Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik II der Universität Würzburg Direktor: Professor Dr. med. Hermann Einsele
Einfluss von Mycophenolat und Everolimus auf die Immunantwort humaner dendritischer Zellen gegen Aspergillus fumigatus
Inaugural – Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von Christian Blockhaus aus Mönchengladbach
Würzburg, Juni 2010
Referent: Professor Dr. med. Hermann Einsele Korreferent: Professor Dr. med. Matthias Eyrich
Dekan: Professor Dr. med. Matthias Frosch Tag der mündlichen Prüfung: 18.11.2010
Der Promovend ist Arzt.
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ............................................................................................. 1
1.1
Das Immunsystem ................................................................................................... 1 1.1.1 Allgemeines ................................................................................................. 1 1.1.2 Die angeborene Abwehr .............................................................................. 2 1.1.3 Toll-Like-Rezeptoren ................................................................................... 2 1.1.4 Signaltransduktion der TLR ......................................................................... 3 1.1.5 Monozyten ................................................................................................... 4 1.1.6 Dendritische Zellen ...................................................................................... 5
1.2
Zytokine ................................................................................................................... 7 1.2.1 Allgemeines ................................................................................................. 7 1.2.2 Signaltransduktion ....................................................................................... 7 1.2.3 TNF-α ........................................................................................................... 8 1.2.4 Interleukin-12 ............................................................................................... 9
1.3
Chemokine ............................................................................................................... 9 1.3.1 Allgemeines ................................................................................................. 9 1.3.2 CCL20/CXCL10 ........................................................................................... 10
1.4
Pilze ......................................................................................................................... 10 1.4.1 Allgemeines ................................................................................................. 10 1.4.2 Die Gattung Aspergillus ............................................................................... 10 1.4.3 Aspergillus fumigatus................................................................................... 11 1.4.4 Invasive Aspergillose ................................................................................... 12 1.4.5 Antimykotika ............................................................................................... 14
1.5
Verwendete Medikamente ....................................................................................... 14 1.5.1 Mycophenolat .............................................................................................. 14 1.5.2 Everolimus (RAD) ....................................................................................... 15
1.6
Zielsetzung ............................................................................................................... 16
2
Material ................................................................................................ 17
2.1
Geräte ....................................................................................................................... 17
2.2
Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 18 2.2.1 Labormaterialien .......................................................................................... 18 2.2.2 Kits ............................................................................................................... 18 2.2.3 Medien ......................................................................................................... 18 2.2.4 Reagenzien ................................................................................................... 19 2.2.5 Zytokine und Immunsuppressiva ................................................................. 19 2.2.6 Primer........................................................................................................... 20 2.2.7 Sonden.......................................................................................................... 20 2.2.8 Antikörper .................................................................................................... 21
3
Methoden ............................................................................................. 22
3.1
Gewinnung dendritischer Zellen .............................................................................. 22 3.1.1 Isolierung von Monozyten ........................................................................... 22 3.1.2 Reifung der dendritischen Zellen ................................................................. 24 3.1.3 Nachweis der dendritischen Zellen .............................................................. 25 3.1.4 Infektion der DCs mit A. fumigatus-Keimschläuchen ................................. 25
3.2
Untersuchung der Zytokinexpression dendritischer Zellen ..................................... 26 3.2.1 Isolierung der Total-RNA ............................................................................ 26 3.2.2 Untersuchung der RNA-Konzentration ....................................................... 26 3.2.3 Umschreibung von RNA in cDNA .............................................................. 26 3.2.4 Quantitative Real-Time PCR ....................................................................... 27
3.3
Durchflusszytometrische Untersuchungen an dendritischen Zellen ........................ 30
