S., Casanova M., Ruysschaert J-M.. Vincente M.: Role of carboxy terminus of Escherichia coli FtsA in self-interaction and cell division. J. Bacteriol. 182, 6366–6373 (2000) 95. Yu X.C., Margolin W.: FtsZ ring clusters in min and partition mutants: role of both the Min system and the nucleoid in regulation FtsZ ring localization. Mol. Microbiol. 32, 315–326 (1999) 96. Yu X.C., Weihe E.K., Margolin W.: Role of the C-terminus of FtsK in Escherichia coli chromosome segregation. J. Bacteriol. 180, 6424–6428 (1998) 97. Yu X.C., Margolin W.: Inhibition of assembly of bacterial cell division protein FtsZ by the hydrophobic dye 5,5’-bis(8-anilino-1-naphthalenosulfonate), J. Biol. Chem. 273, 10216–10222 (1998) 98. Zhou H., Lutkenhaus J.: The switch I and II regions of MinD are required for binding and activating MinC. J. Bacteriol. 186, 1546–1555 (2004) 99. Zhou H., Lutkenhaus J.: Membrane binding by MinD involves insertion of hydrophobic residues within the C-terminal amphipathic helix into the bilayer. J. Bacteriol. 185, 4326–4335 (2003) 100. Zhou H., Schulze R., Cox S., Saez C., Hu Z., Lutkenhaus J.: Analysis of MinD Mutations Reveals Residues Required for MinE Stimulation of the MinD ATPase and Residues Required for MinC interaction. J. Bacteriol. 187, 620–638 (2005) 101. Zhilan F. Castillo-Chavez C., Capurro A.: A model for tuberculosis with exogenous reinfection. Theoret. Popul. Biol. 57, 236–247 (2000) 102. Zhort T.: Molecular mechanism regulating persistent Mycobacterium tuberculosis infection. Microb. Infect. 5, 159–167 (2003)

20

MARTA POP£AWSKA, JAROS£AW DZIADEK

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 21–27 http://www.pm.microbiology.pl

ZASTOSOWANIE I ZNACZENIE ANALIZY SEKWENCJI GENU gyrB W BADANIACH BAKTERII CHOROBOTWÓRCZYCH DLA ROŒLIN Monika Sulikowska, Joanna Pu³awska, Piotr Sobiczewski Laboratorium Bakteriologii, Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa, ul. Pomologiczna 18, 96-100 Skierniewice, e-mail: [email protected] Wp³ynê³o w sierpniu 2006 r.

1. Wstêp. 2. Aktualne badania genu gyrB u bakterii. 3. Wykorzystanie analizy sekwencji gyrB do identyfikacji bakterii fitopatogenicznych oraz w badaniach nad ich filogenez¹ i zró¿nicowaniem genetycznym. 4. Podsumowanie The use and importance of sequence analysis of gyrB gene in study of plant pathogenic bacteria Abstract: The gyrB gene, coding for the B subunit of DNA gyrase (a protein belonging to topoisomerases) has been recently studied as a potential marker for identification and genetic diversity determination of bacteria. Due to its high diversity the gyrB gene is a very good candidate for an evolutionary marker of the relationship between closely related bacteria. Moreover, results obtained from sequence analyses of housekeeping genes to which gyrB belongs, correspond to those of time consuming conventional methods used for identification of bacteria and studies of their phylogeny and genetic diversity. The objective of this paper was to review the recent knowledge regarding the gyrB gene in plant pathogenic bacteria, such as: Pseudomonas aeruginosa, P. syringae, P. viridiflava, Xylella fastidiosa and some other bacteria from Enterobacteriaceae family and Actinomycetales order. 1. Introduction. 2. Present research on gen gyrB in bacteria. 3. Use of sequence analysis of gyrB for identification of plant pathogenic bacteria and for study on their phylogeny and genetic diversity. 4. Summary S³owa kluczowe: bakterie fitopatogeniczne, filogeneza, genetyczne zró¿nicowanie gyrB, identyfikacja Key words: genetic diversity, gyrB, identification, plant pathogenic bacteria, phylogeny

1. Wstêp Gen gyrB koduje podjednostkê B gyrazy tj. bia³ka zaliczanego do topoizomeraz, które uczestnicz¹ w przekszta³caniu DNA w formê superhelisy i w jego relaksacji. U prokariota, topoizomerazy nale¿¹ do du¿ej grupy enzymów, które s¹ odpowiedzialne za kontrolê stanu topologicznego DNA [1, 6, 16]. S¹ to enzymy niezbêdne dla replikacji, transkrypcji, rekombinacji i naprawy DNA [4, 19, 40]. Na podstawie ich zdolnoœci do przecinania pojedynczej lub podwójnej nici DNA wyró¿nia siê odpowiednio dwa g³ówne typy topoizomeraz, I i II, które s¹ z kolei podzielone na podrodziny: IA, IB, IIA i IIB. Gyraza nale¿y do topoizomeraz typu II, podrodziny IIA. Sk³ada siê z dwóch podjednostek A i B kodowanych odpowiednio przez geny gyrA i gyrB [6, 41]. Enzym ten funkcjonuje jako tetramer o strukturze A2B2 [14, 32]. Masa cz¹steczkowa bia³ka GyrB u ró¿nych bakterii wynosi 70 do 90 kDa [2, 19, 23]. U bakterii gyraza jest podstawowym enzymem katalizuj¹cym zale¿n¹ od ATP reakcjê powstawania ujemnych super-skrêtów w kolistym DNA, co daje w rezultacie wysok¹ kondensacjê tego biopolimeru i u³atwia rozkrêcanie podwójnej nici podczas replikacji [18]. G³ówn¹ rolê odgrywa tu N-koniec tego enzymu. Natomiast C-koniec podtrzymuje kompleks utworzony

z podjednostk¹ A gyrazy i uczestniczy w relaksacji niezale¿nej od ATP [11, 19, 44]. Gen gyrB jest ostatnio badany jako potencjalny marker do identyfikacji i okreœlania zró¿nicowania genetycznego bakterii, a tak¿e jako marker ewolucyjny pozwalaj¹cy okreœliæ relacje filogenetyczne miêdzy bakteriami blisko ze sob¹ spokrewnionymi [42]. Bia³ko GyrB nale¿y do klasy enzymów warunkuj¹cych podstawowe funkcje komórki, czyli bia³ek niezbêdnych dla utrzymania metabolizmu komórkowego, których ekspresja nie podlega regulacji. Kodowane s¹ one przez geny okreœlane jako „housekeeping genes”. Analiza sekwencji gyrB jest coraz czêœciej u¿ywana w metodzie MLST (Multilocus Sequence Typing). Metoda ta, poprzez analizê czêœciowych sekwencji (450–500 pz) genów koduj¹cych bia³ka, pozwala uzyskaæ wysoki poziom zró¿nicowania badanych bakterii i jest ostatnio zalecana przy definiowaniu nowych gatunków bakteryjnych [9, 22, 37]. Dodatkowo zaleca siê wykorzystanie analizy sekwencji genu gyrB w analizie filogenetycznej ze wzglêdu na jego trzy bardzo po¿¹dane cechy: ● uniwersalne wystêpowanie u bakterii ● molekularne tempo ewolucji, które jest wy¿sze ni¿ 16S rRNA ● bardzo rzadki horyzontalny transfer – HGT [19, 35, 43].

22

MONIKA SULIKOWSKA, JOANNA PU£AWSKA, PIOTR SOBICZEWSKI

2. Aktualne badania genu gyrB u bakterii W celu identyfikacji i klasyfikacji nowych gatunków i szczepów bakterii mikrobiolodzy i biotechnolodzy u¿ywaj¹ ró¿norodnych markerów taksonomicznych. Prowadzone analizy porównawcze z zastosowaniem metod standardowych s¹ czêsto pracoch³onne, a uzyskane wyniki nie zawsze zadowalaj¹ce. W ci¹gu ostatnich kilkunastu lat metody identyfikacji i filogenetycznej klasyfikacji bakterii uleg³y znacznemu rozwojowi pocz¹wszy od okreœlania stopnia podobieñstwa mikroorganizmów na podstawie hybrydyzacji DNA-DNA [31], a¿ po skomplikowane analizy genomu z zastosowaniem techniki sekwencjonowania DNA. Prace taksonomiczne zwi¹zane z genem podjednostki B gyrazy dotycz¹ g³ównie analizy jego sekwencji. Y a m a m o t o i H a r a y a m a [43] opracowali po raz pierwszy zestaw uniwersalnych starterów komplementarnych do dwóch regionów konserwatywnych genu gyrB u Escherichia coli, Pseudomonas putida i Bacillus subtilis. Stosuj¹c odwrotn¹ transkrypcjê tych regionów zaprojektowano N-koñcowy 41-nukleotydowy starter UP-1 i 44-nukleotydowy C-koñcowy starter UP-2r. Pierwsze 23 nukleotydy na koñcu 5’ obu starterów nie s¹ zdegenerowane i dlatego te¿ mog¹ nie byæ w pe³ni komplementarne dla wszystkich sekwencji gyrB. Jednak¿e s¹ u¿ywane jako miejsca przy³¹czenia starterów UP1S i UP2Sr stosowanych w póŸniejszym etapie do sekwencjonowania. Pozosta³e nukleotydy s¹ zdegenerowane, co pozwala na amplifikacjê sekwencji gyrB u ró¿nych bakterii. Startery te zosta³y zatem tak zaprojektowane, aby mo¿na by³o amplifikowaæ fragment gyrB o d³ugoœci pomiêdzy 1200 a 1400 pz u nawet bardzo odleg³ych od siebie taksonomicznie grup bakterii [43]. Od czasu zaprojektowania przez Y a m a m o t o i H a r a y a m a [43] uniwersalnych starterów, gen gyrB sta³ siê bardzo dogodnym markerem do badañ nad zró¿nicowaniem genetycznym bakterii oraz ich filogenez¹. Pierwsze badania dotyczy³y amplifikacji tego genu z zastosowaniem wymienionych starterów i sekwencjonowania w celu detekcji i taksonomicznej analizy niepatogenicznych dla roœlin bakterii z gatunku P. putida, zdolnych do degradacji propylobenzenu. Porównywano sekwencje genu gyrB oraz genu koduj¹cego 16S rRNA, ze wzglêdu na fakt wystêpowania w 16S rDNA dwóch typów regionów: wysoce konserwatywnego, dziêki któremu mo¿na zdefiniowaæ stopieñ pokrewieñstwa miêdzy ró¿nymi taksonami oraz regionu zmiennego, który w nowoczesnej taksonomii jest czêsto analizowany w celu znalezienia ró¿nic miêdzy szczepami bakterii. Analiza tej podjednostki jest standardowo stosowana dla wykrywania filogenetycznych relacji u prokariota [19, 42, 43].

Dotychczas analiza sekwencji genu gyrB odzwierciedlaj¹ca ewolucyjne zwi¹zki blisko spokrewnionych gatunków i szczepów by³a przeprowadzana zarówno dla bakterii niepatogenicznych dla roœlin takich jak: Marinilabilia [38], Bacillus cereus [3], Pseudomonas stutzeri [5], Fusobacterium necrophorum, F. varium, F. nucleatum [17], Shewanella [40], Aeromonas culicicola [26], Oceanospirillum [34], Micromonospora [20], Salmonella, Shigella i E. coli [10], Vibrio splendidus [21] P. putida [44, 43], Yersinia frederiksenii [8], jak i bakterii chorobotwórczych, które mog¹ powodowaæ znaczne straty gospodarcze w uprawach roœlin. Nale¿¹ do nich: Xylella fastidiosa [30], P. aeruginosa [1], P. syringae [33, 35], P. viridiflava [12] oraz niektóre bakterie z rodziny Enterobacteriaceae [7] i rzêdu Actinomycetales [29]. 3. Wykorzystanie analizy sekwencji gyrB do identyfikacji bakterii fitopatogenicznych, oraz w badaniach nad ich filogenez¹ i zró¿nicowaniem genetycznym Wiêkszoœæ dotychczasowych prac zwi¹zanych z analiz¹ sekwencji 16S rDNA wskazuje, i¿ gen ten zbyt wolno ewoluuje a rezultaty uzyskane z analizy nie pozwalaj¹ na monitorowanie, detekcjê oraz dostateczne zbadanie zale¿noœci u wiêkszoœci bakterii blisko ze sob¹ spokrewnionych. Podobnie zreszt¹ jak metoda hybrydyzacji DNA-DNA, chocia¿ jest standardowo stosowana do okreœlania przynale¿noœci do gatunku, to nie jest metod¹ efektywn¹ dla oszacowania genetycznego dystansu miêdzy szczepami bakterii. To powoduje, ¿e problem szczegó³owej analizy filogenetycznej pozostaje nierozwi¹zany. Ponadto nale¿y pamiêtaæ, ¿e relacje filogenetyczne miêdzy bakteriami ustalone na podstawie pojedynczego genu, ze wzglêdu na przypadkow¹ naturê podstawowych substytucji nukleotydów i inne zjawiska jak np. horyzontalny transfer genów, nie zawsze odzwierciedlaj¹ rzeczywiste pokrewieñstwo [37]. Stwierdzono, ¿e wyniki uzyskane z analizy sekwencji genów gyrB i rpoD s¹ odmienne od tych pochodz¹cych z analizy sekwencji genu koduj¹cego 16S rRNA uwa¿anej za jedn¹ z najbardziej u¿ytecznych do okreœlania filogenezy u organizmów prokariotycznych [3, 45, 46]. Gen rpoD koduje podjednostkê s70 polimerazy RNA i tak jak gyrB wystêpuje uniwersalnie u bakterii. Czynnik s70 jest jednym z elementów kompleksu holoenzymu polimerazy RNA, który umo¿liwia rozpoznanie specyficznej sekwencji promotora w procesie inicjacji transkrypcji [25, 46]. We wczeœniejszych pracach wykazano, i¿ grupowanie szczepów na podstawie hybrydyzacji DNA-DNA oraz analizy sekwencji gyrB by³o prawie identyczne

ZASTOSOWANIE I ZNACZENIE ANALIZY SEKWENCJI GENU gyrB W BADANIACH BAKTERII CHOROBOTWÓRCZYCH...

[45]. Konsekwentnie zatem, analiza porównawcza sekwencji genu gyrB okazuje siê bardziej przydatna do ustalania nie tylko taksonomicznych pozycji szczepów bakteryjnych, ale tak¿e do ich identyfikacji. S a w a d a i wsp. [35] analizowali drogê ewolucji kilku patowarów gatunku Pseudomonas syringae pochodz¹cych z ró¿nych roœlin-gospodarzy w oparciu o analizê genów: gyrB, rpoD oraz genów odpowiadaj¹cych za patogenicznoœæ bakterii: hrpL i hrpS. Bakterie P. syringae nale¿¹ do niebezpiecznych patogenów szerokiej grupy roœlin, zarówno drzew owocowych, np.: jab³oni, gruszy, czereœni, wiœni, moreli; warzyw np.: kalafiora, fasoli, kapusty, ogórka, pomidora, jak i roœlin ozdobnych – np.: lilaka. Powoduj¹ takie choroby jak: rak bakteryjny drzew owocowych (pv. syringae, pv. morsprunorum), bakteryjne zamieranie drzew pestkowych (pv. persicae), bakteryjna kanciasta plamistoœæ ogórka (pv. lachrymas), gnicie ró¿ kalafiora (pv. maculicola) oraz bakterioza lilaka (pv. syringae). Spoœród roœlin sadowniczych najwiêksze szkody wyrz¹dzaj¹ w sadach i szkó³kach drzew pestkowych [15, 36]. Gen rpoD tak jak gen gyrB, wystêpuje w pojedynczej kopii w genomie P. syringae, bardzo rzadko podlega poziomemu transferowi genów, jest stabilny i ewoluuje razem z genomem tej bakterii. Wyniki przeprowadzonych badañ pozwoli³y na utworzenie drzew filogenetycznych i wy³onienie trzech du¿ych grup P. syringae dla ka¿dego z genów: gyrB i rpoD oraz hrpL i hrpS. Stwierdzono jednak, ¿e w przypadku genu gyrB cz³onkowie trzeciej grupy mog¹ tworzyæ nowe odga³êzienie drzewa filogenetycznego, które powsta³o w wyniku ewolucji wczeœniej, ni¿ w grupach utworzonych z analizy pozosta³ych z badanych genów. Dlatego powsta³e grupy s¹ mniej jednolite. Przeprowadzone analizy stanowi³y podstawê konstrukcji dendrogramu wspólnego dla badanych genów (Rys. 1). Wyniki tych badañ pokrywaj¹ siê z wynikami prac z u¿yciem techniki hybrydyzacji DNA-DNA i mog¹ byæ baz¹ dla okreœlenia podobieñstwa patowarów P. syringae [35]. S a r k a r i G u t t m a n [33] poszerzyli badania genomu Pseudomonas syringae analizuj¹c 7 genów: acnB (hydrataza akonityny), cts (syntaza cytrynianu), gap (dehydrogenaza 3-fosforanu aldehydu glicerynowego), pgi (fosfoglukoizomerazy), pfk (fosfofruktokinazy), rpoD oraz gyrB, koduj¹cych bia³ka warunkuj¹ce podstawowe funkcje komórki i nale¿¹cych do czêœci rdzeniowej genomu (core genome). Geny rdzeniowe w przeciwieñstwie do genów adaptatywnych (flexible genome) ró¿ni¹cych siê miêdzy szczepami jednego gatunku, s¹ powszechnie obecne u bakterii i stosunkowo konserwatywne. Ze wzglêdu na to, ¿e genom rdzeniowy jest elementem sta³ym u bakterii, geny wchodz¹ce w jego sk³ad mog¹ byæ u¿yte do badania zmiennoœci ewolucyjnej. Rezultaty uzyskanych

23

badañ pozwoli³y na utworzenie drzew filogenetycznych. Na podstawie analizy sekwencji ka¿dego z badanych genów bakterie podzielono na 4 grupy. Jednak¿e sk³ad grup powsta³ych na podstawie analizy genu gyrB by³ odmienny ni¿ grup powsta³ych w wyniku porównania sekwencji pozosta³ych badanych genów. Istnieje du¿e prawdopodobieñstwo, i¿ w toku ewolucji wyst¹pi³a rekombinacja w³¹czaj¹ca gen gyrB pomiêdzy przodków dwóch grup, co doprowadzi³o do utworzenia bardzo ciekawej grupy powsta³ej z 4 szczepów grupy drugiej i 3 grupy trzeciej. Na podstawie wykonanych badañ stwierdzono tak¿e, i¿ nie ma korelacji miedzy patowarami P. syringae, a ich gospodarzami roœlinnymi. Osiem izolatów P. syringae pv. glicynea zebranych w ci¹gu 13 lat z ró¿nych plantacji soi okaza³y siê genetycznie identyczne. Tak¿e izolaty P. syringae pv. maculicola pochodz¹ce z kapusty Chiñskiej pozosta³y genetycznie jednorodne podczas 12 lat przechowywania. Najbardziej interesuj¹ce by³o wykazanie genetycznej identycznoœci izolatów pochodz¹cych z morwy i tytoniu przechowywanych przez 13 lat. Równie¿ bakterie izolowane z rzodkiewki okaza³y siê identyczne pomimo ró¿nych miejsc pochodzenia (Japonia, USA) [33]. G o s s i wsp. [12] badali genetyczne zró¿nicowanie 93 izolatów Pseudomonas viridiflava pochodz¹cych z Arabidopsis thaliana. Patogen ten jest polifagiem i m.in. powoduje bakteryjn¹ zarazê liœci na melonie, pomidorze, bak³a¿anie, komosie oraz chryzantemie [13, 24]. Analiza czêœciowych sekwencji genu gyrB oraz 4 innych fragmentów genomu P. viridiflava oznaczonych jako 7, 17, 20 i 26, z których czêœæ reprezentuje tzw. housekeeping genes (fragment 7, dwa ró¿ne regiony koduj¹ce fragmentu 26-purA) pozwoli³a na wyodrêbnienie wœród badanych izolatów dwóch g³ównych grup nazwanych A i B. Podstawowe zró¿nicowanie pomiêdzy tymi grupami mo¿na zauwa¿yæ we wszystkich badanych 5 fragmentach DNA. Grupy A i B s¹ monofiletyczne przynajmniej w obrêbie niektórych gatunków rodzaju Pseudomonas. Gen gyrB, jako marker zmiennoœci genetycznej bakterii, badano tak¿e u Xylella fastidiosa – patogena wielu ekonomicznie wa¿nych gatunków roœlin, takich jak: kawa, cytrusy, brzoskwinie, migda³y, lucerna. W wyniku infekcji tych roœlin tworzy siê korek, powoduj¹cy zaburzenie transportu wody i sk³adników pokarmowych [30]. Dziêki wy¿szej czêstotliwoœci wystêpowania substytucji w tym genie mo¿liwe jest u¿ycie jego sekwencji do analizy przydatnej dla oszacowania pokrewieñstwa filogenetycznego i klasyfikacji szczepów, które zró¿nicowa³y siê w nieodleg³ej przesz³oœci. Warto podkreœliæ, ¿e wykonana w ramach tych badañ analiza genu podjednostki 16S rRNA pozwoli³a na odró¿nienie X. fastidiosa od bakterii nale¿¹cych do blisko filogenetycznie spokrewnionego gatunku Xanthomonas campestris. Niemniej jednak wysoki poziom

24

MONIKA SULIKOWSKA, JOANNA PU£AWSKA, PIOTR SOBICZEWSKI

Rys. 1. Drzewo filogenetyczne przedstawiaj¹ce ewolucjê genomu Pseudomonas syringae skonstruowane metod¹ „maximum-likelihood” na podstawie analizy po³¹czonych sekwencji 4 genów gyrB, rpoD, hrpL i hrpS. Nad wewnêtrznymi ga³êziami zamieszczono wspó³czynniki poparcia. (J. Molecular Evolution. 49, 1999, 627–644: Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster, Sawada H., Suzuki F., Matsuda I., Saitou N., Fig.3). Za uprzejm¹ zgod¹ Springer Science i Business Media oraz autora pracy Hiroyuki Sawada [35]

podobieñstwa sekwencji wœród szczepów bakterii Xylella fastidiosa nie pozwala na pogrupowanie izolatów pochodz¹cych z ró¿nych roœlin-gospodarzy. Zalety analizy sekwencji genu gyrB w badaniach nad filogenez¹ ró¿nych bakterii zosta³y równie¿ potwierdzone przez D a u g a [7]. Wyniki porównawcze 16S rRNA oraz genu gyrB bakterii rodziny Enterobacteriaceae, wœród których znajduj¹ siê równie¿ bakterie patogeniczne dla roœlin, pozwoli³y na skonstruowanie drzewa filogenetycznego obrazuj¹cego pokrewieñstwo ewolucyjne bakterii nale¿¹cych do tej rodziny. W tym przypadku, podobnie jak w pracy R o d r i g u e s’ a i wsp. [30], wyniki analizy sekwencji 16S rDNA umo¿liwi³y przedstawienie filogenetycz-

nych zale¿noœci oddalonych od siebie bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, podczas gdy porównywanie sekwencji gyrB okaza³o siê przydatne do scharakteryzowania pokrewieñstwa w obrêbie rodzaju. R i c h e r t i wsp. [29] poddali badaniom zestaw starterów zaprojektowanych przez Y a m a m o t o i H a r a y a m a [43] na bakteriach z rodziny Microbacteriaceae klasy Actinomycetales. Podobnie jak w wy¿ej opisanych pracach, standardow¹ metod¹, jak¹ u¿yto dodatkowo do okreœlenia filogenetycznego pokrewieñstwa miêdzy bakteriami by³a analiza genu 16S rRNA. Jednak¿e i tym razem analiza tego genu nie da³a satysfakcjonuj¹cego wyniku w rozró¿nieniu blisko spokrewnionych szczepów. Ich pokrewieñstwo

ZASTOSOWANIE I ZNACZENIE ANALIZY SEKWENCJI GENU gyrB W BADANIACH BAKTERII CHOROBOTWÓRCZYCH...

zosta³o okreœlone na podstawie genu gyrB. Stosowane dotychczas startery UP-1 i UP-2r, które by³y u¿yteczne w amplifikacji genu gyrB dla szerokiego spektrum bakterii, niestety okaza³y siê zawodne w przypadku bakterii z rodziny Microbacteriaceae pomimo zastosowania ró¿nych warunków reakcji amplifikacji. Dlatego te¿ uznano za konieczne zmodyfikowanie sekwencji starterów uniwersalnych poprzez analizê sekwencji gyrB typowej dla wiêkszoœci gatunków bakterii oraz dodatkowo sekwencji tego genu charakterystycznej dla Actinomycetales. Zaprojektowana para nowych starterów przy zastosowaniu wielu kombinacji pozwoli³a jedynie na uzyskanie produktu amplifikacji nie wiêkszego ni¿ 1000–1100 bp, a wiêc krótszego od najczêœciej wystêpuj¹cej sekwencji genu gyrB. Prawdopodobnie jednym z powodów ró¿nej specyficznoœci pary starterów uniwersalnych dla gyrB jest wysoki poziom zawartoœci procentowej par G+C badanych szczepów nale¿¹cych do rodziny Microbacteriaceae. W zwi¹zku z tym przy³¹czanie starterów mo¿e byæ niespecyficzne, wskutek czego nie pojawia siê produkt spodziewanej wielkoœci. Generalnie, we wszystkich przedstawionych badaniach wykazano znacznie wiêksz¹ zmiennoœæ genu gyrB ni¿ genu koduj¹cego 16S rRNA, a tym samym potwierdzono mo¿liwoœæ okreœlenia filogenetycznego pokrewieñstwa miêdzy szczepami, które zró¿nicowa³y siê stosunkowo niedawno. Stwierdzono równie¿, i¿ analiza sekwencji genów koduj¹cych bia³ka metabolizmu podstawowego mog³aby w przysz³oœci z powodzeniem zast¹piæ hybrydyzacjê DNA-DNA dla utworzenia drzewa filogenetycznego szczepów blisko spokrewnionych oraz przewidzieæ pokrewieñstwo genetyczne [29]. Badania oparte na analizie genu gyrB prowadzono równie¿ w Laboratorium Bakteriologii Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach nad bakteriami z rodzaju Agrobacterium (dane niepublikowane). Produkty amplifikacji genu gyrB o wielkoœci ok. 1200 pz uzyskane z 86 izolatów i szczepów rodzaju Agrobacterium z kolekcji w³asnej poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi Alw21I, MvaI, Bsp143II i HinfI. Uzyskane wzory restrykcyjne by³y podstaw¹ podzia³u badanych bakterii na 24 grupy. Z ka¿dej z nich wybrano reprezentanta, którego gen gyrB zsekwencjonowano. Stwierdzono, ¿e gen ten wykazuje wiêkszy polimorfizm ni¿ inne ewolucyjnie konserwowane geny, takie jak np. geny 16S czy 23S rRNA [27] co daje mo¿liwoœæ opracowania prób do identyfikacji i rozró¿niania poszczególnych taksonów w obrêbie rodzaju Agrobacterium. Ponadto, analiza sekwencji genu gyrB potwierdzi³a taksonomiczn¹ odmiennoœæ szczepów, które jak stwierdzono na podstawie innych badañ mog¹ tworzyæ nowy, jak dot¹d nieopisany gatunek [28].

25

4. Podsumowanie Prowadzone w ostatnich latach intensywne badania nad topoizomerazami DNA pozwalaj¹ coraz lepiej rozumieæ ich mechanizmy dzia³ania oraz rolê, jak¹ pe³ni¹ u bakterii. Gen gyrB nale¿¹cy do typu II tych enzymów znalaz³ tak¿e szerokie zastosowanie w badaniach zwi¹zanych z identyfikacj¹, ró¿nicowaniem i okreœlaniem pokrewieñstwa filogenetycznego mikroorganizmów. Klasyczne metody stosowane dotychczas do identyfikacji bakterii pozwalaj¹ce na okreœlenie cech biochemicznych, fizjologicznych, stopnia podobieñstwa metod¹ hybrydyzacji DNA-DNA, reakcji serologicznych (test ELISA) jak równie¿ zale¿noœci filogenetycznych w oparciu o analizê sekwencji 16S rDNA okaza³y siê, jak wynika z przedstawionych prac, niewystarczaj¹ce do okreœlenia pokrewieñstwa bliskich pod wzglêdem filogenetycznym organizmów prokariotycznych. Analiza porównawcza sekwencji 16S rDNA okazuje siê tu bardziej przydatna do okreœlania pozycji bakterii w obrêbie rodzaju. Jednak¿e do okreœlenia pokrewieñstwa organizmów na poziomie gatunku i poni¿ej (np. patowaru – dla bakterii fitopatogenicznych) wymagana jest analiza sekwencji bardziej zró¿nicowanych genów, np. gyrB. Z tego powodu coraz czêœciej klasyczne badania taksonomiczne uwzglêdniaj¹ce równie¿ analizê sekwencji 16S rDNA s¹ uzupe³niane lub nawet zastêpowane analiz¹ sekwencji genów koduj¹cych bia³ka, warunkuj¹ce podstawowe funkcje komórki. Dobrym kandydatem do tego typu badañ jest w³aœnie gen gyrB ze wzglêdu na swoj¹ uniwersalnoœæ wystêpowania w organizmach prokariotycznych i tempo ewolucji. Ponadto zastosowanie metody bezpoœredniego sekwencjonowania gyrB jest szybkim i dogodnym sposobem identyfikacji bakterii, analiz taksonomicznych oraz monitoringu bakterii w ich naturalnym œrodowisku [43]. Nale¿y jednak podkreœliæ, i¿ zaprojektowane dla genu gyrB startery s¹ u niektórych gatunków bakterii równie¿ komplementarne do sekwencji genu parE koduj¹cego topoizomerazê IV, który nale¿y do tego samego typu i podrodziny, co gyrB, ale pe³ni inn¹ rolê w komórce. W analizach genu gyrB nale¿y wzi¹æ pod uwagê podobieñstwo jego sekwencji do genu parE, gdy¿ w niektórych przypadkach amplifikowane s¹ oba fragmenty i nie ma mo¿liwoœci rozdzielenia ich na ¿elu agarozowym. Aby pokonaæ ten problem proponuje siê zastosowanie klonowania [42]. Przedmiotem dotychczasowych badañ taksonomicznych z wykorzystaniem analizy genu gyrB by³y ró¿ne organizmy prokariotyczne zarówno patogeniczne, jak i niepatogeniczne dla roœlin. We wszystkich przypadkach analiza sekwencji genu okaza³a siê metod¹ trafn¹ do konstrukcji dendrogramów obrazuj¹cych pokrewieñstwo pomiêdzy badanymi grupami

26

MONIKA SULIKOWSKA, JOANNA PU£AWSKA, PIOTR SOBICZEWSKI

mikroorganizmów. Ponadto wyniki analizy genu gyrB koresponduj¹ z metodami standardowymi u¿ywanymi zarówno dla identyfikacji, zró¿nicowania genetycznego oraz filogenezy, co sprawia, i¿ mog¹ one z powodzeniem je zastêpowaæ. Podziêkowanie Pani Prof. dr. hab. Wandzie Ma³ek sk³adamy serdeczne podziêkowanie za konsultacje i cenne uwagi podczas pisania tej pracy. Piœmiennictwo 1. Akasaka T., Onodera Y., Tanaka Y., Sato K.: Cloning, Expression and Enzymatic Characterization of Pseudomonas aeruginosa Topoisomerase IV. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 530–536 (1999) 2. Aubry A., Pan X.S., Fisher L.M., Jarlier V., Cambau E.: Mycobacterium tuberculosis DNA gyrase: interaction with quinolones and correlation with antimycobacterial drug activity. Antimicrob Agents Chemother. 48, 1281–1288 (2004) 3. Bavykin S. G., Lysov Y. P., Zakhariev V., Kelly J. J., Jackman J., Stahl D. A. and Cherni A.: Use of 16S rRNA, 23S rRNA, and gyrB Gene Sequence Analysis To Determine Phylogenetic Relationships of Bacillus cereus Group Microorganisms. J. Clin. Microbiol. 42, 711–3730 (2004) 4. Champoux J.J.: DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu. Rev. Biochem. 70, 369–413 (2001) 5. Cladera A.M., Bennasar A., Barceló M., Lalucat J., GarcíaValdés E.: Comparative Genetic Diversity of Pseudomonas stutzeri Genomovars Clonal Structure, and Phylogeny of the species. J. Bacteriol. 186, 5239–5248 (2004) 6. Corbett K.D., Berger J.M.: Structure of the topoisomerase VI-B subunit: implications for type II topoisomerase mechanism and evolution. EMBO J. 22, 151–163 (2003) 7. Dauga C.: Evolution of the gyrB gene and the molecular phylogeny of Enterobacteriaceae: a model molecule for molecular systematic studies. Int. J. System. Evolut. Microbiol. 52, 531–547 (2002) 8. Demarta A., De Respinis S., Dolina M., Peduzzi R.: Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16S rDNA and gyrB genes sequence analyses. FEMS Microbiol. Lett. 238, 423–8 (2004) 9. Enright M.C., Spratt B.G.: Multilocus sequence typing. Trends in Microbiol. 7, 482–487 (1999) 10. Fukushima M., Kakinuma K., Kawaguchi R.: Phylogenetic Analysis of Salmonella, Shigella, and Escherichia coli Strains on the Basis of the gyrB Gene Sequence. J. Clin. Microbiol. 40, 2779–2785 (2002) 11. Gellert M., Mizuuchi K., O’dea M.H., Nash H.A.: DNA gyrase: An enzyme that introduces superhelical turns into DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3872–3876 (1976) 12. Goss E.M., Kreitman M., Bergelson J.: Genetic diversity, recombination and cryptic clades in Pseudomonas viridiflava infecting natural populations of Arabidopsis thaliana. Genetics 169, 21–35 (2005) 13. Goumans D.E., Chatzaki A.K.: Characterization and host range evaluation of Pseudomonas viridiflava from melon, blite, tomato, chrysanthemum and eggplant. Europ. Plant Pathol. 104, 181–188 (1998)

14. Hannelore S., Roth M., Zimmer Ch.: Biochemical complementation studies in vitro of gyrase subunits from different species. FEBS Lett. 373, 88–92 (1995) 15. Hwang M. S. H., Morgan R. L., Sarkar S. F., Wang P. W., and. Guttman David S.: Phylogenetic Characterization of Virulence and Resistance Phenotypes of Pseudomonas syringae. Appl. Environment. Microbiol. 71, 5182–5191 (2005) 16. Huang W.M.: Bacterial diversity based on type II DNA topoisomerase genes. Annu. Rev. Genet. 30, 79–107 (1996) 17. Jin J., Haga T., Shinjo T., Goto Y.: Phylogenetic analysis of Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium varium and Fusobacterium nucleatum based on gyrB gene sequences. J. Vet. Med. Sci. 66, 1243–1245 (2004) 18. Jura Cz.: Encyklopedia biologiczna. Agencja PublicystycznoWydawnicza „Opres”; Kraków 2000, tom IV str. 184, tom XI str. 34 19. Kasai H., Kanako W., Gasteiger E., Bairoch A., Isono K., Yamamoto S., Harayama S.: Construction of the gyrB Database for the Identification and Classification of Bacteria. Genome Inform Ser. Workshop Genome Inform. 9, 13–21 (1998) 20. Kasai K., Tamura T., Harayama S.: Intrageneric relationships among Micromonospora species deduced from gyrB – based phylogeny and DNA relatedness. Int. J. System. Evolution. Microbiol. 50, 127–134 (2000) 21. Le Roux F., Gay M., Lambert C., Nicolas J.L., Gouy M., Berthe F.: Phylogenetic study and identification of Vibrio splendidus – related strains based on gyrB gene sequences. Dis. Aquat. Organ. 58,143–150 (2004) 22. Maiden M.C.J., Bygraves J.A., Feil E., Morelli G., Russell J.E., Urwin R., Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D.A., Feavers I. M., Achtman M., Spratt B. G.: Multilocus sequence typing: A portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3140–3145 (1998) 23. Manjunatha U.H., Dalal M., Chatterji M., Radha D.R., Visweswariah, mand Nagaraja V.: Functional characterisation of mycobacterial DNA gyrase: an efficient decatenase. Nucleic Acids Res. 30, 2144–2153 (2002) 24. Moretti C., Sequino S., Buonaurio R.: First Report of Leaf Necrosis Caused by Pseudomonas viridiflava on Melon Seedlings in Italy. Plant Disease, 89,109 (2005) 25. Paget M. S. B. and Helmann J. D.: The s70 family of sigma factors. Genome Biology, 4, 203.1–203.6 (2003) 26. Pidiyar V.J., Jangid K., Dayananda K.M., Kazanowski A., Gonzalez J.M., Patole M.S., Shouche Y.S.: Phylogenetic affiliation of Aeromonas culicicola MTCC 3249 (T) based on gyrB gene sequence and PCR-amplicon sequence analysis of cytolytic enterotoxin gene. Syst. Appl. Microbiol. 26, 197–202 (2003) 27. Pu³awska J., Maes M., Willems A., Sobiczewski P.: Phylogenetic Analysis of 23S rRNA Gene Sequences of Agrobacterium, Rhizobium and Sinorhizobium strains. Syst. Appl. Microbiol. 23, 238–244 (2000) 28. Pu³awska J., Piotrowska-Seget Z.: Characterization of Agrobacterium isolates from Chrysanthemum on the basis of biochemical tests, FAME analysis and RAPD. Phytopathol. Pol. 30, 9–17 (2003) 29. Richert K., Brambilla E., Stackebrandt E.: Development of PCR primers for the amplification and direct sequencing of gyrB genes from microbacteria, order Actinomycetales. J. Microbiol. Methods, 60, 115–123 (2005) 30. Rodrigues J.L.M., Silva-Stenico M.E., Gomes J.E., Lopes J.R.S., Tsai S.M.: Detection and Diversity Assessment of

ZASTOSOWANIE I ZNACZENIE ANALIZY SEKWENCJI GENU gyrB W BADANIACH BAKTERII CHOROBOTWÓRCZYCH...

Xylella fastidiosa in Field-Collected Plant and Insect Samples by Using 16S rRNA and gyrB Sequences. Appl. Environ. Microbiol. 69, 4249–4255 (2003) 31. Rossello-Mora R., Amann R.: The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 25, 39–67 (2001) 32. Ruthenburg A.J., Graybosch D.M., Huetsch J.C., Verdine G.L.: A Superhelical Spiral in the Escherichia coli DNA Gyrase A C-terminal Domain Imparts Unidirectional Supercoiling Bias J. Biol. Chem. 280, 26177–26184 (2005) 33. Sarkar S.F., Guttman D.S.: Evolution of the Core Genome of Pseudomonas syringae, a Highly Clonal, Endemic Plant Pathogen. Appl. and Environ. Microbiol. 70, 1999–1012 (2004) 34. Satomi M., Kimura B., Hamada T., Harayama S., Fujii T.: Phylogenetic study of the genus Oceanospirillum based on 16S rRNA and gyrB genes: emended description of the genus Oceanospirillum, description of Pseudospirillum gen. nov., Oceanobacter gen. nov. and Terasakiella gen. nov. and transfer of Oceanospirillum jannaschii and Pseudomonas stanieri to Marinobacterium as Marinobacterium jannaschii comb. nov. and Marinobacterium stanieri comb. nov. 2002. Int. J. System. Evolution. Microbiol. 52, 739–747 (2002) 35. Sawada H., Suzuki F., Matsuda I., Saitou N.: Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J. Molecular Evolution. 49, 627–644 (1999) 36. Sobiczewski P., Schollenberger M.: Bakteryjne choroby roœlin ogrodniczych. Pañstwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leœne, Warszawa, 2002, s. 28, 61, 95, 148. 37. Stackebrandt E., Frederiksen W., Garrity G.M., Grimont P.A.D., Kampfer P., Maiden M.C.J., Nesme X., RosselloMora R., Swings J., Truper H.G., Vauterin L., Ward A.C., Whitman W.B.: Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology. Int. J. System. Evolution. Microbiol. 52, 1043–1047 (2002) 38. Suzuki M., Nakagawa Y., Harayama S., Yamamoto S.: Phylogenetic analysis of genus Marinilabilia and related bacteria

27

based on amino acid sequences of GyrB and emended description of Marinilabilia salmonicolor with Marinilabilia agarovorans as its subjective synonym. Int. J. System. Bacteriol. 49, 1551–1557 (1999) 39. Venkateswaran K., Dohmoto N., Harayama S.: Cloning and nucleotide sequence of the gyrB gene Vibrio parahaemolyticus and its application in detection of this pathogen in shrimp. Appl. Environ. Microbiol. 62, 681–687 (1998) 40. Venkateswaran K., Moser D.P., Dollhopf M.E., Lies D.P., Saffarini D.A., MacGregor B.J., Ringelberg D.B., White D.C., Nishijima M., Sano H., Burghardt J., Stackebrandt E., Nealson K.H.: Polyphasic taxonomy of the genus Shewanella and description of Shewanella oneidensis sp. nov. Int. J. System. Bacteriol. 49, 705–724 (1999) 41. Wang J. C.: Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nature Rev., Molecular Cell Biol. 3, 430–440 (2002) 42. Watanabe K., Nelson J.S., Harayama S., Kasai H.: ICB database: the gyrB database for identification and classification of bacteria. Nucleic Acids Res. 29, 344–345 (2001) 43. Yamamoto S., Harayama S.: PCR Amplification and Direct Sequencing of gyrB Genes with Universal Primers and Their Application to the Detection and Taxonomic Analysis of Pseudomonas putida Strains. Appl. Environ. Microbiol. 61, 1104–1109 (1995) 44. Yamamoto S., Harayama S.: Phylogenetic relationship of Pseudomonas putida strains deduced from the nucleotide sequences of gyrB, rpoD and 16S rRNA genes. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 813–819 (1998) 45. Yamamoto S., Bouvet P.J.M., Harayama S.: Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 87–95 (1999) 46. Yamamoto S., Kasai H., Arnold D.L., Jackson R.W., Vivian A., Harayama S.: Phylogeny of the genus Pseudomonas: intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes. Microbiol. 146, 2385–2394 (2000)

28

MONIKA SULIKOWSKA, JOANNA PU£AWSKA, PIOTR SOBICZEWSKI

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 29–38 http://www.pm.microbiology.pl

BAKTERIE Z RODZAJU PROVIDENCIA – TAKSONOMIA, EPIDEMIOLOGIA, CHOROBOTWÓRCZOŒÆ

Agnieszka Maszewska, Aleksandra B³aszczyk, Agnieszka Torzewska, Antoni Ró¿alski Zak³ad Immunobiologii Bakterii, Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet £ódzki, 90-237 £ódŸ, Banacha 12/16. e-mail: [email protected] Wp³ynê³o w maju 2006 r.

