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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 250 151

51 Int. Cl. : A61K 39/39

7

A61K 39/21 A61P 33/06 // (A61K 39/39 A61K 39:21)

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00943919 .1

86 Fecha de presentación : 28.06.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1198249

87 Fecha de publicación de la solicitud: 24.04.2002

54 Título: Uso de CpG como adyuvante de vacuna contra VIH.

30 Prioridad: 29.06.1999 GB 9915205

31.01.2000 GB 0002200

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.04.2006

73 Titular/es: GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

rue de l’Institut 89 1330 Rixensart, BE

72 Inventor/es: Garcon, Nathalie y

Voss, Gerald

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carpintero López, Francisco

ES 2 250 151 T3

16.04.2006

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 250 151 T3 DESCRIPCIÓN Uso de CpG como adyuvante de vacuna contra VIH. 5

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacuna y su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones por VIH. En particular, la invención se refiere al uso de antígeno de VIH junto con un oligonucleótido CpG.

10

VIH es la principal causa del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) y se considera como uno de los asuntos de salud más urgente en el mundo. Aunque ha habido grandes esfuerzos para producir una vacuna exitosa, los esfuerzos hasta la fecha han fallado en producir una. Por consiguiente, permanece una necesidad de una composición inmunogénica de VIH mejorada.

15

La Solicitud de Patente Internacional Nº 92/06113 se refiere a una formulación de vacuna que comprende la proteína de envuelta gp160 y su derivado de origen natural gp120 con adyuvante monofosforil lípido A 3 desacilado y un vehículo adecuado tal como hidróxido de aluminio.

20

25

30

La Solicitud de Patente Internacional Nº 99/16884 describe formulaciones de vacuna basadas en proteínas de VIH no de envuelta, Nef y Tat, particularmente fusiones de la proteína Nef con Tat, y fusiones de la proteína Nef con Tat o un compañero de fusión inmunológico. Los oligonucleótidos e inmunomoduladores contienen dinucleótidos CpG no metilados (“CpG”) y son conocidos (documentos WO 96/02555, EP 468520). CpG es una abreviatura para restos de dinucleótido de citosina-guanosina presentes en el ADN. Históricamente, se observó que la fracción de ADN de BCG podía ejercer un efecto antitumoral. En estudios adicionales, los oligonucleótidos sintéticos derivados de secuencias génicas de BCG demostraron ser capaces de inducir efectos inmunoestimuladores (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, incluyendo un resto CG central, llevaban esta actividad. El papel central del resto CG en la inmunoestimulación se dilucidó posteriormente en una publicación de Krieg, Nature 374, p546 1995. El análisis detallado ha demostrado que el resto CG tiene que estar en un cierto contexto de secuencia, y que dichas secuencias son comunes en el ADN bacteriano pero raras en ADN de vertebrados. Actualmente se cree que esta diferencia evolutiva permite al sistema inmune de vertebrados detectar la presencia de ADN bacteriano (como sucede durante una infección) que conduce, por consiguiente, a la estimulación del sistema inmune. La secuencia inmunoestimuladora como se define por Krieg es:

35

Purina Purina CG pirimidina pirimidina y donde el resto CG no está metilado.

40

45

50

55

En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos está presente una secuencia palindrómica. Varios de estos restos, como repeticiones de un resto o una combinación de diferentes restos, pueden estar presentes en el mismo oligonucleótido. La presencia de una o más de estas secuencias inmunoestimuladoras que contienen oligonucleótidos pueden activar diversos subconjuntos inmunes, incluyendo células natural killer (que producen interferón γ y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige y col Vol 89 (Nº 8), 1977). Aunque existen otras secuencias que contienen CPG no metilado que no tienen esta secuencia consenso ahora se ha demostrado que son inmunomoduladoras. La presente invención proporciona una formulación de vacuna mejorada que comprende un oligonucleótido CpG y un antígeno de VIH seleccionado entre el grupo gp160 de VIH, gp120 de VIH; una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a (i) un compañero de fusión o (ii) una proteína Tat de VIH o derivado de la misma; o una proteína Tat de VIH o derivado de la misma unida a (i) una proteína de fusión o (ii) una proteína Nef de VIH o derivado de la misma; o una proteína Nef de VIH o derivado de la misma unida a una proteína Tat de VIH o derivado de la misma o un compañero de fusión. Por “compañero de fusión” se entiende cualquier secuencia proteica que no sea Tat o Nef. Preferiblemente, el compañero de fusión es la proteína D o su derivado lipidado lipoproteína D, de Haemophilius influenzae B. En particular, se prefiere que se utilice el tercio N-terminal, es decir, aproximadamente los primeros 100-130 aminoácidos. Esto se representa en este documento como Lipo D 1/3. En una realización preferida de la invención, la proteína Nef o derivado de la misma puede unirse a la proteína Tat o derivado de la misma. Dichas fusiones Nef-Tat pueden unirse también opcionalmente a un compañero de fusión, tal como proteína D. Si está presente, el compañero de fusión normalmente está unido al extremo N-terminal de la proteína Nef o Tat.