3.3.1 Durchflusszytometrie ................................................................................... 30 3.3.2 Vorbereitung der Zellen für die FACS-Untersuchung................................. 31 3.3.3 Untersuchte Antikörper ................................................................................ 31 3.3.4 FITC-Dextran-Assay.................................................................................... 32 3.4
Statistik .................................................................................................................... 32
4
Ergebnisse ............................................................................................ 34
4.1
Zytokinexpression dendritischer Zellen unter Wirkung von Mycophenolat ........... 34 4.1.1 Generierung und Nachweis von DCs aus Monozyten ................................. 34 4.1.2 Sechsstündiger Einfluss durch Mycophenolat ............................................. 35 4.1.3 Zweitägiger Einfluss durch Mycophenolat .................................................. 35 4.1.4 Viertägiger Einfluss durch Mycophenolat ................................................... 36 4.1.5 Gabe von Mycophenolat über die gesamte Differenzierungsdauer ............. 36
4.2
Einfluss von Mycophenolat auf die Entwicklung von DCs..................................... 39 4.2.1 FACS-Analyse unreifer DCs ....................................................................... 39 4.2.2 FACS-Analyse gereifter DCs ...................................................................... 41 4.2.3 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen ................................................. 42
4.3
Lichtmikroskopische Aufnahmen ............................................................................ 43
4.4
Einfluss von RAD auf die Zytokinexpression dendritischer Zellen ........................ 43 4.4.1 Sechsstündiger Einfluss durch RAD ............................................................ 44 4.4.2 Zweitägiger Einfluss durch RAD................................................................. 45 4.4.3 Viertägiger Einfluss durch RAD.................................................................. 45 4.4.4 Gabe von RAD über die gesamte Differenzierungsdauer............................ 46
4.5
Einfluss von RAD auf die Entwicklung dendritischer Zellen ................................. 47 4.5.1 FACS-Analyse unreifer DCs ....................................................................... 47 4.5.2 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen unter RAD .............................. 48
5
Diskussion ............................................................................................ 50
5.1
Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten und Infektion mit A. fumigatus-Keimschläuchen ................................................................................. 52
5.2
Untersuchung des Einflusses von Mycophenolat auf DCs ...................................... 53
5.3
Untersuchung des Einflusses von RAD auf DCs .................................................... 56
5.4
Ausblick ................................................................................................................... 58
6
Zusammenfassung / Summary........................................................... 60
7
Literaturverzeichnis............................................................................ 62
8
Abkürzungen ....................................................................................... 69
1
Einleitung
1.1 Das Immunsystem
1.1.1 Allgemeines Der Mensch ist durch äußere und innere Schutzbarrieren vor pathogenen Organismen, denen er jeden Tag ausgesetzt ist, geschützt. Trotzdem wird dieser Schutz häufig überwunden, was zu einer Gefährdung der Gesundheit führt. Die Auseinandersetzung mit Eindringlingen obliegt dem Immunsystem. Dieses schützt den Menschen, indem es Viren, Bakterien und andere Erreger erkennt und beseitigt. Es kann zwischen körperfremden und körpereigenen Zellen und Substanzen unterscheiden. Doch auch Fehlentwicklungen körpereigener Zellen, die sich abnorm entwickeln, werden erkannt. Dies kann die Entstehung eines Tumors oder einer Autoimmunerkrankung verhindern. Man unterteilt das Immunsystem in eine unspezifische, angeborene Abwehr und in eine spezifische, erworbene Abwehr. Beide kann man noch einmal in eine zellvermittelte und eine humorale Abwehr einteilen. Der Begriff „humoral“ bezeichnet die nichtzellulären Anteile des Immunsystems. Die spezifische Abwehr zeichnet sich dadurch aus, dass sie sich im Laufe des Lebens immer weiterentwickelt. Nach Auseinandersetzung mit einem Erreger bilden sich, im Gegensatz zur unspezifischen Abwehr, Gedächtniszellen. Durch diese kann ein Erreger, mit dem sich der Körper schon früher auseinandergesetzt hat, schnell und effektiv bekämpft werden. Das erworbene humorale Immunsystem besteht aus den BLymphozyten, die sich zu Plasmazellen entwickeln können, welche dann Antikörper produzieren und freisetzen. Die T-Lymphozyten repräsentieren das zellvermittelte erworbene Immunsystem und unterteilen sich in die CD4-positiven T-Helferzellen (Th1 und Th2) sowie die CD8positiven zytotoxischen T-Zellen. Die Abkürzung CD steht für cluster of differentiation und bezeichnet bestimmte Oberflächenmoleküle von Zellen, die man zu ihrer Unterteilung nutzt.
1
1.1.2 Die angeborene Abwehr Die angeborene Abwehr ist der entwicklungsgeschichtlich ältere Teil unseres Immunsystems. Die Reaktion auf einen Erreger erfolgt schnell und liegt zeitlich vor der Reaktion des erworbenen Immunsystems [1]. Dafür ist sie aber unspezifisch. Eine Gedächtnisbildung, wie sie beim erworbenen Immunsystem vorkommt, findet hier nicht statt. Die angeborene Abwehr schützt den Menschen von Geburt an. Zu ihren Bestandteilen gehören Granulozyten, Makrophagen, natürliche Killerzellen und viele andere Zellen. Über den MHC-I-Komplex, den alle kernhaltigen Zellen auf ihrer Oberfläche tragen, können körpereigene Zellen erkannt und bei Entartung oder Infektion eliminiert werden. Körperfremde Strukturen werden über sogenannte pathogen associated molecular patterns (PAMP) erkannt [2]. Hierbei handelt es sich um im Laufe der Evolution hochkonservierte Muster von körperfremden Substanzen oder Mikroorganismen. Die PAMPs sind spezifisch für bestimmte Erregergruppen, nicht für einzelne Erreger. Die Rezeptoren auf den Abwehrzellen, welche die PAMPs erkennen, nennt man pattern recognition receptors (PRR). PRRs werden je nach Funktion in verschiedene Gruppen eingeteilt.