1. Wstêp. 2. Historia rodzaju Providencia i obecna klasyfikacja bakterii w jego obrêbie. 3. Epidemiologia i znaczenie kliniczne Providencia spp. 4. Czynniki chorobotwórczoœci Providencia spp. 5. Podsumowanie Bacteria from the genus Providencia – taxonomy, epidemiology, pathogenicity Abstract: In 1943 Stuart and co-workers described for the first time a group of paracolon bacteria which they designated “anaerogenic paracolon type 29911”. Later, in 1951 Kauffman designated them as Providencia. The current classification of these pathogens is based on DNA-DNA hybridization. Until 2005 the genus Providencia consisted of 5 species: P. alcalifaciens, P. rustigianii, P. stuartii, P. rettgeri and P. heimbachae. In 2005 new species Providencia vermicola was described. P. alcalifaciens, P. rustigianii, P. stuartii, P. retgerri are recognized as facultative pathogens that under favorable conditions cause enteric disease, wound and urinary tract infections. P. alcalifaciens and P. rustigianii cause diarrhea in children, as well as diarrhea in adults who traveled abroad. P. stuartii has been recognized as a pathogen with an increasing involvement in urinary tract infections, primarily in nursing home patients with long term indwelling urinary catheters. P. rettgerii causes UTI and nosocomial infections. In this article we focus on the clinical role of Providencia sp. and on the following potential virulence factors of these bacteria: adherence, invasivenes, urease and lipopolysaccharide (endotoxin). 1. Introduction. 2. The history of the genus Providencia and its present classification. 3. Epidemiology and the clinical role of Providencia spp. 4. Virulence factors of Providencia spp. 5. Summary S³owa kluczowe: bakterie Providencia, chorobotwórczoœæ, czynniki patogennoœci Key words: bacteria Providencia, pathogenicity, virulence factors

1. Wstêp Bakterie z rodzaju Providencia to Gram-ujemne, perytrychalnie urzêsione pa³eczki zaliczone do rodziny Enterobacteriaceae. Ich klasyfikacja nastrêcza³a w przesz³oœci wiele trudnoœci. Pierwsze o nich doniesienia pochodz¹ z pocz¹tku XX w. Poniewa¿ wykazywa³y podobieñstwo do rodzajów Proteus i Morganella, przez pewien czas by³y zaliczane do wspólnego trybu Proteeae [9]. Brak jednoznacznych cech biochemicznych, niejasne znaczenie w chorobotwórczoœci spowodowa³y, i¿ pierwsze doniesienia klasyfikowa³y póŸniejsze Providencia jako oko³ojelitowe bakterie („paracolon bacteria”) [43]. Ich miejsce w taksonomii bakterii zmienia³o siê, i tak naprawdê, dopiero zastosowanie metod genetycznych i molekularnych wprowadzi³o pewien porz¹dek w klasyfikacji w obrêbie wspomnianego trybu. Trzeba te¿ przyznaæ, i¿ pa³eczki z rodzaju Providencia nie wzbudza³y w przesz³oœci tak wielkiego zainteresowania wœród bakterii rodziny Enterobacteriaceae jak pa³eczki Escherichia coli, czy bakterie z rodzajów Salmonella, Shigella, Yersinia oraz Proteus. Wynika³o to z przeœwiadczenia o ich mniejszym znaczeniu w chorobotwórczoœci. Obecnie pa³eczki Providencia sp. odgrywaj¹ coraz wiêksz¹ rolê

jako patogeny warunkowo chorobotwórcze. Wywo³uj¹ one zaka¿enia uk³adu moczowego, przede wszystkim u osób d³ugotrwale cewnikowanych, s¹ tak¿e przyczyn¹ biegunek u podró¿uj¹cych oraz u dzieci. Zainteresowanie czynnikami chorobotwórczoœci tych pa³eczek, a tak¿e opornoœci¹ na dzia³anie antybiotyków wzrasta. Roœnie te¿ znacznie tych bakterii jako czynników etiologicznych zaka¿eniach szpitalnych. Z tych powodów rodzaj Providencia wart jest szerszego opisu. 2. Historia rodzaju Providencia i obecna klasyfikacja bakterii w jego obrêbie Nazwa rodzaju Providencia, zaproponowana przez K a u f f m a n n a w 1951, wywodzi siê od miejsca izolacji bakterii – Providence. S t u a r t i wsp. wyizolowali te bakterie po raz pierwszy z próbek ka³u od pacjentów z biegunk¹ lub nie¿ytem jelit. Nazwali je w 1943 r. „anaerogenic paracolon type 29911” [19, 43]. Pozycja taksonomiczna tych drobnoustrojów zmienia³a siê. Bakterie powoduj¹ce cholerê drobiu, podobne do opisanych przez S t u a r t a i wsp., wyizolowa³ w 1904 r. R e t t g e r. Takie same bakterie, wyizolowane innego materia³u, 14 lat póŸniej H a d l e y i wsp.

30

AGNIESZKA MASZEWSKA, ALEKSANDRA B£ASZCZYK, GNIESZKA TORZEWSKA, ANTONI RÓ¯ALSKI

nazwali Bacterium rettgerei. Ich nazwê zmieniono póŸniej na Bacillus rettgeri. Miejsce w taksonomii bakterii wymienionych wy¿ej pa³eczek zmienia³o siê. Zaliczono je rodzaju Shigella oraz do rodzaju Proteus, w którym utworzono gatunek Proteus rettgeri. PóŸniej dla tych bakterii utworzono oddzielny rodzaj Rettgerella [19, 43]. W 1920 r. O r n s t e i n opisa³ Bacillus inconstans, reklasyfikowany w 1950 r. przez S h o w’a i C l a r k’a jako Proteus inconstans. W 1944 r. G o m e s opisa³ Eberthella alcalifaciens, bakterie wyizolowane od dziecka z biegunk¹. Oba te gatunki bakterii nastêpnie zosta³y reklasyfikowane do gatunku Providencia alcalifaciens [19, 43]. Wracaj¹c do historii bakterii z jednostki taksonomicznej grupy Providence warto wspomnieæ, i¿ proponowano w roku 1952 nadaæ im rangê gatunku Providencia providenciae a w roku 1954 umieszczono je w rodzaju Proteus jako Proteus stuartii [43]. W 1954 r. E w i n g podzieli³ grupê Providence na dwie biogrupy A i B, na podstawie zdolnoœci do wytwarzania gazu podczas rozk³adu glukozy oraz zdolnoœci do fermentacji adonitolu i inozytolu [7]. W 1962 r. ten sam autor nada³ tym biogrupom nazwy gatunkowe Providencia alcalifaciens (biogrupa A) i P. stuartii (biogrupa B) [8]. W pierwszym gatunku wyodrêbniono 4 biogrupy, w drugim – 2. Dopiero kolejne lata badañ, tym razem ju¿ z zastosowaniem metod molekularnych, pozwoli³y na bardziej precyzyjne rozró¿nienie opisywanych szczepów w obrêbie grupy Providence i ich wzajemnych relacji z innymi, wykazuj¹cym podobieñstwa bakteriami, w tym z bakteriami z rodzaju Proteus. Zastosowanie przez B r e n n e r a i wsp. 1978 r. [4] techniki hybrydyzacji DNA, doprowadzi³o do potwierdzenia zasadnoœci wyodrêbnienia trzech gatunków w obrêbie rodzaju Providencia – P. alcalifaciens, P. stuartii i P. rettgeri. Kolejnym problemem, jaki siê wy³oni³, by³o rozstrzygniêcie pierwszeñstwa nazwy dla biogrupy 3 P. alcalifaciens. Postanowiono pod-

Ta b e l a I Ró¿nicowanie biochemiczne w obrêbie trybu Proteeae [43] Pro- Provi- Morgateus dencia nella v + – – + + + – – + – v – V – + – – v – (+) + V + + – –

W³aœciwoœæ biochemiczna Rozk³ad cytrynianu Fermentacja mannozy Up³ynnianie ¿elatyny (22 OC) Wytwarzanie H2S Fermentacja inozytolu Wytwarzanie lipazy Wytwarzanie dekarboksylazy ornityny Hydroliza mocznika (ureaza) Wzrost rozpe³zliwy

+ 90–100% szczepów dodatnich; (+) 75–89,9% szczepów dodatnich; v 25,1–74,9% szczepów dodatnich; (–) 10,1–25% szczepów dodatnich; – 0–10% szczepów dodatnich

nieœæ j¹ do rangi gatunku, nadaj¹c jej nazwê P. rustigianii [18]. Ta propozycja zbieg³a siê w czasie z opisem przez M u l l e r a i wsp. [36] bakterii izolowanych od pingwinów w niemieckich ogrodach zoologicznych, które zaklasyfikowano do rodzaju Providencia i nazwano P. friedericiana. Jak siê okaza³o, gatunki P. rustigianii i P. friedericiana s¹ bardzo podobne, nale¿a³o wiêc wybraæ dla nich jedn¹ nazwê. Przyjêto pierwsz¹, ze wzglêdu na wczeœniejsze jej pojawienie siê w literaturze. W 1986 r. w³¹czono do rodzaju Providencia nowy gatunek P. heimbachae, do którego zaliczono bakterie wyizolowane z ka³u pingwinów i byd³a [37]. Ostatnio zaproponowano umieszczenie w rodzaju Providencia nowego gatunku bakterii P. vermicola [58]. Wyizolowano je z chorobotwórczych dla owadów nicieni Steinernema thermophilus, a badania genetyczne wskaza³y na silne pokrewieñstwo z rodzajem Providencia. W dwóch tabelach przedstawiono cechy biochemiczne pozwalaj¹ce na zaliczanie bakterii do trzech rodzajów Proteus, Providencia i Morganella (tabela I) oraz klasyfikacjê bakterii w obrêbie rodzaju Providencia (tabela II).

Ta b e l a I I Ró¿nicowanie gatunków Providencia na podstawie wybranych cech biochemicznych [11, 18, 43] W³aœciwoœæ biochemiczna Hydroliza mocznika (ureaza) Rozk³ad cytrynianu Wytwarzanie indolu Fermentacja inozytolu Fermentacja adonitolu Fermentacja trehalozy Fermentacja galaktozy Fermentacja ramnozy Fermentacja mannitolu

P. alcalifaciens P. stuartii P. rettgeri P. rustigianii P. heimbachae – + + – + – – – –

v + + + – + + – –

+ + + + + – + v +

– (–) + – – – + – –

– – – v + – + + –

+ 90–100% szczepów dodatnich; (+) 75–89,9 % szczepów dodatnich; v 25,1–74,9% szczepów dodatnich; (–) 10,1–25% szczepów dodatnich; – 0–10% szczepów dodatnich

BAKTERIE Z RODZAJU PROVIDENCIA – TAKSONOMIA, EPIDEMIOLOGIA, CHOROBOTWÓRCZOŒÆ

3. Epidemiologia i znaczenie kliniczne Providencia spp. Bakterie z rodzaju Providencia mog¹ wystêpowaæ poza organizmem cz³owieka. Czêsto spotykanym rezerwuarem tych bakterii s¹ owady, w tym muchy domowe, z których wyizolowano P. alcalifaciens, P. stuartii i P. rettgerii. Ten ostatni gatunek wyizolowano tak¿e z larw muchy Helaemyia petrolei wystêpuj¹cej na terenach wydobywania ropy naftowej. Bakterie z rodzaju Providencia wyizolowano te¿ z gadów i p³azów, u których wystêpuj¹ jako element flory naturalnej przewodu pokarmowego, stwierdzono ich obecnoœæ u wê¿y pytona i boa oraz u ¿mij, a tak¿e u krokodyli i ropuch. Z tych makroorganizmów izoluje siê najczêœciej P. rettgerii. Raczej okazjonalnie izoluje siê bakterie Providencia spp. od ptaków, wykryto je m.in. u dropa i soko³a. Znacznie czêœciej s¹ wykrywane w materia³ach od ssaków, izolowano je z psów, kotów, byd³a, owiec, œwinek morskich, u których stanowi¹ czêœæ flory naturalnej przewodu pokarmowego. Ponadto wystêpowanie P. rettgeri stwierdzono u obleñców, lwów morskich i fok, a tak¿e pingwinów [19] (o wystêpowaniu u tych ostatnich zwierz¹t P. heimbachae wspomniano wy¿ej). Bakterie z rodzaju Providencia mog¹ u organizmów zwierzêcych wywo³aæ szereg schorzeñ. Stwierdzono znaczenie P. alcalifaciens w wywo³ywaniu biegunek u psów, P. stuartii u noworodków byd³a, a P. rettgeri zaka¿eñ uogólnionych i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u krokodyli do 3-roku ¿ycia oraz zapalenia jamy ustnej u wê¿y [19]. Dotychczas opisano izolacjê Providencia spp. z nastêpuj¹cych materia³ów od ludzi: moczu, wymazu z gard³a, z krocza, pach, ran, ka³u, krwi [43]. Mocz i ka³ s¹ najczêstszym materia³em sk¹d izoluje siê Providencia spp. [19]. Bakterie te czêsto nie s¹ jedynym z izolowanych czynników zakaŸnych z badanego materia³u, s¹ wiêc przyczyn¹ infekcji mieszanych. W przypadku próbek moczu izoluje siê je najczêœciej razem z pa³eczkami z rodzaju Proteus i pa³eczkami Pseudomonas aeruginosa. Jak wykazano w serii 2-letnich badañ, czêstoœæ izolacji Providencia ssp. wœród Enterobacteriaceae wynosi 0,8–1,4%, przy czym 75% izolatów pochodzi z moczu. Trzeba te¿ dodaæ, i¿ tylko 39% tych izolatów mia³a udokumentowany, istotnie kliniczny zwi¹zek z zaka¿eniami [57]. Zaka¿enia dróg moczowych powoduje z najwiêksz¹ czêstoœci¹ P. stuartii u osób w podesz³ym wieku, przebywaj¹cych w domach opieki i poddawanych rehabilitacji po przebytych chorobach neurologicznych [32, 51, 67]. Czêstoœæ zaka¿eñ tymi bakteriami w tych grupach pacjentów mo¿e dochodziæ do 18% [19]. Najwa¿niejszym czynnikiem sprzyjaj¹cym zaka¿eniom dróg moczowych Providencia spp. a zw³aszcza

31

P. stuartii, tj. wystêpowania bakteriurii, jest d³ugotrwa³e cewnikowanie pacjentów. W badaniach porównawczych W a r r e n i wsp. [64] wykazali, i¿ ten gatunek by³ izolowany z moczu pacjentów kateteryzowanych z bardzo wysok¹ czêstoœci¹ – œrednio 40%. Zaka¿eniom P. stuartii mog¹ towarzyszyæ lub byæ ich nastêpstwem komplikacje oraz powik³ania – obstrukcja kateterów, ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek, ropieñ nerki, kamienie w pêcherzu lub nerkach, refluks pêcherzowo-moczowodowy, chroniczna niewydolnoœæ nerek i bakteriemia. Powik³ania i komplikacje zwi¹zane z infekcjami tymi bakteriami mog¹ prowadziæ nawet do œmierci [65]. Trzeba jednak dodaæ, ¿e nie wszystkie doniesienia wskazuj¹ jednoznacznie na tak znacz¹c¹ rolê P. stuartii w zaka¿eniach uk³adu moczowego u pacjentów poddanych cewnikowaniu [19]. P e n n e r i wsp. przeprowadzili w 1979 r. badania epidemiologiczne w 12 szpitalach (9 z terenu Kanady, 2 z USA i 1 z Anglii). Ustalili, i¿ zaka¿enia dróg moczowych pacjentów najczêœciej wywo³ywa³y szczepy P. stuartii zaliczane do serogrupy O63 (28,2% wszystkich izolatów). W obrêbie poszczególnych jednostek opieki medycznej stwierdzono przynale¿noœæ szczepów P. stuartii do 1, 2 serogrup, co wskazywa³o na rozprzestrzenianie siê tych bakterii miêdzy pacjentami danego oddzia³u. W 1981 P e n n e r i wsp. [48] ponownie opisali epizod zaka¿enia szpitalnego wywo³anego przez serotyp O63. Infekcja wystêpowa³a u pacjentów przewlekle cewnikowanych, pomimo, i¿ profilaktycznie osoby te poddawano zabiegowi p³ukania pêcherza neomycyn¹. Nie uda³o siê okreœliæ, w jaki sposób drobnoustrój ten rozprzestrzenia³ siê w obrêbie szpitala. Przypadki zaka¿eñ szpitalnych wywo³anych przez bakterie P. stuartii zaliczane do serotypu O63, wœród pacjentów wymagaj¹cych opieki geriatrycznej w szpitalu w Bristolu w Anglii, odnotowali te¿ H a w k e y i wsp. w 1982 [16]. Autorzy ci wykazali, ¿e pacjenci stanowi¹ rezerwuar bakterii na terenie szpitala i ¿e w wiêkszoœci przypadków kolonizacja uk³adu pokarmowego przez pa³eczki P. stuartii by³a Ÿród³em infekcji uk³adu moczowego. Tak¿e S t i c k l e r i wsp. [59] wskazywali na uk³ad pokarmowy cz³owieka jako na Ÿród³o infekcji szpitalnych P. stuartii, z drugiej strony podkreœlali jednak, ¿e znacznie czêœciej stwierdza siê obecnoœæ P. stuarii na skórze pacjentów w okolicy pachwin ni¿ w próbkach ka³u. Natomiast M u l l e r [38] stwierdzi³, ¿e uk³ad pokarmowy cz³owieka nie jest typow¹ nisz¹ ekologiczn¹ dla P. stuartii. Stwierdzenie to opar³ na wynika badañ mikrobiologicznych próbek ka³u pochodz¹cych zarówno od osób zdrowych jak i cierpi¹cych na infekcje pokarmowe. Nie wykaza³ w tych próbkach obecnoœci bakterii tego gatunku. Tak, wiêc œrodowisko bytowania oraz sposób rozprzestrzeniania siê tych bakterii w obrêbie jednostek opieki medycznej nie zosta³y do

32

AGNIESZKA MASZEWSKA, ALEKSANDRA B£ASZCZYK, GNIESZKA TORZEWSKA, ANTONI RÓ¯ALSKI

koñca wyjaœnione. Natomiast W h i t e l e y i wsp. [67] wykazali, ¿e przeniesienie pacjenta z jednego oddzia³u na drugi mog³o spowodowaæ rozprzestrzenienie siê infekcji uk³adu moczowego wywo³anej przez szczep P. stuartii nale¿¹cy do serogrupy O55. Znaczenie bakterii Providencia spp. zw³aszcza P. alcalifaciens jako patogenów wywo³uj¹cych zaka¿enia przewodu pokarmowego pocz¹tkowo ograniczano do subkontynentu indyjskiego [19]. PóŸniej zwrócono uwagê na przypadki biegunek powodowane przez te bakterie u osób podró¿uj¹cych do krajów œródziemnomorskich oraz u dzieci. Czêsto pa³eczki te s¹ jednym z kilku czynników etiologicznych tych biegunek, przewa¿nie wraz z enteropatogennymi i enterotoksycznymi szczepami E. coli oraz bakteriami z rodzaju Campylobacter i Aeromonas [1]. Pierwszy przypadek biegunki u 11-miesiêcznego dziecka, wywo³anej przez Providencia (wówczas Eberthella) alcalifaciens opisano w 1944 r. [43]. Kolejne badania, przeprowadzone w ró¿nych oœrodkach, potwierdzi³y znacznie tych bakterii jako czynnika etiologicznego zaka¿eñ przewodu pokarmowego, w tym biegunek [60]. Stwierdzono, i¿ wœród izolatów klinicznych przewa¿a³y szczepy zaliczane do serogrupy O3 [49]. W 1977 K h o l o d k o v a i wsp. [22] opisali przypadek ostrej infekcji pokarmowej wywo³anej przez szczep P. alcalifaciens zaliczony do serogrupy O2. Analizê zaka¿eñ przewodu pokarmowego u podró¿uj¹cych w rejon Morza Œródziemnego przeprowadzili H a y n e s i H a w k e y [17]. Badacze ci stwierdzili, i¿ pa³eczki P. alcalifaciens by³y odpowiedzialne za zaka¿enia u 10% pacjentów. Dla porównania czêstoœæ izolacji tych bakterii u chorych nie podró¿uj¹cych wynosi 1,3%. Szczegó³owe badania porównawcze czynników etiologicznych biegunek u dzieci poni¿ej 5 roku ¿ycia w Bangladeszu, wskaza³y na znacz¹cy udzia³ P. alcalifaciens w ich wywo³ywaniu. Warto jednak nadmieniæ, i¿ szczepy P. alcalifaciens by³y czêœciej izolowane obok innych patogenów, w tym wy¿ej ju¿ wymienionych E. coli, Campylobacter i Aeromonas, a tak¿e Vibrio cholerae, Shigella flexnerii oraz pierwotniaków Entamoeba histolytica i Giardia lamblia, ni¿ w postaci czystej kultury. Podobne wyniki otrzymano w badaniach przeprowadzonych w Sao Paulo w Brazylii. Wykaza³y one tak¿e znaczenie P. alcalifaciens w tym szczepów inwazyjnych w wywo³ywaniu biegunek [14]. Nale¿y te¿ wskazaæ na doniesienia nie potwierdzaj¹ce znaczenia P. alcalifaciens jako bakterii wywo³uj¹cej biegunki (np. zaka¿enia w Denver USA [13] w Braunschweig Niemcy [28]). Przedstawione wy¿ej doniesienia na temat zaka¿eñ P. alcalifaciens wskazuj¹ na ich zwi¹zek z okreœlonymi miejscami wystêpowania, najczêœciej z krajami o klimacie ciep³ym i gor¹cym. Nale¿y jednak w tym miejscu zwróciæ uwagê na zacieranie siê granic wystêpowania patogenów, ze wzglêdu na du¿¹ i zwiêkszaj¹c¹

siê z ka¿dym rokiem migracjê ludzi na œwiecie. W tym kontekœcie warto przytoczyæ ostatnie doniesienia o zaka¿eniach P. alcalifaciens w sto³ówce szkolnej w Fukui City w Japonii w 2001 r. [40] i w szpitalu polowym Armii Czeskiej stacjonuj¹cej w Turcji [6]). Pa³eczki Providencia mog¹ byæ te¿ czynnikiem etiologicznym bakteriemii, czêœciej u doros³ych mê¿czyzn ni¿ kobiet. Bakteriemia ta mo¿e wynikaæ, lub mo¿e towarzyszyæ schorzeniom typowym dla osób w starszym wieku – kardiologicznym, neurologicznym (stwardnienie rozsiane), zwi¹zanym z nadciœnieniem krwi, diabetyków. Najwa¿niejszymi czynnikami sprzyjaj¹cymi posocznicy spowodowanej Providencia sp. s¹ parali¿ i obstrukcja dróg moczowych [3]. 4. Czynniki chorobotwórczoœci Providencia spp. Do czynników wirulencji pa³eczek z rodzaju Providencia zalicza siê zdolnoœæ do adherencji do komórek nab³onkowych oraz w przypadku P. stuartii do powierzchni sztucznych, a tak¿e w³aœciwoœci inwazyjne typowe dla szczepów P. alcalifaciens, obecnoœæ lipopolisacharydu (endotoksyny), produkcjê ureazy przez czêœæ szczepów P. stuartii oraz wytwarzanie "-ketokwasów (na drodze deaminacji aminokwasów) pe³ni¹cych rolê sideroforów [19]. Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna), zbudowany z trzech regionów ró¿ni¹cych siê pod wzglêdem budowy chemicznej oraz funkcji biologicznych: lipidu A, rdzenia i czêœci O-swoistej, stanowi jeden z g³ównych sk³adników b³ony zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych [53]. Lipid A stanowi centrum aktywnoœci biologicznej endotoksyny, której dzia³anie prowadzi do uogólnionej wielonarz¹dowej niewydolnoœæ organizmu, która czêsto jest przyczyn¹ œmierci [54]. Zró¿nicowanie w budowie lipopolisacharydu (antygen O), obok rzêsek (antygen H) i otoczek (antygen K) jest podstaw¹ klasyfikacji serologicznej bakterii z rodzaju Providencia. Schemat typowania serologicznego bakterii P. alcalifaciens i P. stuartii opracowa³ w 1954 r. E w i n g i wsp. [7], obejmowa³ on 56 antygenów O, 28 typów antygenów H i 2 antygeny otoczkowe. PóŸniej liczbê antygenów O zwiêkszono do 62 [9], a nastêpnie do 63 po rekonstytuowaniu schematu Ewing’a przez P e n n e r a i wsp. [50]. Obejmuje on 17 serogrup O reprezentowanych przez szczepy P. stuartii oraz 46 serogrup O reprezentowanych przez szczepy P. alcalifaciens i P. rustigianii, gatunku, który wczeœniej zaliczano do P. alcalifaciens jako biogrupa 3. Oddzielny schemat typowania serologicznego P. rettgerii opracowali N a m i o k a i S a k a z a k i [41], obejmuje on 34 antygeny O, 26 antygenów H i 1 antygen K. Dotychczas podjêto badania podstaw molekularnych klasyfikacji serologicznej P. alcalifaciens

BAKTERIE Z RODZAJU PROVIDENCIA – TAKSONOMIA, EPIDEMIOLOGIA, CHOROBOTWÓRCZOŒÆ

i P. stuartii. Ich celem jest ustalenie struktury chemicznej antygenów O szczepów reprezentuj¹cych poszczególne serogrupy schematu Ewing’a i zidentyfikowanie w obrêbie tych antygenów epitopów wi¹¿¹cych swoiste przeciwcia³a anty-O. Wyniki tych badañ w odniesieniu do wybranych serogrup ilustruje Tabela III. Badane antygeny O okaza³y siê zawieraæ oprócz typowych sk³adników, wczeœniej wykrywanych w czêœciach O-swoistych LPS bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, tak¿e sk³adniki wczeœniej nie zidentyfikowane lub rzadko obecne. Do nich nale¿y zaliczyæ: 4-(N-acetyl-L-aspart-4-yl)amino-4,6-dideoksy-D-glukozê (DQui4N(AspAc) wykryt¹ w P. stuartii O4 [23] i O33 [61], N-g[(R/S)-1-karboksyetyl]-L-lizynê (alaninolizynê – AlaLys) zwi¹zan¹ z kwasem glukuronowym lub galakturonowym, odpowiednio w P. alcalifaciens O23 [62] i P. rustigianii O14 [24], 3-formamido-3,6-dideoksy-D-galaktozê (Fuc3Nfo) obecn¹ w P. alcalifaciens O21 [25], jak równie¿ aminokwasy – serynê, alaninê podstawiaj¹ce kwasy uronowe lub amino-deoksy-heksozy w LPS P. stuartii O43 [46] i O57 [26] oraz P. alcalifaciens O35 [55]. Niektóre z wymienionych rzadkich sk³adników wchodzi³y w sk³ad determinant antygenowych lub stanowi³y sk³adniki immunodominuj¹ce epitopów wi¹zanych przez swoiste surowice anty-O. Wykazano m.in. znaczenie D-Qui4N(AspAc) w swoistoœci LPS P. stuartii O4 i O33 [23,61], oraz immunodominuj¹c¹ rolê AlaLys w reakcji LPS P. rustigianii O14 [24] i P. alcalifiaciens O23 [62] z surowicami homologicznymi. Bliskie pokrewieñstwo bakterii z rodzaju Providencia z pa³eczkami Proteus znajduje te¿ odzwierciedlenie w reakcjach krzy¿owych pomiêdzy LPS tych bakterii i heterologicznymi surowicami anty-O. Znajomoœæ struktury chemicznej antygenów O tych bakterii pozwala na identyfikacje wspólnych epitopów odpowiedzialnych za te reakcje, co jest szczególnie istotne, kiedy planuje siê u¿yæ w praktyce epidemiologicznej schematów serologicznego typowania wspomnianych bakterii, czêsto wystêpuj¹cych w tym samym materiale klinicznym. Wspólny fragment trisacharydowy wystêpuje w antygenach O P. stuartii O18 i Proteus gatunku genomowego 4 [23] oraz P. alcalifaciens O21 i P. vulgaris O47 [25]. Wspólny sk³adnik D-Qui4N(AspAc) jest odpowiedzialny za reakcje krzy¿owe w uk³adach surowice anty-O-heterologiczne – LPS P. stuartii O33 i P. mirabilis O38 [61], a AlaLys za reaktywnoœæ krzy¿ow¹ P. alcalifaciens O23 i P. rustigianii O14, P. myxofaciens i P. mirabilis O13 [24, 62]. LPS form g³adkich bakterii Gram-ujemnych mo¿e warunkowaæ ich opornoœæ na dzia³ania surowicy. Badania P. rettgeri wykaza³y, ¿e s¹ wra¿liwe na czynniki obecne w surowicy tj. dope³niacz i lizozym [42]. Pa³eczki Providencia wytwarzaj¹ co najmniej trzy rodzaje fimbrii lub afimbriowych aglutynin. S¹ to:

33

1. fimbrie typu I, tj. fimbrie MS (mannose sensitive – mannozo-wra¿liwe), odpowiedzialne za aglutynacjê krwinek œwinki morskiej, aglutynacji hamowanej przez dodanie do œrodowiska mannozy; 2. mannozo-oporne fimbrie MR/P (mannose-resistant Proteus-like fimbriae), powoduj¹ce aglutynacjê erytrocytów ró¿nych gatunków zwierz¹t; 3. mannozo-oporne hemaglutyniny MR/K (mannose-resistant Klebsiella-like hemagglutinins), warunkuj¹ce aglutynacjê krwinek taninowanych [44, 45]. Ekspresjê fimbrii u uropatogennych bakterii mo¿na oceniano nie tylko na podstawie zdolnoœci do hemaglutynacji, ale równie¿ ich zdolnoœci do wi¹zania siê z nab³onkiem dróg moczowych czy te¿ z powierzchni¹ cewników urologicznych. Doniesienia o czêstoœci ekspresji ró¿nych rodzajów fimbrii u Providencia sp. s¹ niejednoznaczne. M o b l e y i wsp. [33] stwierdzili, i¿ szczepy izolowane z przypadków bakteriurii u osób starszych d³ugotrwale cewnikowanych silnie wi¹za³y siê do nab³onka dróg moczowych. Nie wykazano zaœ silnej korelacji pomiêdzy wystêpowaniem fimbrii typu I u tych szczepów (s³abe wi¹zanie bia³ka Tamma Horsfalla) a zjawiskiem adherencji, jak równie¿ czasem utrzymywania siê bakteriurii i intensywnoœci¹ procesu adhezji. Stwierdzono natomiast korelacjê pomiêdzy wystêpowaniem u szczepów P. stuartii fimbrii MR/K i przyleganiem do powierzchni cewników urologicznych oraz wystêpowaniem u pacjentów w d³u¿szym czasie bakteriurii. Fimbrie typu I wydaj¹ siê odgrywaæ wiêksz¹ rolê u szczepów wywo³uj¹cych bakteriuriê utrzymuj¹c¹ siê w krótkim okresie czasu [19, 33]. Badano te¿ wzajemne relacje pomiêdzy bakteriami P. stuartii i E. coli kolonizuj¹cymi razem cewniki urologiczne w œrodowisku sztucznego moczu. Ustalono liczbê bakterii obu gatunków przylegaj¹cych do cewnika i œrodowisku p³ynnym. Stwierdzono wiêksz¹ liczbê bakterii P. stuartii na cewniku, a E. coli w moczu [12]. Potwierdza to znaczenie fimbrii MR/K w przyleganiu bakterii do powierzchni sztucznych, choæ nie mo¿na wykluczyæ dzia³ania jeszcze innych czynników, warunkuj¹cych lepsze przyleganie do cewnika bakterii P. stuartii ni¿ pa³eczek E. coli. Szczepy uropatogenne P. stuartii i P. rettgeri wytwarzaj¹ enzym ureazê, rozk³adaj¹cy mocznik do amoniaku i dwutlenku wêgla. W efekcie dzia³ania tego enzymu podnosi siê pH œrodowiska, co prowadzi do krystalizacji wêglanu apatytu i struwitu, z których formuj¹ siê kamienie moczowe. Wymienione kryszta³y odk³adaj¹ siê na tak¿e na powierzchni cewników zmniejszaj¹c ich œwiat³o [19, 34]. Stwierdzono, i¿ 30% szczepów P. stuartii produkuje ureazê, u tych bakterii enzym ten jest indukowany przez mocznik [66]. Ureaza P. stuartii charakteryzuje siê mas¹ cz¹steczkow¹ 230 kDa i jest metaloproteinaz¹ zbudowan¹ z dwóch

34

AGNIESZKA MASZEWSKA, ALEKSANDRA B£ASZCZYK, GNIESZKA TORZEWSKA, ANTONI RÓ¯ALSKI

Ta b e l a I I I Struktura chemiczna polisacharydów O-swoistych (OPS) Providencia sp. (piœmiennictwo w tekœcie oraz O49 – [5]; O34 i O35 – [55], O30 – [27], O29 i O36 (dane nie opublikowane) Serogrupa O4

O14

O18 O21

O23

O29

O30 O33 O34

O35

O36

O43

O44

O47

O49 O57

Struktura chemiczna OPS $-D-Quip4N(Ac-L-Asp) 1 ↓ 6 →6)-$-D-Galp-(1→3)-$-D-GlcpNAc-(1→3)-$-D-Galp-(1→6)-$-D-GlcpNAc-(1→4)-"-D-GalNAc-(1→3)-"-D-GlcNAc-(1→3)-"-D-GalA-(1→ 6 ↑ 2 2S,8S-AlaLys →4)-$-D-Quip3NAc-(1→6)-"-D-GlcpNAc-(1→4)-$-D-GlcpA-(1→3)-"-D-GalpNAc-(1→ →4)-"-D-GalpNAc-(1→4)-"-D-GalpNAc-(1→3)-$-D-GalpNAc-(1→3)-"-D-GalpA-(1→ 4 ↑ 1 "-D-Fucp3NFo →4)-"-D-GalNAc-(1→3)-"-D-GlcNAc-(1→3)-"-D-GalA-(1→ 6 ↑ 2 2S,8S-AlaLys →3)-"-L-FucpNAc(1→3)-"-D-GlcpNAc(1→6)-"-D-GlcpNAc(1→ 4 ↑ "-D-Glcp →4)-$-D-GlcpAN-(1→4)-$-D-GlcpAN-(1→3)-"-D-FucpNAc4N-(1→ →2)-$-D-Quip4NFm-(1→2)-$-D-Ribf4-(1→ →6)-"-D-GlcpNAc-(1→4)-"-D-GalpA-(1→3)-"-D-GlcpNAc-(1→3)-$-D-Quip4N(Ac-D-Asp)-(1→ →4)-"-L-Fucp-(1→2)-$-D-Glcp-(1→3)-$-D-GlcpNAc-(1→4)-$-D-GlcpA-(1→4)"-L-Fucp-(1→2)-"D-Man-(1→ 3 ↑ "-GalpNAc →4)-$-D-GlcA (1→3)-$-D-GalNAc-(1→3)-"-D-GalNAc-(1→6)-"-D-Glc-(1→ 6 ↑ $-Qui4N-L-Ala-L-Ala →3)-"-L-6dTalp-(1→3)-"-D-GlcpNAc-(1→7)-$-Kdop-(2→ 2  OAc (~ 80%) →4)-$-D-GlcA-(1→3)-$-D-GalA-(1→3)-$-D-GlcNAc-(1→2)-"-D-Rha4NAc-(1→ 6 ↑ L-Ser →3)-"-L-Fuc-(1→3)-"-D-Glc-(1→4)-"-L-Qui-(1→3)-"-D-GlcNAc-(1→4)-"-D-GalNAc-(1→ 4 ↑ $-D-GlcA "-L-Rhap 1 ↓ 3 →3)-"-D-GlcpNAc-(1→2)-$-D-Galp-(1→4)-$-D-Manp-(1→3)-$-D-Manp-(1→4)-$-D-GlcpA-(1→ →6)-$-D-Galp-(1→3)-$-D-GalNpAc-(1→3)-"-Galp(1→ →3)-$-D-GlcNAc-(1→2)-"-D-Gal-(1→3)-"-L-Rha-(1→4)-"-D-Glc-(1→4)-"-D-GalA-(1→ 6 ↑ L-Ala

BAKTERIE Z RODZAJU PROVIDENCIA – TAKSONOMIA, EPIDEMIOLOGIA, CHOROBOTWÓRCZOŒÆ

podjednostek, z których ka¿da sk³ada siê z trzech polipeptydów a 73 kDa, b 10 kDa, g 9 kDa. Strukturê enzymu ureazy P. stuartii mo¿na zapisaæ w nastêpuj¹cej formule ("1, $2, (2)2. Na ka¿d¹ podjednostkê "1, $2, (2 ureazy tych bakterii przypadaj¹ dwa atomy niklu, tworz¹ce wi¹zania koordynacyjne z resztami aminokwasowymi podjednostek [34, 39]. Ureaza P. stuartii jest kodowana plazmidowo, zaœ P. rettgerii chromosomalnie, enzym ten u tych dwóch bakterii charakteryzuje siê du¿ym podobieñstwem, co wykazano pos³uguj¹c siê metod¹ hybrydyzacji DNA [10, 35]. Mniejsz¹ homologiê wykazano natomiast porównuj¹c ureazê tych dwóch bakterii i P. mirabilis. Nie stwierdzono homologii pomiêdzy ureaz¹ Providencia ssp. oraz P. vulgaris, M. morganii i K. pneumoniae [21]. J o h n s o n i wsp. [20], pos³uguj¹c siê modelem mysim i szczurzym zbadali przebieg zaka¿enia dróg moczowych dwoma szczepami P. stuartii ró¿ni¹cymi siê ekspresj¹ czynników chorobotwórczoœci. U¿yto szczepu HO wytwarzaj¹cego ureazê, fimbrie i wykazuj¹cego zdolnoœci do przylegania do nab³onka dróg moczowych oraz szczepu RO nie posiadaj¹cego tych cech. Stwierdzono, i¿ szczep HO wykazywa³ silniejsz¹ zdolnoœæ do zasiedlania pêcherza i nerek, ponadto w nastêpstwie infekcji tym szczepem obserwowano ostre zapalenia miedniczek nerkowych oraz œródmi¹¿szowe zapalenia nerek z uszkodzeniem tkanek. Bakterie szczepu RO wyizolowano z moczu, pêcherza i nerek zwierz¹t doœwiadczalnych w znacznie mniejszej liczbie w porównaniu ze szczepem HO. Stwierdzono, i¿ przebieg infekcji u myszy wywo³anej przez szczep HO P. stuartii by³ bardzo podobny do przebiegu zaka¿enia tych zwierz¹t przez uropatogenny szczep E. coli. W obu przypadkach wyizolowano zbli¿on¹ liczbê bakterii z moczu i narz¹dów uk³adu moczowego oraz obserwowano podobne zmiany histologiczne [15]. Mechanizmy inwazji przez bakterie P. alcalifaciens i P. rustigianii nab³onka jelita nie zosta³y w pe³ni wyjaœnione. Wykazano zdolnoœæ tych bakterii do inwazji m.in. komórek HEp2 (ludzki rak krtani), HeLa (ludzki rak szyjki macicy), Caco-2 (ludzki nab³onek raka okrê¿nicy) i Vero (fibroblasty nerki ma³py zielonej afrykañskiej) [19, 43]. Proces penetracji zapewne jest poprzedzony adherencj¹ do komórek eukariotycznych, warunkowan¹ obecnoœci¹ na tych bakteriach hemaglutynin MR/K i fimbrii MR/P lub MS (typu I). Nie wyjaœniono jednak ich rzeczywistego udzia³u w procesie przylegania do nab³onka [45]. Obserwacje mikroskopowe wskazuj¹ na to, i¿ zjawisko inwazyjnoœci przebiega na drodze endocytozy. Proces inwazji komórek nab³onkowych przez P. alcalifaciens zachodzi z udzia³em mikrofilamentów komórkowych, a penetracja nie przebiega na drodze endocytozy zale¿nej od receptorów, jest te¿ niezale¿na od kwaœnego œrodowiska endosomów [2]. Obserwacje w mikroskopie elektronowym

35

wykaza³y obecnoœæ bakterii zwi¹zanych z powierzchni¹ enterocytów w miejscach pozbawionych mikrokosmków oraz wyd³u¿one, uszkodzone i zwakuolizowane mikrokosmki. W pobli¿u bakterii przylegaj¹cych do b³ony komórkowej w cytoplazmie komórek widoczna by³a polimeryzacja komponentów cytoszkieletu, bakterie by³y rozmieszczone zarówno w cytoplazmie jak i w wakuolach. Przedstawione obserwacje wskazuj¹ na podobieñstwa procesu penetracji nab³onka jelitowego u Providencia sp. i Shigella sp. Opisano tak¿e drugi sposób wnikania bakterii P. alcalifaciens do warstwy nab³onka jelitowego, polegaj¹cy na niszczeniu po³¹czeñ miêdzykomórkowych i wnikaniu pomiêdzy enterocyty. Ten mechanizm wnikania jest podobny do penetracji enterocytów przez Salmonella enterica sv. Typhimurium. Mechanizm niszczenia po³¹czeñ miêdzykomórkowych przez P. alcalifaciens i wnikania pomiêdzy enterocyty nie jest wyjaœniony [21]. Pos³uguj¹c siê modelem szczurzym wykazano mo¿liwoœci przemieszczania siê bakterii P. alcalifaciens ze œwiat³a jelita do mezenterialnych wêz³ów ch³onnych œledziony oraz w¹troby [63]. Dotychczas w literaturze mo¿na znaleŸæ sprzeczne dane dotycz¹ce miejsca kodowania w³aœciwoœci inwazyjnych P. alcalifaciens. Badania M a g a l h a e s i wsp. [29] oraz M u r a t y i wsp. [40] wskazywa³y na zale¿noœæ pomiêdzy posiadaniem przez P. alcalifaciens plazmidów okreœlonej wielkoœci i zdolnoœci¹ do inwazji komórek Caco-2 i HeLa. Inni badacze [14, 46] nie potwierdzili tych obserwacji i przedstawili dane przemawiaj¹ce za umiejscowieniem tych genów na chromosomie. Próby uzyskania mutantów nieinwazyjnych P. alcalifaciens powiod³y siê niedawno [52]. Niezdolne do wnikania do linii Hep2 mutanty transpozonowe tych bakterii nie wytwarza³y, wydzielanego do œrodowiska, bia³ka o masie cz¹steczkowej 28 kDa. Mo¿na wiêc przypuszczaæ, i¿ bia³ko to jest jednym z produktów bakterii warunkuj¹cych inwazyjnoœæ. Autorzy tej pracy w Zak³adzie Immunobiologii Bakterii U£ podjêli kompleksowe badania cech i mechanizmów chorobotwórczoœci P. stuartii i P. alcalifcaciens. Wstêpne wyniki tych badañ potwierdzi³y m.in. w³aœciwoœci inwazyjne i cytotoksyczne pa³eczek P. alcaifaciens [30], nie stwierdzono tych cech u bakterii P. stuartii, które wykaza³y bardzo du¿e zdolnoœci do przylegania do cewników urologicznych, silniejsze od innych badanych uropatogenów [3]. 5. Podsumowanie Bakterie z rodzaju Providencia, odkryte w latach 40-tych ubieg³ego wieku, przez pewien okres czasu pozostawa³y jakby w cieniu innych patogenów z rodziny Enterobacteriaceae. Wywo³ywa³y one zaka¿enia

36

AGNIESZKA MASZEWSKA, ALEKSANDRA B£ASZCZYK, GNIESZKA TORZEWSKA, ANTONI RÓ¯ALSKI

jelitowe na ograniczonych obszarach (P. alcalifaciens) lub by³y (jednym z wielu) czynnikiem etiologicznym zaka¿eñ dróg moczowych (P. stuartii, P. rettgerii). Znacznie ¿ywsze zainteresowanie tymi patogenami obserwujemy od kilku lat. Wynika to z wiêkszego znaczenia P. alcalifaciens jako bakterii bêd¹cych przyczyn¹ biegunek u podró¿uj¹cych oraz P. stuartii, pa³eczek wywo³uj¹cych zaka¿enia uk³adu moczowego o osób kateteryzowanych, zw³aszcza w podesz³ym wieku. Te dwa fakty w powi¹zaniu, z nie poruszonym w tym artykule problemem opornoœci szczepów, zw³aszcza szpitalnych sprawiaj¹, i¿ konieczne wydaje siê byæ podjêcie szerszych, bardziej gruntownych badañ czynników odpowiedzialnych za infekcje tymi bakteriami. W artykule wspomniano o kilku potencjalnych cechach chorobotwórczoœci – trzech rodzajach wytwarzanych fimbrii, zdolnoœci do przylegania, w³aœciwoœciach inwazyjnych, LPS oraz niewra¿liwoœci na dzia³anie dope³niacza. Ekspresja tych cech u szczepów chorobotwórczych, ale tak¿e ich kodowanie genetyczne oraz rzeczywiste znaczenie w chorobotwórczoœci powinny byæ objête szerszymi badaniami. Podjêcia w przysz³oœci kompleksowych badañ wymagaj¹ tak¿e w³aœciwoœci cytotoksyczne P. alcalifaciens oraz zdolnoœæ P. stuartii do tworzenia biofilmu, zarówno wtedy gdy bakterie te rosn¹ w czystej kulturze, jak i wspólnie z innymi bakteriami.