60

65

Los derivados incluidos en la presente invención incluyen moléculas con un extremo de Histidina C-terminal, que preferiblemente comprende entre 5-10 restos de Histidina. Generalmente, el extremo de histidina que contiene n restos se representa en este documento como His (n). La presencia de un extremo de histidina (o “His”) ayuda a la purificación. Más específicamente, la invención proporciona vacunas que comprenden proteínas con la siguiente estructura:

2

ES 2 250 151 T3

5

10

Lipo D 1/3 Lipo D 1/3 Prot D 1/3 Prot D 1/3

-

Nef Nef-Tat Nef Nef-Tat Nef-Tat

-

His(6 ) His(6 ) His(6 ) His(6 ) His(6 )

En una realización preferida, las proteínas se expresan con un extremo de Histidina que comprende entre 5 a 10 y preferiblemente seis restos de histidina. Esto es ventajoso para ayudar a la purificación. La expresión por separado, en levaduras (Saccharomyces cerevisiae) de Nef (Macreadie IG y col 1993, Yeast 9 (6) 565-573) y Tat (Braddock M y col, 1989, Cell 58 (2) 269-79) ya se ha presentado. La proteína Nef sólo está miristoilada. La presente invención también proporciona vacunas que comprenden Nef y/o Tat por separado. El ADN y secuencias de aminoácidos de Nef-His, Tat-His, y de proteínas de fusión Nef-Tat-His representativas se expone en el documento WO99/16884.

15

Particularmente, las vacunas preferidas de acuerdo con la invención comprenden una proteína de fusión de VIH tal como Nef-Tat y opcionalmente una proteína de VIH adicional. Particularmente, se prefiere en una formulación de vacuna de acuerdo con la invención, una combinación de una proteína de fusión de VIH más gp120, más particularmente Nef-Tat con gp120.

20

Los derivados incluidos en la presente invención también incluyen proteínas mutadas. El término “mutado” se usa en este documento para indicar una molécula que ha experimentado deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos usando técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida de sitio o cualquier otro procedimiento convencional.

25

La preparación de vacuna se describe en líneas generales en Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach (Ed. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology Vol. 6 Plenum Press 1995. La encapsulación con liposomas se describe por Fullerton, Patente de Estados Unidos 4.235.877.

30

35

Los oligonucleótidos preferidos contienen preferiblemente dos o más restos CpG separados por seis o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención típicamente son desoxinucleótidos. En una realización preferida, el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditionato, o más preferiblemente un enlace fosforoditioato, aunque pertenecen al alcance de la invención enlaces fosfodiéster y otros enlaces internucleótido incluyendo oligonucleótidos con enlaces internucleótido mixtos. Los oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias

Oligo (denominación interna*) 40

45

50

5’-SECUENCIA-3’

CpG

Tio

WD1001

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

+

+

WD1002

TCT CCC AGC GTG CGC CAT

+

+

WD1003

ACC GAT AAC GTT GCC GGT GAC G

+

-

WD1004

G*G*G GTC AAC GTT GAG* G*G*G* G*G

+

Mezcla

WD1006

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT

+

-

WD1007

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

+

+

TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT

+

+

* mencionado alternativamente como WD001-WD007 55

60

65

En la tabla anterior un + en la columna Tio indica la presencia de una modificación tioato. “Mezcla” indica una mezcla de modificación tioato y secuencia sin modificación tioato (los asteriscos indican las uniones con una modificación tioato). Un - en la columna Tio indica ausencia de una modificación tioato. Un + en la columna CpG indica la presencia de un resto CpG y un - en la columna CpG indica ausencia de un resto CpG. Por ejemplo WD1005 contiene un resto GpC en lugar de un resto CpG, que está marcado de este modo con un - en la columna CpG de la tabla. WD1007 contiene un resto palindrómico (GACGTC) así como otras secuencias CpG no palindrómicas. Esto también pertenece al alcance de un oligonucleótido CpG como término usado en la presente solicitud. Los oligonucleótidos CpG utilizados en la presente invención pueden sintetizarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, (por ejemplo, documento EP 0 468 520). Adecuadamente, dichos oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automático. Los procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en los documentos US 5.666.153, US 5.278.302 y WO 95/26204. 3