1.1.3 Toll-Like-Rezeptoren Toll-Like-Rezeptoren (TLR) gehören zu einer der Untergruppen von PRRs, den signaltransferierenden PRRs. Sie wurden in den 1980er Jahren zuerst bei der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und später beim Menschen entdeckt [3]. TLRs binden, teilweise mit Hilfe von anderen Rezeptoren, zum Beispiel CD14, das fremde Pattern [4]. Diese Bindung führt über die Aktivierung des NF-κB-Pathways zur Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen und somit zu einer Immunantwort (s. 1.1.4) [2]. Heutzutage sind dreizehn TLRs bekannt. Zehn davon konnten beim Menschen nachgewiesen werden. TLR 11-13 wurden bei Mäusen nachgewiesen [5]. Jeder TLR kann ein oder mehrere bestimmte Pattern erkennen. Diese Spezifität konnte nachgewiesen werden [6, 7].
2
Rezeptor TLR 1
Ligand
Herkunft des Liganden
Triacyl-Lipopeptide
Bakterien
lösliche Faktoren
Neisseria meningitidis
Lipoprotein
verschiedene Pathogene
Peptidoglycane
gram-positive Bakterien
Lipoteichonsäure
gram-positive Bakterien
Zymosan
Pilze
TLR 3
Doppelstrang-DNA
Viren
TLR 4
LPS
gram-negative Bakterien
Fusionsproteine
RSV
TLR 5
Flagellin
Bakterien
TLR 6
Lipoteichonsäure
gram-positive Bakterien
Zymosan
Pilze
TLR 7
Einzelstrang-DNA
Viren
TLR 8
Einzelstrang-DNA
Viren
TLR 9
CpG-haltige DNA
Bakterien und Viren
TLR 10
Noch unbekannt
Noch unbekannt
TLR 2
Tab. 1.1: Toll-Like-Rezeptoren und Liganden, Tab. nach Akira (modifiziert) [8]. Aspergillus fumigatus aktiviert über TLR 2 und 4 die Immunzellen [9, 10].
1.1.4 Signaltransduktion der TLR Die Signaltransduktion, also der Transport eines Signals von außerhalb der Zelle in den Zellkern, wird am Beispiel des bakteriellen LPS, eines sehr potenten Bakterientoxins, erläutert [4, 8, 11]: Die Zelle bindet das LPS-Molekül mit Hilfe des Oberflächenmarkers CD14 an seinen TLR 4 (andere Antigene können auch direkt an den TLR binden). Daraufhin bindet die intrazelluläre TIR-Domäne (Toll/Interleukin-1Rezeptor) des TLR 4 an das Protein MyD88 (myeloid differentiation factor 88). Dieses aktiviert über IRAK4 IRAK1. IRAK steht für IL-1-Rezeptor-assoziierte Proteinkinase.
3
An das aktivierte IRAK1 lagert sich TRAF6 an.
TLR
Dieser Komplex, bestehend aus IRAK1 und TRAF6, löst sich von IRAK4 ab, um mit einem weiteren Komplex, bestehend aus TAB und TAK1,
IRAK4
IRAK1
MyD88
UEV1A
UBC13
zu
interagieren.
Dies
führt
zur
Aktivierung zweier κ-Kinasen und zur Bildung eines Kinasendimers. Letzteres phosphorylliert
TRAF6
TAB2 TAK1
das Protein IκB. Nach seiner Phosphoryllierung
TAB1
löst sich das inhibierende IκB von NFκB. Durch diese
Freisetzung
wird
die
Inhibition
IKK-γ IKK-α IKK-β
MAP-Kinasen
aufgehoben,
was
dem
Transkriptionsfaktor
NFκB erlaubt, in den Nukleus vorzudringen, um IκB p50 p65 NFκB
dort die Genexpression zu modulieren. Dieser Signalweg dient nur zur Erklärung. Es wurden mittlerweile weitere Varianten entdeckt.
NFκB-Bindungs-Sequenz
Zellkernmembran
Abb. 1.1: Die Signaltransduktion der Toll-LikeRezeptoren, Abb. nach Akira (modifiziert) [12]
1.1.5 Monozyten Monozyten machen ungefähr 2-8% der gesamten Leukozyten aus und entwickeln sich aus hämatopoietischen Stammzellen aus dem Knochenmark. Sie gehören zu den Zellen des angeborenen Immunsystems. Monozyten haben einen großen Durchmesser und einen nierenförmigen Kern. Mit einer Größe bis zu 20 µm sind sie die größten Zellen unter den Leukozyten [13]. Nach einer kurzen, 1-3tägigen Zirkulationszeit im Blut wandern die Zellen in die verschiedenen Gewebe aus, wo sie sich zu Makrophagen differenzieren [14]. Diese interagieren sowohl mit dem angeborenen als auch mit dem erworbenen Immunsystem. Bei Infektionen werden vermehrt Monozyten produziert (Monozytose), die Zytokine ausschütten und über die Blutzirkulation zum Ort der Infektion gelangen [15]. Eine Monozytose kann aber auch Hinweise auf andere, beispielsweise hämato-onkologische Erkrankungen geben. Eine Reduzierung der Monozytenanzahl (Monozytopenie) tritt unter anderem bei der aplastischen Anämie auf.