Piœmiennictwo 1. Albert M.J., Faruque A.S.G., Mahalanabis D.: Association of Providencia alcalifaciens with diarrhea in children. J. Clin. Microbiol. 36, 1433–1435 (1998) 2. Albert M.J., Ansaruzzaman M., Bhuiyan N.A., Neogi P.K.B., Faruque A.S.G.: Characteristics of invasion of HEp-2 cells by Providencia alcalifaciens. J. Med. Microbiol. 42, 186–190 (1995) 3. B³aszczyk A.: W³aœciwoœci adhezyjne i inwazyjne szczepów Providencia stuartii wyizolowanych z cewników urologicznych. Rozprawa Doktorska. Uniwersytet £ódzki, 2005 4. Brenner D.J., Farmer III J.J., Fanning G.R., Steigerwalt A.G., Klykken P., Wathen H.G., Hickman F.W., Ewing W.H.: Deoxyribonucleic acid relatedness of Proteus and Providencia species. Int. J. Syst. Bacteriol. 28, 269–282 (1978) 5. Bushmarinov I.S., Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Blaszczyk A., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A.: Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii O49. Carbohydr. Res. 339, 1557–1560 (2004) 6. Chlibek R., Jirus J., Beran J.: Diarrhea outbreak among Czech Army field hospital personnel caused by Providencia alcalifaciens. J. Travel Med. 9, 151–152 (2002) 7. Ewing W.H., Tanner K.E., Dennard D.A.: The Providence group: an intermediate group of enteric bacteria. J. Infect. Dis. 94, 134–140 (1954) 8. Ewing W.H.: The tribe Proteeae: its nomenclature and taxonomy. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. 12, 93–102 (1962)

9. Ewing W.H.: The Tribe Proteae. (w): Identification of Enterobacteriaceae red. P.R. Edwards, Elsevier, New York, 1986, s. 454–459 10. Farmer III J.J., Hickman F.W., Brenner D.J., Schreiber M., Rickenbach D.G.: Unusual Enterobacteriaceae: “Proteus rettgeri” that “change” into Providencia stuartii. J. Clin. Microbiol. 6, 373–378 (1977) 11. Farmer III J.J., Davis B.R., Hickman-Brenner F.W., McWhorter A., Huntley-Carter G.P., Asbury M.A., Riddle C., Wathen-Gardy H.G., Elias C., Fanning G.R., Steigerwalt A.G., O’Hara C.M., Morris G.K., Smith P.B., Brenner D.J.: Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21, 46–76 (1985) 12. Fletcher M., Oppenheimer S.R., Warren J.W.: Colonization of urinary catheters by Escherichia coli and Providencia stuartii in a laboratory model system. J. Urol. 152, 232–236 (1994) 13. Graber C.D., Lincoln A.F.: Infantile diarrhea in the Denver area: significance of Proteus-Providencia organism. Pediatrics, 16, 585–589 (1995) 14. Guth B.E.C., Perrella E.: Prevalence of invasive ability and other virulence-associated characteristics in Providencia alcalifaciens strains isolated in Sao Paulo, Brazil. J. Med. Microbiol. 45, 459–462 (1996) 15. Hagberg L., Engberg I., Freter R., Lam J., Olling S., Edén.: Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect. Immun. 40, 273–283 (1983) 16. Hawkey P.M., Penner J.L., Potten M.R., Stephens M., Barton L.J., Speller D.C.E.: Prospective survey of fecal, urinary tract and environmental colonization by Providencia stuartii in two geriatric wards. J. Clin. Microbiol. 16, 422–426 (1982) 17. Haynes J., Hawkey P.M.: Providencia alcalifaciens and travellers’ diarrhea. BMJ, 299, 94–95 (1989) 18. Hickman-Brenner F.W., Farmer III J.J., Steigerwalt A.G., Brenner D.J.: Providencia rustigianii: a new species in the familiy Enterobacteriaceae formerly known as Providencia alcalifaciens biogroup 3. J. Clin. Microbiol. 17, 1057–1060 (1983) 19. Janda J.M., Abbot S.L.: The Enterobacteriaceae, ASM Press, Washington, 2006, s. 279–299 20. Johnson D.E., Lockatell C.V., Hall-Craigs M., Mobley H.L.T., Warren J.W.: Uropathogenicity in rats and mice of Providencia stuartii from long-term catheterized patients. J. Urol. 138, 632–635 (1987) 21. Jones B.D., Mobley H.L.T.: Genetic and biochemical diversity of ureases of Proteus, Providencia and Morganella species isolated from urinary tract infection. Infect. Immun. 55, 2198–2203 (1987) 22. Kholodkova E.V., Kriukov I.M., Baturo A.P., Lifshit M.B., Glebovskaia M.A.: Etiologic role of bacteria of the genus Providencia in acute intestinal diseases. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 12, 20–23 (1977) 23. Kocharova N.A., Torzewska A., Zatonsky G.V., Blaszczyk A., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A. Rozalski A.: Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii O4 containing 4-(N-acetyl-L-aspart-4-yl) amino-4,6-dideoxy-Dglucose. Carbohydr. Res. 339, 195–200 (2004) 24. Kocharova N.A., Zatonsky G.V., Torzewska A., Macieja Z., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A.: Structure of the O-specific polysaccharide of Providencia rustigianii O14 containing Ne-[(S)-1-carboxyethyl]-Na-(Dgalacturonoyl)-L-lysine. Carbohydr. Res. 338, 1009–1016 (2003)

BAKTERIE Z RODZAJU PROVIDENCIA – TAKSONOMIA, EPIDEMIOLOGIA, CHOROBOTWÓRCZOŒÆ

25. Kocharova N.A., Maszewska A., Zatonsky G.V., Bystrova OV., Ziolkowski A., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A.: Structure of the O-polysaccharide of Providencia alcalifaciens O21 containing 3-formamido-3,6-dideoxy-D-galactose. Carbohydr. Res. 338, 1425–1430 (2003) 26. Kocharova N.A., Bushmarinov I.S., Ovchinnikova O.G., Toukach F.V., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A.: The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii O57. Carbohydr. Res. 340, 775–780 (2005) 27. Kocharova N.A., Ovchinnikova O.G., Torzewska A., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Rozalski A.: The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia alcalifaciens O30. Carbohydr. Res. 341, 786–790 (2006) 28. Kocharova N.A., B³aszczyk A., Zatonsky G.V., Torzewska A., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knire, Y.A., Rozalski A.: Structure and cross-reactivity of the O-antigen of Providencia stuartii O18 containing 3-acetamido-3,6-dideoxy-D-glucose. Carbohydr. Res. 339, 409–413 (2004) 29. Magalhaes V., Leal N.C., Melo V.M., Sobreira M., Magalhaes M.: Invasion of HeLa cells by Providencia alcalifaciens presumably is plasmid-encode. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 91, 767–768 (1996) 30. Maszewska A.: Charakterystyka zjawiska inwazyjnoœci oraz w³aœciwoœci cytotoksycznych enteropatogennych szczepów Providencia alcalifaciens. Rozprawa Doktorska. Uniwersytet £ódzki, 2005 31. Mathan M.M., Mathan V.I., Albert M.J.: Electron microscopic study of the attachment and penetration of rabbit intestinal epithelium by Providencia alcalifaciens. J. Pathology 171, 67–71 (1993) 32. McHale P.J., Walker F., Scully B., English L., Keane C.T.: Providencia stuartii infections: a review of 117 cases over an eight year period. J. Hosp. Infect. 2, 155–165 (1981) 33. Mobley H.L.T., Chippendale G.R., Tenney J.H., Mayrer A.R., Crips L.J., Penner J.L., Warren J.W.: MR/K hemagglutination of Providencia stuartii correlates with adherence to catheters and with persistence in catheter-associated bacteriuria. J. Infect. Dis. 157, 264–271 (1988) 34. Mobley H.L.T., Hausinger R.P.: Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiol. Rev. 53, 85–108 (1989) 35. Mobley H.L.T., Chippendale G.R., Fraiman M.H., Tenney J.H., Warren J.W.: Variable phenotypes of Providencia stuartii due to plasmid-encoded traits. J. Clin. Microbiol. 22, 851–853 (1985) 36. Muller H.E.: Providencia friedericiana, a new species isolated form penguins. Int. J. Syst. Bacteriol. 33, 709–715 (1983) 37. Muller H.E., O’Hara C.M., Fanning G.R., Hickman-Brenner F.W., Swenson J.M., Brenner D.J.: Providencia heimbachae, a new species of Enterobacteriaceae isolated from animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 252–256 (1986) 38. Muller H.E.: Occurrence and pathogenic role of MorganellaProteus-Providencia group bacteria in human feces. J. Clin. Microbiol. 23, 404–405 (1986) 39. Mulrooney S.B., Lynch M.J., Mobley H.L.T., Hausinger R.P.: Purification, characterization and genetic organization of recombinant Providencia stuartii urease expressed by Escherichia coli. J. Bacteriol. 170, 2202–2207 (1988) 40. Murata T., Iida T., Shiomi Y., Tagomori K., Akeda Y., Yanagihara I., Mushiake S., Ishiguro F., Honda T.: A large outbreak of foodborne infection attributed to Providencia alcalifaciens. J. Infect. Dis. 184, 1050–155 (2001) 41. Namioka S., Sakazaki R.: Etude sur les Retgerella. Ann.Inst. Pasteur (Paris), 94, 485–499 (1958)

37

42. Nawrot U., Mokracka-Latajka G., Grzybek-Hryncewicz J., Krzy¿anowska B., Jankowski S.: Bactericidal activity of normal human serum against Morganella, Proteus and Providencia strains. Acta Microbiol. Polon. 44, 55–61 (1995) 43. O’ Hara Mohr C., Brenner F.W., Miller J.M.: Classification, identification, and clinical significance of Proteus, Providencia, and Morganella. Clin. Microbiol. Rev. 13, 534–546 (2000) 44. Old D.C., Adegbola R.A.: Hemagglutinins and fimbriae of Morganella, Proteus and Providencia. J. Med. Microbiol. 15, 551–564 (1982) 45. Old D.C., Scott S.S.: Hemagglutinins and fimbriae of Providencia spp. J. Bacteriol. 146, 404–408 (1981) 46. Ovchinnikova O.G., Kocharova N.A., Torzewska A., Blaszczyk A., Shashkov A.S, Knirel Y.A., Rozalski A.: The structure of the O-polysaccharide from the lipopolysaccharide of Providencia stuartii O43 containing an amide of D-galacturonic acid with L-serine. Carbohydr. Res. 340, 1407–1411 (2005) 47. Penner J.L., Hinton N.A., Duncan I.B.R., Hennessy J.N., Whiteley G.R.: O serotyping of Providencia stuartii isolates collected from twelve hospitals. J. Clin. Microbiol. 9, 1–14 (1979) 48. Penner J.L., Hinton N.A., Hamilton L.J., Hennessy J.N.: Three episodes of nosocomial urinary tract infections caused by one O-serotype of Providencia stuartii. J. Urol. 125, 668–671 (1981) 49. Penner J.L., Fleming P.C., Whitey G.R., Hennessy J.N.: O-serotyping Providencia alcalifaciens. J. Clin. Microbiol. 10, 761–765 (1979) 50. Penner J.L., Hinton N.A., Hennesy J.N., Whitley G.: Reconstitution of the somatic (O) antigenic scheme for Providencia and preparation of O-typing antisera. J. Infect. Dis. 133, 283–292 (1976) 51. Rahav G., Pinco E., Silbaq F., Bercovier H.: Molecular epidemiology of catheter-associated bacteriuria in nursing home patients. J. Clin. Microbiol. 32, 1031–1034. (1994) 52. Rahman M., Monira S., Nahar S., Ansaruzzaman M., Alam K., Alam M., Albert M.J.: TnphoA mutants of Providencia alcalifaciens with altered invasiveness of HEp-2 cells. J. Med. Microbiol. 51, 682–686 (2002) 53. Ró¿alski A.: Lipopolisacharyd bakterii Gram-ujemnych – struktura chemiczna, aktywnoœæ biologiczna i znaczenie w chorobotwórczoœci. I. Struktura chemiczna i w³aœciwoœci fizyko-chemiczne lipopolisacharydów, Post. Mikrobiol. 34, 289–315 (1995) 54. Ró¿alski A., Torzewska A., Bartodziejska B., Babicka D., Kwil I., Perepelov A.V., Kondakova A.N., Senchenkova S.N., Knirel Y.A., Vinogradov E.V.: Struktura chemiczna, swoistoœæ antygenowa znaczenie w chorobotwórczoœci lipopolisacharydu (LPS, endotoksyna) na przyk³adzie bakterii Proteus vulgaris. Wiadomoœci Chem. 56, 585–604 (2002) 55. Ró¿alski A., Kocharova N.A., Torzewska A., Bystrova O.V., B³aszczyk A., Ovchinnikova O.G., Maszewska A., Bushmarinov I.S., Wykrota M., Shashkov A.S., Knirel Y.A.: Molecular basis of the serological classification of bacteria from the genus Providencia. Materia³y Naukowe VIII Konferencji „Biologia Molekularna w diagnostyce i biotechnologii”, SSGW Warszawa, 2005, s. 110–113 56. Sobreira M., Leal N.C., Magalhaes M., Guth B.E.C., Almeida A.M.P.: Molecular analysis of clinical isolates of Providencia alcalifaciens. J. Med. Microbiol. 50, 29–34 (2001) 57. Solberg C., Matsen J.M.: Infections with providence bacilli. A clinical and bacteriologic study. Am. J. Med. 50, 241–246 (1971) 58. Somvanshi V.S., Lang E., Straubler B., Sproer C., Shuman P., Ganguly S., Saxena A.K., Stackebrand E.: Providencia

38

AGNIESZKA MASZEWSKA, ALEKSANDRA B£ASZCZYK, GNIESZKA TORZEWSKA, ANTONI RÓ¯ALSKI

vermicola sp. nov., isolated form infvective juveniles of entomopatghogenic nematode Steinernema thermopilum. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 629–633 (2006) 59. Stickler D., Fawcett C., Chawla J.C.: Providencia stuartii: a search for its natural habitat. J. Hosp. Infect. 6, 221–223 (1985) 60. Stuart C.A., Wheeler K.M., McGann V.: Further studies on one anaerogenic paracolon organism, type 29911. J. Bacteriol. 52, 431–438 (1946) 61. Torzewska A., Kocharova N.A., Zatonsky G.V., Blaszczyk A., Bystrova O.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A, Rozalski A.: Structure of the O-polysaccharide of Providencia stuartii O33 containing 4-(N-acetyl-D-aspart-4-yl)amino-4,6-dideoxy-Dglucose. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 41, 133–139 (2004) 62. Torzewska A., Kocharova N.A., Maszewska A., Knirel Y.A., Rozalski A.: Serological characterization of the O-specific polysaccharide of Providencia alcalifaciens O23. Arch. Immunol. Therap. Exp. 52, 43–49, (2004) 63. Veira A.B.R., Koh I.H.J., Guth B.E.C.: Providencia alcalifaciens strains translocate from the gastrointestinal tract and

are resistant to lytic activity of serum complement. J. Med. Microbiol. 52, 633–636 (2003) 64. Warren J.W.: Providencia stuartii: a common cause of antibiotic-resistant bacteriuria in patients with long-term indwelling catheters. Rev. Infect. Dis. 8, 61–67 (1986) 65. Warren J.W., Tenney J.H., Hoopes J.M., Muncie H.L., Anthony W.C.: A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. J. Infect Dis. 146, 719–723 (1982) 66. Weissfeld A.S., McNamara A.M., Tesh V.L., Howard B.J. Enterobacteriaceae (w) Clinical and pathogenic microbiology. red.: Howard B.J., Keiser J., Smith T., Weissfeld A.S., Tilton R., Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, 1994, s. 299–337 67. Whiteley G.R., Penner J.L., Stewart I.O., Stokan P.C., Hinton N.A.: Nosocomial urinary tract infections caused by two O-serotypes of Providencia stuartii in one hospital. J. Clin. Microbiol. 6, 551–554 (1977) Praca naukowa finansowana ze œrodków na naukê w latach 2006–2008 jako projekt badawczy Nr 401 111 31/2542

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 39–47 http://www.pm.microbiology.pl

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – TAKSONOMIA, CHARAKTERYSTYKA, CZYNNIKI WIRULENCJI I METODY IDENTYFIKACJI Anna Michalska, Eugenia Gospodarek Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Miko³aja Kopernika w Toruniu, [email protected] Wp³ynê³o w marcu 2006 r.

1. Wstêp. 2. Pochodzenie, taksonomia i gatunki pa³eczek Enterobacter spp. 3. Ogólna charakterystyka rodzaju Enterobacter. 3.1. Morfologia, hodowla i metabolizm. 3.2. W³aœciwoœci biochemiczne rodzaju. 3.3. Budowa antygenowa i czynniki wirulencji. 4. Wystêpowanie pa³eczek Enterobacter spp. 5. Metody identyfikacji i typowania pa³eczek Enterobacter spp. 5.1. Metody oparte na fenotypowaniu. 5.2. Metody oparte o techniki biologii molekularnej. 6. Podsumowanie Enterobacter spp. bacteria – the taxonomy, characteristics, virulence factors and the methods for identification Abstract: Enterobacter cloacae is part of the normal flora of the gastrointestinal tract of 40 to 80% of people and is widely distributed in the environment. Species of the genus Enterobacter spp. are opportunistic pathogens and are capable of causing opportunistic infections in hospitalized patients. There are 14 known species or biogrups of Enterobacter among which E. cloacae, E. aerogenes and E. sakazakii are the most freqently isolated species. They can be isolated from urine, sputum, respiratory tract, pus and occasionally from blood and spinal fluid. There is lack of knowledge about the factors influencing their pathogenicity and virulence. They posses endotoxin LPS, capsula, type 1 fimbriae, enterotoxins like ST I and LT I from E. coli and are able to produce bacteriocins, aerobactin, enterobactin, yersiniabactin. Enterobacter spp. grow rapidly on typical enteric media, strains from environmental sources at temperature of 20–30°C and from clinical sources at temperature of 37°C. All E. sakazakii strains are usually yellow pigmented. Biochemical reactions differ widely among the species. E. cloacae strains are positive for arginine dihydrolase and ornithine decarboxylase. Biotyping, serotyping (by use of O and H and occasionally capsular antigens), phage typing, an antibiotic susceptibility typing and genotyping methods such RAPD-PCR, AP-PCR, REP-PCR, ERIC-PCR, PFGE, ribotyping and sequencing may be used as epidemiological markers for Enterobacter strains. 1. Introduction. 2. Origin, taxonomy and the species of Enterobacter spp. genus. 3. General characteristics of genus Enterobacter spp. 3.1. Morphology, culture and metabolism. 3.2. Biochemical properties of the genus. 3.3. Antigenic structure and factors associated with resistance. 4. Occurrence of Enterobacter spp. 5. Identyfication end epidemiologic typing of Enterobacter spp. strains. 5.1. Phenotypic techniques. 5.2. Molecular biology methods. 6. Summary S³owa kluczowe: Key words:

1. Wstêp Pa³eczki rodzaju Enterobacter nale¿¹ do bakterii Gram-ujemnych rodziny Enterobacteriaceae. Pocz¹wszy od lat 80. XX wieku, zaobserwowano wzrastaj¹c¹ liczbê zaka¿eñ tymi bakteriami i uznano je, obok pa³eczek Klebsiella spp. i Serratia spp., za jeden z wa¿nych czynników etiologicznych zaka¿eñ uk³adowych, g³ównie u chorych leczonych w warunkach szpitalnych [21, 62]. Zaka¿enia te maj¹ czêsto charakter endogenny i rozwijaj¹ siê po wczeœniejszej kolonizacji chorego szczepami szpitalnymi, a œmiertelnoœæ z ich powodu, zw³aszcza u pacjentów oddzia³u intensywnej terapii, jest doœæ wysoka i wynosi do 87% [40, 41, 65]. St¹d, niezmiernie wa¿ne jest dog³êbne poznanie tych drobnoustrojów.

2. Pochodzenie, taksonomia i gatunki pa³eczek Enterobacter spp. Nazwa rodzaju Enterobacter pochodzi z jêzyka greckiego od s³ów „enteron” – jelitowy, „bacter” – bakteria i oznacza bakteriê jelitow¹. Nazwa rodzaju zosta³a zaproponowana w 1960 roku, jednak jego historia siêga koñca XIX wieku. W 1885 roku E s c h e r i c h wyizolowa³ z mleka pa³eczkê, któr¹ nazwa³ Bacillus lactis aerogenes. Po raz pierwszy bakterie zosta³y dok³adniej opisane przez J o r d a n a w 1890 r. [wg 7, 67]. Pierwsze informacje dotycz¹ce rodzaju Enterobacter pojawi³y siê w VII edycji Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology wydanej w 1957 roku [7]. Wówczas nazwa Enterobacter jeszcze nie istnia³a, ale wydanie to zamieszcza³o informacje na temat rodzaju

40

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

Aerobacter, obejmuj¹cego A. aerogenes i A. cloacae oraz na temat rodzaju Paracolobactrum, który aktualnie zawiera E. aerogenes, E. cloacae i Hafnia alvei [7]. Nazwa pa³eczek ulega³a wielokrotnie zmianom i opisywano je jako Bacillus aerogenes (K r u s e, 1896 r.), Aerobacter aerogenes (B e i j e r i n c k, 1900 r.), Cloaca (C a s t e l l a n i i C h a l m e r s, 1919 r.) [7, 67]. W latach 60. ubieg³ego wieku, gatunki rodzaju Enterobacter mia³y kilka synonimów: Aerobacter cloacae, Aerobacter A, Cloaca A (obecnie E. cloacae), Aerobacter aerogenes, Aerobacter B, Cloaca B (obecnie E. aerogenes), Enterobacter liquefaciens, Aerobacter C (obecnie Serratia liquefaciens), Enterobacter hafniae, Enterobacter alvei (obecnie H. alvei) [7, 67]. Powodowa³o to wiele zamieszania w systematyce i taksonomii bakterii. W kolejnych latach nast¹pi³y istotne zmiany taksonomiczne i nomenklaturowe. Nazwê rodzaju Enterobacter i jednego z gatunków – E. cloacae – zaproponowali w 1960 roku H o r m a e c h a e i E d w a r d s, a nastêpnie E d w a r d s i E w i n g w 1962 roku. W 1963 roku ostatecznie odrzucono nazwê Cloaca i zaakceptowano nazwê rodzaju Enterobacter [7, 67]. W ci¹gu ostatnich kilkudziesiêciu lat w systematyce pa³eczek Enterobacter spp. zachodzi³y nie tylko liczne zmiany zwi¹zane z nazw¹ rodzaju i gatunków, ale tak¿e przynale¿noœci bakterii, które wczeœniej nale¿a³y do tego rodzaju, a nastêpnie zosta³y z niego wy³¹czone. Z tego powodu kolejne wydania Mannual of Systematic Bacteriology Bergey’a zawiera³y poprawki dotycz¹ce rozszerzenia rodzaju o nowe gatunki lub wykluczenia niektórych z rodzaju Enterobacter [5, 7]. By³o to mo¿liwe, miêdzy innymi, dziêki badaniom zawartoœci zasad nukleinowych (guaniny+cytozyny, G+C) w DNA komórek bakteryjnych [62]. Na podstawie w³aœciwoœci biochemicznych i hybrydyzacji DNA w³¹czono do rodzaju Enterobacter trzy gatunki pa³eczek Erwinia spp.: E. dissolvens, E. nimipressuralis, E. cancerogenus, zaœ wy³¹czono gatunki E. alvei i E. liquefaciens, z których utworzono H. alvei i S. liquefaciens [3, 7]. Wed³ug VII wydania Mannual of Clinical Microbiology do rodzaju Enterobacter zalicza siê 14 gatunków i biogrup [23, 38, 67]. Nie wszystkie s¹ chorobotwórcze dla ludzi. Najczêœciej jako patogenne dla cz³owieka wymieniane s¹ gatunki: E. aerogenes, E. agglomerans (obecnie odrêbne genetycznie pa³eczki Pantoea agglomerans), E. cloacae i E. sakazakii [7, 65, 75]. Szczepy pozosta³ych gatunków: E. asburiae, E. amnigenus (biogrupa 1 i 2), E. cancerogenus (synonim E. taylorae), E. gergoviae, E. hormaechei, s¹ rzadziej izolowane z materia³ów klinicznych i ze œrodowiska szpitalnego [6, 24, 38, 57, 61, 65, 74]. Pa³eczek E. intermedium, jak dot¹d, nie izolowano od ludzi [74], a E. dissolvens, E. nimipressuralis i E. pyrinus nale¿¹ do, tzw. fitopatogenów [6, 10]. W ostatnich latach do rodzaju

Enterobacter w³¹czono dwa kolejne gatunki: E. kobei [45] i E. cowanii [37], które izolowano z materia³ów klinicznych. 3. Ogólna charakterystyka rodzaju Enterobacter 3.1. Morfologia, hodowla i metabolizm Enterobacter spp. s¹ prostymi Gram-ujemnymi pa³eczkami, o wymiarach 0,6–1,0 mm szerokoœci i 1,2–3,0 mm d³ugoœci. Zwykle uk³adaj¹ siê w nieregularne skupiska. Wiêkszoœæ jest urzêsiona peritrichalnie. Niektóre szczepy, zw³aszcza E. aerogenes, mog¹ posiadaæ cienk¹ otoczkê. Pod wzglêdem zapotrzebowania na tlen s¹ wzglêdnymi beztlenowcami i wykazuj¹ fermentacyjny typ metabolizmu. Zawartoœæ G+C w DNA wynosi 52–60 mol% [7, 62]. Pa³eczki Enterobacter spp. rosn¹ dobrze na pod³o¿ach zwyk³ych i wybiórczych dla bakterii Enterobacteriaceae. Optymalny wzrost na pod³o¿ach sta³ych uzyskuje siê po 18–24 godzinach inkubacji w temperaturze 20–30°C dla szczepów pochodz¹cych ze œrodowiska naturalnego i w temperaturze 37°C dla szczepów izolowanych z materia³ów klinicznych [62]. Na pod³o¿u MacConkey’a pa³eczki E. cloacae rosn¹ w postaci p³askich, nieznacznie opalizuj¹cych, g³adkich lub szorstkich, a czasem œluzowych, podobnych do Klebsiella spp. kolonii laktozo-dodatnich lub laktozo-ujemnych. Kolonie maj¹ niereregularny brzeg i œrednicê 2–3 mm. Na pod³o¿u Xylose-Lysine-Deoxycholate Agar (XLD) pa³eczki te tworz¹ kolonie o barwie ¿ó³tej. Na pod³o¿u Hektoen Enteric Agar (HE) kolonie maj¹ podobn¹ œrednicê i s¹ zabarwione na kolor ³ososiowo-ró¿owy [62, 74]. E. sakazakii, mog¹ wytwarzaæ na pod³o¿ach zwyk³ych lub wzbogaconych w temperaturze 25°C ¿ó³ty barwnik, nierozpuszczalny w wodzie i nie dyfunduj¹cy do pod³o¿a. Jego wytwarzanie zale¿y od sk³adu pod³o¿a, na którym prowadzona jest hodowla oraz od temperatury inkubacji. W temperaturze 37°C i po wielokrotnych pasa¿ach szczepu, barwnik ten mo¿e byæ s³abo wytwarzany lub wcale [5, 7, 22]. Szczepy E. aerogenes i E. gergoviae tworz¹ kolonie przypominaj¹ce wygl¹dem E. cloacae [74]. 3.2. W³aœciwoœci biochemiczne rodzaju Pa³eczki Enterobacter spp. wytwarzaj¹ reduktazê azotow¹, fermentuj¹ z wytworzeniem kwasu i gazu glukozê, a tak¿e inne cukry jak: mannitol, arabinozê, ramnozê, ksylozê, trehalozê, celobiozê, maltozê, melibiozê. Wiêkszoœæ szczepów daje dodatni¹ reakcjê Voges-Proskauera (wytwarzanie acetoiny) i ujemny test z czerwieni¹ metylow¹. Bakterie te zazwyczaj rozk³adaj¹ cytrynian na pod³o¿u Simmonsa oraz malo-

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – TAKSONOMIA, CHARAKTERYSTYKA, CZYNNIKI WIRULENCJI I METODY IDENTYFIKACJI

Ta b e l a I

Reakcje biochemiczne odró¿niaj¹ce gatunki pa³eczek Enterobacter spp. Reakcja biochemiczna

41

Gatunki Enterobacter spp. E. aerogenes

E. cloacae

E. sakazakii

E. gergoviae

Wytwarzanie dekarboksylazy ornityny

+

+

+

+

Wytwarzanie dekarboksylazy lizyny

+

–

–

+

Wytwarzanie dehydrolazy argininy

–

+

+

–

Fermentacja sorbitolu

+

+

–

–

Fermentacja laktozy

+

+

+/–

+

Wytwarzanie ureazy

–

+/–

–

+

Wytwarzanie ¿ó³tego barwnika

–

(–)

+

–

+ – 90,0–100% szczepów daje reakcje dodatnie, (+) – 75,0–89,9% szczepów daje reakcje dodatnie, +/– – 25,1–74,9% szczepów daje reakcje dodatnie, (–) – 10,1–25,0% szczepów daje reakcje dodatnie, – 0,0–10,0% szczepów daje reakcje dodatnie

nian, które stanowi¹ Ÿród³o wêgla i energii. Pa³eczki E. nimipressuralis hydrolizuj¹ ¿elatynê. Bakterie Enterobacter spp. nie rozk³adaj¹ tiosiarczanu, nie wytwarzaj¹ deoksyrybonukleazy, lipazy, esterazy, dezaminazy fenyloalaniny, w wiêkszoœci nie wytwarzaj¹ indolu. Niektóre gatunki, zw³aszcza E. gergoviae, rzadziej E. cloacae, mog¹ hydrolizowaæ mocznik [5, 8, 62]. Cech¹ charakterystyczn¹ tego rodzaju, z wyj¹tkiem szczepów z gatunku E. agglomerans, jest wytwarzanie dekarboksylazy ornityny. Na podstawie wykazania tej reakcji i potwierdzenia ruchu mo¿na odró¿niæ pa³eczki Enterobacter spp. od Klebsiella spp. Jednak pod wzglêdem biochemicznym miêdzy gatunkami Enterobacter spp. mog¹ wystêpowaæ pewne ró¿nice w wytwarzaniu innych enzymów, np. dehydrolazy argininy, dekarboksylazy lizyny [5, 62, 74]. Ró¿nice wybranych cech biochemicznych pa³eczek Enterobacter spp. przedstawia tab. I. 3.3. Budowa antygenowa i czynniki wirulencji Pa³eczki Enterobacter spp. s¹ ma³o poznanymi patogenami. W zwi¹zku z tym niewiele wiadomo o czynnikach warunkuj¹cych ich patogennoœæ i zjadliwoœæ. Struktura antygenowa pa³eczek Enterobacter spp. jest mniej z³o¿ona w porównaniu z innymi pa³eczkami Enterobacteriaceae. W budowie antygenowej wyró¿nia siê antygen O-somatyczny (niem. Ohne Hauch, bez powiewu) i antygen H-rzêskowy (niem. Hauch, powiew). Niektóre szczepy, zw³aszcza E. aerogenes (oko³o 80%), mog¹ posiadaæ tak¿e antygen otoczkowy K (niem. Kapsel, otoczka) i dawaæ reakcje krzy¿owe z przeciwcia³ami przeciw antygenom otoczkowym Klebsiella spp. (g³ównie K68 i K26) [7, 29, 62, 73, 75]. Wa¿nym czynnikiem wirulencji jest lipopolisacharyd (LPS), odpowiedzialny przede wszystkim za wstrz¹s septyczny, gor¹czkê, indukcjê nieswoistej od-

powiedzi zapalnej, aktywacjê dope³niacza, makrofagów i obni¿enie ciœnienia krwi [75]. Kolejnym czynnikiem chorobotwórczoœci pa³eczek Enterobacter spp., zw³aszcza E. aerogenes, jest obecnoœæ polisacharydowej otoczki, która chroni komórkê przed wysychaniem, fagocytoz¹, dostêpem antybiotyków i uczestniczy w swoistej adhezji bakterii do komórek nab³onkowych gospodarza u³atwiaj¹c tym samym kolonizacjê pacjenta [7, 65, 75]. Wa¿nym czynnikiem wirulencji bakterii Gramujemnych u³atwiaj¹cym adhezjê s¹ fimbrie. K e l l e r i wsp. [42] donosz¹, ¿e u wiêkszoœci pa³eczek Enterobacter spp. wystêpuj¹ fimbrie typu 1, na których wystêpuj¹ g³ównie adhezyny bia³kowe, mannozo-wra¿liwe hemaglutyniny (mannose-sensitive hemagglutinin, MSHA), sporadycznie zaœ adhezyny mannozo-oporne (mannose-resistant hemagglutinin, MRHA). Jednym z czynników zjadliwoœci pa³eczek Enterobacter spp. jest opornoœæ na bakteriobójcze dzia³anie dope³niacza surowicy ludzkiej, która kodowana jest najczêœciej w chromosomie bakterii [42, 75]. Niektóre szczepy pa³eczek Enterobacter spp. wytwarzaj¹ enterotoksyny podobne do ciep³osta³ych toksyn (thermostable toxin, ST I) i ciep³ochwiejnych toksyn (thermolabile toxin, LT I) E. coli. Efekt ich dzia³ania polega na aktywacji cyklazy guanylowej i adenylowej w komórkach nab³onka jelitowego, które odpowiadaj¹ za nadmiern¹ sekrecjê wody i elektrolitów. Wytwarzanie tych enterotoksyn kodowane jest w genach, które zosta³y przeniesione z pa³eczek E. coli na plazmidach lub transpozonach [5, 42, 43, 44, 75]. Oprócz enterotoksyn, niektóre szczepy E. cloacae mog¹ wytwarzaæ toksynê podobn¹ do toksyny Shiga II (Shiga-like toxin II, SLT II). Taki szczep w 1996 roku izolowano od pacjenta z zespo³em hemolityczno-mocznicowym (hemolytic uremic syndrome, HUS) [58]. Wa¿nym czynnikiem wirulencji pa³eczek E. gergoviae jest wytwarzanie ureazy [5, 7, 8, 62]. Enzym ten

42

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

poprzez hydrolizê mocznika powoduje alkalizacjê moczu, co prowadziæ mo¿e do zwiêkszonego wytr¹cania i odk³adania siê struwitu o sk³adzie fosforanowo-magnezowo-amonowym. Sytuacja taka stwarza korzystne warunki do rozwoju zaka¿enia. Potencjalnymi czynnikami chorobotwórczoœci Enterobacter spp. mog¹ byæ bakteriocyny [29, 31, 69, 71]. Ich wytwarzanie determinowane jest genami zawartymi na plazmidach, które jednoczeœnie nios¹ geny opornoœci producenta na dzia³anie obcej w œrodowisku bakteriocyny i mog¹ byæ przenoszone podczas koniugacji [2, 31]. Wytwarzanie bakteriocyn aktywnych wobec pa³eczek Enterobacter spp. i Klebsiella spp. wykazano u szczepu E. cloacae DF13 [31]. Szczep ten wytwarza kloacynê DF13 (bia³ko o masie cz¹steczkowej 58 kDa), której aktywnoœæ zwi¹zana jest, z tzw. bia³kami uwalniaj¹cymi bakteriocynê (bacteriocin release proteins, BRPs) kodowanymi przez gen pCloDF13 [71]. Mechanizm dzia³ania tej bakteriocyny na spokrewnione szczepy E. cloacae polega (podobnie, jak w przypadku dzia³ania kolicyny ColE3 wytwarzanej przez E. coli), na hamowaniu syntezy bia³ek poprzez inaktywacjê rRNA, wycinaniu fragmentów RNA za pomoc¹ bakteriocyn o aktywnoœci rybonukleazy, podczas gdy synteza RNA i DNA pozostaje zachowana [15, 31]. Rybosomy poddane dzia³aniu tej bakteriocyny staj¹ siê nieaktywne, prawdopodobnie w wyniku utraty jednego lub kilku bia³ek czynnoœciowych. Bakteriocyny umo¿liwiaj¹ bakteriom wyeliminowanie szczepów konkurencyjnych i u³atwiaj¹ osiedlanie siê w nowym œrodowisku [63]. Pa³eczki Enterobacter spp. wytwarzaj¹ równie¿ siderofory (aerobaktyny, enterobaktyny, yersiniabaktyny) wychwytuj¹ce od gospodarza jony ¿elaza z transferyny. Substancje te in vivo zapewniaj¹ bakteriom korzystne warunki rozwoju [42, 51, 52, 66]. Dziêki temu bakterie kolonizuj¹ce jelito mog¹ penetrowaæ poprzez nab³onek kosmków do organów wewnêtrznych, w których mog¹ przetrwaæ, namno¿yæ siê i wywo³aæ zaka¿enie. Mokracka i wsp. [51, 52] stwierdzili, ¿e wszystkie szczepy E. aerogenes, E. sakazakii i 99% szczepów E. cloacae wytwarza enterobaktyny, które maj¹ wysokie powinowactwo do ¿elaza, choæ ich rola jako czynnika wirulencji nie jest do koñca wyjaœniona. Autorzy donosz¹ tak¿e o wytwarzaniu aerobaktyn przez 49% szczepów E. cloacae (szczepy E. aerogenes i E. sakazakii nie wytwarzaj¹ tego zwi¹zku) i yersiniabaktyn u 1% szczepów E. cloacae. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie yersiniabaktyn, regulacjê i transport ¿elaza do cytoplazmy komórki bakteryjnej, zlokalizowane s¹ w, tzw. wyspach wysokiej patogennoœci (High Pathogenicity Islands, HPI) [51, 52, 53, 66]. HPI s¹ regionami chromosomu bakteryjnego zawieraj¹cymi geny, które czêsto tworz¹ bloki wirulencji lub kasety wirulencji, zwi¹zane z

chorobotwórczoœci¹, poniewa¿ posiadaj¹ czêsto geny koduj¹ce tak¿e inne czynniki wirulencji (toksyny, adhezyny, systemy sekrecji bia³ek). Wystêpuj¹ one u szczepów chorobotwórczych, a brak ich, lub wystêpuj¹ sporadycznie, u szczepów niepatogennych [34, 35, 53]. Niewiele jest informacji na temat rozmieszczenia i budowy HPI u pa³eczek Enterobacter spp. Zaobserwowano obecnoœæ Yersinia HPI koduj¹cych yersiniabaktyny u innych bakterii Enterobacteriaceae, w tym u Enterobacter spp. [1, 51, 66]. Szczepy tych pa³eczek posiadaj¹ fragmenty DNA o wielkoœci 35–45 kDa zawieraj¹ce geny irp1, irp2, fyuA odpowiedzialne za syntezê yersiniabaktyn, które u³atwiaj¹ rozwój zaka¿enia. 4. Wystêpowanie pa³eczek Enterobacter spp. Pa³eczki Enterobacter spp. s¹ rozpowszechnione w œrodowisku naturalnym. Wystêpuj¹ w glebie, wodzie, œciekach, odchodach zwierzêcych, a tak¿e w owadach i na roœlinach: trawa, kukurydza, banany, sa³ata [62, 65]. Stanowi¹ endogenn¹ florê przewodu pokarmowego u 40–80% zdrowych ludzi [17, 18, 27, 42, 64, 65]. Izolowano je z wymazów z gard³a, plwociny, moczu [18, 40, 62, 65], a tak¿e ze skóry pach, pachwin, wymazów miêdzy palcami u ludzi [8], oraz ze skóry zwierz¹t, miêdzy innymi koni, byd³a, psów, œwiñ, kurcz¹t [7, 65]. Jako bakterie oportunistyczne mog¹ byæ chorobotwórcze dla ludzi i zwierz¹t. Odnotowano przypadek posocznicy z ich udzia³em u szympansów [7]. U pacjentów hospitalizowanych mog¹ staæ siê czynnikiem odpowiedzialnym za zaka¿enia szpitalne. W œrodowisku szpitalnym pa³eczki Enterobacter spp. wystêpuj¹ w miejscach wilgotnych, np. w zlewach, nawil¿aczach, aparaturze wspomagaj¹cej oddychanie [17, 18, 65]. 5. Metody identyfikacji i typowania pa³eczek Enterobacter spp. 5.1. Metody oparte na fenotypowaniu Typowanie bakterii ma znaczenie w ich identyfikacji i klasyfikacji, oraz w badaniach epidemiologicznych. Klasyczne metody typowania bakterii opieraj¹ siê g³ównie na analizie fenotypów i wykrywaniu obecnoœci lub braku cech charakterystycznych dla danego drobnoustroju podlegaj¹cych ekspresji. Badania oparte o cechy fenotypowe nie zawsze s¹ wiarygodne, poniewa¿ brak lub ekspresja danej cechy mo¿e byæ modyfikowana przez œrodowisko. W celu dok³adnego okreœlenia szczepów czêsto konieczne jest korzystanie z kilku metod genotypowania jednoczeœnie [18].

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – TAKSONOMIA, CHARAKTERYSTYKA, CZYNNIKI WIRULENCJI I METODY IDENTYFIKACJI

Wœród najczêœciej stosowanych metod fenotypowych wymienia siê: biotypowanie pa³eczek Enterobacter spp. za pomoc¹ testów biochemicznych, wykrywaj¹cych aktywnoœæ enzymów komórkowych, typowanie serologiczne na podstawie antygenów O i H, typowanie za pomoc¹ bakteriocyn, bakteriofagów oraz okreœlanie wzorów opornoœci na antybiotyki [13, 29, 31, 56, 62, 64, 69, 71, 73]. Do identyfikacji gatunków Enterobacter spp. na podstawie cech biochemicznych wykorzystywane s¹ komercyjne testy dla pa³eczek Enterobacteriaceae, np. Api 20 E, ID 32 E, ID 32GN (bioMérieux), obejmuj¹ce 20 lub 32 reakcje biochemiczne. Czêst¹ wad¹ biotypowania jest b³êdna identyfikacja gatunku na podstawie niepoprawnie odczytanych w³aœciwoœci metabolicznych szczepu wynikaj¹cych, np. z odmiennych warunków inkubacji i hodowli lub utraty plazmidów koduj¹cych pewne w³aœciwoœci metaboliczne. Dowodzi to o niskiej przydatnoœci tej metody dla celów epidemiologicznych [18]. Podobnie jest w przypadku typowania na podstawie wra¿liwoœci szczepów na antybiotyki, gdzie wp³yw na okreœlenie lekoopornoœci szczepów mog¹ mieæ warunki hodowli, pojawienie siê przypadkowych mutacji punktowych w genomie bakterii, czy nabycie przez szczep plazmidów lub transpozonów zawieraj¹cych geny opornoœci na antybiotyki. Sytuacja taka mo¿e doprowadziæ do pojawienia siê podobnych wzorów opornoœci u ró¿nych szczepów lub identycznych wzorów u ró¿nych izolatów bakterii [18, 71]. Serotypowanie jest technik¹, opieraj¹c¹ siê na badaniu reakcji surowic odpornoœciowych z antygenami bakterii. Technika ta na podstawie 53 odmian antygenu O i 57 odmian antygenu H oraz na podstawie antygenów K u szczepów wytwarzaj¹cych otoczki, pozwala wyró¿niæ kilkadziesi¹t serotypów pa³eczek Enterobacter spp. [7, 11, 29, 62, 73, 75]. Wadami tej metody s¹ wysokie koszty, czasoch³onnoœæ, skomplikowana procedura otrzymywania surowic odpornoœciowych [18, 71]. Typowanie bakteriofagami polega na ró¿nicowaniu szczepów na podstawie ich wra¿liwoœci lub opornoœci na lizê przez swoisty dla danego gatunku zestaw bakteriofagów. Z piœmiennictwa [11, 13, 29, 56, 73] wynika, ¿e typowanie pa³eczek Enterobacter spp. mo¿na przeprowadzaæ za pomoc¹ zestawu 15–50 fagów. Metoda ta stosowana jest g³ównie przez laboratoria referencyjne [18, 71]. Typowanie bakteriocynowe polega na oznaczeniu wra¿liwoœci poszczególnych szczepów na bakteriocyny oraz na okreœleniu, czy badane szczepy wytwarzaj¹ bakteriocyny skierowane przeciwko szczepom wskaŸnikowym [13, 18, 73]. Metoda typowania za pomoc¹ kloacyn (bakteriocyny E. cloacae) zosta³a zaproponowana i opisana przez Trauba [69]. Ograniczeniem tego typowania jest skomplikowana metodyka [18].