ES 2 250 151 T3

5

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora con efectos secundarios adversos significativos en vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 11000 µg de proteína, preferiblemente 2-500 µg, más preferiblemente 5-250 µg. Una cantidad óptima para una vacuna particular pueden determinarse por estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o más inmunizaciones de estimulación adecuadamente espaciadas.

10

También es posible pre-administrar el oligonucleótido CpG poco antes de la vacunación con el antígeno de VIH, por ejemplo 1 día antes.

15

Por consiguiente, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para tratar un ser humano en necesidad del mismo con una composición de vacuna que comprende un antígeno de VIH y un oligonucleótido CpG (como se ha definido anteriormente) o con el oligonucleótido CpG seguido de un tiempo adecuado por el antígeno de VIH. También se proporciona un kit que comprende cantidades eficaces de una formulación que contiene oligonucleótido CpG para su uso como una formulación iniciadora para la pre-administración a pacientes humanos y un antígeno de VIH para la inyección en algún momento adecuado después, como se ha descrito anteriormente.

20

Los oligonucleótidos CpG preferidos son los indicados en la tabla anterior. Adecuadamente, el CpG estará presente estará presente en el intervalo de 10 µg por dosis a 2000 µg, preferiblemente 50-1000 µg, tal como aproximadamente 50 o aproximadamente 500 o aproximadamente 1000 µg por dosis. 25

Adecuadamente, la vacuna usada en la presente invención puede comprender un vehículo tal como una sal de aluminio, por ejemplo, hidróxido de aluminio (Al(OH)3 ), fosfato de aluminio o fosfato sulfato de aluminio (alumbre), o un aceite no tóxico en emulsión con agua o una mezcla de los mismos. 30

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40

45

Si se usa una sal de aluminio (preferiblemente hidróxido de aluminio) como vehículo generalmente está presente en el intervalo de 50 a 100 µg, preferiblemente 100 a 500 µg por dosis. El aceite no tóxico en emulsiones con agua preferiblemente contiene un aceite no tóxico, por ejemplo, escualeno y un emulsionante tal como (monooleato de polisorbitano) Tween 80, en un vehículo acuoso tal como solución salina tamponada con fosfato. Si se desea, la vacuna usada en la presente invención puede comprender un adyuvante adicional, preferiblemente un adyuvante de saponina tal como QS21, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 9517210, opcionalmente en presencia de un esterol, tal como colesterol, como se describe, por ejemplo, en el documento PCT/EP96/01464. La vacuna de la invención también puede comprender monofosforil lípido A y derivados del mismo conocidos en la técnica. Un derivado preferido es un monofosforil lípido A 3 des-O-acilado, descrito en la Patente Británica Nº GB 2 220 221. Por consiguiente, las formulaciones de vacuna de la presente invención pueden comprender adicionalmente otros excipientes farmacéuticos o inmunoestimuladores. En una realización preferida, la formulación de vacuna comprende adicionalmente una sal de aluminio, preferiblemente hidróxido de aluminio. En una realización adicional, también puede incluirse un adyuvante de saponina tal como QS21 (Aquila). La presente invención ahora se describirá con referencia a los siguientes ejemplos:

50

Ejemplos Ejemplo 1 55

Estudios de inmunogenicidad usando GP120 de VIH-1 formulada con CpG o CpG/alumbre Evaluación de CpG y CpG/alumbre en monos rhesus Resumen del experimento

60

Se realizó un estudio de inmunogenicidad para evaluar el efecto adyuvante de CpG en primates no humanos. Se inmunizaron grupos de cinco monos dos veces con gp120 de VIH-1W6.1D en combinación con CpG o CpG/alumbre. Después de la segunda inmunización, se evaluó la respuesta inmune de los animales. Se evaluaron los anticuerpos frente a gp120 y respuestas linfoproliferativos así como de citoquinas. 65