4
Monozyten werden in verschiedene Subtypen unterteilt. Diese Einteilung richtet sich nach
der
Oberflächenstruktur
der
Zellen.
Der
für
Monozyten
typische
Oberflächenmarker ist CD14, ein anderer für die Unterscheidung wichtiger Marker ist CD16. Je nach Untergruppe haben Monozyten verschiedene Eigenschaften. Die Zellen haben die Möglichkeit, in andere Zellen zu differenzieren; so können CD14+CD16-Monozyten zu dendritischen Zellen reifen [14]. Diese Tatsache wurde in der vorliegenden Arbeit genutzt, indem Monozyten aus Blutproben isoliert und durch Zugabe bestimmter Zytokine in unreife DCs umgewandelt wurden.
1.1.6 Dendritische Zellen Dendritische Zellen (DCs) wurden 1973 von Steinmann beschrieben [16]. Er benannte sie nach ihren baumähnlichen Ausläufern (griech. το δενδρον, dendron). Es handelt sich bei DCs um antigenpräsentierende Zellen (APCs). Sie entstehen aus plasmazytoiden oder myeloischen Vorläuferzellen [17]. Von diesen ausgehend differenzieren sie zu unreifen interstitiellen DCs, Langerhans-Zellen und anderen Zellen, welche vor allem auf Schleimhäuten, aber auch in der Haut zu finden sind. In dieser Arbeit wurden aus Monozyten entwickelte DCs (moDCs) untersucht. Durch ihren Einfluss auf andere Abwehrzellen übernehmen DCs eine wichtige Aufgabe in der Kontrolle des Immunsystems [18]. Sie spielen eine Rolle in der Verbindung von angeborenem und erworbenem Immunsystem. DCs sind in der Lage, große Mengen Flüssigkeit zu absorbieren; so können sie innerhalb einer Stunde ein Volumen ihrer eigenen Größe aufnehmen [19]. Zunächst liegen DCs in der Peripherie als unreife Zellen (iDCs) vor. Sie sind noch nicht vollständig in der Lage, T-Zellen zu stimulieren. Das ändert sich nach Antigenkontakt. Dieser wird über TLRs hergestellt und führt dazu, dass die Zelle Zytokine sezerniert, die autokrin, also auf die Zelle selbst wirken und so zu einer Reifung der DCs führen [20]. Eine reife DC (mDC) ist in der Lage, mit Zellen der erworbenen Abwehr zu kommunizieren. Sie verliert allerdings damit ihre Eigenschaft, Antigene aufzunehmen [21]. mDCs exprimieren, wie alle antigenpräsentierenden Zellen, MHC-II-Komplexe. Diese werden zur Interaktion mit T-Zellen benötigt. Außerdem finden sich auf der Oberfläche der DCs MHC-I-Komplexe, Adhäsionsmoleküle und die wichtigen kostimulatorischen Moleküle [17].
5
IL-10
Pathogene, Zytokine, T-Zellen unreife DC
reife DC
Abb. 1.2: Entwicklung einer unreifen (immature) zu einer reifen (mature) DC nach Kontakt mit pathogenen Erregern, Zytokinen oder T-Zellen. Diese Reifung wird z. Bsp. durch IL-10 verhindert. Abbildung in Anlehnung an Banchereau [18] Im Lymphknoten nehmen mDCs Kontakt zu T-Zellen auf. Die Aktivierung findet in zwei Phasen statt. Zum einen binden Adhäsionsmoleküle, zum Beispiel ICAM-1 oder ICAM-2, an bestimmte Rezeptoren der T-Zelle. Zum anderen interagieren der MHC-IIKomplex und der T-Zell-Rezeptor miteinander. Eine wichtige Rolle bei dieser Bindung spielen die kostimulatorischen Moleküle CD80 sowie CD86 [22]. CD83 ist der entscheidende Marker für mDCs und sehr wichtig für die Interaktion mit der T-Zelle [23, 24]. Es gibt aber auch Faktoren, die die Reifung von DCs hemmen, so zum Beispiel IL-10, aber auch VEGF [25]. Dies spielt eine Rolle bei der verminderten Immunantwort von DCs bei Tumoren [26]. Als wichtiger Rezeptor für die Erkennung von Pilzen durch DCs wurde kürzlich Dectin-1 identifiziert [27].
In vitro ist es möglich, aus Monozyten nach Zugabe von GM-CSF und IL-4 DCs reifen zu lassen [28]. Die Entwicklung zur mDC wird vor allem durch LPS, aber auch durch andere Toxine gefördert. Auch Zytokine spielen hier wieder eine Rolle. TNF-α fördert die Reifung, IL-10 hemmt diese [25]. Die Wirkung von Medikamenten auf DCs ist seit längerem Gegenstand der Forschung. Eine Übersicht über die Wirkung verschiedener Immunsuppressiva auf DCs gibt eine Arbeit von Abe et al. [29].