43

5.2. Metody oparte o techniki biologii molekularnej Z powodu niedoskona³oœci, niskiej powtarzalnoœci i przydatnoœci niektórych metod fenotypowania, coraz czêœciej w badaniach epidemiologicznych stosuje siê metody genotypowania. Zalet¹ metod genetycznych opartych na analizie DNA jest to, ¿e odznaczaj¹ siê wysok¹ czu³oœci¹ i swoistoœci¹, przyspieszaj¹ wykrycie oraz identyfikacjê drobnoustrojów trudno hodowlanych, pozwalaj¹ na identyfikacjê genów warunkuj¹cych zjadliwoœæ drobnoustrojów, zdolnoœæ do wytwarzania toksyn, opornoœæ na antybiotyki. Ponadto, wykazanie ró¿nic miêdzy poszczególnymi szczepami na poziomie gatunku daje mo¿liwoœæ identyfikacji ró¿nych klonów bakterii, Ÿróde³ zaka¿enia oraz sposobów transmisji drobnoustrojów w okreœlonym œrodowisku i czasie [18,19]. Najczêœciej stosowane metody biologii molekularnej opieraj¹ siê na: analizie restrykcyjnej chromosomalnego DNA (restriction endonucleasis analysis, REA-DNA) b¹dŸ plazmidowego DNA (restriction endonucleasis analysis of plazmid DNA, REAP-DNA), analizie chromosomalnego DNA z zastosowaniem sond genetycznych, np. metody rybotypowania (riboprinting, RP), analizie produktów ³añcuchowej reakcji polimerazy (polimerase chain reaction, PCR), sekwencjonowaniu [18]. W typowaniu genetycznym pa³eczek Enterobacter spp. zastosowanie maj¹ g³ównie: analiza wzorów restrykcyjnych chromosomalnego DNA metod¹ elektroforezy pulsacyjnej (pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) [9, 11, 14, 25, 26, 46, 47, 50, 52, 55, 60, 72], losowa amplifikacja polimorficznego DNA w reakcjach typu RAPD-PCR (random amplified polimorphic DNA PCR) i AP-PCR (arbitrarily primed PCR) [4, 12, 14, 32, 33 41], amplifikacja odcinków DNA zawartych pomiêdzy powtarzaj¹cymi siê sekwencjami pozagenowymi, tzw. REP (repetetive extragenic elements) i powtarzaj¹cymi siê sekwencjami wewn¹trzgenowymi charakterystycznymi dla rodziny Enterobacteriaceae, tzw. ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence) w reakcjach REP-PCR i ERIC-PCR [4, 20, 25, 30, 36, 49, 50, 70], rybotypowanie (riboprinting, RP) [11, 20, 25, 28, 30, 32, 33], sekwencjonowanie [9, 16, 39, 48, 49, 59]. Metody biologii molekularnej wykorzystywane w badaniach nad pa³eczkami Enterobacter spp. oparte o PCR, s³u¿¹ g³ównie do identyfikacji i typowania szczepów w dochodzeniach epidemiologicznych, zw³aszcza szczepów wytwarzajacych $-laktamazy [46, 47, 49, 50, 59]. Metody RAPD-PCR i AP-PCR polegaj¹ na amplifikacji przypadkowych, nieznanych fragmentów chromosomu bakteryjnego, przy u¿yciu krótkiego (8–10 par zasad w RAPD-PCR, oko³o 20 pz w AP-PCR) dowolnie zaprojektowanego jednego lub dwóch starterów.

44

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

Produkty amplifikacji rozdziela siê elektroforetycznie w ¿elu agarozowym lub poliakrylamidowym. Otrzymuje siê w ten sposób wzór ca³ego genomu charakterystyczny dla danego izolatu. Obydwie metody znalaz³y zastosowanie w badaniach nad identyfikacj¹ gatunków i szczepów, a tak¿e nad stopniem ich pokrewieñstwa. Umo¿liwiaj¹ wychwycenie zmiennoœci genetycznej pomiêdzy blisko spokrewnionymi szczepami tego samego gatunku, bez potrzeby wstêpnej informacji o sekwencji analizowanego DNA. Podobieñstwo miêdzy szczepami okreœla siê na podstawie liczby produktów reakcji PCR rozdzielanych podczas elektroforezy oraz ich wielkoœci (wzór pr¹¿ków o okreœlonej wielkoœci) [18, 54]. W metodach tych do typowania szczepów Enterobacter spp. stosuje siê, np. primery 5’ GGTGCGGGAA 3’ i 5’ AAGAGCCCGT 3’ [14, 41]. Metody te s¹ proste, szybkie i charakteryzuj¹ siê du¿¹ si³¹ dyskryminacji, ale mog¹ sprawiaæ problemy techniczne w zwi¹zku z doborem starterów, nisk¹ powtarzalnoœci¹ wyników oraz trudnoœciami w porównywaniu otrzymanych wzorów [54]. W typowaniu Enterobacter spp., wykorzystuje siê równie¿ metody REP-PCR i ERIC-PCR, które polegaj¹ na amplifikacji odcinków DNA zawartych miêdzy powtarzaj¹cymi siê sekwencjami REP i ERIC koduj¹cymi tRNA. Ze wzglêdu na wysok¹ zmiennoœæ liczby i po³o¿enia sekwencji powtórzonych w chromosomie bakteryjnym, produkty amplifikacji PCR charakteryzuj¹ siê znacznym polimorfizmem d³ugoœci. Prowadzi to do powstania profili z wieloma lub jednym (w zale¿noœci od u¿ytych starterów) zamplifikowanym fragmentem. W badaniach tego typu mo¿na wykorzystaæ startery, np. ERIC 1R (5’ ATGTAAGCTCCTGGGGATTCA-3’) i ERIC2 (5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’) [20, 25, 49, 70]. Kolejn¹ z metod biologii molekularnej wykorzystywanych w typowaniu Enterobacter spp. jest rybotypowanie. Technika ta polega na rozdziale elektroforetycznym w ¿elu agarozowym fragmentów DNA strawionych enzymami restrykcyjnymi, a nastêpnie na hybrydyzacji z sondami komplementarnymi do genów koduj¹cych sekwencje rRNA (najczêœciej podjednostki 16S i 23S RNA). Geny rRNA stanowi¹ wysoce konserwatywny element genomu danego gatunku bakterii. Poszczególne szczepy ró¿ni¹ siê liczb¹ i lokalizacj¹ kopii genów koduj¹cych rRNA. Metod¹ t¹ osi¹ga siê wysoki poziom rozdzielczoœci. Wzory otrzymywane po hybrydyzacji posiadaj¹ po kilka do kilkunastu pr¹¿ków. Im organizmy bardziej spokrewnione, tym wiêcej wspólnej wielkoœci fragmentów wystêpuje w obrazie profilu. Wadami typowania t¹ metod¹ s¹: wieloetapowoœæ, d³uga procedura, u¿ycie pierwiastków radioaktywnych i d³ugi proces doboru w³aœciwych endonukleaz [18]. D u m a r c h e i wsp. [20] wykorzystali tê metodê z u¿yciem enzymu restrykcyjnego EcoR1

do typowania szczepów wytwarzaj¹cych $-laktamazy o rozszerzonym zakresie substratowym (extendedspectrum $-lactamases, ESBL) u pa³eczek E. aerogenes. F e r n á n d e z - B a c a i wsp. [25] wykorzystali rybotypowanie z u¿yciem czterech enzymów restrykcyjnych BglI, SalI, EcoRI i HindIII, do typowania epidemiologicznego szczepów E. cloacae, przy czym przy trawieniu DNA bakterii za pomoc¹ BglI uzyskano najlepsze wyniki. W celach epidemiologicznych rybotypowanie Enterobacter spp. wykorzystali równie¿ inni badacze [11, 28, 30, 32, 33]. Analiza chromosomalnego DNA, a tak¿e porównywanie pokrewieñstwa szczepów mo¿liwe jest równie¿ dziêki sekwencjonowaniu amplifikowanego wczeœniej w reakcji PCR DNA. Do badañ stosuje siê najczêœciej sekwencje wysoce zmiennego fragmentu 16S rRNA lub charakterystyczne dla poszczególnych gatunków sekwencje pojedynczych genów z ³añcucha DNA, np. odpowiedzialne za opornoœæ na antybiotyki. W ten sposób mo¿na porównaæ pokrewieñstwo szczepów, np. poprzez wykrycie genów blaVIM-2 koduj¹cych wytwarzanie metalo-$-laktamazy VIM-2 u E. cloacae [39] oraz genów blaCTX-M-3 koduj¹cych wytwarzanie CTX-M-3 [16] i blaCTX-M-10 koduj¹cych wytwarzanie CTX-M-10 [9]. W ostatnich latach pojawi³o siê wiele prac dotycz¹cych typowania pa³eczek Enterobacter spp. w oparciu o wzory DNA chromosomalnego, poddanego dzia³aniu enzymów restrykcyjnych i rozdzielanego za pomoc¹ PFGE [9, 11, 14, 25, 26, 41, 46, 47, 55, 60, 72]. Technika ta, powszechnie uznawana za najlepiej ró¿nicuj¹c¹ szczepy bakterii, polega na rozdziale fragmentów DNA o du¿ej wielkoœci. Do analizy DNA pa³eczek Enterobacter spp. najczêœciej stosuje siê restryktazê XbaI lub NotI. W wyniku trawienia otrzymuje siê 5–20 fragmentów DNA o wielkoœci 1000–800 000 pz, co pozwala na porównanie profili rozdzia³u DNA (wzorów restrykcyjnych) ró¿nych szczepów bakteryjnych i ustalenie podobieñstw lub ró¿nic miêdzy nimi. W materiale genetycznym szczepów nale¿¹cych do tego samego klonu mog¹ wystêpowaæ pojedyncze ró¿nice, bêd¹ce najczêœciej wynikiem mutacji punktowej, delecji lub inercji. T e n o v e r i wsp. [68] opracowali kryteria interpretacji wzorów PFGE. Szczepy uznaje siê za genetycznie nierozró¿nialne, je¿eli ich wzory restrykcyjne maj¹ te same miejsca ciêcia i wielkoœæ powsta³ych fragmentów jest taka sama. U szczepów blisko spokrewnionych wystêpuj¹ we wzorach restrykcyjnych bakterii 2 lub 3 ró¿ne fragmenty. Szczepy ró¿ni¹ce siê 4–6 pr¹¿kami okreœla siê jako prawdopodobnie spokrewnione. Natomiast szczepy ró¿ni¹ce siê 7 lub wiêcej pr¹¿kami uwa¿a siê za niespokrewnione, nale¿¹ce do ró¿nych klonów [54, 68]. Technika ta charakteryzuje siê du¿¹ czu³oœci¹ i powtarzalnoœci¹, co sprawia, ¿e ma ona ogromne znaczenie w dochodzeniach

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – TAKSONOMIA, CHARAKTERYSTYKA, CZYNNIKI WIRULENCJI I METODY IDENTYFIKACJI

epidemiologicznych, a liczne badania porównawcze wykaza³y wy¿szoœæ tej metody w zestawieniu z innymi technikami molekularnymi [54]. 6. Podsumowanie Pa³eczki Enterobacter spp. s¹ szeroko rozpowszechnionymi w przyrodzie drobnoustrojami, podobnymi do pa³eczek Klebsiella spp., ale ma³o poznanymi pod wzglêdem czynników wirulencji. Cech¹ charakterystyczn¹ rodzaju, odró¿niaj¹c¹ te bakterie od pa³eczek Klebsiella spp. jest wytwarzanie dekarboksylazy ornityny. Uwa¿ane s¹ za endogenn¹ florê oportunistyczn¹ kolonizuj¹c¹ przewód pokarmowy, która mo¿e odpowiadaæ za zaka¿enia szpitalne. Wœród znanych gatunków bakterii tego rodzaju, najczêœciej uznawanymi za patogenne dla ludzi s¹: E. cloacae, E aerogenes i E. sakazakii. Do najwa¿niejszych czynników wirulencji tych bakterii nale¿¹: LPS, otoczka, fimbrie typu 1, enterotoksyny podobne do toksyn LT I i ST I E. coli, ureaza (E. gergoviae), bakteriocyny, siderofory, enterobaktyny, yersiniabaktyny. Identyfikacja fenotypowa pa³eczek rodzaju Enterobacter spp. mo¿e byæ przeprowadzona ró¿nymi metodami. Wœród nich wymienia siê najczêœciej metody biotypowania, typowania serologicznego na podstawie 53 odmian antygenu O i 57 odmian antygenu H, typowania za pomoc¹ bakteriocyn, bakteriofagów i wzorów opornoœci na antybiotyki. Do najczêœciej u¿ywanych metod typowania szczepów Enterobacter spp. w oparciu o metody genetyczne: PFGE, rybotypowanie, sekwencjonowanie, typowanie z u¿yciem metod RAPD-PCR, AP-PCR, ERIC-PCR i REP-PCR. Metody te, stosuje siê czêsto nie tylko do identyfikacji i oceny pokrewieñstwa szczepów, ale tak¿e do wykrywania genów opornoœci bakterii na antybiotyki. Natomiast przy porównywaniu szczepów bakteryjnych dla potrzeb epidemiologii, za najlepsz¹ uwa¿a siê technikê PFGE. Piœmiennictwo 1. Bach S., de Almeida A., Carniel E.: The Yersinia high-pathogenicity islands is present in different members of the family Enterobacteriaceae. FEMS Microbiol. Lett. 183, 289–294 (2000) 2. Barefoot S.F., Harmon K.M., Grinsted D.A. Nettles C.G.: Bacteriocins, molecular biology (w:) Encyclopedia of microbiology. red. Lederberg J., Academic Press, San Diego, New York, Boston, 1992, s. 417–430 3. Beji A., Mergaert J., Gavini F., Izard D., Kersters K., Leclerc H., De Ley J.: Subjective synonimy of Erwinia herbicola, Erwinia milletiae and Enterobacter agglomerans and redefinition of the taxon by genotypic and phenotypic data. Int. J. Syst. Bacteriol. 38, 77–88 (1988)

45

4. Bosi C., Davin-Regli A., Bornet C., Mallea M., Pages J.M., Bollet C.: Most Enterobacter aerogenes strains in France belong to a prevalent clone. J. Clin. Microbiol. 37, 2165–2169 (1999) 5. Brenner D.J: Enterobacteriaceae (w:) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, red. Murray R.G.E., Brenner D.J., Bryant M.P., Holt J.G., Krieg N.R., Moulder J. W., Pfenning N., Sneath P. H. A., Stley J. T. Williams and Wilkins, Baltimore, Hong Kong, London, Sydney, 1984, vol. I, s. 408–420 6. Brenner D.J., McWhorter A.C., Kai A., Steigerwalt A.G., Farmer III J.J.: Enterobacter asburiae spp. nov., a new species found in clinical specimens, and reassgnment of Erwinia dissolvens and Erwinia nimipressuralis to the genus Enterobacter as Enterobacter dissolvens and Enterobacter nimipressuralis comb. J. Clin. Microbiol. 23, 1114–1120 (1986) 7. Brenner D.J.: Chapter 95. The genus Enterobacter (w:) The Procaryotes. A handbook on habitats, isolation and identification of bacteria. red. Starr M.P., Stolp H., Trüper H.G., Balows A. Schilgel H.G., Springer Verlag, Berlin, 1981, s. 1173–1180 8. Brenner D.J., Richard C., Steigerwalt A.G., Asbury M.A., Mendel M.: Enterobacter gergoviae spp. nov.: a new species of Enterobacteriaceae found in clinical specimens and environment. Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 1–6 (1980) 9. Cantón R., Oliver A., Coque T.M., Varela M., Pérez-Diaz J.C., Baquero F.: Epidemiology of extended-spectrum $-lactamase producing Enterobacter isolates in a Spanish hospital during a 12-year period. J. Clin. Microbiol. 40, 1237–1243 (2002) 10. Chung Y.R., Brenner D.J., Steigerwalt A.G., Kim B.S., Kim H.T., Yun Cho K.: Enterobacter pyrinus spp. nov., an organism associated with brown leaf spot disease of pear trees. Int. J. Syst. Bacteriol. 43, 157–161 (1993) 11. Darini A.L.C., Magalhaes V.D., Levy C.L., Barth A.L., Coscina A.L.: Phenotyping and genotyping methods applied to relatedness of Brazilian isolates of Enterobacter cloacae. Braz. J. Med. Biol. Res. 32, 1077–1081 (1999) 12. Davin-Regli A., Saux P., Bollet C., Gouin F., de Micco P.: Investigation of outbreaks of Enterobacter aerogenes colonization and infection in intensive care units by random amplification of polymorphic DNA. J. Med. Microbiol. 44, 89–98 (1996) 13. Daw M.A., Corcoran G.D., Falkiner F.R. Keane C.T.: Application and assesment of cloacing typing of Enterobacter cloacae. J. Hosp. Infect. 20, 141–151 (1992) 14. De Mann P., Van der Veeke E. Leemreijze M., Van Leeuwen W., Vos G., Van der Anker J., Verbrugh H., Van Belkum A.: Enterobacter species in a pediatric hospital: horizontal transfer or selection in individual patients? J. Infect. Dis. 184, 211–214 (2001) 15. Dery³ko M.: W³aœciwoœci fenotypowe Enterobacteriaceae kontrolowane przez plazmidy. Post. Mikrobiol. 21, 143–169 (1982) 16. Doucet-Populaire F., Ghnassia J.C., Bonnet R., Sirot J.: First isolation of CTX-M-3 producing Enterobacter cloacae in France. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3239–3240 (2000) 17. Dzier¿anowska D.: Antybiotykoterapia praktyczna. "-medica press, Bielsko-Bia³a, 2000, s. 21–28, 184–185 18. Dzier¿anowska D., Jeliaszewicz J.: Zaka¿enia szpitalne. "-medica press, Bielsko-Bia³a, 1999, s. 84–90, 461–476 19. Dzier¿anowska D., Kamiñska W.: Zastosowanie metod biologii molekularnej do wykrywania genów opornoœci na antybiotyki. Zaka¿enia, 1, 24–33 (2003) 20. Dumarche P., de Champs C., Sirot D., Chanal C., Bonnet R., Sirot J.: TEM derivative-producing Enterobacter aerogenes strains: dissemination of prevalent clone. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1128–1131 (2002)

46

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

21. Falkiner F.R.: Enterobacter in hospital. J. Hosp. Infect. 20, 137–140 (1992) 22. Farmer III J.J., Asbury M.A. Hickman F. W., Brenner D.J.: Enterobacter sakazaki: a new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 569–584 (1980) 23. Farmer III J.J.: Enterobacteriaceae: introduction and identification (w:) Manual of clinical microbiology, 7-th ed., red. Murray P.R. Baron E.J., Phaller M.A., Tehover F.C., Yolken R.H. American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1999, s. 442–458 24. Farmer III J.J., Fanning G.R., Davis B.R., O’Hara C.M., Riddle C., Hickman-Brenner F.W., Asbury M.A., Lowery III V.A., Brenner D.J.: Escherichia fergusonii and Enterobacter taylorae, two new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 21, 77–81 (1985) 25. Fernández-BacaV. Ballesteros F., Hervást J.A., Villalón P., Dominguez M.A., Benedis V.J., Albertis S.: Molecular epidemiological typing of Enterobacter cloacae isolates from a neonatal intensive care unit: three-year prospective study. J. Hosp. Infect. 49, 173–182 (2001) 26. Finnström O., Isaksson B., Haeggman S., Burman L.G.: Control of an outbreak of a highly $-lactam-resistant Enterobacter cloacae strain in a neonatal special care unit. Acta Pediatr. 87, 1070–1074 (1998) 27. Flynn D.M., Weinstein R.A., Nathan C: Patient’s endogenous flora as the source of nosocomial Enterobacter in cardiac surgery. J. Infect. Dis. 156, 363–368 (1987) 28. Garaizar J., Kaufman M.E., Pitt T.L.: Comparison of ribotyping with conventional methods for the type identification of Enterobacter cloacae. J. Clin. Microbiol. 29, 1303–1307 (1991) 29. Gaston M.A., Stricland M.A., Ayling-Smith B.A., Pitt T.L.: Epidemiological typing of Enterobacter aerogenes. J. Clin. Microbiol. 27, 564–565 (1989) 30. Georghiou P.R., Hamill R.J., Wright C.E., Versalovic J., Koeuth T., Watson D.A., Lupski J.R.: Molecular epidemiology of infections due to Enterobacter aerogenes: identifications of hospital outbreak-associated strains by molecular techniques. Clin. Infect. Dis. 20, 84–94 (1995) 31. Graaf F.K., Planta R.J., Stouthamer A.H.: Effect of bacteriocin produced by Enterobacter cloacae on protein biosyntesis. Biochim. Biophis. Acta, 240, 122–136 (1971) 32. Grattard F., Pozzeto B., Berthelot P., Rayet I., Ros A., Lauras B., Gaudin O.G.: Arbitrarily primed PCR, ribotyping and plasmid pattern analysis applied to investigation of a nosocomial outbreak due to Enterobacter cloacae in a neonatal intensive care unit. J. Clin. Microbiol. 32, 596–602 (1994) 33. Grattard F., Pozzeto B., Tabard L., Petit M., Ros A., Gaudin O.: Characterization of nosocomial strains of Enterobacter aerogenes by arbitrarily primed PCR analysis and rybotyping. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 16, 224–230 (1995) 34. Hacker J., Blum-OehlerG., Mûhldorfer I., Tschäpe H.: Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbal evolution. Mol. Microbiol. 23, 1089–1097 (1997) 35. Hacker J., Kaper J.B.: Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annu. Rev. Microbiol. 54, 641–679 (2000) 36. Hulton C.S., Higgins C.F., Sharp P.M.: ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Mol. Microbiol. 5, 825–834 (1991) 37. Inoue K., Sugiyama K., Kosako Y., Sakazaki R., Yamai S.: Enterobacter cowanii spp. nov., a new species of the family

Enterobacteriaceae resembling Enterobacter cloacae. Curr. Microbiol. 41, 417–420 (2000) 38. Janicka G., Kania I., Ulatowska B., Kruszyñska E., Wojda M.: Wystêpowanie pa³eczek z rodzaju Enterobacter w materia³ach klinicznych i pobranych ze œrodowiska szpitalnego. Wiad. Lek. 52, 11–12 (1999) 39. Jeong S.H., Lee K., Chong Y., Yum J.H., Lee S.H., Choi H.J., Kim J.M., Park K.H., Han B.H., Lee S.W. i wsp.: Characterization of a new integron containing VIM-2, a metallo-$-lactamase gene cassette, in a clinical isolate of Enterobacter cloacae. J. Antimicrob. Chemother. 51, 397–400 (2003) 40. Kamiñska W., Murawska B., Dzier¿anowska D.: Zaka¿enia Enterobacter cloacae na Oddziale Dializoterapii i Transplantologii. Terapia, 3, 8–10 (1999) 41. Kamiñska W., Patzer J., Dzier¿anowska D.: Urinary tract infections caused by endemic multi-resistant Enterobacter cloacae in a dialysis and transplantation unit. J. Hosp. Infect. 51, 215–220 (2002) 42. Keller R., Pedroso M.Z., Ritchmann R., Silva R.M.: Occurrence of virulence-associated properties Enterobacter cloacae. Infect. Immun. 66, 645–649 (1998) 43. Klipstein F.A, Engert R.F: Partial purification and properties of Enterobacter cloacae heat-stabile enterotoxin. Infect. Immun. 13, 1307–1314 (1976) 44. Klipstein F.A., Engert R.F.: Immunological interrelationships between cholera toxin and heat-labile and heat-stabile enterotoxins of coliform bacteria. Infect. Immun. 18, 110–117 (1977) 45. Kosako Y., Tamura K., Sakazaki R., Miki K.: Enterobacter kobei spp. nov. a new species of the family Enterobacteriaceae resembling Enterobacter cloacae. Curr. Microbiol. 33, 261–265 (1996) 46. Kuboyama R.H., Bosco de Oliveira H., Moretti-Branchini M.L.: Molecular epidemiology of systemic infection caused by Enterobacter cloacae in a high-risk neonatal intensive care unit. Infect. Contr. Hosp. Epidemiol. 24, 490–494 (2003) 47. Lavigne J.P., Bouziges N., Chanal C., Mahamat A., MichauxCharachon S., Sotto A.: Molecular epidemiology of Enterobacteriaceae isolates producing extended-spectrum $-lactamases in French hospital. J. Clin. Microbiol. 42, 3805–3808 (2004) 48. Lee S.H., Jeong S.H., Park Y.M.: Characterization of blaCMY-10 a novel, plasmid-encoded AmpC-type $-lactamase gene in a clinical isolate of Enterobacter aerogenes. J. Appl. Microbiol. 95, 744–752 (2003) 49. Lee S.H., Jeong S.H., Shin S.H., An Y.J., Choi Y.W., Jung Y.CH., Jung H.I., Sohn E.S., Jeong S.H., Lee K.J.: Dissemination of SHV-12 and characterization of new AmpC-type $-lactamase genes among clinical isolates of Enterobacter species in Korea. J. Clin. Microbiol. 41, 2477–2482 (2003) 50. Mammeri H., Laurans G., Eveillard M., Castelain S., Eb F.: Coexistence of SHV-4 and TEM-24-producing Enterobacter aerogenes strains before a large outbreak of TEM-24-producing strains in a French hospital. J. Clin. Microbiol. 39, 2184–2190 (2001) 51. Mokracka J, Kaznowski A., Szarata M., Karczmarek E.: Siderophore-mediated strategies of iron acquisition by extraintestinal isolates of Enterobacter spp. Acta Microbiol. Pol. 52, 81–86 (2003) 52. Mokracka J, Koczura R., Kaznowski A.: Yersiniabactin and other siderophores produced by clinical isolates of Enterobacter spp. and Citrobacter spp. FEMS Immun. Med. Microbiol. 40, 51–55 (2004) 53. Mokracka J, Koczura R., Kaznowski A.: Wyspy patogennoœci. Post. Mikrobiol. 41, 51–69 (2002)

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – TAKSONOMIA, CHARAKTERYSTYKA, CZYNNIKI WIRULENCJI I METODY IDENTYFIKACJI

54. Murawska B., Dzier¿anowska D.: Zastosowanie metod biologii molekularnej w diagnostyce mikrobiologicznej. Mikrob. Med. 2, 38–44 (1999) 55. Neuwirth C., Siebor E., Lopez J., Pechinot A., KaŸmierczak A.: Outbreak of TEM-24-producing Enterobacter aerogenes in an intensive care unit and dissemination of the extendedspectrum $-lactamase to other members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 34, 76–79 (1996) 56. Nieradko J., Kurlenda J.: Ocena oddzia³ywañ plazmidów na zmianê wzoru litycznego klinicznych izolatów Enterobacter cloacae. Med. Doœw. Mikrobiol. 55, 343–349 (2003) 57. O’Hara C.M., Steigerwalt A.G., Hill B.C., Farmer III J.J., Fanning G.R., Brenner D.J.: Enterobacter homraechei, a new species of the family Enterobacteriaceae formerly known as enteric group 75. J. Clin. Microbiol. 27, 2046–2049 (1989) 58. Paton A.W., Paton J.C.: Enterobacter cloacae producing a Shiga-like toxin II-related cytotoxin associated with a case of hemolytic-uremic syndrome. J. Clin. Microbiol. 34, 463–465 (1996) 59. Perilli M., Dell’Amico E., Segatore B., de Nassis M.R., Bianchi C., Luzzaro F., Rossolini G.M., Toniolo A., Nicoletti G., Amicosante G.: Molecular characterization of extendedspectrum $-lactamases produced by nosocomial isolates of Enterobacteriaceae from an Italian nationwide survey. J. Clin. Microbiol. 40, 611–614 (2002) 60. Piagnerelli M., Carlier E., Deplano A., Lejeune P., Govaerts D.: Risk factors for infection and molecular typing in patients in the intensive care unit colonized with nosocomal Enterobacter aerogenes. Infect. Contr. Hosp. Epidemiol. 23, 452–456 (2002) 61. Pitout J.D.D., Moland E.S., Sanders C.C., Thompson K.S., Fitzsimmons S.R.: $-lactamases and detection of $-lactam resistance in Enterobacter spp. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 35–39 (1997) 62. Richard C.: Genus VI. Enterobacter (w:) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, red. Murray R. G. E., Brenner D.J., Bryant M.P., Holt J.G., Krieg N.R., Moulder J.W., Pfenning N., Sneath P.H.A., Stley J.T. Williams and Wilkins, Baltimore, Hong Kong, London, Sydney, 1984, vol. I, s. 465–469 63. Riley M.A., Wertz J.E.: Bacteriocins: evolution, ecology and application.. Annu. Rev. Microbiol. 56, 117–137 (2002) 64. Samet A., Œledziñska A., Dziemaszkiewicz E., Ar³ukowicz E., Wyszczelski M., Œwica P., GrêŸlikowska H.: Charakterystyka

47

Gram-ujemnych pa³eczek Enterobacter cloacae izolowanych od pacjentów w SPSK 1 w Gdañsku w 1998 r. Klin. Chorób ZakaŸ. i Zaka¿. Szpit. 4, 23–31 (2000) 65. Sanders W.E., Jr., Sanders Ch.C.: Enterobacter sp.: pathogens poised to flourish at the turn of the century. Clin. Microbiol. Rev. 10, 220–241 (1997) 66. Schubert S., Cuenca S., Fischer D., Heeseann J.: High-pathogenicity islands of Yersinia pestis in Enterobacteriaceae isolated from blood cultures and urine samples: prevalence and functional expression. J. Infect. Dis. 182, 1268–1271 (2000) 67. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A.: Approved lists of bacterial names. Int. Syst. Bacteriol. 30, 225–420 (1980) 68. Ternover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., Swaminathan B.: Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsedfield gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J. Clin. Microbiol. 33, 2233–2239 (1995) 69. Traub W.H., Spohr M., Blech R.: Bacteriocin typing of clinical isolates of Enterobacter cloacae. J. Clin. Microbiol. 16, 885–889 (1982) 70. Tzelepi E., Giakkoupi P., Sofianou D., LoukovaV., Kemeroglou A., Tsakris A.: Detection of extended-spectrum $-lactamases in clinical isolates of Enterobacter cloacae and Enterobacter aerogenes. J. Clin. Microbiol. 38, 542–546 (2000) 71. Van der Wal F.J, Hagen C.M., Oudega B, Luirink J.: The stable bacteriocin release protein signal peptide, expressed as a separate entity, functions in the release of cloacin DF13. FEMS Microbiol. Lett. 131, 173–177 (1995) 72. Van Nierop W.H., Duse A.G., Stewart R.G., Bilgeri Y.R., Koornof H.J.: Molecular epidemiology of an outbreak of Enterobacter cloacae in the Neonatal Intensive Care Unit of a provincial hospital in Gauteng, South Africa. J. Clin. Microbiol. 36, 3085–3087 (1998) 73. Weischer M., Kolmos H.J., Kaufmann M.E., Rosdahl V.T.: Biotyping, phage typing, and O-serotyping of clinical isolates of Enterobacter cloacae. APMIS, 101, 838–844 (1993) 74. Weissfeld A.S., McNamara A.M., Tesh V.L., Howard B.J.: Chapter 16. Enterobacteriaceae (w:) Clinical and pathogenic microbiology. red. Howard B.J., Keiser J.F., Smith T.F., Weissfeld A.S., Tilton R.C., Mosby, 1997, s. 299–336 75. Zaremba M.L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska. PZWL, 2001, s. 165, 207–208

48

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 49–58 http://www.pm.microbiology.pl

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – ZAKA¯ENIA, LEKOWRA¯LIWOŒÆ I MECHANIZMY OPORNOŒCI NA ANTYBIOTYKI Anna Michalska, Eugenia Gospodarek Katedra i Zak³ad Mikrobiologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Miko³aja Kopernika w Toruniu, [email protected] Wp³ynê³o w marcu 2006 r.

1. Wstêp. 2. Zaka¿enia z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. 2.1. Czynniki predysponuj¹ce do zaka¿eñ. 2.2. Epidemiologia zaka¿eñ. 2.3. Udzia³ gatunkowy pa³eczek Enterobacter spp. w zaka¿eniach. 2.4. Zaka¿enia z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. 3. Wra¿liwoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na antybiotyki. 4. Opornoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na antybiotyki. 4.1. Mechanizmy opornoœci na antybiotyki $-laktamowe. 4.1.1. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem chromosomalnych $-laktamaz AmpC. 4.1.2. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem $-laktamaz plazmidowych. 4.1.3. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem karbapenemaz. 4.1.4. Opornoœæ spowodowana zmianami w bia³kach porynowych i wypompowywaniem antybiotyku. 4.2. Opornoœæ na aminoglikozydy. 4.3. Opornoœæ na fluorochinolony. 4.4. Opornoœæ na inne antybiotyki. 5. Podsumowanie Enterobacter spp. Bacteria – the infections, susceptibility and resistance to antibiotics Abstract: Enterobacter cloacae is frequently isolated from patients with hospital-acquired infections. As it is a part of the normal flora of the gastrointestinal tract, nosocomial infections are mostly endogenous. Enterobacter spp. strains may be the cause of bacteriemia, infections of skin and soft tissues, respiratory tract, urinary tract, and other organs. E. cloacae has an intrinsic resistance to ampicillin and to first and second generation cephalosporins like cephalothin and cefoxitin, a mechanism mediated by the production of an inducible Bush group 1 $-lactamase AmpC. Resistance to extended spectrum cephalosporins, broad spectrum penicillins and aztreonam is due to mutation in chromosomal gene ampD. Once this mutation occurs, high levels of the chromosomal $-lactamase (derepressed AmpC $-lactamase) are expressed. This phenotype commonly occurs under antibiotic treatment and Enterobacter isolates resistant to third generation cephalosporins account over 30% of the isolates from intensive care unit. Strains of Enterobacter spp. are also able to produce plasmid-encoded cephalosporinases, classical TEM, SHV, OXA enzymes, differents types of ESBLs and carbapenem-hydrolizing enzymes: NmcA, IMI-1, IMP-8, VIM2, VIM-4 and VIM-5 $-lactamases. 1. Introduction. 2. Infections caused by Enterobacter spp. 2.1. Risk factors of the infections caused by Enterobacter spp. 2.2. Epidemiology. 2.3. Participation of the Enterobacter species in the infections. 2.4. Infections caused by Enterobacter spp. 3. Susceptibility of Enterobacter spp. to antibiotics. 4. Resistance of Enterobacter spp. to antibiotics. 4.1. Resistance of Enterobacter spp. to $-laktam antibiotics. 4.1.1. Resistance due to the production of chromosomal AmpC encoding $-lactamases. 4.1.2. Resistance due to the production of plasmids encoding $-lactamases. 4.1.3. Resistance due to the production of carbapenemases. 4.1.4. Resistance due to the production of changes proteins of porins and efflux pomp. 4.2. Resistance to aminoglicosides. 4.3. Resistance to fluoroqinolones. 4.4. Resistance to other antibiotics. 5. Summary S³owa kluczowe: Key words:

1. Wstêp Gram-ujemne pa³eczki rodzaju Enterobacter s¹ rozpowszechnione w przyrodzie. Miejscem ich naturalnego bytowania jest przewód pokarmowy ludzi i zwierz¹t, gleba oraz woda [19, 20, 23, 70, 71]. Odnotowano tak¿e przypadki izolacji szczepów E. cloacae i E. aerogenes ze skóry [6]. Jako bakterie oportunistyczne sporadycznie wywo³uj¹ zaka¿enia u ludzi zdrowych [71], ale mog¹ byæ przyczyn¹ zaka¿eñ o ró¿nej lokalizacji u pacjentów hospitalizowanych, u których kolonizuj¹ drogi oddechowe, moczowe, rany [19, 20, 32, 36, 37, 70, 71, 92].

Przed er¹ antybiotykow¹ bakterie tego rodzaju nie by³y uznawane za istotny czynnik etiologiczny zaka¿eñ. Do lat 70. XX wieku zak³adano, ¿e pa³eczki te mog¹ byæ odpowiedzialne za zaka¿enia szpitalne, ale w du¿o mniejszym stopniu ni¿, np. E. coli czy Klebsiella spp. Zaka¿enia z ich udzia³em stanowi³y 5–7% wszystkich zaka¿eñ szpitalnych w USA w latach 1976–1989 [33, 71]. Wed³ug danych z NINS (National Nosocomial Infection Surveillance) od pocz¹tku lat 80. XX wieku obserwuje siê wzrost zaka¿eñ Enterobacter spp., zw³aszcza na oddzia³ach intensywnej terapii (OIT) [21, 36, 71].

50

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

2. Zaka¿enia z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. 2.1. Czynniki predysponuj¹ce do zaka¿eñ Wyst¹pieniu zaka¿eñ z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. sprzyjaj¹ liczne czynniki ryzyka: wiek pacjenta, choroby podstawowe i towarzysz¹ce, stosowanie inwazyjnych metod diagnostycznych i leczniczych (endoskopia, hemodializa, oddech wspomagany), przed³u¿ony pobyt w szpitalu, zw³aszcza na OIT, d³ugotrwa³e stosowanie antybiotyków o szerokim zakresie dzia³ania i cytostatyków [23, 61, 71, 91]. W grupie wysokiego ryzyka znajduj¹ siê chorzy o obni¿onej odpornoœci organizmu, z niedoborami immunologicznymi (chorzy z nowotworami, pacjenci leczeni immunosupresyjnie), osoby w podesz³ym wieku, noworodki urodzone przedwczeœnie z nisk¹ mas¹ urodzeniow¹, cukrzycy i pacjenci z oparzeniami [48, 61, 91]. Dodatkowymi czynnikami obci¹¿aj¹cymi jest obecnoœæ biomateria³ów i aparatury podtrzymuj¹cej funkcje ¿yciowe [20, 32, 36, 37, 54, 70, 71, 91]. 2.2. Epidemiologia zaka¿eñ Zaka¿enia pa³eczkami Enterobacter spp. mog¹ mieæ charakter egzogenny. Istotn¹ rolê w rozprzestrzenianiu siê tych bakterii czêsto stanowi aparatura medyczna. Szczepy Enterobacter spp. izolowano z respiratorów, aparatów do dializy, endoskopów, cewników, rurek tracheostomijnych, p³ynów inwazyjnych, p³ynów do dializ, roztworów soli fizjologicznej [36, 54, 68]. Odnotowano przypadki rozprzestrzeniania siê pa³eczek Enterobacter spp. przez termometry [15, 83]. Czêœciej jednak zaka¿enia pa³eczkami Enterobacter spp. maj¹ charakter endogenny i rozwijaj¹ siê u chorych wczeœniej skolonizowanych, szczególnie leczonych antybiotykami [23, 36, 71]. Os³abienie odpornoœci pacjenta i hamuj¹cy wp³yw antybiotyków na rozwój naturalnej flory sprzyjaj¹ kolonizacji pa³eczkami, co poprzedza zaka¿enie. Wrotami zaka¿eñ s¹ g³ównie: przewód pokarmowy (5–39%), drogi oddechowe (8–50%), moczowe (7–27%), ¿ó³ciowe (18–20%), linie wewn¹trznaczyniowe (6–19%), rany pooperacyjne (7–25%), oparzenia (17%) i tkanki miêkkie (2–5%) [32, 36 37, 70, 71]. Wektorem przenosz¹cym pa³eczki mo¿e byæ personel medyczny [54, 71]. 2.3. Udzia³ gatunkowy pa³eczek Enterobacter spp. w zaka¿eniach Udzia³ pa³eczek Enterobacter spp. w zaka¿eniach jest zró¿nicowany. Wœród gatunków najczêœciej izolowanych z materia³ów klinicznych s¹ E. cloacae oraz E. aerogenes, rzadziej notuje siê E. sakazakii, E. cancerogenus, E. gergoviae i E. asburiae [32, 71,87, 92].