4

ES 2 250 151 T3 Grupos de monos

5

Grupo

antígeno

Adyuvante

1

gp120 de VIH-1W6.1

CpG/alumbre

2

gp120 de VIH-1W6.1

CpG

10

Formulación Lotes de componente usados

15

Componente 20

Marca

Gp120* Al(OH)3

Superfos

CpG 25

Número de Lote

Concentración (mg/ml)

Tampón

47/025

0,456

PBS

96A0089

10,380

H2 O

WD001

5

H2 O

* gp120 del clon W6.1D de VIH-1 (Groenink y col., 1991)

Procedimiento de formulación 30

Las formulaciones se prepararon un día antes de cada inyección. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación. Grupo 1 de CpG/alumbre (500 µl/dosis) 35

Se adsorbió gp120 (50 µg) sobre 500 µg de Al(OH)3 durante 1 hora. La formulación se tamponó con una solución a pH 6,8 de PO4 /NaCl concentrada 10 veces antes de la adición de 500 µg de WD001. Después de 15 minutos, se añadieron 50 µg/ml de tiomersal como conservante. 40

Grupo 2 de CpG (500 µl/dosis) Se diluyó gp120 (50 µg) en tampón PO4 /NaCl a pH 6,8 antes de la adición de 500 µg de CpG WD001. Después de 15 minutos, se añadieron 50 µg/ml de tiomersal como conservante.

45

Procedimientos inmunológicos Se inmunizaron cinco monos rhesus (Macaca mulatta) por grupo dos veces por vía intramuscular con 500 µl de vacuna a un intervalo de cuatro semanas. Los sueros y células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) se tomaron en varias ocasiones.

50

55

60

Los anticuerpos específicos de gp120 en sueros de monos inmunizados se determinaron en un ELISA como se describe en Mooij y col., 1998. Brevemente, se revistieron placas de ELISA con 1 µg/ml de gp120, se saturaron con BSA y se sometieron a incubación con sueros de mono rhesus seguido por anticuerpo biotinilado humano α. Finalmente, se añadió HRP-estreptavidina y se cuantificó en una reacción de color usando OPD como substrato. Se evaluó la linfoproliferación usando PBMC purificadas en gradiente de densidad de monos rhesus inmunizados. Las células se sembraron por cuadruplicado a 1 x 105 en 100 µl de RPMI/FCS al 5% por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Después, se añadieron otros 100 µl de medio solo o que contenía gp120 soluble (10 µg/ml) y se incubaron cultivos paralelos durante 48 horas. Después, se remplazaron los 100 µl de sobrenadante de cultivo por medio fresco que contenía 1 µCi de [3 H]-timidina. Después de 16 horas, se recogieron las células sobre placas de filtro y la radioactividad incorporada se determinó en un contador β. Los resultados se expresan en cpm y en índices de estimulación (SI = cpm de cultivos que contienen antígeno/cpm de cultivos de medio solo), SI mayor de 3 se considera como respuesta positiva.

65

Se prepararon placas de 96 pocillos de fondo plano revistiendo con un anticuerpo de captura específico de IFN-γ en 50 µl de PBS durante 4 horas a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces y se sembraron PBMC de manera similar a 5

ES 2 250 151 T3

5

los ensayos de linfoproliferación. Después de 48 horas de cultivo, las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween 20 al 0,05% y se añadieron 50 µl de anticuerpo específico de IFN-γ secundario biotinilado diluido en PBS/Tween/FCS al 1% durante 2 horas. Las placas se lavaron otra vez y se incubó un anticuerpo con biotina α conjugado con oro durante 1 hora. Después de los lavados adicionales, se visualizaron los ELIspot usando un kit de potenciación de plata (50 µl/pocillo). La reacción se detuvo después de aproximadamente 30 minutos añadiendo agua desionizada. Las células secretoras de citoquinas se contaron por examen microscópico. Resultados

10

Los análisis de anticuerpos específicos de gp120 en sueros de los monos reveló que todos los animales en los dos grupos habían adquirido respuestas inmunes específicas (Tabla 1 y Figura 1). Fueron detectables algunas respuestas bajas en dos animales ya después de una inmunización. Después de la segunda inmunización, todos los animales mostraron títulos altos de anticuerpos específicos de gp120.

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TABLA 1

d-12 20

Grupo 1

N5V 1055 R441 BXJ CPJ