6
1.2 Zytokine
1.2.1 Allgemeines Zytokine sind Proteine, welche diverse Funktionen im Rahmen der angeborenen und der erworbenen Immunabwehr besitzen. Sie werden von verschiedensten Zellen sezerniert. Zytokine nehmen Einfluss auf die Kommunikation, aber auch auf die Differenzierung, das Wachstum und die Aktivierung von Zellen [30].
Zytokine sind sehr vielseitig. Ein Zytokin kann unterschiedliche Reaktionen auslösen (Pleiotropie) [31]. Diese können auch gegensätzlich sein. So kann ein Zytokin sowohl pro-inflammatorisch als auch anti-inflammatorisch wirken. Dies hängt unter anderem von seiner Umgebung ab. Aber auch das Vorhandensein anderer Zytokine beeinflusst die Wirkung. Für eine bestimmte Reaktion gibt es unter Umständen mehrere Zytokine (Redundanz) [31]. Um eine optimale Wirkung zu erreichen ist oft ein Synergismus, also das Zusammenspiel mehrerer Zytokine, vonnöten. Zu den Zytokinen gehören die Interleukine, Tumornekrosefaktoren, Interferone, colony stimulating factors (CSF), Wachstumsfaktoren und viele mehr.
1.2.2 Signaltransduktion Die Signaltransduktion der Zytokine soll hier am Beispiel von IL-12 erläutert werden: Der Zytokinrezeptor liegt in seiner inaktivierten Form als Monomer vor. Nach Bindung von IL-12 kommt es zu einer Dimerisierung und anschließenden Phosphoryllierung des Rezeptors. Die beiden Ketten binden im Zytoplasma je eine JAK-Kinase, im Falle von IL-12 die beiden Kinasen JAK2 und TYK2, welche ebenfalls phosphorylliert werden. Der nun entstandene Rezeptor-JAK-Komplex führt zur Phosphoryllierung von zwei STAT-Molekülen (signal transducer and activator of transcription), die zu einem Dimer aggregieren und in den Zellkern wandern, um dort die Gentranskription zu initiieren.
7
Zytokine
γ
β
β
γ Jak
Ser/Thr Kinase
Jak
Y Y-
P
- S
YP Y PY -
STAT
STAT
STAT Y P - Y STAT -
Y -
P
P
-S
STAT Y P P - Y STAT Durch Zytokine induzierbare Gene
TTCNNNGAA
TATA
Abb. 1.3: Signaltransduktion der Zytokine nach Ortmann et al.(modifiziert) [32]
1.2.3 TNF-α Der Tumornekrosefaktor-alpha wird vor allem von Zellen des mononukleären Phagozytosesystems (MPS), aber auch von anderen Zellen des Immunsystems ausgeschüttet. Sein molekulares Gewicht liegt bei ca. 17 kD [2]. Das bakterielle LPS ist der stärkste Auslöser für eine TNF-α-Ausschüttung. Die Erkennung erfolgt, wie auch bei A. fumigatus, über TLR 2 und TLR 4. TNF-α wird membrangebunden produziert und durch das TNF-α-Konversionsenzym in seine lösliche Form umgewandelt [30]. Es sind zwei Rezeptoren bekannt, TNFR I und TNFR II. An diesen ruft TNF-α ähnliche Effekte hervor. Seine Ausschüttung ermöglicht zum Beispiel Granulozyten den Austritt aus den Blutgefäßen in Richtung einer Entzündung. Die Expression der hierfür nötigen Adhäsionsmoleküle und Selektine wird durch TNF-α erhöht [30].
8
Des Weiteren hat TNF-α Bedeutung bei der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten oder bei der Chemotaxis (Anlocken von Zellen). Neben der antitumorösen hat TNF-α auch eine pro-inflammatorische Wirkung, welche bei der Sepsis, aber auch beispielsweise beim Asthma, eine Rolle spielt [30, 33].
1.2.4 Interleukin-12 Wie andere Zytokine auch, wird Interleukin-12 (IL-12) von verschiedenen Zellen ausgeschüttet, so zum Beispiel von B-Zellen und DCs. Es gibt zwei Untereinheiten, p40 und p35 [30]. Zu den diversen Funktionen von IL-12 gehören neben der Beeinflussung von NKZellen, welche es aktiviert und zur Proliferation stimuliert, die Beeinflussung von Lymphozyten sowie die Entwicklung von T-Helfer-Zellen nach Antigenkontakt [34]. Außerdem spielt es eine Rolle bei allergischen Erkrankungen.