Zaka¿enia o etiologii E. sakazakii czêœciej wystêpuj¹ u noworodków i mog¹ byæ zwi¹zane, np. ze spo¿yciem mleka w proszku [7, 19, 20, 22, 30, 68, 71, 87, 92]. 2.4. Zaka¿enia z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. Pa³eczki rodzaju Enterobacter spp. uwa¿ane s¹ za endogenn¹ florê oportunistyczn¹, która mo¿e wywo³aæ zaka¿enia szpitalne, zw³aszcza u pacjentów leczonych w OIT, oddzia³ach neonatologicznych, chirurgicznych, hematologicznych, onkologicznych i transplantologicznych [14–16, 36,–38, 48, 70, 71]. W szpitalu w wyniku stosowania w leczeniu antybiotyków o szerokim zakresie dzia³ania, zw³aszcza cefalosporyn, dochodzi do selekcji szczepów opornych, które kolonizuj¹ przewód pokarmowy hospitalizowanego chorego, staj¹c siê tym samym Ÿród³em zaka¿eñ [21, 73]. Bakterie te odpowiedzialne s¹ za zaka¿enia ró¿nych uk³adów, np. pokarmowego, oddechowego, moczowego, dróg ¿ó³ciowych oraz zaka¿enia krwi, ran skóry, tkanek miêkkich, koœci i stawów [19, 20, 32, 33, 36, 37, 68, 70, 71, 85]. Pod wzglêdem czêstoœci izolacji z materia³ów klinicznych od pacjentów hospitalizowanych pa³eczki Enterobacter spp. zajmuj¹ czwarte miejsce po E. coli, Pseudomonas spp. i Klebsiella spp. [33, 71]. Pa³eczki Enterobacter spp. zajmuj¹ trzecie miejsce pod wzglêdem czêstoœci izolacji drobnoustrojów z uk³adu oddechowego u chorych hospitalizowanych. Wspólnie z pa³eczkami Klebsiella spp., Serratia spp. stanowi¹ wa¿n¹ przyczynê zapalenia p³uc, oskrzeli, rozedmy p³uc, zw³aszcza u chorych sztucznie wentylowanych [21, 33, 71, 92] i pacjentów po przeszczepach p³uc (60–67% pacjentów), u których zaka¿enie mia³o swe Ÿród³o w przeszczepianym narz¹dzie [14, 71]. Œmiertelnoœæ z powodu zapalenia p³uc o tej etiologii wynosi 14–71% i wzrasta w porównaniu z innymi pa³eczkami Gram-ujemnymi [71]. Wœród zaka¿eñ skóry o etiologii Enterobacter spp. wymieniane s¹ najczêœciej zapalenie tkanki ³¹cznej, zapalenie miêœni, nekrotyzuj¹ce zapalenie powiêzi, zaka¿enia ropne [71]. Pa³eczki zajmuj¹ czwarte miejsce (10,3%) na liœcie przyczyn zaka¿eñ ropnych wœród chorych OIT i oddzia³ów pooparzeniowych [71]. Zaka¿enia te zwi¹zane s¹ z wczeœniejsz¹ kolonizacj¹ skóry pacjenta, zw³aszcza szczepami E. cloacae [23]. Pa³eczki Enterobacter spp. zajmuj¹ pi¹te miejsce wœród patogenów odpowiedzialnych za zaka¿enia szpitalne krwi (5,3%) i zaka¿enia uk³adu moczowego (6,1%) [71]. Zaka¿enia wystêpuj¹ zw³aszcza u chorych dializowanych, cewnikowanych, d³ugotrwale hospitalizowanych [36, 37, 54, 59, 71]. Posocznica zazwyczaj przebiega z wysok¹ (15–87%) œmiertelnoœci¹ (najwiêksza na oddzia³ach noworodkowych, oparzeniowych i transplantologii) i ma charakter zaka¿eñ

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – ZAKA¯ENIA, LEKOWRA¯LIWOŒÆ I MECHANIZMY OPORNOŒCI NA ANTYBIOTYKI

wtórnych, bêd¹cych nastêpstwem infekcji innych uk³adów [71], ale mo¿e byæ tak¿e spowodowane podaniem zanieczyszczonych p³ynów infuzyjnych [85, 87]. Gatunkami dominuj¹cymi w takich przypadkach s¹: E. cloacae i E. aerogenes [71]. Za posocznicê, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków oraz za ropnie mózgu, powstaj¹ce szczególnie po zabiegach neurochirurgicznych czêsto odpowiedzialne s¹ tak¿e szczepy E. sakazakii, wykazuj¹ce tropizm do komórek oœrodkowego uk³adu nerwowego [7, 19, 20, 22, 30, 68, 71, 87, 92]. GroŸnym dla ¿ycia pacjenta zaka¿eniem z udzia³em pa³eczek Enterobacter spp. przebiegaj¹cym z wysok¹, do 44% œmiertelnoœci¹ jest zapalenie miêœnia sercowego [71, 79]. Do zaka¿eñ predysponuj¹ szczególnie stany po zabiegach kardiochirurgicznych zwi¹zanych z wszczepieniem sztucznych zastawek i protez oraz przewlek³e choroby serca [79]. Pa³eczki rodzaju Enterobacter mog¹ byæ przyczyn¹ pooperacyjnego zapalenia ga³ki ocznej [49, 71], zapaleñ koœci i stawów, zaka¿eñ pêcherzyka ¿ó³ciowego i narz¹dów jamy brzusznej [54, 71]. 3. Wra¿liwoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na antybiotyki Wœród pa³eczek Enterobacter spp. wystêpuje zró¿nicowana wra¿liwoœæ na antybiotyki [51, 62, 75, 76]. Szczepy E. cloacae i E. aerogenes charakteryzuj¹ siê naturalnym brakiem wra¿liwoœci na aminopenicyliny, amoksycylinê z kwasem klawulanowym i tzw. „stare” cefalosporyny o w¹skim zakresie dzia³ania, np. cefazolinê, cefoksytynê [51, 71, 75]. Naturalny brak wra¿liwoœci na cefoksytynê wykazuj¹ tak¿e szczepy E. cancerogenus, E. asburiae, E amnigenus i E. hormachei [76]. Natomiast niektóre szczepy E. sakazakii i E. gergoviae mog¹ byæ wra¿liwe na te antybiotyki [62, 71, 76]. Szczepy te równie¿ s¹ wra¿liwe na aminoglikozydy [71, 76]. Od 25 do 90% szczepów Enterobacter spp. jest wra¿liwych na ureidopenicyliny i karboksypenicyliny oraz po³¹czenia tych antybiotyków z inhibitorami $-laktamaz [31, 70, 71]. Dodanie inhibitorów $-laktamaz do antybiotyków $-laktamowych nie zawsze jednak zwiêksza ich aktywnoœæ wobec pa³eczek E. aerogenes i E. cloacae, np. dodanie kwasu klawulanowego do tikarcyliny mo¿e zmniejszyæ aktywnoœæ tego antybiotyku z powodu mo¿liwoœci wyindukowania chromosomalnej $-laktamazy u tych gatunków [71, 73]. Cefalosporyny II generacji nie s¹ wystarczaj¹co aktywne wobec pa³eczek E. cloacae (naturalna œredniowra¿liwoœæ), poniewa¿ minimalne stê¿enia hamuj¹ce (MIC50) dla nich czêsto przekraczaj¹ dopuszczalne stê¿enia terapeutyczne [71]. Natomiast cefalosporyny III generacji charakteryzuj¹ siê doœæ wysok¹ aktyw-

51

noœci¹ wobec Enterobacter spp. Wra¿liwoœæ wobec cefotaksymu wykazuje 37–95% szczepów, a wobec ceftazidimu 41–94% szczepów [31, 70, 71]. Wobec cefalosporyn IV generacji jest wra¿liwych od 91 do 99% szczepów Enterobacter spp. [71]. Z antybiotyków $-laktamowych najwiêksz¹ aktywnoœæ, od 96 do 100%, wobec pa³eczek Enterobacter spp. wykazuj¹ karbapenemy. MIC50 dla tych antybiotyków jest poni¿ej dopuszczalnego stê¿enia terapeutycznego [31, 70, 71]. Wra¿liwoœæ na aminoglikozydy wœród pa³eczek Enterobacter spp. jest zró¿nicowana i dotyczy 49–100% szczepów [31, 70, 71, 76]. Szczepy E. sakazakii mog¹ byæ czêœciej wra¿liwe na aminoglikozydy w porównaniu z innymi gatunkami, co zwi¹zane jest z mniejsz¹ mo¿liwoœci¹ nabywania przez nie plazmidów zawieraj¹cych geny opornoœci na te antybiotyki [71]. Spoœród innych leków fluorochinolony wykazuj¹ aktywnoœæ wobec 64–100% szczepów Enterobacter spp., a kotrimoksazol wobec 40–100% szczepów [19, 31, 71, 92]. 4. Opornoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na antybiotyki Jednym z wa¿niejszych problemów wspó³czesnej antybiotykoterapii jest rozprzestrzenianie siê szczepów Enterobacter spp. opornych na wiêkszoœæ antybiotyków stosowanych w lecznictwie. Zwi¹zane jest to z powszechnym i czêsto nieracjonalnym stosowaniem antybiotyków o szerokim zakresie dzia³ania zw³aszcza, cefalosporyn, karbapenemów i po³¹czeñ ureidopenicylin z inhibitorami $-laktamaz [73] oraz z nabywaniem przez te drobnoustroje ró¿norodnych mechanizmów opornoœci na te leki [71]. Najczêœciej wystêpuj¹cym mechanizmem opornoœci na antybiotyki u pa³eczek Enterobacteriaceae jest wytwarzanie enzymu hydrolizuj¹cego lub modyfikujacego lek, jak ma to miejsce w przypadku opornoœci na antybiotyki $-laktamowe i aminoglikozydowe. Pozosta³e mechanizmy (zmiana miejsca docelowego dzia³ania antybiotyku, zmiana przepuszczalnoœci os³on komórkowych bakterii, aktywne wypompowywanie antybiotyku z komórki bakterii) czêœciej odpowiedzialne s¹ za opornoœæ na inne grupy antybiotyków i chemioterapeutyków, np. na trimetoprim/sulfametoksazol, fluorochinoliny [19, 28, 71, 90]. 4.1. Mechanizmy opornoœci na antybiotyki $-laktamowe 4.1.1. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem chromosomalnych $-laktamaz AmpC G³ówny mechanizm opornoœci na antybiotyki $-laktamowe u pa³eczek Enterobacter spp. zwi¹zany

52

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

jest z wytwarzaniem kodowanej chromosomalnie (przez gen ampC) indukowanej $-laktamazy AmpC, która nie jest hamowana przez kwas klawulanowy [19, 28, 31, 66, 71, 77, 78]. W naturalnych warunkach enzym ten jest wytwarzany w iloœciach œladowych, na sta³ym poziomie (ekspresja konstytutywna) [19, 28, 78]. W obecnoœci niektórych antybiotyków, zw³aszcza takich, jak ampicylina, amoksycylina, cefalosporyny I generacji, cefoksytyna, czy imipenem, wytwarzanie tego enzymu wzrasta (ekspresja indukowana) [19, 28, 78]. Zjawisko to powoduje, ¿e pa³eczki Enterobacter spp. s¹ naturalnie oporne na aminopenicyliny i cefalosporyny I i II generacji, które jednoczeœnie s¹ substratami $-laktamaz AmpC. Opornoœæ ta dotyczy te¿ po³¹czeñ aminopenicylin z inhibitorami $-laktamaz. W takich przypadkach w leczeniu zaka¿eñ nie nale¿y stosowaæ antybiotyków bêd¹cych silnymi induktorami z innymi antybiotykami $-laktamowymi, np. cefoksytyny i piperacyliny [19]. Chromosomalne $-laktamazy AmpC zazwyczaj s¹ indukowane i wystêpuj¹ u 70–80% szczepów Enterobacter spp. [81]. Enzymy te charakteryzuj¹ siê bardzo szerokim zakresem dzia³ania obejmuj¹cym g³ównie penicyliny (oprócz temocyliny) oraz cefalosporyny I–III generacji. Jednak w zale¿noœci od gatunku bakterii, mog¹ wykazywaæ ró¿n¹ aktywnoœæ. Wiêkszoœæ szczepów E. cloacae, E. aerogenes E. asburiae i E. taylorae wytwarza tego typu enzymy na wysokim poziomie. Natomiast niektóre szczepy E. gergoviae i E. sakazakii mog¹ wytwarzaæ ten enzym na bardzo niskim poziomie (ekspresja w stanie wyjœciowym ma charakter konstytutywny) lub nie wytwarzaæ go wcale, co t³umaczy ich wiêksz¹ wra¿liwoœæ na ampicylinê i cefalosporyny starszych generacji [62, 71, 76]. Czêstym zjawiskiem wœród szczepów szpitalnych E. cloacae, E. aerogenes, E. sakazakii, E. asburiae i E. cancerogenus jest, tzw. derepresja $-laktamaz AmpC [19, 28, 31, 71]. Wynika ona z pojedynczej mutacji w chromosomalnym genie ampD, który prawid³owo zapobiega nadprodukcji $-laktamazy AmpC, co prowadzi do zmiany ekspresji enzymu z indukcyjnej na konstytutywn¹. Enzym ten wytwarzany jest stale na bardzo wysokim poziomie. Czêstoœæ pojawiania siê mutacji w genach odpowiedzialnych za wytwarzanie derepresorowanych $-laktamaz AmpC w komórkach Enterobacter spp. wynosi 10–5–10–7 [28, 77]. Szczepy wytwarzaj¹ce takie enzymy s¹ oporne na wszystkie antybiotyki $-laktamowe z wyj¹tkiem karbapenemów, temocyliny i cefalosporyn IV generacji, a tak¿e na po³¹czenia $-laktamów z inhibitorami $-laktamaz [19, 28, 31, 53, 62, 71, 78]. W przypadkach bakteriemii leczonych cefalosporynami III generacji, czêstoœæ selekcji zmutowanych szczepów mo¿e wynosiæ nawet do 20% [28]. Opisano tak¿e szczepy wytwarzaj¹ce, tzw. chromosomaln¹ cefalosporynazê o rozszerzonym zakresie

substratowym, zdoln¹ do inaktywacji tak¿e karbapenemów, powsta³¹ w wyniku nadprodukcji cefalosporynazy AmpC [19, 82]. Poziom ekspresji enzymów AmpC w stanie indukcji i derepresji jest 10-krotnie wy¿szy u pa³eczek Enterobacter spp. i Citrobacter spp. ni¿ u pa³eczek Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. Wyselekcjonowane mutanty Enterobacter spp. mog¹ stanowiæ florê szpitaln¹ i dotyczyæ 15–50% szczepów izolowanych od chorych leczonych na oddzia³ach intensywnej terapii [28]. Selekcji mutantów opornych w szpitalu sprzyja szerokie stosowanie w leczeniu antybiotyków o szerokim zakresie dzia³ania, zw³aszcza cefalosporyn III generacji, które s¹ dobrymi substratami dla tych enzymów [31, 70, 71]. W zwi¹zku z rozprzestrzenianiem siê mutantów z derepresorowym genem, stosowanie cefalosporyn w zaka¿eniach pa³eczkami Enterobcter spp. nie jest wskazane, za wyj¹tkiem zaka¿eñ uk³adu moczowego, gdzie antybiotyki te osi¹gaj¹ tak wysokie stê¿enia, ¿e nawet szczepy oporne zostaj¹ zabite [19, 28, 36, 71]. 4.1.2. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem $-laktamaz plazmidowych Oprócz $-laktamaz kodowanych chromosomalnie u pa³eczek Enterobacter spp. wystêpuj¹ tak¿e kodowane plazmidowo $-laktamazy AmpC powsta³e w wyniku przeniesienia genu ampC E. cloacae z chromosomu na plazmid. Przyk³adem takich, tzw. „wtórnych $-laktamaz klasy C” wystêpuj¹cych u pa³eczek Enterobacter spp. s¹ enzymy MIR-1 [28, 66, 69 78], ACT1 [69], CMY-10 [39]. Enzymy te hydrolizuj¹ oksyimino-$-laktamy, cefamycyny i s¹ oporne na dzia³anie inhibitorów $-laktamowych. Czêsto nazywane s¹ te¿ cefamycynazami [28]. Jednym z mechanizmów opornoœci na antybiotyki $-laktamowe u pa³eczek Enterobacter spp. jest wystêpowanie kodowanych plazmidowo $-laktamaz TEM-1, TEM-2 i SHV-1 (nale¿¹cych do klasy A wg Amblera, grupa 2b wg Bush) lub OXA-1 (klasy D wg Amblera, grupa 2d wg Bush) [71]. Enzymy te nadaj¹ opornoœæ na szerokozakresowe penicyliny, np. piperacylinê i cefalosporyny I generacji u szczepów E. cloacae. Bakterie wytwarzaj¹ce takie $-laktamazy s¹ zazwyczaj wra¿liwe na szerokozakresowe cefalosporyny i po³¹czenia $-laktamów z inhibitorami $-laktamaz [19, 28, 63, 71]. Innym mechanizmem opornoœci na antybiotyki $-laktamowe wœród pa³eczek Enterobacteriaceae jest wytwarzanie enzymów o rozszerzonym profilu substratowymu (extended-spectrum $-lactamases, ESBL) z grupy 2be wg B u s h [8, 19, 28, 42, 63, 71]. Wœród pa³eczek Enterobacter spp. ten typ opornoœci na antybiotyki odnotowano w ró¿nych krajach ze zró¿nicowan¹ czêstoœci¹, np. w Hiszpanii – oko³o 0,4% szcze-

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – ZAKA¯ENIA, LEKOWRA¯LIWOŒÆ I MECHANIZMY OPORNOŒCI NA ANTYBIOTYKI

pów [8], we Francji – 2,5–53,5% [13, 74], w Wielkiej Brytanii – 33,0% [11], Grecji – 45,6% [80], Chinach – 46,7% [93], Stanach Zjednoczonych – 18,0–34,0% [41, 67], Nigerii – 20% [1]. Enzymy typu ESBL, powsta³e w wyniku mutacji punktowej w genach enzymów macierzystych TEM i SHV, warunkuj¹ opornoœæ na wiêkszoœæ antybiotyków $-laktamowych, tj. penicylin (oprócz temocyliny), cefalosporyn (oprócz cefamycyn) i monobaktamów. Szczepy Enterobacter spp. wytwarzaj¹ce enzymy typu ESBL mog¹ byæ wra¿liwe jedynie na penicyliny z inhibitorami (zw³aszcza na piperacylinê z tazobaktamem), karbapenemy i czasem na cefepim [28, 42, 53]. Po³¹czenia penicylin z inhibitorami $-laktamaz nie zawsze s¹ jednak wystarczaj¹co skuteczne [28, 42, 62, 71]. Wra¿liwoœæ ta odró¿nia je od derepresorowanych $-laktamaz, które pozostaj¹ oporne na penicyliny z inhibitorami i szerokozakresowe cefalosporyny III generacji. Wystêpowanie enzymów typu ESBL u pa³eczek Enterobacter spp. stwierdza siê czêœciej u szczepów E. aerogenes ni¿ E. cloacae [1, 80]. Dotychczas u pa³eczek Enterobacter spp. stwierdzono nastêpuj¹ce rodzaje enzymów typu ESBL: TEM-1, TEM-2, TEM-3 [13, 18, 63], TEM-8 [18], TEM-10, TEM-12 [63, 67], TEM-16 [40], TEM-20 [72], TEM-24 [8, 13, 18, 46, 56, 60, 63], TEM-26 [60, 63, 67, 72], TEM-27 [8], TEM-52 [60], TEM-80 [2], SHV-2, SHV-3, SHV-4, SHV-5 [11, 18, 46, 63], SHV-7 [41], SHV-12 [40, 60, 72] i nie spokrewnione z enzymami typu TEM i SHV enzymy: SFO-1 [47], IBC-1 [26, 38], CTM-1 [72], CTX-M-3 [17, 88], CTX-M-8 [5], CTM-10 [8], VEB-1 [27], VEB-3 [35]. Opisywane pa³eczki wytwarzaj¹ce enzymy typu ESBL, mog¹ byæ oporne równie¿ na aminoglikozydy, tetracykliny, trimetoprim, sulfonamidy i chloramfenikol, poniewa¿ opornoœæ na te antybiotyki kodowana jest na tym samym plazmidzie [63, 71]. Pojawienie siê takich szczepów w szpitalu jest sygna³em do zaostrzenia re¿imu sanitarnego i zweryfikowania polityki antybiotykowej. 4.1.3. Opornoœæ zwi¹zana z wytwarzaniem karbapenemaz Opornoœæ pa³eczek Enterobacteriaceae na karbapenemy mo¿e wynikaæ ze zmian w bia³kach porynowych, nadprodukcji, tzw. chromosomalnej cefalosporynazy o szerokim zakresie substratowym zdolnej do hydrolizy karbapenemów, a tak¿e w zwi¹zku z wytwarzaniem karbapenamaz – enzymów zaliczanych do klas: A, B i D w klasyfikacji wg Amblera [19, 58, 78, 90]. Ostatni mechanizm jest najczêstsz¹ przyczyn¹ opornoœci na tê grupê antybiotyków, równie¿ wœród pa³eczek Enterobacter spp. Pierwsze dwa szczepy E. cloacae oporne na imipenem izolowano w 1984 roku w Kalifornii, w Stanach

53

Zjednoczonych [58, 64, 65], a nastêpny we Francji w 1990 roku (E. cloacae, szczep NOR-1) [57, 58, 64]. Szczepy te wytwarza³y, oprócz $-laktamaz TEM-1 oraz AmpC kodowane chromosomalnie, $-laktamazy oznaczone jako IMI-1 (szczepy amerykañskie) i NmcA (szczep francuski). Enzymy IMI-1 i NmcA (nonmetallocarbapenamase of class A, NmcA) zaliczane s¹ do grupy 2f wg B u s h (do klasy A wg Amblera). Posiadaj¹ w centrum aktywnym aminokwas serynê. Obydwa enzymy nale¿¹ do niemetaloenzymów i wykazuj¹ 95% podobieñstwo homologicznych sekwencji [50, 58, 64, 65, 78]. Z tego powodu uwa¿a siê, ¿e IMI-1 mo¿e byæ typem $-laktamazy Nmc. Enzymy te, indukowane przez cefoksytynê lub imipenem, hydrolizuj¹ karbapenemy (przy czym imipenem szybciej jest hydrolizowany ni¿ meropenem), aminokarboksypenicyliny, monobaktamy i cefalosporyny starszych generacji (np. cefalotynê). Szczepy wykazuj¹ce ten typ opornoœci zachowuj¹ wra¿liwoœæ na cefalosporyny III i IV generacji [19, 50, 65, 78]. Oba enzymy s¹ hamowane przez inhibitory $-laktamaz. Tazobaktam jest bardziej skuteczny wobec IMI-1, a kwas klawulanowy wobec NmcA [57, 58, 65, 78]. Stwierdzono tak¿e, ¿e ekspresja obu enzymów jest regulowana przez region regulatorowy Lys-R zwany NmcR, który odgrywa rolê aktywatora biosyntezy karbapenemazy przy obecnoœci induktora. Ponadto wykryto, ¿e gen ampD odpowiedzialny za regulacjê chromosomalnej $-laktamazy AmpC mo¿e regulowaæ równie¿ ekspresjê enzymu NmcA, a mutacja w tym genie mo¿e prowadziæ jednoczeœnie do nadprodukcji chromosomalnej cefalosporynazy AmpC i ekspresji karbapenemazy NmcA [52, 58, 64]. W 2001 roku wyizolowano od pacjenta z Bostonu pierwszy szczep pa³eczek Enterobacter spp. wytwarzaj¹cy serynozale¿ny enzym KPC-2 (nazwa pochodzi od szczepu Klebsiella pneumoniae, u którego po raz pierwszy wykryto w 2001 roku karbapenemazê KPC-1) [29]. Enzym ten nale¿y do klasy A wg Bush i wykazuje 45% podobieñstwo aminokwasów do enzymu Sme-1 Serratia marcescens oraz 90% homologii z enzymami NmcA i IMI-1. Zakres dzia³ania pozostaje taki, jak u wszystkich serynozale¿nych karbapenemaz klasy A. Kolejn¹ grup¹ enzymów hydrolizuj¹cych karbapenemy wystêpuj¹c¹ wœród pa³eczek Enterobacter spp. s¹ metaloenzymy zawieraj¹ce atom cynku w centrum aktywnym enzymu. Nale¿¹ one do grupy 3 wg B u s h (do klasy B wg Amblera). Geny koduj¹ce wytwarzanie tych enzymów znajduj¹ siê na chromosomie, plazmidach lub integronach [19, 28, 58, 66, 78]. W przeciwieñstwie do niemetaloenzymów klasy A, enzymy tej grupy nie hydrolizuj¹ monobaktamów i s¹ oporne na dzia³anie znanych inhibitorów $-laktamaz (kwasu klawulanowego, sulbaktamu, tazobaktamu), ale ulegaj¹ inaktywacji pod wp³ywem dzia³ania zwi¹zków

54

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

chelatuj¹cych, np. EDTA. W spektrum substratowym metaloenzymów znajduj¹ siê natomiast szerokozakresowe penicyliny (aminopenicyliny, ureidopenicyliny), cefalosporyny (zw³aszcza III–IV generacji), cefamycyny i karbapenemy [28, 58, 66, 78]. Enzymy te podzielono na cztery grupy: typu IMP 1–18, typu VIM 1–13 (nazwa pochodzi od miejsca wykrycia pierwszego enzymu w 1997 roku – Verona IMipenemase, VIM), typu SPM-1 (Sao Paulo metallo-$-lactamase, SPM), GIM-1 (German IMipenemase, GIM – wykryty w 2002 roku) [34, 43, 58, 84, 89]. Niewiele jest doniesieñ na temat metaloenzymów wœród pa³eczek Enterobacter spp. [34, 43, 58, 89]. Dotychczas wykryto u nich nastêpuj¹ce metaloenzymy klasy B hydrolizuj¹ce karbapenemy: IMP-8 (wykryty w latach 1999–2000 u szczepów pochodz¹cych od 20 pacjentów na Tajwanie) [89], VIM-2 (u szczepu od pacjenta z Korei w 2000 roku) [34, 58], VIM-4 (u szczepu od pacjentki we W³oszech w 2002 roku, pierwsze doniesienie z Europy) [43], VIM-5 (u szczepu od pacjenta w Turcji w 2002 roku) [24]. We wszystkich przypadkach wykrycia opornoœci na karbapenemy z powodu wytwarzania cynkozale¿nych enzymów klasy B, pacjenci byli leczeni przez d³u¿szy czas karbapenemami. Chocia¿ wytwarzanie tych enzymów zdarza siê bardzo rzadko, oczywistym jest fakt, ¿e izolacja takich szczepów z materia³ów klinicznych winna prowadziæ do ograniczenia zu¿ycia karbapenemów. 4.1.4. Opornoœæ spowodowana zmianami w bia³kach porynowych i wypompowywaniem antybiotyku Jednym z mechanizmów opornoœci bakterii na antybiotyki mog¹ byæ zmiany w przepuszczalnoœci os³on komórkowych i bia³ek porynowych [19]. Pa³eczki Enterobacter spp. mog¹ w ten sposób wykazywaæ opornoœæ na karbapenemy i inne antybiotyki $-laktamowe. Z piœmiennictwa [4, 9, 10, 12, 82, 90] wynika, ¿e zmiana przepuszczalnoœci lub brak ekspresji bia³ek porynowych OmpF (o masie cz¹st. 39-kDa) i OmpC (o masie cz¹st. 42-kDa) powoduje pojawienie siê szczepów E. aerogenes opornych na imipenem i jednoczeœnie œredniowra¿liwych na meropenem i cefepim. Znane s¹ te¿ szczepy Enterobacter spp. oporne na antybiotyki $-laktamowe z powodu czynnego wypompowywania leku z komórki na zasadzie „pompy” [3, 44]. 4.2. Opornoœæ na aminoglikozydy Opornoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na aminoglikozydy wynika przede wszystkim z wytwarzania enzymów modyfikuj¹cych antybiotyk [55, 71]. Wœród enzymów tych dominuj¹ acetylotransferazy (AAC): AAC(3)-II, AAC(6’)-II, AAC(3)-III, AAC(3)-I,

AAC(3)-V, rzadziej natomiast wystêpuj¹ nukleotydotransferazy (AAD lub ANT), np. ANT(2”). W wyniku dzia³ania tych enzymów powstaj¹ acetylo-, nukleotydylopoochodne formy antybiotyku, które nie wykazuj¹ dzia³ania w miejscu docelowym antybiotyku, czyli na podjednostkê 30S rybosomu. Jednoczesna synteza kilku enzymów modyfikuj¹cych antybiotyk mo¿e doprowadziæ do opornoœci szczepów na wszystkie antybiotyki aminoglikozydowe. Geny opornoœci na te antybiotyki znajduj¹ siê na plazmidach lub transpozonach, obok genów warunkuj¹cych wytwarzanie enzymów typu ESBL. St¹d, oba typy opornoœci mog¹ wystêpowaæ razem [63, 71]. 4.3. Opornoœæ na fluorochinolony Geny opornoœci na fluorochinolony zlokalizowane s¹ na chromosomie bakteryjnym. Podstawowym mechanizmem opornoœci na fluorochinolony wœród pa³eczek Enterobacter spp. s¹ mutacje w genie gyrA koduj¹cym podjednostkê A gyrazy DNA. Efektem takich mutacji jest synteza enzymów, które przestaj¹ byæ miejscem docelowego dzia³ania fluorochnolonów, które blokuj¹c podjednostkê gyrazy doprowadza³y do zahamowania replikacji i œmierci komórki [25, 86]. Opornoœæ niskiego stopnia na fluorochinolony, podobnie jak na chloramfenikol, mo¿e byæ spowodowana czynnym usuwaniem antybiotyku z komórki („efflux pomp”) [44, 45]. 4.4. Opornoœæ na inne antybiotyki Naturalna opornoœæ pa³eczek Enterobacter spp. na rifampicynê, linkozamidy, makrolidy (z wyj¹tkiem azytromycyny), glikopeptydy, streptograminy i kwas fusydowy zwi¹zana jest z nieprzepuszczalnoœci¹ b³ony zewnêtrznej pa³eczek Enterobacteriaceae [76]. 5. Podsumowanie W ostatnich latach w wielu krajach notuje siê dynamiczny wzrost znaczenia pa³eczek Enterobacter spp. w zaka¿eniach szpitalnych. Bakterie te charakteryzuj¹ siê naturaln¹ opornoœci¹ na aminopenicyliny, amoksycylinê z kwasem klawulanowym i cefoksytynê. Z gatunków tego rodzaju najczêœciej uznawanymi za patogenne dla ludzi s¹: E. cloacae, E aerogenes i E. sakazakii. Wrotami zaka¿eñ dla tych drobnoustrojów s¹ g³ównie przewód pokarmowy, drogi oddechowe, moczowe, ¿ó³ciowe, linie wewn¹trznaczyniowe, rany, oparzenia i tkanki miêkkie. Bakterie mog¹ wywo³ywaæ zaka¿enia dróg moczowych, oddechowych, ¿ó³ciowych, zaka¿enia ran, skóry, tkanek miêkkich, koœci, stawów, posocznice i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – ZAKA¯ENIA, LEKOWRA¯LIWOŒÆ I MECHANIZMY OPORNOŒCI NA ANTYBIOTYKI

Najczêœciej wystêpuj¹cym mechanizmem opornoœci u pa³eczek Enterobacter spp. na antybiotyki jest wytwarzanie kodowanej chromosomalnie indukowanej $-laktamazy AmpC. Czêstym zjawiskiem u wielu szczepów szpitalnych E. cloacae, E. aerogenes, E. sakazakii, E. asburiae i E. cancerogenus jest, tzw. derepresja $-laktamaz AmpC powsta³a na skutek mutacji chromosomalnej w genie ampD. Prowadzi ona do zmiany ekspresji enzymu z indukcyjnej na konstytutywn¹. Szczepy wytwarzaj¹ce derepresorowane enzymy charakteryzuj¹ siê opornoœci¹ na wszystkie antybiotyki $-laktamowe z wyj¹tkiem karbapenemów i cefalosporyn IV generacji, a tak¿e na po³¹czenia $-laktamów z inhibitorami $-laktamaz. Pa³eczki Enterobacter spp. mog¹ wytwarzaæ tak¿e kodowane plazmidowo $-laktamazy typu AmpC, klasyczne enzymy typu TEM, SHV, OXA, enzymy typu ESBL i karbapenemazy: IMI-1 i NmcA, IMP-8, VIM-2, VIM-4, VIM-5. Selekcji opornych mutantów w szpitalu sprzyja powszechne stosowanie w leczeniu zaka¿eñ antybiotyków o szerokim zakresie dzia³ania, zw³aszcza cefalosporyn III generacji i karbapenemów. Piœmiennictwo 1. Aibinu I.E., Ohaegbulam V.C., Adenipekun E.A., Ogunsola F.T., Odugbemi T.O., Mee B.J.: Extended-spectrum $-lactamase enzymes in clinical isolates of Enterobacter species from Lagos, Nigeria. J. Clin. Microbiol. 41, 2197–2200 (2003) 2. Arpin C., Labia R., Dubois V., Noury P., Souquet M., Quentin C.: TEM-80, a novel inhibitor-resistant $-lactamase in a clinical isolate of Enterobacter cloacae. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1183–1189 (2002) 3. Bornet C., Chollet R., Mallea M., Chevalier J., Davin-Regli A., Pages J.M., Bollet C.: Imipenem and expression of multidrug efflux pump in Enterobacter aerogenes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301, 985–990 (2003) 4. Bornet C., Davin-Regli A., Bosi C., Pages J.M., Bollet C.: Imipenem resistance of Enterobacter aerogenes mediated by outer membrane permeability. J. Clin. Microbiol. 38, 1048–1052 (2000) 5. Bonnet R., Sampaio J.L., Labia R., De Champs C., Sirot D., Chanal C., Sirot J.: A novel CTX-M $-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolated in Brasil. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1936–1942 (2000) 6. Brenner D.J.: Chapter 95. The genus Enterobacter (w:) The Procaryotes. A handbook on habitats, isolation and identification of bacteria. red. Starr M.P., Stolp H., Trüper H.G., Balows A. Schilgel H.G., Springer Verlag, Berlin, 1981, s. 1173–1180 7. Burdette J.H., Santos C.: Enterobacter sakazaki brain abscess in the neonate: the importance of neuroradiologic imaging. Pediatr. Radiol. 30, 33–34 (2000) 8. Cantón R., Oliver A., Coque T.M., Varela M.C., Perez-Diaz J.C., Baquero F.: Epidemiology of extended-spectrum $-lactamase-producing Enterobacter isolates in a spanish hospital during 12-year period. J. Clin. Microbiol. 40, 1237–1243 (2002) 9. Charrel R.N., Pages J.M., Micco P.D., Mallea M.: Prevalence of outer membrane porinalteration in $-lactam antibiotic-

55

resistant Enterobacter aerogenes. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 2854–2858 (1996) 10. Chow J.W., Shlases D.M.: Imipenem resistance associated with the loss of a 40 kDa outer membrane protein in Enterobacter aerogenes. J. Antimicrob. Chemother. 28, 499–504 (1991) 11. Crowley B., Ratcliffe G.: Extended-spectrum $-lactamases in Enterobacter cloacae: underestimated but clinically significant. J. Antimicrob. Chemother. 51, 1316–1317 (2003) 12. De Champs C. Henquell C., Guelon D., Sirot D., Gazuy N., Sirot J.: Clinical and bacteriological study of nosocomial infections due to Enterobacter aerogenes resistant to imipenem. J. Clin. Microbiol. 31, 123–127 (1993) 13. De Champs C., Sirot D., Chanal C., Bonnet R., Sirot J., and the French Study Group.: A 1998 survey of extended-spectrum $-lactamases in Enterobacteriaceae in France. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3177–3179 (2000) 14. Deusch E.A., Grimm M., Graninger W., Kleptko W., Wolner E.: Early bacterial infections in lung transplant recipients. Chest 104, 1412–1416 (1993) 15. Dijk Y., Bik E.M., Hochstenbach-Vernooij S., Vlist G.J., Savelkoul P.H.M., Kaan J.A., Diepersloot R.J.A.: Management of an outbreak of Enterobacter cloacae in a neonatal unit using simple preventive measures. J. Hosp. Infect. 51, 21–26 (2002) 16. Dorsey G., Borneo H.T., Sun S.J., Wells J., Steele L., Howland K., Perdreau-Remington F., Bangsberg D.R.: A heterogenous outbreak of Enterobacter cloacae and Serratia marcescens infections in a surgical intensive care unit. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 21, 465–469 (2000) 17. Doucet-Populaire F., Ghnassia J.C., Bonnet R., Sirot J.: First isolation of CTX-M-3 producing Enterobacter cloacae in France. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3239–3240 (2000) 18. Dumarche P., de Champs C., Sirot D., Chanal C., Bonnet R., Sirot J.: TEM derivative-producing Enterobacter aerogenes strains: dissemination of prevalent clone. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1128–1131 (2002) 19. Dzier¿anowska D.: Antybiotykoterapia praktyczna. "-medica press, Bielsko-Bia³a, 2000, s. 184–185 20. Dzier¿anowska D., Jeliaszewicz J.: Zaka¿enia szpitalne. "medica press, Bielsko-Bia³a, 1999, s. 84–90 21. Falkiner F.R.: Enterobacter in hospital. J. Hosp. Infect. 20, 137–140 (1992) 22. Farmer J.J., Asbury M.A. Hickman F. W., Brenner D.J.: Enterobacter sakazaki: a new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. Int. J. Syst. Bacteriol. 30, 569–584 (1980) 23. Flynn D.M. Weinstein R.A., Nathan C.: Patient’s endogenous flora as the source of nosocomial Enterobacter in cardiac surgery. J. Infect. Dis. 156, 363–368 (1987) 24. Gacar G.G., Midilli K., Kolayli F., Ergen K., Gundes S., Hosoglu S., Karadenizli A., Vahaboglu H.: Genetic and enzymatic properties of metallo-$-lactamase VIM-5 from a clinical isolate of Enterobacter cloace. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4400–4403 (2005) 25. Georgopoulos A., Schein R., Buxbaum A.: Mechanism of quinolone in clinical isolates of Enterobacter clocae. Clin. Microbiol. Infect. 4, 2–4 (1998) 26. Giakkoupi P., Tzouvelekis L.S., Tsakris A., Loukova V., Sofianou D., Tzelepi E.: IBC-1, a novel integron-associated clas A $-lactamase with extended-spectrum properties produced by an Enterobacter cloacae clinical strain. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 2247–2253 (2000)

56

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

27. Girlich D., Poirel L., Leelaporn A., Karim A., Tribuddharat C., Fenevald M., Nordmann P.: Molecular epidemiology of the integron-located VEB-1 extended-spectrum $-lactamase in nosocomial enterobacterial isolates in Bangkok, Thailand. J. Clin. Microbiol. 39, 175–182 (2001) 28. Gniadkowski M.: $-laktamazy u pa³eczek Gram-ujemnych. Mikrobiologia Medycyna 2, 17–24 (1997) 29. Hossain A., Ferraro M.J., Pino R.M., Dew R.B., Moland E.S., Lockhart T.J., Thomson K.S., Goering R.V., Hanson N.D.: Plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 in an Enterobacter spp. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 4438–4440 (2004) 30. Huang C.R., Chang W.N., Lu C.H.: Adult Enterobacter meningitis: a high incidence of coinfection with other pathogens and frequent association with neurosurgical procedurs. Infect. 29, 75–79 (2001) 31. Janicka G., Kania I., K³yszejko Cz., Wróblewski M., Ulatowska B.: Wra¿liwoœæ na antybiotyki niektórych gatunków rodzaju Enterobacter izolowanych z ró¿nych materia³ów klinicznych. Wiad. Lek. 53, 9–10 (2000) 32. Janicka G., Kania I., Ulatowska B., Kruszyñska E., Wojda M.: Wystêpowanie pa³eczek z rodzaju Enterobacter w materia³ach klinicznych i pobranych ze œrodowiska szpitalnego. Wiad. Lek. 52, 11–12 (1999) 33. Jarvis W.R., Martone W.J.: Predominant pathogens in hospital infections. J. Antimicrob. Chemother. 29 (supl. A.), 19–24 (1992) 34. Jeong S.H., Lee K., Chong Y., Yum J.H., Lee S.H., Choi H.J., Kim J.M., Park K.H., Han B.H., Lee S.W. i wsp.: Characterization of a new integron containing VIM-2, a metallo-$-lactamase gene cassette, in a clinical isolate of Enterobacter cloacae. J. Antimicrob. Chemother. 51, 397–400 (2003) 35. Jiang X, Ni Y, Jiang Y., Yuan F., Han Kamieñska, Li Kamieñska, Liu H., Yang L., Lu Y: Outbreak of infection caused by Enterobacter cloacae producing the novel VEB-3 $-lactamase in China. J. Clin. Microbiol. 43, 826–831 (2005) 36. Kamiñska W., Murawska B., Dzier¿anowska D.: Zaka¿enia Enterobacter cloacae na Oddziale Dializoterapii i Transplantologii. Terapia, 3, 8–10 (1999) 37. Kamiñska W., Patzer J., Dzier¿anowska D.: Urinary tract infections caused by endemic multi-resistant Enterobacter cloacae in a dialysis and transplantation unit. J. Hosp. Infect. 51, 215–220 (2002) 38. Kartali G., Tzelepi E., Pournaras S., Kontopoulou C., Kontos F., Sofianou D., Manitias A.N., Tsakris A.: Outbreak of infections caused by Enterobacter cloacae producing the integron-associated-$-lactamase IBC-1 in a neonatal intensive care unit of a Greek hospital. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1577–1580 (2002) 39. Lee S.H., Jeong S.H., Park Y.M.: Characterization of blaCMY-10 a novel, plasmid-encoded AmpC-type $-lactamase gene in a clinical isolate of Enterobacter aerogenes. J. Appl. Microbiol. 95, 744–752 (2003) 40. Lee S.H., Jeong S.H., Shin S.H., An Y.J., Choi Y.W., Jung Y.CH., Jung H.I., Sohn E.S., Jeong S.H., Lee K.J.: Dissemination of SHV-12 and characterization of new AmpCtype $-lactamase genes among clinical isolates of Enterobacter species in Korea. J. Clin. Microbiol. 41, 2477–2482 (2003) 41. Levison M.E., Mailapur Y.V., Pradhan S.K., Jacoby G.A., Adams P., Emery Ch.L., May P.L., Pitsakis P.G.: Regional occurrence of plasmid-mediated SHV-7, an extended-spectrum $-lactamase, in Enterobacter cloacae in Philadelphia teaching hospitals. Clin. Infect. Dis. 35, 1551–1554 (2002)

42. Livemore D.M.: $-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microb. Rev. 8, 557–584 (1995) 43. Luzzaro F., Docquier J.D., Colion C., Endimiani A., Lombardi G., Amicosante G., Rossolini G.M., Toniolo A.: Emergence in Klebsiella pneumoniae and Enterobacter cloacae clinical isolates of the VIM-4 metallo-$-lactamase encoded by a conjugative plasmid. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 648–50 (2004) 44. Malléa M, Chevalier J., Bornet C., Eyraud A., Davin-Regli A., Bollet C., Pagès J.M.: Porin alterations and active efflux: two in vivo drug resistance strategies used by Enterobacter aerogenes. Microbiology, 144, 3003–3009 (1998) 45. Malléa M., Chevalier J., Eyaud A., Pagés J.P.: Inhibitors of antibiotic efflux pump in Enterobacter aerogenes strains. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 1370–1373 (2002) 46. Mammeri H., Laurans G., Eveillard M., Castelain S., Eb F.: Coexisistence of SHV-4 and TEM-24-producing Enterobacter aerogenes strains before a large outbreak of TEM-24-producing strains in a Franch hospital. J. Clin. Microbiol. 39, 2184–2190 (2001) 47. Matsumoto Y., Inoue M.: Characterization of SFO-1, a plasmid-mediated inducible class A $-lactamase from Enterobacter cloacae. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 307–13 (1999) 48. McConkey S.J., Coleman D.C., Falkiner F.R., McCann S.R., Daly P.A.: Enterobacter cloacae in a haematology/oncology ward – first impressions. J. Hosp. Infect. 14, 277–284 (1989) 49. Mirza E.G., Karakûcûk S., Doganay M., Caglayangil A.: Postoperative endophtalmitis caused by Enterobacter species. J. Hosp. Infect. 26, 167–172 (1994) 50. Mourey L., Kotra L.P., Bellettini J., Bulychev A., O’Bien M., Miller M.J., Mobashery S., Samama J.P.: Inhibition of the broad spectrum nonmetallocarbapenamase of class A (NMC-A) $-lactamaase from Enterobacter cloacae by monocyclic $-lactams. J. Biol. Chem. 274, 25260–25265 (1999) 51. Mutjens H.L., van der Ros-van de Repe J.: Comparative in vitro susceptibilities of eight Enterobacter species, with special reference to Enterobacter sakazaki. Antimicrob. Agents Chemother. 29, 367–370 (1986) 52. Naas T., Massuard S., Garnier F., Nordmann P.: AmpD is required for regulation of expression of NmcA, a carbapenemhydrolizing $-lactamase of Enterobacter cloacae. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2908–2915 (2001) 53. Naumiuk £., Samet A., Dziemaszkiewicz E.: Cefepime in vitro activity against derepressed extended-spectrum $-lactamase ESbL-producing and non-ESbL-producing Enterobacter cloacae by a disk diffusion method. J. Antimicrob. Chemother. 48, 321–322 (2001) 54. Naskalski J.W.: Zaka¿enia bakteryjne w œrodowisku szpitalnym – wybrane problemy. Charakterystyka wybranych drobnoustrojów oportunistycznych jako czynnika zaka¿eñ szpitalnych. Badanie i Diagnoza, 7, 53–64 (2001) 55. Neonakis I., Gikas A., Scoulica E., Manios A., Georgiladakis A., Tselentis Y.: Evolution of aminoglycoside resistance phenotypes of four Gram-negative bacteria: an 8-year survey in a University Hospital in Greece. J. Antimicrob. Agents. 22, 526–531 (2003) 56. Neuwirth C., Siebor E., Lopez J., Pechinot A., Kazmierczak A.: Outbreak of TEM-24-producing Enterobacter aerogenes in an intensive care unit and dissemination of the extendedspectrum $-lactamase to other members of the family Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 34, 76–79 (1996) 57. Nordmann P., Mariotte S., Naas T., Nicolas MH.: Biochemical properties of a carbapenem-hydrolizyng $-lacta-