1.3 Chemokine
1.3.1 Allgemeines Chemokine sind Peptide, deren Hauptaufgabe die Chemotaxis, also das Anlocken von Leukozyten und anderen Zellen ist. Produzenten sind vor allem Zellen des MPS und APCs [35]. Sie zeichnen sich durch Cysteinreste aus, an deren Stellung sich die Klassifizierung der Chemokine orientiert. Bekannt sind vier Hauptgruppen: Bei der C-X-C-Untergruppe ist der mittlere Cysteinrest durch eine beliebige Aminosäure ersetzt. Chemokine, bei denen zwei Reste nebeneinander liegen, gehören zur C-C-Untergruppe. Die beiden genannten Gruppen machen den Hauptteil der Chemokine aus. Außerdem existieren noch eine C-Gruppe mit nur einem Cysteinrest und eine CX3C-Untergruppe, bei der die beiden Reste durch drei Aminosäuren getrennt werden. Die
Chemokinrezeptoren
können
durch
die
Interaktion
mit
verschiedenen
Untereinheiten der G-Proteine und auch anderen Rezeptoren unterschiedliche Signalkaskaden auslösen [36].
9
1.3.2 CCL20/CXCL10 Das in dieser Arbeit auf seine Expression hin getestete CCL20 (Mip-3-α) bindet an den Chemokinrezeptor CCR6 und spielt eine Rolle bei inflammatorischen und homöostatischen Prozessen. In einem Mausmodell wurde kürzlich die Bedeutung von CCR6 bei der Abwehr der invasiven Aspergillose beschrieben [37]. Mezger et al. zeigten, dass CXCL10-Polymorphismen eine Bedeutung bei der Erkennung einer entstehenden invasiven Aspergillose (IA) haben könnten [38].
1.4 Pilze
1.4.1 Allgemeines Pilze (Fungi) werden zu den Eukaryonten gezählt. Sie besitzen ein Zytoskelett sowie einen Zellkern und sind höher entwickelt als Bakterien. Pilze leben saprotroph, das heißt, sie leben von den sich zersetzenden organischen Stoffen ihrer Umgebung. Sie gehören damit neben den Bakterien zu den wichtigsten Destruenten. Die Symbiose zwischen einem Pilz und einer Pflanze bezeichnet man als Mykorrhiza: Der Pilz wächst an der Wurzel; er liefert der Pflanze wichtige Nährstoffe und wird selber von dieser ernährt. Pilze spielen eine wichtige Rolle sowohl in der Medizin als auch im alltäglichen Leben. So wird aus Penicillium notatum das Penicillin gewonnen, aus Penicillium camemberti hingehen der französische Camembert. Hefepilze finden Verwendung in der Bier- und Weinherstellung. Vergiftungen mit dem bekannten „Fliegenpilz“ Amanita muscaria enden oft tödlich. Hautpilze, die Dermatophyten, sind in der Form von Fußpilz eine der häufigsten Erkrankungen durch Pilze beim Menschen. Weitere Bedeutung haben Pilze als Halluzinogene und, wie weiter unten beschrieben, als Krankheitserreger bei immunsupprimierten Menschen.
1.4.2 Die Gattung Aspergillus Die Gattung Aspergillus gehört zu den Schimmelpilzen. Von ihr sind mehrere hundert Arten bekannt. Aspergillen kommen ubiquitär vor. Sie sind sogenannte opportunistische Erreger, das heißt, dass sie für den immunkompetenten Menschen zumeist nicht
10
gefährlich sind. Dies kann sich jedoch bei Störungen des Immunsystems ändern. Aspergillen können Infektionen und Allergien auslösen. Es können aber auch Krebserkrankungen wie das Leberzellkarzinom ausgelöst werden. Letzteres entwickelt sich durch das von A. flavus produzierte Aflatoxin. Der für den immunsupprimierten Menschen wichtigste Auslöser von invasiven Pilzkrankheiten nach Candida spp., einem Hefepilz, ist der Schimmelpilz A. fumigatus.
1.4.3 Aspergillus fumigatus Die Gattung Aspergillus wurde zum ersten Mal 1729 von Micheli beschrieben, die Art A. fumigatus von Fresenius im Jahr 1863 [39]. A. fumigatus ist ein saprophytischer, thermophiler Schimmelpilz und spielt eine Rolle bei der Zersetzung von Kohlenstoffen. Sexuelle Vermehrungsformen sind nicht bekannt; die Verbreitung findet über Konidien statt, welche durch die Luft transportiert werden [40]. Konidien haben einen Durchmesser von 2-3 µm und können deshalb über die Atemwege bis in die Alveolen eindringen.
Abb. 1.4: A. fumigatus-Konidien [41]
11
Abb. 1.5: sporulierende Konidie, entnommen von Latgé [40]
Jeder Mensch atmet mehrere hundert Konidien am Tag ein, welche normalerweise durch das angeborene Immunsystem Immuns eliminiert werden [42].. Bei sehr starker Inhalation können
allergische
Reaktionen
bis
hin
zur
allergischen
bronchopulmonalen
Aspergillose auftreten [43]. [43] Eine weitere Manifestationsform tationsform ist das Aspergillom. Bei immunsupprimierten Patienten kann es durch Ausbreitung der Konidien zum schweren Krankheitsbild der invasiven Aspergillose kommen. Diese wird in mehr als 90% der Fälle von A. fumigatus ausgelöst [40]. Ein großes Problem stellt lt das Vorkommen von Pilzen in Krankenhäusern dar. Sogar auf Intensivstationen kann A. fumigatus nachgewiesen werden [44]..