PA£ECZKI ENTEROBACTER SPP. – ZAKA¯ENIA, LEKOWRA¯LIWOŒÆ I MECHANIZMY OPORNOŒCI NA ANTYBIOTYKI

mase from Enterobacter cloacae and cloning of the gene into Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 936–946 (1993) 58. Nordmann P., Poirel L.: Emerging carbapenemases in Gramnegative aerobes. Clin. Microbiol. Infect. 8, 321–331 (2002) 59. Paton A.W., Paton J.C.: Enterobacter cloacae producing a Shiga-like toxin II-related cytotoxin associated with a case of hemolytic-uremic syndrome. J. Clin. Microbiol. 34, 463– 465 (1996) 60. Perilli M., Dell’Amico E., Segatore B., de Nassis M.R., Bianchi C., Luzzaro F., Rossolini G.M., Toniolo A., Nicoletti G., Amicosante G.: Molecular characterization of extendedspectrum â-lactamases produced by nosocomial isolates of Enterobacteriaceae from an Italian nationwide survey. J. Clin. Microbiol. 40, 611–614 (2002) 61. Piagnerelli M., Kennes B., Brogniez Y., Deplano A., Govaerts D.: Outbreak of nosocomal multidrug-resistant Enterobacter aerogenes in a geriatric unit: failure of isolation contact, analysis of risk factors, and use of pulsed-field gel electrophoresis. Infect. Control. Hospit. Infect. 21, 651–653 (2000) 62. Pitout J.D.D., Moland E.S., Sanders C.C., Thompson K.S., Fitzsimmons S.R.: $-lactamases and detection of $-lactam resistance in Enterobacter spp. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 35–39 (1997) 63. Pitout J.D.D., Thompson K.S., Hanson N.D., Ehrhardt A.F., Coudron P., Sanders Ch.C.: Plasmid-mediated resistance to expanded-spectrum cephalosporins among Enterobacter aerogenes strains. Antimicob. Agents Chemother. 42, 596–600 (1998) 64. Pottumarthy S., Moland E.S., Juretschko S., Swanzy S.R. Thompson K.S., Fritsche T.R.: NmcA carbapenem-hydrolizing enzyme in Enterobacter cloacae in North America. Emerg. Infect. Dis. 9, 999–1002 (2003) 65. Rasmussen B.A., Bush K., Keeney D., Yang Y., Hare R., O’Gara C., Medeiros A.A.: Chracterization of IMI-1 $-lactamase, a class A carbapenem-hydrolizing enzyme from Enterobaacter cloacae. Antimicob. Agents Chemother. 40, 2080–2086 (1996) 66. Rice L.B., Bonomo R.A: $-lactamases: which ones are clinically important? Drug Resistance Updates, 3, 178–189 (2000) 67. Rice L.B., Wiley S.H., Papanicolaou G.A., Medeiros A.A., Eliopoulos G.M., Moellering R.C., Jacoby G.A.: Outbreak of ceftazidime-resistance caused by extended-spectrum $lactamases at a Massachusetts chronic-care facility. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2193–2199 (1990) 68. Richard C.: Genus VI. Enterobacter. (w:) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, red. Murray R. G. E., Brenner D. J., Bryant M. P., Holt J. G., Krieg N. R., Moulder J. W., Pfenning N., Sneath P. H. A., Stley J. T. Williams and Wilkins, Baltimore, Hong Kong, London, Sydney, 1984, vol. I, s. 465–469 69. Rottman M., Benzerara Y., Hanau-Bercot B., Bizet Ch., Philippon A., Arlet G.: Chromosomal ampC genes in Enterobacter species other than Enterobacter cloacae and ancestral association of the ACT-1 plasmid-encoded cephalosporinase to Enterobacter asburiae. FEMS Microbiol. Lett. 210, 87– 92 (2002) 70. Samet A., Œledziñska A., Dziemaszkiewicz E., Ar³ukowicz E., Wyszczelski M., Œwica P., GrêŸlikowska H.: Charakterystyka Gram-ujemnych pa³eczek Enterobacter cloacae izolowanych od pacjentów w SPSK 1 w Gdañsku w 1998 r. Klin. Chorób ZakaŸ. i Zaka¿. Szpit. 4, 23–31 (2000)

57

71. Sanders W.E., Jr., Sanders Ch.C.: Enterobacter spp.: pathogens poised to flourish at the turn of the century. Clin. Microbiol. Rev. 10, 220–241 (1997) 72. Sanguinetti M., Posterano B., Spanu T., Ciccaglione D., Romano L., Fiori B., Nicoletti G., Zanetti S., Fadda G.: Characterization of clinical isolates of Enterobacteriaceae from Italy by BD Phoenix extended-spectrum $-lactamase detection method. J. Clin. Microbiol. 41, 1463–1468 (2003) 73. Schwaber M.J., Graham C.S., Sands B.E., Gold H.S., Carmeli Y.: Treatment with a broad-spectrum cephalosporin versus piperacillin-tazobactam and the risk for isolation of broad-spectrum cephalosporin-resistant Enterobacter species. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 1882–1886 (2003) 74. Sirot D., Goldstein F.W. Soussy C.J., Courtieu A.L., Husson M.G., Lemozy J., Meyran M., Morel C., Perez R., QuentinNoury C., Reverdy M.E., Scheftel J.M., Rosembaum M., Rezvani Y.: Resistance to cefotaxym and seven other $-lactams in members of the family Enterobacteriaceae: a 3-years survey in France. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 128– 131 (1992) 75. Stock I.: Natural antibiotic susceptibility of Enterobacter spp., with special reference to Enterobacter aerogenes and Enterobacter intermedius strains. J. Chemother. 14, 444–460 (2002) 76. Stock I., Wiedemann B.: Natural antibiotic susceptibility of Enterobacter amnigenus, Enterobacter cancerogenus, Enterobacter gergoviae and Enterobacter sakazaki strains. Clin. Microbiol. Infect. 8, 564–578 (2002) 77. Tejedor-Junco M.T., Gonzalez-Martin M., Gonzalez-Lama Z.: Type I $-lactamases of Enterobacter cloacae and resistance to $-lactam antibiotics. Folia Microbiol. 43, 683–686 (1998) 78. Thomson K.S., Moland E.S.: Version 2000: the new $-lactamases of Gram-negative bacteria at the dawn of the new millennium. Microb. Infect. 2, 1225–1235 (2000) 79. Tunkel A.R., Fisch M.J., Schlein A., Schled W.M.: Enterobacter endocarditis. J. Infect. Dis. 24, 233–240 (1992) 80. Tzelepi E., Giakkoupi P., Sofianou D., Loukovw V., Kemeroglou A., Tsakris A.: Detection of extended spectrum $-lactamases in clinical isolates of Enterobacter cloacae and Enterobacter aerogenes. J. Clin. Microbiol. 38, 542–546 (2000) 81. Tzelepi E., Tzouvelekis L.S., Vatopoulos A.C., Mentis A.F., Tsakris A., Legakis N.J.: High prevalence of stably derepressed clas-I-$-lactamase expression in multiresistant clinical isolates of Enterobacter cloacae from Greek hospitals. J. Med. Microbiol. 37, 91–95 (1992) 82. Tzouvelekis L.S., Tzelepi E., Mentis A.F., Vatopoulos A.C., Tsakris A.: Imipenem resistance in Enterobacter aerogenes is associated with derepression of chromosomal cephalosporinases and imipaired permeability. FEMS Microbiol. Lett. 74, 195–199 (1992) 83. Van der Berg R.W.A., Claahsen H.L., Niessen M., Muytjens H.L., Liem K., Voss A.: Enterobacter cloacae outbreak in the NICU related to disinfected thermometers. J. Hosp. Infect. 45, 29–34 (1999) 84. Walsh T.R.: The emergence and implications of metallo-$lactamases in Gram-negative bacteria. Clin. Microbiol. Infect. 11, (Suppl. 6), 2–9 (2005) 85. Wang S.A., Jarvis W.R. i wsp.: Enterobacter cloacae bloodstream infections traced to contaminated human albumin. Clin. Inf. Dis. 30, 35–40 (2000) 86. Weigel L.M., Steward Ch.D., Tenover F.C.: gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in eight species of Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 2661–2667 (1998)

58

ANNA MICHALSKA, EUGENIA GOSPODAREK

87. Weissfeld A.S., McNamara A.M., Tesh V.L., Howard B.J.: Chapter 16. Enterobacteriaceae (w:) Clin. Path. Microb. red. Howard B.J., Keiser J.F., Smith T.F., Weissfeld A.S., Tilton R.C., Mosby, s. 299–336 (1997) 88. Yamasaki K., Komatsu M., Yamashita T., Shimakawa K., Ura T., Nishio H., Satoh K., Washidu R., Kinoshita S., Aihara M.: Production of CTX-M-3 extended-spectrum $-lactamase and IMP-1 metallo-$-lactamase by five Gramnegative bacilli: survey of clinical isolates from seven laboratories collected in 1998 and 2000, in the Kinki region of Japan. J. Antimicrob. Chemother. 51, 631–638 (2003) 89. Yan J.J., Ko W.Ch., Chuang Ch.L., Wu J.J.: Metallo-$-lactamase-producing Enterobacteriaceae isolates in a university hospital in Taiwan: prevalence of IMP-8 in Enterobacter cloacae and first identification of VIM-2 in Citro-

bacter freundii. J. Antimicrob. Chemother. 50, 503–511 (2002) 90. Yigit H., Anderson G.J., Biddle J. W., Steward Ch.D., Rashed J.K., Valera L.L., McGowan J.E., Tenover F.C.: Carbapenem resistance in a clinical isolate of Enterobacter aerogenes is associated with decreased expression of OmpF and OmpC porin analogs. Antimicob. Agents Chemother. 46, 3817–3822 (2002) 91. Zaremba M.L.: Istota zaka¿eñ drobnoustrojami oportunistycznymi. Przegl. Epidemiol. 55 (Supl 3), 91–99 (2001) 92. Zaremba M.L., Borowski J.: Mikrobiologia lekarska. PZWL, 2001, s. 165, 207–208 93. Zhou Z., Li L., Yu Y., Ma Y.: The status of drug resistance and ampC gene expression in Enterobacter cloacae. Chin. Med. J. 116, 1244–1247 (2003)

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 59– 67 http://www.pm.microbiology.pl

CHLAMYDIE ŒRODOWISKOWE – NOWE PATOGENY CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T Ma³gorzata Pawlikowska, Wies³aw Deptu³a

Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydzia³ Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Szczeciñski, ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; e-mail: [email protected], tel. (091) 444 16 05/08, fax (091) 444 16 06 Wp³ynê³o we wrzeœniu 2006 r.

1. Wprowadzenie. 2. Pozycja systematyczna chlamydii. 3. Charakterystyka rodziny Parachlamydiaceae. 4. Charakterystyka rodziny Simkaniaceae. 5. Charakterystyka rodziny Waddliaceae. 6. Chlamydie niesklasyfikowane. 7. Podsumowanie Environmental chlamydiae – new pathogens for human and animals Abstract: To date the studies concerning chlamydiae – intracellular bacteria causing a lot of animal and human diseases, concentrated on pathogens belonging to Chlamydia sp. and Chlamydophila sp. Lately, thanks to molecular biology techniques, among the environmental microorganisms, new species of chlamydiae have been described as potential pathogens of human and animals. 1. Introduction. 2. Taxonomy of chlamydiae. 3. Characteristics of family Parachlamydiaceae. 4. Characteristic of family Simkaniaceae. 5. Characteristics of family Waddliaceae. 6. Non-classified chlamydiae. 7. Summary S³owa kluczowe: chlamydie œrodowiskowe, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Waddliaceae Key words: environmental chlamydiae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Waddliaceae

1. Wprowadzenie Chlamydie s¹ zarazkami powoduj¹cymi u ludzi i u zwierz¹t wiele schorzeñ przebiegaj¹cych jako zaka¿enia objawowe, bezobjawowe, utajone, a tak¿e latentne [21, 47, 50]. Drobnoustroje te charakteryzuj¹ siê wy³¹cznie wewn¹trzkomórkowym sposobem rozmna¿ania w ¿ywych komórkach. Zale¿y ono od dostêpnoœci ATP gospodarza [26, 46]. Dalsz¹ ich charakterystyczn¹ cech¹ jest unikalny cykl rozwojowy trwaj¹cy 48–72 godziny, z dwiema formami morfologicznymi: cia³kiem elementarnym (EB – elementary body) jako form¹ zakaŸn¹ i cia³kiem siateczkowatym (RB – reticulate body), dziel¹cym siê przez podzia³ poprzeczny [27, 47, 51]. Bakterie te izolowano nie tylko od ludzi, wielu zwierz¹t, w tym od ssaków (m.in. byd³a, owiec koni, kóz, œwiñ, psów, kotów, gazeli, koali, królików, niedŸwiedzi, gryzoni, oposów, fretek), ale tak¿e od ponad 140 gatunków ptaków oraz od bêzkrêgowców (ma³¿e, stu³biop³awy, pajêczaki, równonogi, kraby) [7, 10, 50]. Przeciwcia³a anty-Chlamydiae stwierdzono równie¿ u ma³ych gryzoni (krety, myszy, ryjówki, ziêbie³ki, rzêsorki, nornice, norniki) [3] oraz u dzikich prze¿uwaczy (jeleñ szlachetny, muflon, daniel, kozioro¿ec pirenejski) [9], co dowodzi³oby, ¿e mikroorganizmy te maj¹ wielu naturalnych gospodarzy. Obecnie wœród chlamydii opisano zarazki, okreœlone jako tzw. chlamydie œrodowiskowe, które s¹ potencjalnymi patogenami dla cz³owieka i zwierz¹t. Stwierdzono, ¿e wystêpuj¹ w nowych niszach ekologicznych jako endosymbionty pierwotnia-

ków [1, 5, 17, 25, 26, 33, 35, 48], w mule wodnym [4, 34] i w wodzie [57], jako wtrêty hodowli komórkowych [37, 38, 40, 41, 46], a tak¿e jako zarazki wystêpuj¹ce w bakteriocytach jelitowych owadów [23, 56], w cia³ach t³uszczowych owadów [6], w w¹trobo-trzustce równonoga [44], ³o¿yskach poronionych p³odów [12, 13, 32, 43, 53], odchodach nietoperzy [2] oraz skrzelach i komórkach nab³onkowych ryb [8, 14, 49] (tab.I). 2. Pozycja systematyczna chlamydii W najbardziej pe³nym i akceptowanym przez wiêkszoœæ mikrobiologów opracowaniu taksonomii bakterii [27], chlamydie zró¿nicowane na podstawie sekwencji 16S rDNA, tworz¹ oddzieln¹ liniê ewolucyjn¹ bakterii (Bacteria), tworz¹c nowy typ (Phylum B16.) – Chlamydiae, z rzêdem Chlamydiales i czterema rodzinami: Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae i Waddliaceae. Nadto w obecnej nomenklaturze dotycz¹cej rzêdu Chlamydiales [7], u¿ywa siê trzech okreœleñ dotycz¹cych tych bakterii, a mianowicie: – „chlamydia” – dotyczy klasycznych chlamydii, obecnie nale¿¹cych do rodzaju Chlamydia sp. oraz Chlamydophila sp., – „chlamydia-like” – odnosi siê do bakterii wewn¹trzkomórkowych, podobnych do chlamydii np. ze wzglêdu na cykl ¿yciowy, – „chlamydia-related” lub „chlamydial” – odnosi siê do mikroorganizmów wykazuj¹cych podobieñstwo tylko na podstawie filogenezy molekularnej.

60

Systematyka rzêdu Chlamydiales [1, 2, 4–6, 8, 12–14, 17, 21, 23, 25–27, 32–35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 48, 49, 53, 56, 57] Rz¹d

Chlamydiales Chlamydiaceae

Parachlamydiaceae

Simkaniaceae

Rodzaj i gatunek Rodzaj: Chlamydia (Ch.) Gatunek: Ch. trachomatis Ch. suis Ch. muridarum Rodzaj: Chlamydophila (Chl.) Gatunek: Chl. psittaci Chl. abortus Chl. felis Chl. caviae Chl. pecorum Chl. pneumoniae

Rodzaj: Gatunek: Rodzaj: Gatunek:

Inne gatunki

“Candidatus “Candidatus Rhabdo-chlamydia Protochlamydia amoebophila”; porcellionis”, “Candidatus Parachlamydia sp. UV-7; Rhabdo-chlamydia crassificans”; ECL I–V, VII*; ECL VI

ECL VII*

Parachlamydia (P.) P. acanththoamoebae Neochlamydia (N.) N. hartmanellae

Rodzaj: Gatunek: Rodzaj: Gatunek:

Simkania (S.) S. negevensis Fritschea “Candidatus Fritschea bemisiae” “Candidatus F. eriococci”

Objaœnienia: ECL – chlamydialne linie œrodowiskowe (environmental chlamydiae lineage); * – szczepy tej linii wykazuj¹ 87–89% podobieñstwo do bakterii rodziny Chlamydiaceae; ** – sugeruje siê, ¿e zarazki te przynale¿¹ do rzêdu Chlamydiales – grupa chlamydie niesklasyfikowane [8, 49]

Waddliaceae

Chlamydie niesklasyfikowane

Rodzaj: Waddlia (W.) Gatunek: W. chondrophila W. malaysiensis

“Candidatus Piscichlamydia salmonis”, Criblamydia sequanensis, Bakterie chlamydio-podobne**

Brak danych

MA£GORZATA PAWLIKOWSKA, WIES£AW DEPTU£A

Rodzina

Ta b e l a I

CHLAMYDIE ŒRODOWISKOWE – NOWE PATOGENY CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T

Dodatkowo do tej terminologii wprowadzono sformu³owanie „Candidatus” które odnosi siê do bakterii jeszcze nie wyhodowanych w hodowli tkankowej, a jedynie wyizolowanych od naturalnego gospodarza [23]. W oparciu o okreœlenie sekwencji 16S rRNA i 23S rRNA oraz analizê domeny I 23S rRNA [17–22], w rzêdzie Chlamydiales wyodrêbniono trzy linie (grupy) (tab. I): 1. liniê trachomatis, do której nale¿¹ szczepy Chlamydia (Ch.) trachomatis izolowane od ludzi i w dalszym ci¹gu nazwane Ch. trachomatis, z dwoma biotypami trachoma i LGV (lymphogranuloma venerum) [16, 21]; Ch. muridarum wyizolowane od œwinek morskich i chomików oraz Ch. suis – szczepy od œwiñ [16, 21]. Nie uwzglêdniono w tej grupie szczepów Ch. trachomatis stwierdzonych u byd³a [11, 52]. 2. liniê non-trachomatis, do której nale¿¹ szczepy uprzednio nale¿¹ce do Chlamydia psittaci, a okreœlane jako Chlamydophila (Chl.), do której zaliczono Chl. psittaci, Chl. abortus, Chl. felis, Chl. caviae, Chl. pecorum oraz Chl. pneumoniae [16, 21]; 3. grupê, do której nale¿¹ bakterie tworz¹ce obecnie trzy nowe rodziny: Parachlamydiacae, Simkaniaceae i Waddliaceae [1, 2, 4, 5, 6, 12–14, 17, 21, 23, 25–27, 32–35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 49, 53, 56], które okreœla siê tak¿e jako „chlamydie œrodowiskowe”, do których zaliczono tak¿e chlamydie niesklasyfikowane [8, 14, 49, 57]. Rodzinê Chlamydiaceae (tab. I) tworz¹ bakterie z dwóch pierwszych linii (rodzaje Chlamydia i Chlamydophila), które znane s¹ jako zarazki chorobotwórcze dla cz³owieka i zwierz¹t, lecz nie s¹ przedmiotem niniejszej pracy. Pozosta³e trzy rodziny Parachlamydiaceae, Simkaniaceae i Waddliaceae (tab. I) nazywane s¹ obecnie chlamydiami œrodowiskowymi, jako ¿e bakterie zaliczane do nich, izolowano jako endosymbionty z wolno ¿yj¹cych ameb [1, 5, 17, 25, 26, 33, 35, 48], z mu³u wodnego [4, 34] oraz z wody [57], a tak¿e jako wtrêty kontaminuj¹ce hodowle komórkowe [37, 38, 40, 41, 46], oraz jako zarazki wystêpuj¹ce w bakteriocytach jelitowych owadów [23, 56], w cia³ach t³uszczowych owadów [6], w w¹trobo-trzustce stawonoga równonoga [44], w ³o¿ysku poronionego p³odu bydlêcego [12, 13, 32, 43, 53] oraz w odchodach nietoperzy [2]. Dodatkowo do tej grupy chlamydii zaliczono zarazki izolowane ze skrzel [14, 49] i komórek nab³onkowych [8] ryb, których nie zaklasyfikowano do tych trzech rodzin, ale przypisano do rzêdu Chlamydiales. 3. Charakterystyka rodziny Parachlamydiaceae Rodzinê Parachlamydiaceae tworz¹ obecnie dwa rodzaje zarazków: Parachlamydia, Neochlamydia ka¿dy z jednym gatunkiem oraz gatunek „Candidatus Pro-

61

tochlamydia amoebophila” oraz inne endosymbionty œrodowiska wodnego (tab.I). Bakterie te zosta³y wyizolowane jako endosymbionty ameb z ich trofozoitów [1, 25, 26, 35] oraz jako endosymbionty pochodz¹ce z mu³u wodnego [4, 34] i z wody [57]. Zaliczenie tych zarazków do rzêdu Chlamydiales spowodowane jest 80–90% identycznoœci¹ genów rybosomalnych oraz typowym cyklem replikacyjnym dla chlamydii [21]. Nie s¹ one jednak¿e rozpoznawalne przez przeciwcia³a monoklonalne dla trisacharydu Kdo LPS – charakterystycznego dla rodziny Chlamydiaceae [21]. Parachlamydie obecnie okreœlane s¹ jako nowo pojawiaj¹ce siê patogeny [31]. Wynika to z faktu, i¿ jako endosymbionty ameb mog¹ przyczyniaæ siê do rozwoju niektórych schorzeñ u ludzi. Miêdzy innymi upatruje siê ich roli w zapaleniu rogówki u osób nosz¹cych soczewki kontaktowe, jako ¿e ameby – gospodarze parachlamydii, znajduj¹ siê w biofilmie na szk³ach kontaktowych [7, 31]. Tak¿e u osób z obni¿on¹ odpornoœci¹ parachlamydie mog¹ powodowaæ zmiany skórne [7]. Równie¿ zdolnoœæ tych mikroorganizmów do prze¿ywania wewn¹trz ameb, mo¿e powodowaæ utajone infekcje dróg oddechowych, gdy¿ ameby ulegaj¹ lizie w b³onie œluzowej nosa, a parachlamydie zostaj¹ uwolnione i mog¹ infekowaæ komórki uk³adu oddechowego [7]. 1. Rodzaj Parachlamydia jest reprezentowany przez gatunek Parachlamydia acanthoamoebae, do którego przynale¿¹ szczepy Bn9, Berg17 i kilka izolatów bez nazwy (szczepy UWE1, UWC22, TUME1, sequanensis) [1, 17, 26, 35, 48, 57]. Wykazano je w trofozoitach Acanthamoeba, któr¹ izolowano od ludzi z epidemi¹ wilgotnej gor¹czki w Vermont USA (Hall’s coccus), a tak¿e od kobiety w Niemczech nie wykazuj¹cej objawów chorobowych [17, 21]. Cech¹ charakterystyczn¹ P. acanthoamoebeae jest wystêpowanie w jej cyklu ¿yciowym trzeciej formy rozwojowej, tzw. cia³ek ksiê¿ycowych (crescend bodies), które obserwuje siê przy przed³u¿onej inkubacji tak wewn¹trz ameb jak i poza nimi [30]. 2. Rodzaj Neochlamydia reprezentowany jest przez gatunek Neochlamydia hartmannellae (szczep typowy A1Hsp oraz inne) bytuj¹cy wewn¹trz ameb Hartmanella vermiformis, ale który mo¿e równie¿ namna¿aæ siê w amebach Dictyostelium discoideum [35]. Gatunek ten po raz pierwszy, jak wspomniano wczeœniej, wyizolowano z ameb H. vermiformis odfiltrowanych z systemu wodnego jednostki dentystycznej w Lahnstein w Niemczech [35]. Obecnie sugeruje siê, ¿e ze wzglêdu na powszechne wystêpowanie tych bakterii jako endosymbiontów ameb w œrodowisku wodnym, mog¹ stanowiæ one zagro¿enie dla cz³owieka, gdy¿ wykazano zwi¹zek N. hartmanella z gor¹czk¹ wilgotn¹ (Hall’s coccus) oraz z syndromem Kawasaki u ludzi [31]. Mikroorganizm ten w odró¿nieniu

62

MA£GORZATA PAWLIKOWSKA, WIES£AW DEPTU£A

od innych zarazków z rzêdu Chlamydiales charakteryzuje siê tym, ¿e jego cia³ka elementarne i siateczkowate umieszczone s¹ bezpoœrednio w cytoplazmie i nie s¹ otoczone wakuolami, co mo¿e œwiadczyæ o istnieniu tzw. mechanizmów ucieczkowych zarazków z fagosomów [35]. 3. „Candidatus Protochlamydia amoebophila” to dawniejszy szczep UWE25, który by³ klasyfikowany w rodzaju Parachlamydia sp. [21], jednak obecnie, po dok³adniejszej analizie 16S rRNA, 23S rRNA, analizie genów endorybonukleazy P (RNase P) oraz analizie 44 bia³ek rybosomalnych, sklasyfikowano go jako odrêbny gatunek [5]. Wykazuje on podobieñstwo do Parachlamydia acanthoamoebae szczep Bn9 w 92,9% (16S rRNA) i 90,3% (23S rRNA) [5]. Mimo, ¿e dopiero podobieñstwo oko³o 95% pozwala mówiæ o nowym rodzaju [21], to jednak analiza filogenetyczna wskazuje wyraŸnie, ¿e zarazek UWE25 tworzy monofiletyczn¹ grupê w rodzinie Parachlamydiacae [5]. Cech¹ tego endosymbionta jest to, i¿ wystêpuje w komórce gospodarza wewn¹trz ma³ych inkluzji, w których znajduje siê jedna lub kilka bakterii [1, 26, 35]. Ponadto genom tej bakterii (2,4 Mpz) jest prawie dwukrotnie wiêkszy od bakterii z rodziny Chlamydiaceae (1–1,2 Mpz), a zawartoœæ G+C jest mniejsza (35,8 mol%) ni¿ w genomie Chlamydiaceae (39,2–41,3 mol%) [33]. Nadto w b³onie zewnêtrznej tego zarazka znajduje siê wiele bia³ek bogatych w cysteinê, ale brak jest charakterystycznych bia³ek MOMP, swoistych dla bakterii z rzêdu Chlamydiales [5]. Ciekawym jest fakt, ¿e w genomie UWE25 znajduj¹ siê geny koduj¹ce LPS, ale brak jest genów koduj¹cych biosyntezê polisacharydu O [33]. Jako paso¿yt energetyczny, tak jak wszystkie chlamydie, posiada on w odró¿nieniu od pozosta³ych Chlamydiales, które maj¹ tylko 2 takie transportery, a¿ 5 izoform transporterów nukleotydów (pc0240, pc0241, pc0250, pc0485, pc1343) [33]. Tak¿e w genomie tego endosymbionta znajduj¹ siê geny koduj¹ce system sekrecyjny typu III (TTSS- type three secretion system), który posiadaj¹ wszystkie chlamydie, gdy¿ odpowiada on za patogennoœæ [33]. Przypuszcza siê tak¿e, ¿e UWE25 jest zdolny do interakcji z komórk¹ gospodarza poprzez typ IV systemu sekrecyjnego (TFSS – type four secretion system), gdy¿ geny koduj¹ce ten system znaleziono w jego genomie [33]. UWE25 wykorzystuje system TFSS do wydzielania bia³ek efektorowych do komórki ameby, gdy¿ brak jest genów koduj¹cych funkcje TFSS polegaj¹ce na przekazywaniu DNA [33]. Kolejn¹ jego charakterystyczn¹ cech¹ jest wystêpowanie siedmiu modu³ów wysp genomowych w chromosomie, a jeden z nich zawiera geny koduj¹ce F-podobny system koniugacyjny DNA (F-like conjugative DNA transfer) [29]. 4. Inne endosymbionty œrodowiska wodnego. Wiêkszoœæ endosymbiontów z tej grupy, dla których siedli-

skiem jest wiele organizmów m.in. pierwotniaki, zalicza siê do rodziny Parachlamydiaceae [4, 34]. Badania Horna i Wagnera [34] dotycz¹ce mu³u z wody pochodz¹cej z systemów nawadniania roœlin w Niemczech, nad wystêpowaniem genów koduj¹cych 16S rRNA charakterystycznych dla rzêdu Chlamydiales (z wy³¹czeniem rodziny Chlamydiaceae), a nastêpnie 16S rDNA konserwatywnych dla domeny Bacteria, wykaza³y 11 prób dodatnich, które posiada³y materia³ genetyczny podobny do bakterii z rzêdu Chlamydiales. Na tej podstawie opisali oni siedem linii, które nazwano „chlamydialnymi liniami œrodowiskowymi” (ECL – environmental chlamydiae lineage). Cztery nowe linie ewolucyjne, jak dot¹d nieznane w obrêbie tego rzêdu, oznaczono ECL I, ECL II, ECL VI oraz ECL VII, a pozosta³e trzy nazwano chlamydiami „niezwyk³ymi” i oznaczono ECL III, ECL IV i ECL V [34]. Szczegó³owa analiza sekwencji 16S rRNA wykaza³a, ¿e ka¿da z czterech nowych linii reprezentuje nieznane rodzaje. I tak ECL I i ECL II nale¿¹ do Parachlamydiaceae, gdy¿ wykazuj¹ odpowiednio 87–90% i 91% podobieñstwo z t¹ rodzin¹, ECL VI w 88% wykazuje podobieñstwo do Simkania negevensis, zaœ ECL VII tworzy monofiletyczn¹ grupê wykazuj¹c¹ 87–89% podobieñstwo z Chlamydiaceae [34]. Linie oznaczone jako ECL III – V obejmuj¹ce „niezwyk³e” chlamydie na podstawie podobieñstwa 16S rRNA znalaz³y siê tak¿e w rodzinie Parachlamydiaceae [34]. Inny zespó³ badaczy [4] pozyska³ chlamydialny szczep UV-7 równie¿ z mu³u z systemu nawadniania roœlin w Niemczech, który dodano do hodowli ameby Acanthoamoeba sp. UWC1 oraz do ssaczych linii komórkowych (Vero, Hela 229, NCI-H292) [4]. Przy u¿yciu mikroskopu elektronowego, po 7 dniach od zainfekowania hodowli ameb, wykazano w ich trofozoitach obecnoœæ okr¹g³ych bakterii wewn¹trzkomórkowych zlokalizowanych w wakuolach, cia³ko EB o œrednicy 0,3–0,5 µm oraz cia³ko RB o œrednicy 0,5–0,7 µm, a tak¿e cia³ka ksiê¿ycowe (CB) – charakterystyczne dla rodziny Parachlamydiaceae [4]. Analiza genetyczna tych endosymbiontów wykaza³a du¿e podobieñstwo (98,2– –98,7%) do rodziny Parachlamydiaceae, a w szczególnoœci do Parachlamydia acanthoamoebae szczep Bn9 (98,7%) [4]. Trzeba stwierdziæ, i¿ mimo ¿e podobieñstwo sekwencji 16S rRNA w granicach 97,5% pozwala na utworzenie dwóch rodzajów [55], to jednak¿e autorzy [4] zdecydowali siê nazwaæ odkryty enodsymbiont Parachlamydia sp. UV-7 (Uniwersytet Wiedeñski, izolat nr 7). Natomiast zaka¿enie tym samym szczepem UV-7 linii ssaczych, wykaza³o ¿e infekcja przebiega³a w komórkach zainfekowanych tak¿e w postaci trzech form (EB, RB, CB), a nadto bakteria ta tworzy ma³e inkluzje wewn¹trz komórek oraz charakteryzuje siê opóŸnionym tempem infekcji w stosunku do infekcji komórek ameb [4].

CHLAMYDIE ŒRODOWISKOWE – NOWE PATOGENY CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T

4. Charakterystyka rodziny Simkaniaceae Rodzinê Simkaniaceae (tab.I) tworz¹ obecnie dwa rodzaje: rodzaj Simkania z jednym gatunkiem, rodzaj Fritschea z dwoma gatunkami oraz gatunki „Candidatus Rhabdochlamydia porcellionis” i „Candidatus R. crassificans”. 1. Rodzaj Simkania reprezentuje gatunek Simkania negevensis, opisany po raz pierwszy w 1993 roku jako mikroorganizm „Z” [38], a który izolowano jako wtrêt z hodowli komórkowych. Drobnoustroje te nie s¹ rozpoznawane przez przeciwcia³a monoklonalne dla trisacharydu LPS "Kdo-(2→8)-"Kdo-(2→4)"Kdo, typowego „znaku” dla rodziny Chlamydiaceae [21]. Przynale¿noœæ ich do rzêdu Chlamydiales warunkowana jest cyklem rozwojowym oraz identycznoœci¹ genów rybosomalnych, która wynosi 80–90% [21]. Cech¹ charakterystyczn¹ tego¿ mikroorganizmu jest to, i¿ wzrost nastêpuje jedynie w ¿ywych komórkach, a ich cykl ¿yciowy sk³ada siê z dwu form – cia³ka elementarnego i cia³ka siateczkowatego, z tym, ¿e nie trwa on 48–72 h, ale wynosi 12–15 dni [38, 40, 59]. Badania genetyczne dotycz¹ce analizy sekwencji 16S rDNA wykaza³y 83% podobieñstwo do chlamydii [41]. Zarazek ten posiada nadto grupê I intronów w sekwencji 23S rRNA, która jest spokrewniona z analogicznymi odcinkami chloroplastów i mitochondrii alg (Chlamydomonas eugamentos, Ch. pallidostigmatica) oraz ameby (Acanthamoeba castellani) [22]. Bakteriê Simkania negevensis izolowano tak¿e z zapalenia oskrzeli od dzieci oraz od osób doros³ych w Izraelu (Negev) [24, 37, 39, 45, 46]. Wykazano tak¿e wysoki poziom przeciwcia³ anty-Simkania u doros³ych ludzi w Kanadzie w populacji Innuitów [28, 45] oraz u ludzi doros³ych w Japonii [58]. Oprócz tego notuje siê przypadki izolowania tej bakterii z zasobów wody do picia oraz ze œcieków [42]. Wykazano tak¿e, ¿e S. negevensis jest zdolna do infekowania ameb Acanthoamoeba polyphaga, przez co mo¿e stanowiæ zagro¿enie tak¿e dla cz³owieka [36]. 2. Rodzaj Fritschea reprezentowany jest przez dwa gatunki Fritschea bemisiae i F. eriococci [23, 56], które izolowano jako endosymbionty z bakteriocytów jelit owadów Bemisia tabacci (m¹cznik ostroskrzyd³y) i Eriococci spurius (czerwiec wi¹zowiec) [56]. Badania genetyczne sekwencji 16S-23S rRNA wykaza³y 91% podobieñstwo tych bakterii do rodziny Simkaniaceae [23, 56] – uznano je za nowy rodzaj w obrêbie rodziny [23] i nazwano „Candidatus Fritschea bemisiae” oraz „Candidatus F. eriococci”, gdy¿ nie uda³o siê ich jak do tej pory wyhodowaæ w hodowli tkankowej. Wystêpuj¹ one wewn¹trzkomórkowo, z charakterystycznym dwufazowym cyklem ¿yciowym oraz wykazuj¹ powy¿ej 80% podobieñstwo sekwencji rRNA do gatunków z rzêdu Chlamydiales [23]. Dowiedzio-

63

no, ¿e „Candidatus F. bemisiae” mo¿e byæ wykrywany za pomoc¹ mikroskopii elektronowej i techniki PCR, zaœ „Candidatus F. eriococci” za pomoc¹ techniki PCR [23], zaœ szczepami wzorcowymi dla nich s¹ odpowiednio, szczep Falk oraz szczep Elm [23]. 3. „Candidatus Rhabdochlamydia porcellionis” jest bakteri¹ ¿yj¹c¹ wewn¹trzkomórkowo wyizolowana z w¹trobo-trzustki równonoga Porcellio scober (prosionek szorstki), któr¹ tak¿e zakwalifikowano do rodziny Simkaniaceae [44]. Pocz¹tkowo endosymbiont ten by³ sklasyfikowany jako riketsja [15], ale badania morfologiczne, w tym barwienie metod¹ Gimeneza oraz reakcja krzy¿owa z surowicami anty-Ch. trachomatis i anty-Ch. psittaci, kwalifikowa³y go do chlamydii. Zaproponowano nazwê „Chlamydia isopodii” [54], jednak¿e nie zosta³o to zaakceptowane przez Miêdzynarodowy Komitet ds. Systematyki Bakteryjnej. Badania K o s t a n j š e k i wsp. [44] polegaj¹ce na analizie 16S rRNA pozwoli³y na okreœlenie przynale¿noœci tej bakterii do rzêdu Chlamydiales. W mikroskopie elektronowym wyró¿niono trzy formy morfologiczne tego zarazka: sferyczne cia³ko siateczkowate, sferyczne wczesne cia³ko elementarne, tzw. forma poœrednia oraz dojrza³e cia³ko elementarne kszta³tu laseczki [15]. Analiza genetyczna sekwencji 16S rRNA tego zarazka wykaza³a 90,5–91,7% podobieñstwo do analogicznej sekwencji ECL VI, zaœ podobieñstwo ich sekwencji rybosomalnych w stosunku do rzêdu Chlamydiales, wynios³o 83,1–87,2% [44]. Analiza filogenetyczna wykaza³a, ¿e „Candidatus Rhabdochlamydia porcellionis” tworzy niezale¿na liniê w rzêdzie Chlamydiales, która jest blisko „spokrewniona” z ECL VI, a nieco „zdystansowana” do Simkania negevensis szczep ZT (86,7% podobieñstwo) [44]. Zarazek ten nie daje siê hodowaæ i jest bakteri¹ nieruchliw¹, posiadaj¹c¹ œcianê komórkow¹ typu Gram-ujemnego bez warstwy peptydoglikanu, a w komórce gospodarza wystêpuje w wakuoli [44]. 4. „Candidatus Rhabdochlamydia crassificans” jest bakteri¹ bytuj¹co wewn¹trzkomórkowo wyizolowana z cia³ t³uszczowych karaczanów wschodnich (Blatta orientalis) [6]. Pocz¹tkowo s¹dzono, ¿e jest to Rikettsia, ale w badaniach polegaj¹cych na analizie sekwencji 16S rRNA i 16S rDNA, wykazano 86–87% podobieñstwo z bakteriami z rodziny Parachlamydiaceae, 85–86% podobieñstwo z bakteriami z rodziny Simkaniaceae, 82–85% z rodzajami Chlamydia i Chlamydophila i 80% podobieñstwo z „Candidatus Piscichlamydia salmonis”. Jednak¿e najwiêksze podobieñstwo, bo a¿ 97,1% bakteria ta wykazuje w stosunku do sekwencji „Candidatus Rhabdochlamydia porcellionis”. Bakteria ta posiada dwufazowy cykl ¿yciowy z cia³kiem EB i RB, a tak¿e z dwiema formami poœrednimi – p³askim cia³kiem przypominaj¹cym sp³aszczone powiêkszone cia³ko EB oraz cia³o zagêszczone, które