1.4.4 Invasive Aspergillose Die IA ist eine lebensbedrohliche, schwer zu behandelnde opportunistische Erkrankung. Sie tritt vor allem bei Patienten atienten nach Transplantationen und bei TumorTumor sowie HIVPatienten auf,, also bei Menschen, deren Abwehr geschwächt ist [45, 46]. Die eingeatmeten
Konidien
bilden
in
der
Lunge
ein
Myzel
und
lösen
eine
Aspergilluspneumonie aus. Durch hämatogene Streuung in Niere, ZNS, Herz und andere Organe breitet sich die IA aus. Die stetige Weiterentwicklung Weiterentwicklung und häufige Gabe von Immunsuppressiva hat bis heute die Inzidenz und die Prävalenz der IA stark erhöht und es ist auch weiterhin damit zu rechnen, dass sich dieser Trend Tren fortsetzt. Die Patienten sind einem em unterschiedlich hohen Erkrankungsrisiko ausgesetzt. Die Mortalität der IA ist in allen en Fällen sehr hoch (s. Tab. 1.2).
12
Organ
Inzidenz
Mortalität
Leber
1-8%
87%
Lunge
3-14%
68%
Herz
1-15%
78%
Niere
0-4%
77%
Tab. 1.2: Inzidenz und Mortalität der IA in verschiedenen Organen, Tab. nach Singh [47] Trat die IA früher vor allem innerhalb der ersten 90 Tage nach Transplantation auf (early-onset), wird heute vermehrt von später einsetzenden Infektionen berichtet (lateonset). Dies hängt neben unterschiedlicher Medikation auch vom transplantierten Organ ab [48]. Solé et al. wiesen einen Zusammenhang zwischen der IA und der Abstoßung von Lungentransplantaten nach [49]. Bei Stammzelltransplantierten konnte durch den Einsatz von Wachstumsfaktoren die Dauer der Neutropenie verkürzt werden, so dass man bei diesen Patienten eine Zunahme von late-onset-IA aufgrund von GvHD und deren Therapie mit Glucokortikoiden beobachten kann [50]. Das IA-Erkrankungsrisiko korreliert mit der Dauer der Therapie und der Höhe der täglich verabreichten Medikamentendosis [51]. Des Weiteren wurde eine starke Zunahme von Aspergillosen durch andere Pilze als A. fumigatus beobachtet [50].
Entscheidend für eine günstige Prognose der IA ist der schnelle Nachweis von A. fumigatus. Dieser gestaltet sich jedoch oftmals als sehr schwierig. Antikörpersuchtests sind erhältlich, aber in ihrer Durchführung problematisch, da das Immunsystem nicht adäquat funktioniert und somit auch weniger Antikörper gebildet werden können. Eine neuere Methode der Aspergillusdetektion ist der seit einigen Jahren in Europa zugelassene Galactomannan-Antigen-Test, dessen klinische Anwendung allerdings limitiert ist [52, 53]. Ein anderer Ansatz, der seit einigen Jahren erprobt wird, ist der Nachweis von Pilzgenom durch die quantitative real-time Polymerase Kettenreaktion (qtPCR). Eine standardisierte, zuverlässige Methode, A. fumigatus nachzuweisen, ist dringend erforderlich. Einen Überblick über die aktuellen Möglichkeiten und zukünftige Verfahren geben Einsele et al. [54].
13
1.4.5 Antimykotika Zur Behandlung der IA stehen nur wenige Medikamente zur Verfügung. Die Behandlung ist schwierig, langwierig und kostenintensiv. Ein Problem besteht in der Tatsache, dass die IA meistens erst sehr spät entdeckt wird. Ein bekanntes Medikament ist das seit langem eingesetzte Amphotericin B, welches an das Ergosterin in der Pilzwand bindet und diese auflöst. Aufgrund der Ähnlichkeit mit menschlichen Proteinen ist die Behandlung mit Amphotericin B sehr nebenwirkungsreich [55, 56]. Die Therapie spricht je nach Grunderkrankung außerdem sehr unterschiedlich an [57]. Eine andere Wirkstoffgruppe sind die Azole, welche über eine Synthesehemmung des Ergosterins den Pilz schädigen. Als Beispiel seien hier Voriconazol und Posaconazol genannt [58, 59]. Aus der Gruppe der Echinokandine kann auf Caspofungin zurückgegriffen werden. Da es die Pilze an anderer Stelle angreift, kann es gut mit Azolen kombiniert werden [60]. Die bei der Behandlung bakteriell verursachter Krankheiten gefürchtete Entwicklung von Resistenzen ist bei Pilzkrankheiten nicht so häufig.