64

MA£GORZATA PAWLIKOWSKA, WIES£AW DEPTU£A

przechodzi w cia³ko RB [6]. Obecnie brak jest danych co do mo¿liwoœci hodowania tej bakterii w kulturach tkankowych [6]. 5. Charakterystyka rodziny Waddliaceae Do rodziny Waddliaceae (tab. I) nale¿y jeden rodzaj Waddlia z dwoma gatunkami. 1. Gatunek Waddlia chondrophila zosta³ zaklasyfikowany jako pierwszy do tej rodziny. Pierwotnie by³ on oznaczony jako WSU 86–1044 [12], izolowany z komórek poronionego p³odu byd³a w pierwszym trymestrze ci¹¿y, a który pierwotnie, ze wzglêdu na cykl replikacyjny, uznano jako riketsjê [12, 13, 21, 53, 43]. Obecnie zaklasyfikowano go do rzêdu Chlamydiales z uwagi na podobieñstwo jego sekwencji 16S rRNA w granicach 84,7–85,3%. Nale¿y do bakterii Gramujemnych, nie produkuje glikogenu, syntetyzuje LPS pozbawiony charakterystycznego dla chlamydii trisacharydu "Kdo-(2→8)-"Kdo-(2→4)-"Kdo [21, 53]. Badania serologiczne wykaza³y, ¿e bakteria ta nie reaguje z przeciwcia³ami dla Rikettsia, Coxiella, Wolbachia a nawet Chlamydia, jedynie wykazano s³ab¹ reakcjê z przeciwcia³ami dla Cowdria ruminantum [21, 53]. H e n n i n g i wsp. [32] wyizolowali bakteriê i wykazali, ¿e W. chondrophila jest przyczyn¹ poronienia u byd³a w 228 dniu ci¹¿y. 2. Gatunek Waddlia malaysiensis ¿yj¹ca wewn¹trzkomórkowo bakteria sklasyfikowana ostatnio do rodzaju Waddlia. Izolowano j¹ z odchodów nietoperzy Eonycteris spelaea w Malezji [2]. W hodowli komórek Vero zarazek ten po 48–72 godzinach od zainfekowania odchodami nietoperzy, daje inkluzje zawieraj¹ce ma³e komórki bakteryjne. Podobny efekt zaobserwowano w linii hodowlanej z ludzkiej tkanki p³ucnej (MRC-5), nerek (HEK), krtani (HEp-2), linii B-limfoblastycznej oraz ma³piej nerki (LLC-MK2), a tak¿e linii epitelialnej gryzoni (3T3, BHK) [38]. Zarazek ten w hodowli HEK po 48 godzinach od infekcji wytwarza cia³ka siateczkowate dziel¹ce siê poprzez podzia³ podwójny [2]. Ich inkluzje mo¿na wybarwiæ metod¹ Giemzy, jednak nie reaguj¹ w metodzie immunofluorescencji rozpoznaj¹cej bia³ka MOMP Ch. trachomatis [2]. Analiza sekwencji 16S i 23 S rRNA oraz przestrzeni 16S-23S rRNA tych zarazków, wykaza³a odpowiednio 91% i 96% podobieñstwo do sekwencji Waddlia chondrophila, czyli ¿e jest to mikroorganizm blisko spokrewniony z ni¹, lecz tworz¹cy odrêbny rodzaj [2]. 6. Chlamydie niesklasyfikowane Przyjmuje siê, ¿e ta grupa zarazków tworzona jest m.in. przez „Candidatus Piscichlamydia salmonis” (tab. I). Zarazek ten zosta³ opisany przez zespó³ Gra-

ghi [14], który bada³, przy pomocy mikroskopii elektronowej, próby pochodz¹ce ze skrzeli ³ososi hodowlanych z Irlandii i Norwegii. W próbach pochodz¹cych z Norwegii, wykazano inkluzje zawieraj¹ce cia³ka siateczkowate (RB) o ró¿nym kszta³cie (wyd³u¿one, kuliste) i d³ugoœci 0,7–1,8 mm oraz cia³ka poœrednie (IB – intermediate bodies) o kszta³cie okr¹g³ym do owalnego d³ugoœci 0,6–0,8 mm, zaœ w próbach pochodz¹cych z Irlandii stwierdzi³, a¿ trzy formy rozwojowe tego zarazka: cia³ka siateczkowate (RB), poœrednie (IB) oraz elementarne (EB) [14]. Ze wzglêdu na ró¿nice w morfologii cia³ek przypuszcza siê, i¿ te endosymbionty izolowane ze skrzeli ryb z Irlandii i Norwegii, reprezentuj¹ dwa ró¿ne gatunki [14]. Dodatkowe badania z przeciwcia³ami monoklonalnymi dla trisacharydu "Kdo-(2→8)-"Kdo-(2→4)-"Kdo, charakterystycznego dla rzêdu Chlamydiales wykaza³y, ¿e zachodz¹ reakcje krzy¿owe wobec nich, jednak nie wskazuj¹ one na obecnoœæ tego trisacharydu, a jedynie œwiadcz¹, ¿e w œcianie tych endosymbiontów s¹ cz¹steczki podobne do tego¿ trisacharydu [14]. Natomiast analiza genetyczna 16S rRNA i 16S rDNA wykaza³a, ¿e ich sekwencjê 16S rRNA cechuje podobieñstwo do bakterii rzêdu Chlamydiales, a w szczególnoœci do endosymbiontów ameb UWE1 (82%) i UWC22 (81%), a tak¿e do Chlamydophila psittaci – szczep MN (80%) i Ch. pneumoniae – szczep N16 (80%) [14]. Analiza filogenetyczna oparta na porównaniu sekwencji 16S rDNA dowiod³a, ¿e badane endosymbionty izolowane ze skrzel ³ososi s¹ zbli¿one zarówno do bakterii rzêdu Chlamydiales jak i Rickettsiales, jednak¿e bakterie te tworz¹ osobn¹ liniê w rzêdzie Chlamydiales i zaproponowano dla nich nazwê „Candidatus Piscichlamydia salmonis” [14]. Tak¿e do grupy chlamydii niesklasyfikowanych nale¿y zaliczyæ Criblamydia sequanensis wyizolowan¹ z wód Sekwany [57]. Pozytywne próby wykazuj¹ce obecnoœæ materia³u genetycznego tego zarazka uzyskano w hodowli ameb Acanthamoeba castellanii. Analiza genetyczna polegaj¹ca na sekwencjonowaniu genów 16S rRNA, 16S rDNA, translokazy ADP/ATP i RnpB, wykaza³a w 88,5–89,8% podobieñstwo do Parachlamydiacea, 87,1–88,3% podobieñstwo do rodziny Waddliaceae, 86,2–85,6% podobieñstwo do rodziny Chlamydiaceae i 84,7–85,6% podobieñstwo do rodziny Simkaniaceae. Autorzy wyci¹gnêli z tych badañ tak¿e wniosek, ¿e nowa bakteria nie przynale¿y do ¿adnej rodziny, ale cechuje j¹ podobieñstwo do zarazków z rzêdu Chlamydiales [57]. Bakteria ta posiada cykl ¿yciowy z dwiema formami morfologicznymi cia³kiem EB o kszta³cie gwiaŸdzistym i cia³kiem RB. Próby hodowli w liniach tkankowych Vero, HEL, Hep-2 i A549 tego zarazka okaza³y siê negatywne, jednak mo¿liwa by³a reinfekcja kultury ameb supernatantem z tych hodowli [57]. St¹d proponuje siê utworzenie nowej rodziny Cribla-

CHLAMYDIE ŒRODOWISKOWE – NOWE PATOGENY CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T

mydiaceae fam. nov. [57]. Oprócz omawianych zarazków sugeruje siê przynale¿noœæ do grupy chlamydii niesklasyfikowanych tak¿e innych bakterii wewn¹trzkomórkowych. Jedn¹ z nich jest wyizolowana z cyst skrzelowych ³ososia atlantyckiego (Salmo salar), okr¹g³a, Gram-ujemna bakteria z cyklem komórkowym charakterystycznym dla bakterii rzêdu Chlamydiales [49], zaœ drug¹ to chlamydio-podobny ze wzglêdu na cykl rozwojowy zarazek, stwierdzony w komórkach nab³onkowych dorady (Sparus aurata) [8]. 7. Podsumowanie Z przedstawionych faktów wynika, ¿e bakterie okreœlane jako chlamydie œrodowiskowe s¹ mikroorganizmami doœæ powszechnie wystêpuj¹cymi. Jedne z nich jak Parachlamydia acanthoamoebae czy Simkania negevensis mog¹ byæ potencjalnymi patogenami cz³owieka, gdy¿ ta pierwsza by³a izolowana od ludzi z syndromem Kawasaki i z przypadków gor¹czki wilgotnej, zaœ druga z zapalenia oskrzeli. Inne, jak Waddlia chondrophila, mog¹ byæ przyczyn¹ ronieñ u byd³a i przez to mog¹ prowadziæ do strat gospodarczych. Zdolnoœæ parachlamydii do prze¿ywania wewn¹trz ameb, nie tylko typowych gospodarzy, a tak¿e zdolnoœæ do infekowania komórek ssaczych, m.in. monocytów/makrofagów, mo¿e wskazywaæ na ich udzia³ w patogenezie niektórych schorzeñ, których etiologia do tej pory do koñca nie jest poznana. Tak¿e stwierdzanie chlamydii œrodowiskowych, które mog¹ infekowaæ komórki ssacze, u owadów, nietoperzy czy ryb oraz wykazywanie obecnoœci tych zarazków w œrodowisku wodnym np. mule, jest bardzo interesuj¹ce tak z punktu teoretycznego jak i praktycznego. £¹czy siê to z faktem, ¿e obecne techniki badawcze pozwoli³y nie tylko na zaklasyfikowanie tych drobnoustrojów do chlamydii, ale tak¿e wykaza³y ich rolê w zaka¿eniach ssaków, w których chlamydie s¹ uznawane za patogeny wysokiego ryzyka dla ludzi i zwierz¹t. Piœmiennictwo 1. Amman R., Springer N., Schonhuber W., Ludwig W., Schmid E.N., Muller K.D., Michel R.: Obligate intracellular bacterial parasites of acanthoamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Envirom. Microbiol. 63, 115–121 (1997) 2. Chua P.K.B., Corkill J.E., Hooi P.S, Cheng S.C., Winstanley C., Hart C. A.: Isolation of Waddlia malaysiensis, a novel intracellular bacterium, from fruit bat (Eonycteris spelaea). Emerg. Inf. Dis. 11, 271–277 (2005) 3. Cislakova L., Stanko M., Petukova J., Prokopèakova H., Pefko B.: Protilatky proti chlamydiam u drobnych cicavcov na vychodnym slovensku. Slov. Vet. Èas. 24, 43–47 (1999) 4. Collingro A., Poppert S., Heinz E., Schmitz-Esser S., Essig A., Schweikert M., Wagner M., Horn M.: Recovery of

65

an environmental sludge by co-cultivation with Acanthoamoeba sp. Microbiology, 151, 301–309 (2005) 5. Collingro A., Toenshoff E.R., Taylor M.W., Fritsche T.R., Wagner M., Horn M.: ‘Candidatus Protochlamydia amoebophila’ an endosymbiont of Acanthoamoeba spp. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1863–1866 (2005) 6. Corsaro D., Thomas V., Goy G., Venditti D., radek R., Greub G.: ‘Candidatus Rhabdochlamydia crassificans’, an intracellular bacterial pathogen of the cockroach Blatta orientalis (Insecta: Blattodea). Syst. Appl. Microbiol. (2006) (w druku) 7. Corsaro D., Venditti D.: Emerging Chlamydial infections. Crit. Rev. Microbiol. 30, 75–106 (2004) 8. Crespo S., Zarza C., Padros F., Marin de Mateo M.: Epitheliocystis agents in sea bream Spartus aurata: morphological evidence for two distinct chlamydia-like developmental cycles. Dis. Aquat. Org. 37, 61–72 (1999) 9. Cubero-Pablo M.J., Plaza M., Perez L., Gonzalez M., LeonVizcaino L.: Seroepidemiology of chlamydial infections of wild ruminants in Spain. J. Wild. Dis. 36, 35–47 (2000) 10. Deptu³a W., Pawlikowska M., Travnièek M.: Chlamydofilozy u zwierz¹t i ludzi. Med. Wet. 58, 337–340 (2002) 11. Deptu³a W., Ruczkowska J., Szenfeld J., Choroszy-Król I., Travnièek M.: Immunologicky status u hovadzieho dobytka prirodzene infikovaneho mikroorganizmami Chlamydia trachomatis a Chlamydia psittaci. Vet. Med. (Praha), 35, 73–80 (1990) 12. Dilbeck P.M., Evermann J.F., Crawford T.B., Ward A.C.S., Leathers C.W., Holland C.J., Mebus C.A., Logan L.L., Rurangirwa F.R., McGuire T.C.: Isolation of a previously undescribed rickettsia from an aborted bovine fetus. J. Clin. Microbiol. 28, 814–816 (1990) 13. Dilbeck-Robertson P., McAllister M.M., Bradway D., Evermann J.F.: Results of a new serologic test suggest an association of Waddlia chondrophila with bovine abortion. J. Vet. Diagn. Invest. 15, 468–469 (2003) 14. Draghi A., Popov V.L., Kahl M.M., Stanton J.B., Brown C.C., Tsongalis G.J., West A.B., Frasca S.: Characterization of ‘Candidatus Piscichlamydia salmonis’ (order Chlamydiales), a chlamydia-like bacterium associated with epitheliocystis in farmed atlantic salmon (Salmo salar). J. Clin. Microbiol. 42, 5286–5297 (2004) 15. Drobne D., Štrus J., Žnidaršiè N., Zidar P.: Morphological description of bacterial infection of digestive glands in the terrestrial isopod Porcellio scaber (isopoda, crustacean). J. Invertebr. Pathol. 73, 113–119 (1999) 16. Euzeby J.P.: Dictionnaire de bacteriologie veterinaire. Chlamydiales, Chlamydiaceae, Waddliaceae. [www.bacterio.cict. fr/bacdico/cc/chlamydiales.html] (11.01.2006, data ostatniego sprawdzenia) 17. Everett K.D.: Chlamydia and Chlamydiales: more than meets the eye. Vet. Microbiol. 75, 109–126 (2000) 18. Everett K.D.E., Andersen A.A.: The ribosomal intergene spacer and domain I of the 23S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 461–473 (1997) 19. Everett K.D.E., Andersen A.: Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 803–813 (1999) 20. Everett K.D.E., Andersen A.A., Plaunt M., Hatch T.P.: Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein gene of Ch. psittaci 6BC. Infect. Immun. 59, 2853–2855 (1991) 21. Everett K.D., Bush R.M., Andersen A.A.: Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiacae

66

MA£GORZATA PAWLIKOWSKA, WIES£AW DEPTU£A

fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiacae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 415–440 (1999) 22. Everett K.D.E., Kahane S., Bush R.M., Friedman M.G.: An unspliced group I intron in 23S rRNA links Chlamydiales, chloroplasts, and mitochondria. J. Bacteriol. 181, 4734–4740 (1999) 23. Everett K.D.E., Thao ML., Horn M., Dyszynski G.E., Baumann P.: Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1581–1587 (2005) 24. Friedman M.G., Galil A., Greenberg S., Kahane S.: Seroprevalence of IgG antibodies to the chlamydia-like microorganism “Simkania Z” by ELISA. Epidemiol. Infect. 122, 117–123 (1999) 25. Fritsche T.R.: Polyphyletic origins of bacterial endosymbionts of free-living amoebae. Proc. 10th Int. Cong. Bacteriol. Appl. Micorbiol., Paris 2002, s. 60. 26. Fritsche T.R., Horn M., Wagner M., Herwig R.P., Schleifer K-H., Gautom R.K.: Phylogenetic diversity among geographically dispersed Chlamydiales endosymbionts recovered from clinical and environmental isolates of Acanthoamoeba spp. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2613–2619 (2000) 27. Garity G.M.: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. IInd Ed. Vol. 1. Boone D.R., Castenholz R.W. (ed.), SpringerVerlag, New York 2001. 28. Greenberg D., Banerji A., Friedmann M.G., Chiu C-H., Kahane S.: High rate of Simkania negevensis among Canadian Inuit infants hospitalized with lower respiratory tract infections. Scand. J. Infect. Dis. 35, 506–508 (2003) 29. Grueb G., Collyn F., Guy L., Rotrn C-A.: A genomic island present along the bacterial chromosome of the Parachlamydiaceae UWE25, an obligate amoebal endosymbiont, encodes a potentially functional F-like conjugative DNA transfer system. BMC Microbiology, 4, 48–59 (2004) 30. Greub G., Raoult D.: Crescent bodies of Parachlamydia acanthoamoeba and its life cycle within Acanthoamoeba polyphaga: an electron micrograph study. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3076–3084 (2002) 31. Greub G., Raoult D.: Parachlamydiaceae: potential emerging pathogens. Emerg. Inf. Dis. 8, 625–630 (2002) 32. Henning K., Schares G., Granzow H., Polster U., Hartmann M., Hotzel H., Sachse K., Peters M., Rauser M.: Neospora caninum and Waddlia chondrophila strain 2032/99 in a septic stillborn calf. Vet. Microbiol. 85, 285–292 (2002) 33. Horn M., Collingro A., Schmitz-Esser S., Beier C.L., Purkhold U., Fartmann B., Brandt P., Nyakatura G.J., Droege M., Frishman D., Rattei T., Mewes H.-M., Wagner M.: Illuminating the evolutionary history of Chlamydiae. Science, 304, 728–730 (2004) 34. Horn M., Wagner M.: Evidence for additional genus-level diversity of Chlamydiales in the environment. FEMS Microbiol. Lett. 204, 71–74 (2001) 35. Horn M., Wagner M., Müller K-D., Schmid E.N., Fritsche T.R., Schleifer K-H, Michel R.: Neochlamydia hartmannellae gen. nov., sp. nov. (Parachlamydiaceae), an endoparasite of amoeba Hartmannella vermiformis. Microbiology, 146, 1231–1239 (2000) 36. Kahane S., Dvoskin B., Mathias M., Friedmann M.G.: Infection of Acanthoamoeba polyphaga with Simkania negevensis and S. negevensis survival within amoebal cysts. Appl. Environm. Microbiol. 67, 4789–4795 (2001)

37. Kahane S., Everett K.D., Kimnel N., Friedman M.G.: Simkania negevensis strain ZT: growth, antigenic and genome characteristics. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 815–820 (1999) 38. Kahane S., Gonen R., Sayada C., Elion J., Friedman M.G.: Description and partial characterizaton of a new chlamydialike microorganism. FEMS Microbiol. Lett. 109, 329–334 (1993) 39. Kahane S., Greenberg D., Friedman M.G., Haikin H., Dagan R.: High prevelance of “Simkania Z”, a novel chlamydialike bacterium, in infants with acute bronchiolitis. J. Inf. Dis. 177, 1425–1429 (1998) 40. Kahane S., Kimmel N., Friedmann M.G.: The growth cycle of Simkania negevensis. Microbiology, 148, 735–742 (2002) 41. Kahane S., Metzer E., Friedman M.G.: Evidence that the novel microorganism „Z” may belong to a new genus in the family Chlamydiaceae. FEMS Microbiol. Lett. 126, 203–208 (1995) 42. Kahane S., Platzner N., Dvoskin B., Izthaki A., Friedman M.G.: Evidence for the presence of Simkania negevensis in drinking water and in reclaimed wastewater in Israel. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3346–3351 (2004) 43. Kocan K.M., Crawford T.B., Dilbeck P.M., Evermann J.F., McGuire T.C.: Development of a rickettsia isolated from an aborted bovine fetus. J. Bacteriol. 172, 5949–5955 (1990) 44. Kostanjšek R., Štrus J., Drobne D., Avguštin G.: ‘Candidatus Rhabdochlamydia porcellionis’, an intracellular bacterium from the hepatopancreas of the terrestrial isopod Porcellio scaber (Crustacea: Isopoda). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 543–549 (2004) 45. Lieberman D., Dvoskin B., Lieberman D.V., Kahane S., Friedman M.G.: Serological evidence of acute infection with the chlamydia-like microorganism Simkania negevensis (Z) in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 21, 307–309 (2002) 46. Lieberman D., Kahane S., Lieberman D., Friedman M.G.: Pneumonia with serological evidence of acute infection with the chlamydia-like microorganism “Z”. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 578–582 (1997) 47. Mardh P.A, Paavonen J., Parlakkainen M.: Chlamydia. Plenum Med. Book Comp., New York 1989. 48. Marrie T.J., Raoul D., la Scola B., Birtles R.J., de Carolis E.: Legionella-like and other amoebal pathogens as agents of community-acquired pneumonia. Emerg. Inf. Dis. 7, 1026–1029 (2001) 49. Nylund A., Kvenseth A.M., Isdal E.: A morphological study of the epitheliocystis agent in farmed Atlantic salmon. J. Aquat. Anim. Health 10, 43–55 (1998) 50. Pawlikowska M., Deptu³a W.: Adherence and ingesting capacity of peripheral blood granulocytes in rabbits immunised with various antigens of Chlamydia sp. Centr. Europ. J. Immunol. 24, 293–298 (1999) 51. Rockey D.D., Matsumoto A.: The chlamydial development cycle. Prokaryotic Development, Ed. Brun Y.V & Shimkets L.J., American Society of Microbiology, Washington, DC 2000, p.403–410. 52. Ruczkowska J., Choroszy-Król I., Deptu³a W.: Detection of Ch. trachomatis in the bulls ejaculates by immunoenzymatic (Chlamydiazyme Abbott) immunofluorescent (Chlamyset Orion) and cell culture (McCoy) methods. Zoonoses Cong. Int. Participation VIth Joint Meeting of European Leptospira Workers, Brno 1988, s. 40. 53. Rurangirwa F.R., Dilbeck P.M., Crawford T.B., McGuire T.C., McElwain T.F.: Analysis of the 16S rRNA gene of micro-organism WSU 86-1044 from an aborted bovine foetus

CHLAMYDIE ŒRODOWISKOWE – NOWE PATOGENY CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T

reveals that it is a member of the order Chlamydiales: proposal of Waddliaceae fam. nov., Waddlia chondrophila gen. nov., sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 577–581 (1999) 54. Shay M.T., Bettica A., Vernon G.M., Witkus E.R.: Chlamydia isopodii sp. n., an obligate intracellular parasite of Porcellio scaber. Exp. Cell. Biol. 53, 115–120 (1985) 55. Stackebrandt E., Goebel B.M.: Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 836–849 (1994) 56. Thao M-L., Baumann L., Hess J.M., Falk B.W., Ng J.C.K., Gullan Baumann P.: Phylogenetic evidence for two new insect-associated chlamydia of the family Simkaniaceae. Curr Microbiol. 47, 46–50 (2003)

67

57. Thomas V., Casson N., Greub G.: Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales islated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125–2136 (2006) 58. Yamaguchi T., Yamazaki T., Inoue M., Mashida C., Kawagoe K., Ogawa M., Shiga S., Nakagawa Y., Kishimoto T., Kurane I., Ouchi K., Ohzeki T.: Prevalence of antibodies against Simkania negevensis in a healthy Japanese population determined by the microimmunofluorescence test. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43, 21–27 (2005) 59. Yamaguchi T., Yamazaki T., Inoue M., Ogawa M., Shiga S., Nakagawa Y., Kishimoto T., Ouchi K., Ohzeki T.: Factors improving the propagation of Simkania negevensis strain Z in cell culture. Jpn. J. Infect. Dis. 57, 103–106 (2004)

68

MA£GORZATA PAWLIKOWSKA, WIES£AW DEPTU£A

I N F O R M A C J E,

K O M U N I K A T Y,

RECENZJE

Recenzje ksi¹¿ek Z prawdziw¹ przyjemnoœci¹ donoszê, ¿e oficyna PWN S.A. wyda³a w 2006 roku trzy bardzo dobre, dotowane przez Ministra Nauki i Szkolnictwa Wy¿szego podrêczniki akademickie. S¹ nimi Biologia molekularna bakterii, Genetyka molekularna oraz Biologia molekularna w medycynie – Elementy genetyki klinicznej. Ksi¹¿ki te ³¹czy wiele wspólnych cech. Po pierwsze, w tytule ka¿dej z nich – pomimo – i¿ zajmuj¹ siê wydzielon¹ dziedzin¹ przyrody znajduje siê okreœlenie „molekularna” – termin ten oznacza charakterystyczny dla koñca XX i pocz¹tku XXI wieku sposób ogl¹dania przyrody, ju¿ nie na poziomie komórki czy krajobrazu, ale na poziomie cz¹steczek i ich wzajemnych relacji. Po drugie, omawiane podrêczniki napisane s¹ od nowa przez prawie wy³¹cznie polskich autorów, reprezentuj¹cych ró¿ne oœrodki naukowe (Uniwersytety, Akademie medyczne, placówki PAN-u itp.). Po trzecie, wszystkie prezentuj¹ najwy¿szy poziom naukowy, ka¿da z nich jest bezcennym Ÿród³em wielkiej iloœci faktów. Po czwarte, stanowi¹ prace zbiorowe – tendencja zamiany „samotnego” autora zespo³em wynika jak s¹dzê z ogromnej specjalizacji we wspó³czesnej nauce. Osobiœcie jestem zwolennikiem pisania podrêczników jednoautorskich. Uwa¿am, ¿e prace zespo³owe s¹ byæ mo¿e faktograficznie bogatsze od indywidualnych, ale zwykle nie s¹ merytorycznie spójne, trac¹ na jasnoœci narracji. S¹dzê, ¿e w podrêczniku napisanym przez zespó³ gubi siê niewielk¹ szczyptê polotu, któr¹ mo¿e w³asn¹ ksi¹¿kê zaprawiæ „samotny” autor o zdecydowanej indywidualnoœci. Wœród powojennych polskich podrêczników do klasyki gatunku zaliczam pierwsze wydania ¯ycia bakterii autorstwa nie ¿yj¹cego ju¿ profesora W³adys³awa J.H KunickiegoGoldfingera – w podrêczniku tym, napisanym ¿ywym i doskona³ym polskim jêzykiem, wyk³ad naukowy mikrobiologa, jest przeplatany refleksj¹ filozofa przyrody oraz wybornie ilustrowany zabawnymi rysunkami Szymona Kobyliñskiego. Obawiam siê, ¿e ten rodzaj oryginalnych oraz indywidualnie przygotowanych podrêczników akademickich zaczyna stanowiæ ju¿ przesz³oœæ. Na koniec rozwa¿añ ogólnych chcia³bym podaæ jeszcze jedn¹ wspóln¹ cechê recenzowanych podrêczników, jest ni¹ jednolity, dobry graficznie projekt ok³adki (autor Edwin Radzikowski). W kolejnych ksi¹¿kach ok³adki ró¿ni¹ siê od siebie zdjêciami przedstawiaj¹cymi ró¿ne obiekty badawcze oraz kolorami. Ogólny wygl¹d ok³adki sugeruje jedn¹ seriê wydawnicz¹. Autor: praca zbiorowa pod redakcj¹ naukow¹ Jadwigi Baj i Zdzis³awa Markiewicza Tytu³: Biologia molekularna bakterii Redaktor PWN Krystyna Mostowik Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Warszawa 2006 Wydanie pierwsze. ISBN-13: 978-83-01-14724-2 ISBN-10: 83-01-14724-5

Autor: praca zbiorowa pod redakcj¹ naukow¹ Piotra Wêgleñskiego Tytu³: Genetyka molekularna Redaktor PWN Krystyna Kruczyñska Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Warszawa 2006 Wydanie nowe (drugie, pierwsze 1995) ISBN-13: 978-83-14744-0 ISBN-10: 83-01-14744-X

Ksi¹¿ka nawi¹zuje do szeœciu wydañ ¯ycia bakterii W.H. Kunickiego-Goldfingera, zosta³a napisana przez grono Jego uczniów: Jadwigê Baj, Dariusza Bartosika, El¿bietê K. JagusztynKrynick¹, Zdzis³awa Markiewicza, Andrzeja Piekarowicza, Miros³awê W³odarczyk oraz Krystynê I. Wolsk¹. Wczeœniej autorzy próbowali „uwspó³czeœniæ” ostatnie wydanie ¯ycia bakterii (PWN 2005), jednak¿e okaza³o siê to tym razem bezsensowne. Od pierwszego wydania ¯ycia bakterii nast¹pi³ zbyt du¿y skok w poznaniu budowy oraz funkcji komórek bakteryjnych oraz samej natury zjawisk biologicznych. St¹d dalsze ulepszanie ksi¹¿ki nie mia³o ju¿ sensu. Obecny podrêcznik oznakowany terminem „molekularny” jest bardziej nowoczesny od pierwotnego wzoru i zawiera wiele informacji o wspó³czesnym stanie wiedzy. Omawiana w nim problematyka badañ jest nieco ró¿na od tej z pierwowzoru. Oprócz klasycznej w podrêcznikach z mikrobiologii tematyki jak: budowa komórki bakteryjnej, systemy klasyfikacji drobnoustrojów, struktura i funkcje materia³u genetycznego wprowadzono w nim kilka nowych b¹dŸ znacz¹co odmiennie napisanych rozdzia³ów, takich jak Molekularne podstawy bakteryjnej patogenezy czy Ruchome elementy genetyczne. S¹dzê, i¿ mniej miejsca w ksi¹¿ce zajmuje klasyczna fizjologia, wiêcej genetyka oraz aspekty regulacji metabolizmu drobnoustrojów. W sumie ksi¹¿ka ta spe³nia dobrze wymogi nowoczesnego podrêcznika akademickiego z zakresu mikrobiologii ogólnej. Jerzy Hrebenda

Genetyka molekularna koresponduje z omawianym ju¿ podrêcznikiem. J. Baj i Z. Markiewicza. Obie ksi¹¿ki s¹ spójne tematycznie a w wielu punktach œwietnie siê uzupe³niaj¹. Redaktorem naukowym Genetyki molekularnej jest Piotr Wêgleñski, by³y Rektor Uniwersytetu Warszawskiego, genetyk, badacz oraz nauczyciel akademicki. P. Wêgleñski od lat zajmowa³ siê upowszechnianiem w kraju genetyki. To w³aœnie t³umaczonej przez Niego ksi¹¿ce F.W. Stahla pt. Mechanizmy dziedziczenia. (1969 r.) zawdziêczamy pierwsze – po okresie „³ysenkizmu” informacje o tej dyscyplinie naukowej. Podrêcznik Genetyka molekularna, pierwowzór obecnego wydania, ukaza³ siê po raz pierwszy w 1995 r. i przez d³ugi czas by³ trudn¹ do kupienia ksi¹¿k¹. Dzisiejsze nowe wydanie przygotowane wg koncepcji Wêgleñskiego napisali najbli¿si Jego wspó³pracownicy: Piotr Bêbas, Magdalena Fikus, Pawe³ Golik, El¿bieta K. Jagusztyn-Krynicka, Andrzej Jerzmanowski, Janusz Limon, Barbara Lipiñska, Marta Nurek, Krzysztof Staroñ, Piotr Wêgleñski i W³odzimierz Zagórski-Ostoja. W nowym wydaniu znajduj¹ siê podstawowe informacje z genetyki oraz biologii molekularnej. Omówiono w nim takie problemy jak: budowa materia³u genetycznego, kod genetyczny, biosynteza bia³ek, in¿ynieria genetyczna, genomika i proteomika, procesy ró¿nicowania i wzrostu, choroby nowotworowe oraz ewolucja genów. W tym miejscu chcia³bym zwróciæ szczególnie uwagê na trzy zawarte w ksi¹¿ce rozdzia³y tj. Molekularne podstawy procesów odpornoœciowych, Genetyczne pod³o¿e chorób nowotworowych

Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski

70

RECENZJE KSI¥¯EK

oraz Nowy wspania³y œwiat biotechnologii. Ka¿dy z tych rozdzia³ów tworzy oddzieln¹ ca³oœæ i mo¿e byæ traktowany jako syntetycznie napisany, samodzielny podrêcznik z Immunologii, Chorób nowotworowych czy Biotechnologii. Ostatni rozdzia³ traktuj¹cy o zastosowaniu technik biologii i genetyki molekularnej w praktyce uwa¿am za szczególnie cenny. Obecnie brak jest aktualnego, napisanego po polsku podrêcznika z biotechnologii. Wprawdzie mo¿na polecaæ jedno z wydañ uaktualnionego podrêcznika Aleksandra Chmiela pt. Biotechnologia – podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, jednak¿e jest to ksi¹¿ka, traktuj¹ca w wiêkszoœci, o tradycyjnej a nie nowoczesnej biotechnologii. Autorka Nowego i wspania³ego œwiata biotechnologii (M. Fikus) bardzo trafnie przedstawia wspó³czesne pogl¹dy na obszary zainteresowañ nowoczesnej biotechnologii oraz charakteryzuje jej g³ówne nurty nazywane bia³¹, czerwon¹ i zielon¹ biotechnologi¹. Rozdzia³ obfituje w du¿¹ iloœæ aktualnych danych. Opisuj¹ one dynamikê rozwoju biotechnologii jak i przedstawiaj¹ zyski uzyskiwane dziêki stosowaniu tej techniki. Wad¹ rozdzia³u jest jego lapidarnoœæ, czytaj¹c go mia³em wra¿enie, ¿e mam przed oczami nie rozdzia³ podrêcznika, a szczegó³owy konspekt przygotowany dla wydawcy. Jerzy Hrebenda Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski

Autor: praca zbiorowa pod redakcj¹ naukow¹ Jerzego Bala Tytu³: Biologia molekularna w medycynie Elementy genetyki klinicznej Redaktor PWN Krystyna Kruczyñska Wydawnictwo Naukowe PWN S.A. Warszawa 2006 Wydanie drugie (zmienione, pierwsze 2001) ISBN-13: 978-83-01-14703-7 ISBN-10: 83-01-14703-2 Biologia molekularna w medycynie – Elementy genetyki klinicznej Jerzego Bala, stanowi kolejny tom z serii biologii molekularnej PWN. Jest to drugie zmienione wydanie. Ksi¹¿ka sk³ada siê z dwu czêœci, pierwsza obejmuje problematykê ogóln¹ (diagnostyka molekularna w medycynie, podstawy genetyki, genom cz³owieka, zasady dziedziczenia, zmiennoœæ i dziedzicznoœæ, genetyczna ró¿norodnoœæ populacji ludzkiej). Czêœæ ogólna, bez diagnostyki, jest tematycznie bardzo podobna do opisywanej problematyki w ksi¹¿ce Wêgleñskiego. Ró¿nice pomiêdzy ww. podrêcznikami polegaj¹ na, zawê¿eniu w ksi¹¿ce Bala problematyki do jednego obiektu tj. cz³owieka, zmianie akcentów

z podstawowych problemów genetyki na próbê przedstawienia anomalii w tych procesach (ok. ¾ tekstu to opis chorób kompleksowych, mitochondrialnych oraz genetycznych chorób dziedzicznych), ukierunkowaniu materia³u zawartego w ksi¹¿ce Bala z problematyki czysto poznawczej na zagadnienia praktyczne (testy diagnostyczne, identyfikacja grup krwi, testy oparte na analizie DNA itp.), oraz wprowadzeniu do podrêcznika elementów z zakresu uregulowañ prawnych (rozdzia³ napisany przez Marka Safjana, oryginalne teksty jak np. Konwencja o Ochronie Praw Cz³owieka i Godnoœci Istoty Ludzkiej wobec Zastosowañ Biologii i Medycyny, przyk³ady wyników diagnostyki molekularnej itp.). Informacje natury praktycznej zosta³y uzupe³nione rozdzia³em zatytu³owanym Biotechnologia (produkcja szczepionek, przeciwcia³ monoklonalnych, produkcja zwi¹zków biologicznie aktywnych oraz zwierz¹t transgenicznych dla produkcji biofarmaceutyków). Doœæ oryginalnym przedsiêwziêciem jest omówienie szczepionek g³ównie na przyk³adzie otrzymywania ich w roœlinach. Podrêcznik zosta³ napisany przez wielu œwietnych autorów: Jerzego Bala, Ewê Bartnik, Ewê Bocian, Ewê Brojer, Barbarê Czartorysk¹, W³adys³awa A. Daniela, Janusza Fietta, Alain Fishera, Marek Gniatkowski, Piotra Grabarczyka, Józefa Kapustê, Piotra Kozio³a, Janusza Limona, Barbarê Lisowsk¹-Grospierre, Tadeusza Mazurczaka, Normana J. Pieni¹¿ka, Jacka Pietrzyka, Tomasza Pniewskiego, Marka Safjana, Janusza A. Siedleckiego, Annê Tylki-Szymañsk¹, Joannê Wiszniewsk¹, Wojciecha Wiszniewskiego i Ewê Ziêtkiewicz. Na koniec chcia³bym poruszyæ jeszcze dwie kwestie: ksi¹¿ka zosta³a zaprojektowana przez J. Bala wg bardzo rozs¹dnej koncepcji oraz napisana przez grono wysokiej klasy specjalistów. Dla ilustracji tej tezy wymieniê nazwiska tylko dwu Autorów: Marek Safjan, by³y Prezes Trybuna³u Konstytucyjnego, profesor Uniwersytetu Warszawskiego, laureat Nagrody Stefana Kisielewskiego, za stosowanie zasady „dura lex sed lex” – Profesor wielokrotnie wypowiada³ siê na tematy niektórych aspektów prawnych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej i medycyny: Norman J. Pieni¹¿ek – pocz¹tkowo pracowa³ w Instytucie Biochemii Biofizyki w Warszawie (w Zak³adzie œp. prof. W. Gajewskiego) obecnie jest Kierownikiem Referencyjnej Diagnostyki Molekularnej Narodowego Centrum Chorób Infekcyjnych w Atlancie. Trudno znaleŸæ lepszego Autora rozdzia³u pt. Diagnostyka Chorób infekcyjnych i inwazyjnych. S¹dzê, ¿e recenzowany podrêcznik mo¿na polecaæ jako pomoc w nauczaniu biologii molekularnej na uniwersytetach oraz akademiach medycznych. Jerzy Hrebenda Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski

Warszawa, listopad 2006

RECENZJE KSI¥¯EK

71

Recenzje ksi¹¿ek Uprzejmie donoszê, i¿ wraz z ¿yczeniami z okazji Œwi¹t Bo¿ego Narodzenia i Nowego Roku, otrzymaliœmy od Wydawnictwa Naukowego PWN trzy kolejne, wydane w 2006 roku, ksi¹¿ki. S¹ one ró¿ne jeœli chodzi o ich charakter i przeznaczenie, wszystkie jednak zajmuj¹ siê wa¿nymi problemami z zakresu ogólnie rozumianej biologii. Polecaj¹c PT czytelnikom lekturê tych ksi¹¿ek mam nadziejê, ¿e oprócz wartoœci poznawczych znajd¹ tam równie¿ wiele praktycznych informacji, u¿ytecznych w pracy zawodowej.

Autor: Jerzy Buchowicz Tytu³: Biotechnologia molekularna Geneza, przedmiot, perspektywy badañ Redaktor PWN: Irena Zienkiewicz Projekt ok³adki: Edwin Radzikowski Wydawnictwo Naukowe PWN S.A Warszawa 2006 Wydanie pierwsze ISBN-13: 978-83-01-14822-5 ISBN-10: 83-01-14822-5

Autor: praca zbiorowa pod redakcj¹ naukow¹ Przemys³awa Wojtaszka, Adama WoŸnego i Lecha Ratajczaka Tytu³: Biologia komórki roœlinnej, I tom Struktura Redaktor PWN Krystyna Mostowik Wydawnictwo Naukowe P.W.N. S.A. Warszawa 2006 Wydanie pierwsze ISBN-13: 978-83-01-14838-6 t.1 ISBN-10: 83-01-14838-1 t.1

Ksi¹¿ka J. Buchowicza nie jest podrêcznikiem akademickim, nie jest te¿ opisem monograficznym klasycznej biotechnologii rozumianej jako: zintegrowane zastosowanie biochemii, mikrobiologii i nauk in¿ynieryjnych w celu wykorzystania zdolnoœci drobnoustrojów, jak i kultur tkankowych. Autor na ok. 150 stronach tekstu stara³ siê przedstawiæ now¹ dyscyplinê o w³asnych celach badawczych, jak¹ stanowi biotechnologia molekularna. Wg Niego jest to nauka powsta³a na styku wspó³czesnej biologii eksperymentalnej oraz techniki. Sam termin – biotechnologia molekularna – nie zosta³ dotychczas zdefiniowany, choæ podobno jest instynktownie zrozumia³y, przez ka¿dego biologa i biotechnologa. (informacje ze wstêpu). Wreszcie nazwa dyscypliny pochodzi od tytu³u projektu badawczego Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN – Molekularne podstawy biotechnologii, opracowanego w roku 1984. Zainteresowania Biotechnologii molekularnej id¹ w dwu kierunkach; pierwszy znany pod terminem in¿ynierii genetycznej polega na uzyskiwaniu zrekombinowanego DNA oraz pracy na tym polimerze, drugi zajmuje siê interferencj¹ RNA-RNA. Ksi¹¿ka sk³ada siê tylko z trzech rozdzia³ów – pierwszy stanowi wstêp i traktuje doœæ pobie¿nie o historii odkryæ, enzymach restrykcyjnych, cytogenetyce oraz genomice; rozdzia³ drugi – najbardziej rozbudowany zawiera opis podstawowych zainteresowañ biotechnologii molekularnej tj. klonowania molekularnego, sztucznych chromosomów, transformacji, agroindukcji, transformacji plastydów i mitochondrów, embriogenezie somatycznej, zwierzêtom transgenicznym. Kolejne podrozdzia³y opisuj¹ wykorzystanie biotechnologii molekularnej w medycynie (terapia genowa, terapeutyczne zastosowanie interferencji RNA-RNA) oraz omawiaj¹ problemy zwi¹zane z GMO. Ksi¹¿kê koñcz¹ krótkie rozwa¿ania Autora na temat przysz³oœci biotechnologii molekularnej. Ksi¹¿ka napisana jest bardzo dobr¹ polszczyzn¹, czyta siê j¹ z prawdziw¹ przyjemnoœci¹. Pozornie robi wra¿enie literatury popularno naukowej – jednak¿e zrozumienie g³êbszych myœli zawartych miêdzy opisem, wydawa³o by siê technicznych informacji, wymaga pewnego przygotowania przyrodniczego. Jerzy Hrebenda

Podrêcznik „Biologia komórki roœlinnej” jest pierwszym w jêzyku polskim tak obszernym dzie³em prezentuj¹cym ca³oœciowe spojrzenie na biologiê komórki roœlinnej, a wiêc z jednej strony na budowê, z drugiej na funkcjê, a tak¿e na pochodzenie komórki roœlinnej. Powi¹zanie struktury z funkcj¹, pokazanie ich wspó³zale¿noœci, a przede wszystkim integracja osi¹gniêæ ró¿nych dziedzin biologii roœlin jest ogromna zalet¹ podrêcznika. Nawet w podrêcznikach obcojêzycznych biologia komórki roœlinnej stanowi pewn¹ niewielk¹ czêœæ ich treœci. W rozumieniu wielu biologów zajmuj¹cych siê komórk¹ zwierzêc¹, komórka roœlinna ró¿ni siê od zwierzêcej jedynie obecnoœci¹ œciany komórkowej i plastydów, a pozosta³e struktury komórkowe wygl¹daj¹ i funkcjonuj¹ tak samo. W ich rozumieniu nie ma wiêc potrzeby pisania podrêcznika poœwiêconego biologii komórki roœlinnej. Nowy podrêcznik pod redakcj¹ P. Wojtaszka, A. WoŸnego i L. Ratajczaka pokazuje ró¿nice w biologii komórki roœlinnej i zwierzêcej, a tym samym wyprowadza studentów z b³êdu o jednakowej biologii tych dwóch typów komórek. Ogromn¹ zalet¹ publikacji s¹ bardzo aktualne, nowe zagadnienia dotycz¹ce np. biomechaniki roœlin, iRNA, czy transportu bia³ek i RNA przez plazmodesmy, których z oczywistych powodów nie by³o w poprzednim podrêczniku „Podstawy biologii komórki roœlinnej” z 2000 r. Bardzo siê cieszê, ¿e podrêcznik „Biologia komórki roœlinnej” zosta³ napisany, wydany i trafi do r¹k studentów. Ksi¹¿ka napisana jest w sposób przystêpny. Ka¿dy rozdzia³ zawiera wprowadzenie definiuj¹ce opisywan¹ strukturê, a nastêpnie opis budowy okreœlonej struktury lub kompartmentu komórkowego. Tekst jest bogato ilustrowany, co znakomicie u³atwia zrozumienie budowy i funkcjonowania danej struktury. Pojêcia i terminy specjalistyczne wyjaœnione s¹ w tekœcie, a tak¿e zawarte w s³owniczku podstawowych pojêæ i terminów. Dodatkowo na koñcu ka¿dego rozdzia³u znajduje siê opis hase³ i wyjaœnienie okreœlonych pojêæ, bêd¹ce de facto krótkim streszczeniem ka¿dego rozdzia³u, co znakomicie u³atwia zrozumienie, podsumowanie i powtórzenie okreœlonego zagadnienia.

Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski

72

RECENZJE KSI¥¯EK

Na szczególne podkreœlenie zas³uguj¹ bardzo klarownie i skrótowo napisane za³¹czniki zawieraj¹ce s³owniczek pojêæ i terminów, definicje wybranych jednostek oraz nomenklaturê g³ównych sk³adników komórkowych. Dwa ostatnie za³¹czniki, tak rzadko spotykane w podrêcznikach biologicznych, s¹ bardzo przydatne. Podrêcznik zawiera skróty stosowane w biologii komórki, bardzo u¿yteczne w czytaniu i zrozumieniu tekstu, wraz z odpowiednimi pierwowzorami anglojêzycznymi. Zasadnicz¹ czêœæ podrêcznika stanowi¹ rozdzia³y z umieszczonym na pocz¹tku ka¿dego z nich szczegó³owym spisem treœci, co znacznie u³atwia znalezienie informacji. Na koñcu poszczególnych rozdzia³ów s¹ has³a wyjaœniaj¹ce pojêcia u¿yte w rozdziale i podsumowuj¹ce tekst ka¿dego z nich. Warto podkreœliæ umieszczony na koñcu ka¿dego rozdzia³u spis literatury pozwalaj¹cy na poszerzenie informacji na temat poruszanych zagadnieñ. Za³¹czniki zawieraj¹ce s³owniczek pojêæ i terminów, definicje wybranych jednostek oraz nomenklaturê g³ównych sk³adników komórkowych s¹ bardzo przydatne. Materia³ ilustracyjny: schematy, rysunki, wzory zwi¹zków chemicznych, a przede wszystkim zdjêcia mikroskopowe s¹ nieodzowne dla zrozumienia budowy poszczególnych komórek, struktur wewn¹trz komórkowych, przebiegu cykli komórkowych i wewn¹trzkomórkowych przemian. Na szczególne uznanie zas³uguj¹ zdjêcia z mikroskopu œwietlnego, konfokalnego, elektronowego transmisyjnego i skaningowego (str. 396–428); bardzo u³atwiaj¹ one zrozumienie tekstu. Publikacja jest podrêcznikiem akademickim. Treœæ zawarta w „Biologii komórki roœlinnej” jest ca³kowicie zgodna ze Standardami kszta³cenia Rady G³ównej Szkolnictwa Wy¿szego (21.06.2006) dla kierunku biologia, a tak¿e ze Standardami innych kierunków studiów, gdzie treœci kszta³cenia dotycz¹ biologii molekularnej, budowy, funkcji, rozwoju i ewolucji organizmów. Podrêcznik jest adekwatny do zakresu i poziomu zajêæ zarówno z biologii komórki, jak i anatomii roœlin, biologii rozwoju roœlin oraz zajêæ metodycznych z technik mikroskopowych. Opiniowany podrêcznik z „Biologii komórki roœlinnej” bêdzie bardzo przydatny dla studentów kierunków o profilu biologicznym, do zajêæ dotycz¹cych budowy, funkcji, rozwoju i pochodzenia komórek roœlinnych. Powinien byæ polecany szczególnie do zajêæ z biologii komórki, a tak¿e niektóre z jego rozdzia³ów do zajêæ z fizjologii roœlin, anatomii roœlin, biologii rozwoju roœlin, ewolucjonizmu oraz technik mikroskopowych. Agnieszka Mostowska

Instytut Biologii Eksperymentalnej Roœlin, Uniwersytet Warszawski

Autor: Stanley E Manahan Tytu³: Toksykologia œrodowiskowa. Aspekty chemiczne i biochemiczne T³umaczenie: W³adys³aw Boczoñ, Henryk Koroniak Wydawca: Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 ISBN-13: 978-83-01-14841-6 ISBN-10: 83-01-14841-1 Podrêcznik w 20 rozdzia³ach przedstawia aktualny stan wiedzy z zakresu toksykologii w oparciu chemiê i biochemiê œrodowiska. Autor w pierwszych dwóch rozdzia³ach przypomina podstawy chemii nieorganicznej i organicznej oraz zjawiska towarzysz¹ce przemianom chemicznym w œrodowisku. Kolejne dwa rozdzia³y poœwiêcone zosta³y biochemii i przemianom metabolicznym zarówno na poziomie komórki jak i ca³ego organizmu. W rozdziale 5 omówione zosta³y œrodowiskowe procesy biologiczne i podstawy ekotoksykologii. W tym rozdziale t³umacze wprowadzaj¹ nowy w jêzyku polskim termin „biostê¿anie” w miejsce biokoncentracji czy te¿ bioakumulacji. W oryginale Autor u¿ywa s³ów „bioconcentration” i „bioacumulation”. Wprowadzenie nowego terminu wydaje siê niepotrzebne, tym bardziej, ¿e w ¿adnych s³ownikach tematycznych powszechnie dostêpnych podobne s³owo nie wystêpuje. Podstawy toksykologii i chemii toksykologicznej znajdziemy kolejno w rozdzia³ach 6 i 7. W podrêczniku omówiono tak¿e genetyczne aspekty toksykologii i reakcje fizjologiczne organizmu na czynniki toksyczne w³¹cznie z toksykologi¹ rozwojow¹ i teratologi¹. W dalszych 10 rozdzia³ach Autor przedstawia kolejno toksycznoœæ pierwiastków (metali, metaloidów i niemetali), zwi¹zków nieorganicznych z podzia³em na grupy i dalej w podobny sposób zwi¹zków organicznych. Ostatni rozdzia³ poœwiêcony zosta³ nowoczesnym metodom analizy ksenobiotyków. Na koñcu ka¿dego rozdzia³u umieszczono spis literatury, literatury uzupe³niaj¹cej oraz zestaw pytañ i problemów. Taka konstrukcja w znakomity sposób u³atwia systematyczne i rozumne przyswajanie wiedzy. Jest to podrêcznik nowoczesny. Zgodnie z notk¹ wydawcy umieszczon¹ na tylnej ok³adce podrêcznik przeznaczony jest dla studentów chemii, biologii, geografii. Rzeczywiœcie szeroki zakres tematyczny i omówienie w pierwszych rozdzia³ach podstaw chemii, biochemii i fizjologii czyni ten podrêcznik dostêpnym dla szerokiego grona odbiorców. Trzeba jednak stwierdziæ, ¿e wiedza zawarta w podrêczniku jest wiedz¹ podstawow¹ i powinna zostaæ opanowana w ci¹gu pierwszych lat studiów oraz otworzyæ drogê do zg³êbiania bardziej specjalistycznych problemów. Jednoczeœnie podrêcznik wychodzi naprzeciw wymaganiom zawartym w standardach nauczania dla nastêpuj¹cych kierunków studiów: biologia, ochrona œrodowiska, chemia i w mniejszym stopniu geografia, ochrony œrodowiska, farmacji i medycyny. Aleksandra Sk³odowska

Pracownia Analizy Ska¿eñ Œrodowiskowych, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski

POST. MIKROBIOL., 2007, 46, 1, 73–75 http://www.pm.microbiology.pl

INFORMACJA DLA AUTORÓW Postêpy Mikrobiologii zamieszczaj¹ artyku³y przegl¹dowe ze wszystkich dziedzin mikrobiologii nie drukowane w innych czasopismach oraz w dziale Nowoœci Wydawniczych recenzje nowych ksi¹¿ek z zakresu mikrobiologii i nauk pokrewnych, które ukazuj¹ siê w Polsce. Artyku³y drukowane w Postêpach Mikrobiologii nie mog¹ byæ bez zgody Redakcji publikowane w innych periodykach. 1. Sposób przygotowania manuskryptu. 1.1. Tekst Prace nale¿y przysy³aæ do Sekretariatu Redakcji w postaci elektronicznego zapisu tekstu w edytorze Microsoft Word dowolnej edycji w wersji PL na dyskietkach komputerowych (3,5” 1,44 MB), na p³ytach CD lub DVD. Do dyskietki powinny byæ do³¹czone 2 egz. tekstu artyku³u ca³kowicie zgodnego z zapisem elektronicznym. Objêtoœæ pracy nie powinna przekraczaæ wraz z piœmiennictwem i ilustracjami 30 stron maszynopisu. Maszynopis powinien byæ jednostronny (wielkoœæ czcionki 12, odstêp pomiêdzy wierszami 1,5), z numeracj¹ stron. Po tytu³ach wydzielonych nie nale¿y stawiaæ kropek. Na oddzielnej stronie (strona tytu³owa) nale¿y podaæ tytu³ pracy, pod nim w pe³nym brzmieniu imiona i nazwiska autorów, spis treœci (tytu³y poszczególnych rozdzia³ów) oraz kilka (nie wiêcej jak piêæ) s³ów kluczowych (keywords). Tytu³ pracy i spis treœci nale¿y powtórzyæ w jêzyku angielskim. S³owa kluczowe mog¹ b¹dŸ nie pojawiaæ siê w tytule pracy – nale¿y je podaæ w porz¹dku alfabetycznym. Praca powinna koñczyæ siê krótkim podsumowaniem, zawieraj¹cym najistotniejsze elementy treœci. Na oddzielnej stronie nale¿y do³¹czyæ krótkie streszczenie pracy w jêzyku angielskim (maksymalnie 250 s³ów). Tekst pracy powinien byæ zgodny z zaleceniami szczegó³owymi Redakcji. Przes³ane do redakcji prace winny byæ napisane poprawn¹ polszczyzn¹. Redakcja rekomenduje P.T. Autorom S³ownik Poprawnej Polszczyzny (red. Witold Doroszewski, Halina Kurkowska, Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa,1998) jako pomoc w redagowaniu tekstu. Jakkolwiek Postêpy Mikrobiologii s¹ polskojêzyczne, nie wyklucza siê druku prac, napisanych po angielsku. 1.2. Ilustracje Tabele i rysunki (po dwa egz., o rozmiarze nie przekraczaj¹cym 26,5 cm × 18 cm) winny byæ wykonane starannie (dok³adne krycie) czarnym tuszem na kalce technicznej lub w formie wydruku z drukarki laserowej lub atramentowej. Fotografie (po dwa egz.) nale¿y sporz¹dzaæ na b³yszcz¹cym papierze, najlepiej w formacie 13 cm×18 cm. Materia³y te nale¿y za³¹czyæ oddzielnie. Nie nale¿y pozostawiaæ w maszynopisach wolnych miejsc na rysunki i zdjêcia, a tylko na kopii zaznaczyæ miejsce, w którym powinny byæ umieszczone, np. tab. 1, rys. 1. Liczbê rysunków i tabel nale¿y ograniczyæ do istotnie niezbêdnej iloœci. Te same wskazówki odnosz¹ siê do pojedynczych wzorów chemicznych. Ka¿da tabela powinna byæ oznaczona kolejnym numerem rzymskim oraz mieæ nag³ówek opisuj¹cy jej treœæ. Na osobnej kartce nale¿y za³¹czyæ spis z objaœnieniami jakie powinny siê znaleŸæ pod rysunkami lub z uwag¹ „objaœnienia w tekœcie”. Podpisy pod wykresami, rysunkami, zdjêciami nale¿y umieœciæ na osobnej stronie.

1.3. Piœmiennictwo Cytowan¹ literaturê (Piœmiennictwo) nale¿y wpisaæ oddzielnie jako ostatnie strony maszynopisu, wymieniaj¹c pozycje w kolejnoœci alfabetycznej. W wykazie powinny byæ podane kolejno: liczba porz¹dkowa, nazwisko autora, pierwsze litery imion, nazwiska wspó³autorów pracy i pierwsze litery ich imion (w kolejnoœci podanej w cytowanej pracy), pe³ny tytu³ cytowanej pracy, skrócony tytu³ czasopisma, tom, strona, i rok wydania (w nawiasach). Dla cytowanych wydawnictw nieperiodycznych nale¿y podaæ kolejno: nazwisko i pierwsze litery imion autora, lub wspó³autorów, tytu³ dzie³a, wydawnictwo, miejsce i rok wydania. W przypadku odwo³ywania siê do artyku³u w pracy zbiorowej nale¿y dodatkowo podaæ tytu³ tej pracy oraz nazwisko jej redaktora, wydawnictwo, miejsce wydania, rok, tom oraz na koñcu stronê, np. Portnoy D. A., Sun A. N., Bielecki J. E., Escape from the phagosome and cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes (w) Microbial Adhesion and Invasion, red. M. Hook, L. Œwitalski, Springer Verlag, New York, 1991, s. 86. W przypadku gdy liczba wspó³autorów pracy przekracza 10, nale¿y podaæ nazwiska i inicja³y pierwszego oraz ostatniego wspó³autora a nastêpnie dodaæ uwagê i wsp. np. Tomb J.F., J.C. Venter i wsp.: The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 338, 539–543 (1997) (wy¿ej cytowana praca jest dzie³em 42 autorów) Powo³ywanie siê w tekœcie na pozycje cytowanej literatury nastêpuje przez wymienienie liczby porz¹dkowej w nawiasach np. (10). Iloœæ cytowañ w piœmiennictwie nie mo¿e przekraczaæ 100 pozycji. 1.3.1. Piœmiennictwo danych cytowanych z sieci internetowej Cytowanie danych z sieci internetowej mo¿e jedynie dotyczyæ informacji pochodz¹cych z prac oryginalnych zamieszczanych w sieci przez uznane w œrodowisku naukowym oraz recenzowane czasopisma. Redakcja bêdzie równie¿ uznawaæ cytacje informacji ze Ÿróde³ autoryzowanych przez uznane w œrodowisku autorytety z dziedziny nauk przyrodniczych. Warunkiem koniecznym przy u¿yciu informacji ze strony internetowej jest sprawdzenie i aktualizacja zapisu informacyjnego na stronie WEB w dniu wysy³ania maszynopisu. W przypadku niew³aœciwego adresu i niemo¿liwoœci odtworzenia informacji z sieci komputerowej, prace bêd¹ zwracane autorom. Cytowanie informacji publikowanej na stronach sieci internetowej powinno wygl¹daæ nastêpuj¹co: 14. XYZ Website 14 listopada 2004 roku (online), nazwisko wydawcy, jeœli jest znane, http://cbx.iou.pgr. (10 PaŸdziernika 2004 roku, data ostatniego sprawdzenia adresu). Cytowanie ksi¹¿ek powinno zawieraæ szczegó³owe dane o wydawnictwie. Cytacje prac oryginalnych przesy³anych poprzez sieæ komputerow¹ powinna zawieraæ nastêpuj¹ce dane: Nazwisko autora, inicja³y imion, data przyjêcia pracy, tytu³ pracy. Nazwa czasopisma, numer: strony (jeœli s¹ dostêpne) (online), adres internetowy, data potwierdzenia wa¿noœci adresu.

74

INFORMACJA DLA AUTORÓW

1.3.2. Elektroniczne wersje ilustracji Redakcja Postêpów Mikrobiologii  akceptuje ilustracje zachowane w formatach: TIFF, JPG lub EPS.  Wszystkie grafiki nale¿y przesy³aæ w 100% wymiarze bez koniecznoœci skalowania. Minimalna rozdzielczoœæ stosowana w ilustracjach powinna wynosiæ 300 dpi dla zdjêæ szarych i kolorowych, 600 dpi dla liter i 1200 dpi dla linii w wykresach. Grafiki kolorowe nale¿y zachowywaæ w formacie CMYK. Dane s¹ przyjmowane na standardowych mediach takich jak dyskietki (3,5 cala), p³yty CD lub DVD. Przes³ane dyski lub dyskietki nie bêd¹ zwracane autorom. Zalecana przez redakcjê kompresja informacji to ZIP lub RAR. W celu szczegó³owej informacji proszê wysy³aæ zapytanie przez e-mail na adres [email protected]. 2. Prawo autorskie W przypadku reprodukcji w pracy cudzych rysunków lub tabel – nawet w formie zmodyfikowanej – b¹dŸ cytowania fragmentów cudzego tekstu, Autorzy Postêpów Mikrobiologii przed przys³aniem tych materia³ów do Redakcji s¹ zobowi¹zani do uzyskania pisemnej zgody od Autorów oryginalnych prac i Wydawnictwa (z której materia³y te pochodz¹) na ich reprodukcjê. Cytowany tekst powinien byæ wyraŸnie oznaczony w odpowiednim miejscu manuskryptu, zaœ u do³u strony powinna byæ zamieszczona informacja dotycz¹ca pochodzenia cytatu oraz uzyskanej zgody na przedruk. Zaœwiadczenia wraz z informacj¹ którego rysunku, tabeli lub cytatu dotycz¹, nale¿y przes³aæ wraz z manuskryptem przeznaczonej do publikacji pracy. Uprzejmie zawiadamiamy, i¿ od 3-ciego zeszytu PM (2001 r.) Autorów naszego Pisma obowi¹zywaæ bêdzie sk³adanie wraz z manuskryptem oœwiadczenia dotycz¹cego praw autorskich. 3. Zalecenia szczegó³owe* 3.1. Nazewnictwo drobnoustrojów Nale¿y stosowaæ dwucz³onowe nazwy zawieraj¹ce nazwê rodzajow¹ oraz gatunkow¹ (np. Escherichia coli). Nazwy rodzajowe mog¹ byæ u¿yte same tj. bez nazwy gatunkowej, natomiast nie mo¿na u¿yæ samych tylko nazw gatunkowych. Gdy w pracy podaje siê pierwszy raz nazwê gatunku, musi ona sk³adaæ siê z pe³nych wyrazów, przy ponownym u¿yciu tej nazwy, podaje siê tylko pierwsz¹ literê nazwy rodzajowej (zawsze du¿¹ ) oraz nazwê gatunkow¹ w pe³nym brzmieniu np. E. coli. Nazwy gatunku, rodziny, rzêdu, klasy, dzia³u oraz królestwa nale¿y pisaæ kursyw¹. Informacje szczegó³owe dotycz¹ce pisowni oraz prawid³owego nazewnictwa (zgodnego z wymogami wspó³czesnej systematyki ) – przyjête przez Redakcjê Postêpów Mikrobiologii, za instrukcj¹ ASM – mo¿na znaleŸæ w Instructions to Authors, J. Bacteriol. Jan. 1999. Zgodnie z propozycjami WHO – Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella („Antigenic Formulas of the Salmonella Serovars” (M.Y. Popoff and L. Le Minor, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France, 1997) and „Identification and Serotyping of Salmonella and an Update of the Kaufmann-White Scheme” (A.C. McWhorter-Murlin and F.W. Hickman-Brenner, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.) do rodzaju Salmonella nale¿¹ tylko dwa gatunki tj. S. enterica i S. bongori – pierwszy z nich podzielony zosta³ na 6 podgatunków. Stosowane dotychczas zwyczajowe nazwy, nie posiadaj¹ce statusu taksonomicznego, takie jak serotyp, typ serologiczny, zosta³y zast¹pione nazw¹ serowaru (w oryginale serovar, sv.). Nazwê serowaru nale¿y pisaæ du¿¹ liter¹ oraz prostym pismem (np. Typhi, Paratyphi B, Typhimurium itp.). Zgodnie z po* fragmenty instrukcji dla autorów czasopism wydawanych przez American Society for    Microbiology – wykorzystywanie w P.M. za zgod¹ Journals Departments ASM.

wy¿szym, nazwê pierwszego podgatunku rodzaju Salmonella mo¿na zapisaæ: S. enterica subsp. enterica sv. Typhimurium lub Salmonella subsp. I. sv. Typhimurium, b¹dŸ po prostu, Salmonella Typhimurium. 3.2. Nomenklatura genetyczna W³aœciwoœci genetyczne szczepu opisywane s¹ w terminach fenotypu oraz genotypu. Fenotyp opisuje obserwowane w³aœciwoœci organizmu. Genotyp okreœla genetyczn¹ strukturê organizmu, zwykle odnosi siê do szczepu dzikiego. Ww. okreœlenia s¹ bli¿ej objaœnione w pracy Demerec i wsp. Genetics 54 61: 76, 1966. (a) Fenotypowe okreœlenie w³aœciwoœci organizmu stosuje siê gdy zmutowane loci nie zosta³y zidentyfikowane oraz zmapowane. Mo¿e byæ tak¿e u¿yte w przypadku, gdy identyfikuje siê produkt genu np. bia³ko OmpA. Zapis fenotypu zasadniczo sk³ada siê z trzech liter, nie mo¿na ich pisaæ kursyw¹, pierwsza litera powinna byæ zawsze du¿¹ liter¹. Preferuje siê u¿ycie liczb rzymskich lub arabskich dla oznaczania bliŸniaczych fenotypów np. Pol1, Pol2, Pol3 itd. Typ dziki mo¿na zapisaæ dodatkowym oznaczeniem plus (Pol+); w odró¿nieniu do tego oznaczenie minus okreœlaæ bêdzie fenotyp mutanta (Pol–). Czasami pewne charakterystyczne w³aœciwoœci organizmu mo¿na zapisaæ u¿ywaj¹c liter np. (StrS ). (b) Genotypowe oznaczenia s¹ podobne do fenotypowych – w obu przypadkach stosuje siê zestaw trzech liter; genotyp pisze siê zawsze ma³ymi literami oraz kursyw¹ (np. ara, his, rps.). Promotor, terminator oraz operator oznacza siê literami p, t oraz o (np. lacZp, lacZt, lacZo;. Bachman i Low; Microbiol. Rev. 44, 1–56, 1980). (c) Typ dziki alleli mo¿na zaznaczyæ wpisuj¹c dodatkowe oznaczenie plus nad oznaczeniem genu np. ara+, his+, nie oznacza siê natomiast zmutowaych alleli znakiem minus. (d) Miejsca mutacji oznacza siê poprzez wstawiania liczby kolejnych izolacji (liczby alleli) po symbolu zmutowanego locus (np. araA1, araA2 itp.). W przypadku, gdy tylko jedno takie locus istnieje, lub gdy nie wiadomo w którym kolejnym locus mutacja powsta³a – po oznaczeniu genu wstawia siê myœlnik w miejscu du¿ej litery oznaczaj¹cej locus, zaœ dalej podaje siê liczbê izolacji (np. ara-23). (e) Zapis genotypu mo¿e byæ wzbogacony innymi oznaczeniami jak plus, dla typu dzikiego czy minus dla mutanta – mo¿na wprowadziæ oznaczenia okreœlaj¹ce mutacje jak np. mutacja Amber (Am), mutant termowra¿liwy (Ts), mutant konstytutywny (Con), mutant wra¿liwy na niskie temperatury (Cs), bia³ko hybrydowe (Hyb) np. araA230(Am), his D21(Ts). Wprowadzanie innych wzbogaceñ powinno byæ poprzedzone w tekœcie odpowiednim wyjaœnieniem. (f) Dodatkowe oznaczenia mog¹ te¿ byæ u¿yte w przypadku koniecznoœci rozró¿nienia tego samego genu znajduj¹cego siê w ró¿nych organizmach lub szczepach tego samego gatunku np. hisE.coli lub hisK-12. Dodatkowe oznaczenia stosuje siê równie¿ dla rozró¿nienia pomiêdzy genetycznymi elementami o tej samej nazwie np. promotory operonu gln; glnA1 i glnA2. (g) Delecjê oznacza siê symbolem, D usytuowanym przed zdelecjonowanym genem lub regionem np. D trpA432, D (aroPaceE)419, lub D his(dhuA hisJ hisQ)1256. Fuzjê genów ara i lac mo¿na przedstawiæ w ten sam sposób – F (ara-lac)1256. Podobnie F (araB’ -lacZ+)(Hyb) oznacza, ¿e fuzja nast¹pi³a pomiêdzy genami araB a lacZ. Inwersja jest oznaczana nastêpuj¹co IN (rrnD-rrnE)1. Insercjê genu his E. coli do plazmidu pSC101 w pozycji 0 zasad (0kb) zapisuje siê nastêpuj¹co pSC101 W (Okb::K-12hisB)4. Oznaczenie obecnoœci episomu polega na podaniu jego symboli w nawiasie po nazwie szczepu rodzicielskiego np. W3110/F’ 8(gal+).

75

INFORMACJA DLA AUTORÓW

3.3. Skróty nazw chemicznych Nie wymagaj¹ dodatkowych wyjaœnieñ skróty nazw, takich jak: – nazwy miar i wag regulowanych przez Systeme International dc Unites (SI), ogólnie akcetowane jednostki takie jak bp, kb, Da, masa cz¹st., m. cz¹st. – skróty nazw chemicznych takich jak: DNA, cDNA, RNA, cRNA, RNaza, DNaza, rRNA, mRNA, tRNA; AMP, ADP, ATP, dATP,ddATP, GTP itp., – ATPaza, dGTPaza itp. NAD+, NADH, NADPH, NADP+, poly(A), poly(dT) itp., – nazwy powszechnie stosowanych technik biologii molekularnej np. PCR, SDS-PAGE, nazwy ogólnie znanych linii komórkowych np. HeLa, J774 – nazwy jednostek biologicznych; PFU ( jednostka formowania ³ysinek), CFU (jednostka formowania kolonii), MIC ( minimalne stê¿enia hamuj¹ce wzrost), itp. Nowe zasady kszta³towania nomenklatury endonukleaz restrykcyjnych oraz metylotransferaz zosta³y opublikowane w Nucleic Acids Research 2003, 31: 1805–1812. Przy pisaniu prac prosimy o korzystanie z zawartych tam informacji. 3.4. Pisownia danych numerycznych Standardowe jednostki metryczne s¹ stosowane dla okreœlania d³ugoœci, wagi i objêtoœci. W przypadku przedstawiania tych wartoœci oraz molarnoœci nale¿y stosowaæ przedrostki m, µ, n oraz p dla wartoœci 10–3, 10–6, 10–9 oraz 10–12. Temperaturê nale¿y przedstawiaæ tylko w stopniach Celsjusza np. 37°C. 3.5. Pisownia substancji znakowanych izotopami Jeœli wyznakowana jest pojedyncza cz¹steczka w zwi¹zku chemicznym nale¿y nazwê tego zwi¹zku zapisaæ w nastêpuj¹cy sposób 14CO2, 3H2O, H235SO4. Taki sam sposób zapisu stosuje

siê gdy radioaktywna cz¹steczka nie wystêpuje w naturalnej formie wyznakowanego zwi¹zku np. 32S-ATP lub gdy symbol izotopu zwi¹zany jest z niespecyficzn¹ nazw¹ zwi¹zku np. 14C aminokwasy, 3H-liganty itp. W przypadku niektórych specyficznych zwi¹zków chemicznych mo¿na stosowaæ nawiasy kwadratowe obejmuj¹ce symbole radioaktywnej cz¹steczki przed nazw¹ chemiczn¹ zwi¹zku np. [14C] mocznik, L-[metylo-14C] metionina, [g–32P] ATP. 4. Uwagi dodatkowe Redakcja zastrzega sobie mo¿liwoœæ dokonywania skrótów i poprawek nie wp³ywaj¹cych na treœæ pracy. W przypadku koniecznoœci wprowadzenia zmian w treœci odsy³a siê autorowi jeden egzemplarz pracy oraz dyskietkê w celu dokonania poprawek. Adresy instytucji, w których pracuj¹ autorzy (adres pocztowy oraz e-mail) nale¿y podawaæ w maszynopisie pracy po piœmiennictwie. Prace nie odpowiadaj¹ce wymaganiom Redakcji bêd¹ odsy³ane autorom bez rozpatrzenia merytorycznego. W razie nie przyjêcia pracy do druku Redakcja zwraca dyskietkê oraz jeden egzemplarz wydruku, drugi zatrzymuje u siebie. Za datê wp³ywu przyjmuje siê dzieñ otrzymania pracy w formie zgodnej z instrukcj¹ dla autorów. Autorzy otrzymuj¹ bezp³atnie 15 odbitek pracy. Za prace opublikowane w Postêpach Mikrobiologii nie przewiduje siê honorariów autorskich. Prace nale¿y nadsy³aæ na adres sekretarza naukowego redakcji: Dr Bohdan Jerzy Staroœciak Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej Akademia Medyczna ul. Oczki 3 02 - 007 Warszawa tel. (22) 628-08-22 lub 621-13-51

Oœwiadczenie dotycz¹ce praw Autorskich 1. .................................................................................................................... (nazwisko/a i imiê/ona autora/ów – proszê podkreœliæ autora korespondencyjnego)

................................................................................................................... Adres Autorów: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tytu³ pracy: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................................................................................................................... 2. Oœwiadczenie (proszê wype³niæ a lub b) (a) Oœwiadczam. i¿ w mojej/naszej pracy przeznaczone do opublikowania rysunki oraz tabele, s¹ oryginalne tzn. zosta³y wymyœlone i zaprojektowane przez autorów przedk³adanego Redakcji manuskryptu. W pracy nie ma cytatów z obcej publikacji. ..................................... (miejsce i data)

..................................... (podpis korespondencyjnego autora)

(b) Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Autorów na reprodukcjê rysunków nr: ......................................, zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Autorów na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê rysunków nr: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . , zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (* podaæ bibliografie prac oryginalnych, z których reprodukowane bêd¹ rysunki lub tabele) Do Oœwiadczenia za³¹czam oryginalne zezwolenia reprodukcji w liczbie: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , Rysunków: . . . . . . . . . . . . . . . . , tabel: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , cytowanego tekstu: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..................................... (miejsce i data)

..................................... (podpis korespondencyjnego autora)

76

INFORMACJA DLA AUTORÓW

JUBILEUSZ 80-LECIA PTM Sympozjum Naukowe Œwiat cz³owieka œwiatem drobnoustrojów 31 sierpnia – 1 wrzeœnia 2007 r., Kraków W dniach 31.08 – 01.09.2007 r. odbêdzie siê Sympozjum Naukowe pt. Œwiat cz³owieka œwiatem drobnoustrojów z okazji Jubileuszu 80-lecia Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów organizowane przez Zarz¹d G³ówny PTM i Oddzia³ Krakowski PTM. Celem Sympozjum Œwiat cz³owieka œwiatem drobnoustrojów bêdzie prezentacja dorobku polskiej mikrobiologii na tle mikrobiologii œwiatowej, a tak¿e podkreœlenie wa¿nej roli mikrobiologii w ¿yciu cz³owieka w aspekcie wspó³czesnych niebezpieczeñstw ze strony drobnoustrojów, wynikaj¹cych ze zmian populacyjnych, klimatycznych i gospodarczych. W ramach Sympozjum bêd¹ prezentowane nastêpuj¹ce zagadnienia: Ø Sesja historyczna Ø Patogeneza zaka¿eñ cz³owieka Ø Nowe i nawracaj¹ce choroby zakaŸne i zaka¿enia Ø Wykorzystanie metod biologii molekularnej w diagnostyce i epidemiologii zaka¿eñ Ø Nowe mo¿liwoœci w leczeniu i zapobieganiu zaka¿eniom Nie przewiduje siê doniesieñ naukowych uczestników, zarówno w formie ustnych prezentacji, jak i w formie plakatów. Miejsce obrad: Auditorium Maximum Uniwersytetu Jagielloñskiego w Krakowie Szczegó³owe informacje dotycz¹ce sympozjum mo¿na uzyskaæ na stronie internetowej www.microbiology.pl Biuro Organizacyjne Sympozjum: Polskie Towarzystwo Mikrobiologów tel. (22) 841-33-67; fax (22) 841-29-49; e-mail: [email protected] Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów

XXVI Zjazd Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów 4–7 wrzeœnia 2008 r., Szczecin W dniach 4–7.09.2008 r. odbêdzie siê XXVI Zjazd Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów organizowany przez Szczeciñski Oddzia³ Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów. Miejsce obrad: Rektorat Pomorskiej Akademii Medycznej, Zamek Ksi¹¿¹t Pomorskich Szczegó³owe informacje dotycz¹ce zjazdu uka¿¹ siê na stronie internetowej: www.microbiology.pl i w Postêpach Mikrobiologii – zeszyt 2, 2007 r. Komitet Organizacyjny XXVI Zjazdu Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów

77

INFORMACJA DLA AUTORÓW

Redakcja Postêpów Mikrobiologii gor¹co dziêkuje recenzentom nie bêd¹cym cz³onkami Komitetu Redakcyjnego, którzy na nasz¹ proœbê podjêli siê oceny prac nadsy³anych do naszego pisma w roku 2006: Dr hab. Katarzynie Brzostek Prof. dr hab. Adamowi Jaworskiemu, Prof. dr hab. Miros³awie W³odarczyk Prof. dr hab. Zofii Zwolskiej

Informacja dla Autorów prac drukowanych w Postêpach Mikrobiologii Uprzejmie informujemy PT Autorów PM, ¿e zgodnie z decyzj¹ Zarz¹du G³ównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów z dnia 6 lutego 2007 roku nast¹pi zmiana w zasadach przyjmowania prac do druku w naszym piœmie. Autorzy manuskryptów proszeni s¹ (od zeszytu numer 1/2008) o wnoszenie op³at (za ka¿dy artyku³ 250 PLN) na konto Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów: Bank BPH S.A. 53 1060 0076 0000 3200 0105 5596. Otrzymanie przez Redakcjê pracy wraz z kopi¹ potwierdzenia wp³aty jest warunkiem uruchomienia procedury wydawniczej. Do dowodu wp³aty nale¿y do³¹czyæ (na osobnej kartce) informacje zawieraj¹ce tytu³ pracy, nazwisko autora korespondencyjnego oraz dane do wystawienia faktury VAT (NIP, adres instytucji lub osoby fizycznej). W przypadku niedopuszczenia pracy do druku zwrot op³aty dokonany bêdzie przez ksiêgowoœæ PTM. Redakcja

78

INFORMACJA DLA AUTORÓW

P U B L I K A C J E M E T O D Y C Z N E I S TA N D A R D Y

INFORMACJA DOTYCZ¥CA PRAC DRUKOWANYCH W DZIALE PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY W dziale zatytu³owanym PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY publikowane bêd¹ artyku³y przegl¹dowe o charakterze metodycznym, reprezentuj¹ce dowoln¹ dziedzinê mikrobiologii. Redakcja Postêpów Mikrobiologii (PM), w porozumieniu z Zarz¹dem G³ównym PTM ustali³a, i¿ drukowanych bêdzie rocznie nie wiêcej ni¿ cztery artyku³y tej kategorii. Redaktorem odpowiedzialnym za wartoœæ merytoryczn¹, redakcjê tekstu oraz ostateczne przyjêcie pracy do druku jest prof. dr hab. Stefania Giedrys-Kalemba. adres: prof.dr hab. Stefania Giedrys-Kalemba – Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej. Al. Powstañców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax (091) 46 616 51, 52, fax (091) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected] Prace metodyczne przeznaczone do druku podlegaj¹ ocenie dokonywanej przez sta³ych Recenzentów lub Ekspertów powo³ywanych ka¿dorazowo przez Redaktora dzia³u. Lista sta³ych Recenzentów patrz pkt.5. Strona tytu³owa ka¿dego artyku³u zaopatrzona bêdzie w informacje, i¿ praca nale¿y do PUBLIKACJI METODYCZNYCH I STANDARDÓW oraz ka¿dorazowo podana bêdzie data otrzymania od Autorów manuskryptu jak i data zaakceptowania go do druku. Zalecenia dla autorów: 1. Przesy³anie publikacji : ● Manuskrypt (w dwu egzemplarzach w formie papierowej oraz jednym egzemplarzu na noœniku elektronicznym wraz z rysunkami, tabelami itp.) proszê przesy³aæ bezpoœrednio do Redaktora PUBLIKACJI METODYCZNYCH I STANDARDÓW. ● Podaj¹c adres/y Autorów publikacji nale¿y zaznaczyæ Autora korespondencyjnego – prócz adresu pocztowego, numeru telefonu i ew. faxu nale¿y obligatoryjnie podaæ adres e-mailowy Autora korespondencyjnego. 2. Sposób przygotowania manuskryptu – Pracê nale¿y opracowaæ zgodnie z ogólnymi zaleceniami zawartymi w INFORMACJI DLA AUTORÓW Postêpów Mikrobiologii (POST. MIKROB. 2006, 45, 1, 79–82) z uwzglêdnieniem nastêpuj¹cych zmian: ● Objêtoœæ pracy nie mo¿e przekraczaæ wraz z piœmiennictwem i ilustracjami 20 stron maszynopisu. ● Liczba cytowañ w rozdziale Piœmiennictwo nie powinna przekraczaæ 50 pozycji. ● W spisie cytowanego piœmiennictwa nale¿y umieszczaæ wy³¹cznie prace drukowane w czasopismach naukowych, niedopuszczalne jest zamieszczanie danych bibliograficznych prospektów reklamowych lub promocyjnych firm farmaceutycznych. 3. Prawa autorskie – do ka¿dej przygotowanej do druku publikacji za³¹czyæ Oœwiadczenie dotycz¹ce praw autorskich. Wzór oœwiadczenia mo¿na pobraæ ze strony internetowej Postêpów Mikrobiologii. 4. Zalecenia i uwagi dodatkowe: ● W celu unikniêcia kryptoreklamy, proszê o zwrócenie szczególnej uwagi na sposób przedstawienia czytelnikom produktów komercyjnych lub metod opracowanych przez producentów. Autorzy s¹ równie¿ zobowi¹zani do ujawnienia (je¿eli takie istniej¹) wszelkich powi¹zañ (honoraria, granty, p³atne ekspertyzy lub inne formy uzyskiwania korzyœci osobistych) miêdzy Autorami a firm¹, której produkt ma istotne znaczenie w nades³anej pracy. W tym celu ka¿dy z Autorów proszony jest o z³o¿enie Deklaracji dotycz¹cej

80

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY

● ●

„konfliktu interesów”. Konflikt interesów wystêpuje, kiedy Autor lub zak³ad pracy Autora ma finansowe lub osobiste zwi¹zki z innymi osobami lub instytucjami, które mog¹ wp³ywaæ na jego dzia³ania i decyzje. Wzór deklaracji mo¿na pobraæ ze strony internetowej Postêpów Mikrobiologii. Redakcja Postêpów Mikrobiologii zastrzega sobie prawo ostatecznej decyzji o akceptacji pracy przeznaczonej do druku w dziale PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY. Wszelkie proponowane zmiany w INFORMACJI DLA AUTORÓW P.M. zostan¹ przedstawione PT Czytelnikom Postêpów Mikrobiologii przed ich wprowadzeniem.

5. Stali recenzenci dzia³u PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY: Jerzy D³ugoñski ( Uniwersytet £ódzki) Waleria Hryniewicz (Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego) Józef Kur (Uniwersytet Gdañski) Eugeniusz Ma³afiej (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki) Anna Przondo-Mordarska (Akademia Medyczna we Wroc³awiu)

[W z ó r ] Oœwiadczenie dotycz¹ce „konfliktu interesów”1 1. Nazwisko i imiê autora: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. Tytu³ pracy: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ................................................................................................ 3. Oœwiadczenie (proszê wype³niæ a lub b, niepotrzebne skreœliæ) (a) Oœwiadczam, ¿e „konflikt interesów” nie wystêpuje (b) Oœwiadczam, ¿e wystêpuje „konflikt interesów”, który polega na: ............................................................................................. ............................................................................................. ............................................................................................. ............................................................................................. ............................. (miejsce i data)

............................. (podpis Autora)

................................................................................................ ................................................................................................ ................................................................................................

Konflikt interesów wystêpuje, kiedy autor lub zak³ad pracy autora ma finansowe lub osobiste zwi¹zki z innymi osobami lub instytucjami, które mog¹ wp³ywaæ na jego dzia³ania i decyzje 1

Spis treœci Prof. dr Uli Schwarz (10.06.1934 – 21.12.2006) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P o p ³ a w s k a, J. D z i a d e k – Bia³ka podzia³u komórkowego bakterii – dru¿yna pierœcienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. S u l i k o w s k a, J. P u ³ a w s k a, P. S o b i c z e w s k i – Zastosowanie i znaczenie analizy sekwencji genu gyrB w badaniach bakterii chorobotwórczych dla roœlin . . . A. M a s z e w s k a, A. B ³ a s z c z y k, A. T o r z e w s k a, A. R ó ¿ a l s k i – Bakterie rodzaju Providencia – taksonomia, epidemiologia, chorobotwórczoœæ . . . . . . . . . . . . A. M i c h a l s k a, E. G o s p o d a r e k – Pa³eczki Enterobacter spp. – taksonomia, charakterystyka, czynniki wirulencji i metody identyfikacji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. M i c h a l s k a, E. G o s p o d a r e k – Pa³eczki Enterobacter spp. – zaka¿enia, lekowra¿liwoœæ i mechanizmy opornoœci na antybiotyki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P a w l i k o w s k a, W. D e p t u ³ a – Chlamydie œrodowiskowe – nowe patogeny cz³owieka i zwierz¹t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

59

Informacje, komunikaty, recenzje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

69

5 21 29 39 49

Contents Prof. dr Uli Schwarz (10.06.1934 – 21.12.2006) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P o p ³ a w s k a, J. D z i a d e k – Bacterial cell division proteins. The fellowship of the ring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. S u l i k o w s k a, J. P u ³ a w s k a, P. S o b i c z e w s k i – The use and importance of sequence analysis of gyrB gene in study of plant pathogenic bacteria . . . . . . . . . . A. M a s z e w s k a, A. B ³ a s z c z y k, A. T o r z e w s k a, A. R ó ¿ a l s k i – Bacteria from the genus Providencia – taxonomy, epidemiology, pathogenicity . . . . . . . . . . . A. M i c h a l s k a, E. G o s p o d a r e k – Enterobacter spp. bacteria – the taxonomy, characteristics, virulence factors and the methods for identification . . . . . . . . . . . . . . A. M i c h a l s k a, E. G o s p o d a r e k – Enterobacter spp. Bacteria – the infections, susceptibility and resistance to antibiotics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. P a w l i k o w s k a, W. D e p t u ³ a – Environmental chlamydiae – new pathogens of humans and animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

29

Information, new reports, books reviews . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

69

5 21

39 49 59

INSTRUKCJA DLA AUTORÓW PRAC PUBLIKOWANYCH W SUPLEMENTACH DO KWARTALNIKA POSTÊPY MIKROBIOLOGII W celu u³atwienia publikowania w jednym miejscu artyku³ów o podobnej problematyce, Postêpy Mikrobiologii wydawaæ bêd¹ w formie suplementów, nastêpuj¹ce prace naukowe: 1. Referaty z sesji plenarnych Zjazdów naukowych, Konferencji naukowych oraz Sympozjów organizowanych staraniem Zarz¹du G³ównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów oraz Komitetu Mikrobiologii Polskiej Akademii Nauk. Manuskrypt pojedynczego referatu nie powinien przekraczaæ 25-ciu stron i powinien byæ przygotowany wg Informacji dla Autorów Postêpów Mikrobiologii. Ca³oœæ materia³ów przygotowanych do jednego suplementu nie mo¿e przekraczaæ 150 stron maszynopisu. 2. Streszczenia przyjêtych przez organizatorów referatów oraz doniesieñ prezentowanych na ww. Zjazdach naukowych, Konferencjach oraz Sympozjach. Streszczenie nie powinno przekraczaæ jednej strony maszynopisu i koñczyæ siê nie wiêcej jak trzema pozycjami cytowanego piœmiennictwa. W suplemencie nie bêd¹ publikowane oryginalne prace doœwiadczalne prezentowane na ww. Zjazdach naukowych. Prace te po odpowiednim przygotowaniu, zgodnie z instrukcj¹ dla autorów, mo¿na przesy³aæ do Redakcji Polish Journal of Microbiology (Acta Microbiologica Polonica) lub innego czsopisma naukowego. Autorzy lub zamawiaj¹cy suplement ponosz¹ pe³ny koszt jego opracowania oraz wydania. Mo¿liwy jest druk czterech suplementów rocznie. Poniewa¿ materia³y przeznaczone do suplementu nie s¹ opracowywane oraz nie podlegaj¹ ocenie Zespo³u Redakcyjnego Postêpów Mikrobiologii, zamawiaj¹cy suplement, tj. osoba upowa¿niona przez Zarz¹d G³ówny Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów lub Komitet Mikrobiologii PAN, bierze ca³kowit¹ odpowiedzialnoœæ za redakcjê oraz wartoœæ merytoryczn¹ suplementu. Wydanie suplementu powinno byæ poprzedzone jego akceptacj¹ przez Zespó³ Redakcyjny Postêpów Mikrobiologii.

Redakcja nie ponosi odpowiedzialnoœci za treœæ reklam i og³oszeñ

Oferta Reklamy Postêpy Mikrobiologii udostêpni¹ w ka¿dym numerze kilka stron (³¹cznie z wewnêtrznymi stronami ok³adek) reklamie. Pismo nasze dociera co kwarta³ do kilku tysiêcy odbiorców. S¹ wœród nich specjaliœci ró¿nych dziedzin mikrobiologii, pracuj¹cy jako nauczyciele wy¿szych uczelni, szkó³ œrednich oraz pracownicy naukowi instytutów badawczych, biotechnolodzy oraz lekarze. Du¿¹ grupê naszego pisma stanowi¹ studenci. Cena og³oszenia czarno-bia³ego wewn¹trz numeru wynosi: 1/2 strony 250,– z³ ca³a strona 500,– z³ Proponujemy równie¿ og³oszenia kolorowe – cena do uzgodnienia. Teksty opracowanych graficznie reklam proszê sk³adaæ na adres Redakcji Postêpów Mikrobiologii, 02-007 Warszawa, ul. Oczki 3, tel. 628 08 22.