1.5 Verwendete Medikamente
1.5.1 Mycophenolat MMF
MPA
Abb. 1.6: Strukturformeln von Mycophenolatmofetil (MMF) und Mycophenolsäure (MPA) [61]
14
Mycophenolsäure
(MPA,
C17H20O6;
Mr
=
320,3)
wurde
ursprünglich
aus
Penicilliumarten gewonnen und war als Antibiotikum gedacht. Erst später entdeckte man seine immunsupprimierende Wirkung [62]. Um die Bioverfügbarkeit im Körper zu erhöhen, wird MPA als Mycophenolatmofetil (MMF), eine sogenannte Prodrug, verabreicht [63]. MMF wird relativ rasch im Körper zu MPA umgewandelt. MPA ist ein reversibler, selektiver und nicht-kompetitiver Hemmer der InosinmonophosphatDehydrogenase (IMPDH) [64]. Diese Hemmung führt zu einer Verminderung der denovo-Purin-Synthese, auf welche vor allem Lymphozyten angewiesen sind [63]. Purine sind DNA-Bausteine und damit für die Lymphozyten überlebenswichtig. Dies erklärt die Hemmung der Lymphozyten. Der Patient ist in der Folge immunsupprimiert. So lässt sich die Rate an Abstoßungen nach Organtransplantationen senken, da das Immunsystem das fremde Organ nicht als fremd erkennt. Der Patient ist aber aufgrund seiner reduzierten Abwehr anfällig für Infektionen. MMF wird vor allem nach Nieren-, Herz- und Lebertransplantation in Kombination mit anderen Immunsuppressiva, wie zum Beispiel Ciclosporin, gegeben. Es findet aber auch in der Behandlung von Hautkrankheiten Verwendung [65, 66]. Bekannte Nebenwirkungen sind Durchfälle, Übelkeit, Blutbildungsstörungen und das Auftreten opportunistischer Erkrankungen, wie der invasiven Aspergillose [64]. Es wurde jedoch auch beschrieben, dass MMF inflammatorische Syndrome auslösen kann, die allerdings nach Absetzen des Medikaments wieder sistieren [67].
1.5.2 Everolimus (RAD)
Abb. 1.7: Strukturformel von RAD [68]
15
Everolimus (M: 958,25, C53H83NO14 ) ist ein Derivat von Rapamycin (RAPA), das von der Actinomyces-Art Streptomyces hygroscopicus produziert wird [69]. Everolimus hat im
Vergleich
Bioverfügbarkeit
zu
RAPA
eine
bessere
Pharmakokinetik
[70]. Beide Medikamente
inhibieren
und
den
eine
erhöhte
mTOR-Signalweg
(mammalian Target Of Rapamycin) [71]. Dieser Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Zellzyklus‘. Die Aktivierung von mTOR führt die Zelle von der G1- in die S-Phase [72]. RAD inhibiert diesen Signalweg. Dies führt zu einer Unterdrückung der T-Zell-Aktivierung. Everolimus wird – ebenso wie MMF - zur Vermeidung von Organabstoßungen vor allem nach Nieren- und Herztransplantation zusammen mit anderen Immunsuppressiva eingesetzt [73]. Die Nebenwirkungen sind ähnlich denen des MMF.
1.6 Zielsetzung Seit einigen Jahren gibt es Bestrebungen, DCs als Impfstoffe gegen diverse Erkrankungen, darunter auch die IA, einzusetzen. Hierbei muss jedoch gewährleistet sein, dass diese Zellen auch unter einer immunsuppressiven Therapie des Patienten im Stande sind, eine Immunantwort auszulösen. Mit Hinblick auf diese Problematik und auf die Tatsache, dass noch immer wenig über die Wirkung von Medikamenten auf DCs bekannt ist, war das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von MPA und RAD auf DCs bezüglich
ihrer
Differenzierung
aus
Monozyten
sowie
ihrer
Reifung
und
Zytokinantwort nach Kontakt mit A. fumigatus zu untersuchen. Hierfür sollte zum einen die Zytokinexpression von DCs untersucht werden, nachdem diese über verschiedene Zeiträume mit dem Medikament kultiviert und im Anschluss daran durch den Zusatz von A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert wurden. Zum anderen sollten mittels durchflusszytometrischer Experimente Effekte auf die Entwicklung und Reifung der Zellen untersucht werden, indem iDCs und mDCs gezielt auf bestimmte Oberflächenmarker hin untersucht wurden.
16
2 Der
Material folgende
Abschnitt
enthält
eine
Auflistung
der
verwendeten
Geräte,
Labormaterialien, Kits, Reagenzien, Lösungen, Medien, Immunsuppressiva, Primer, Sonden und Antikörper.
2.1 Geräte
Gerät
Bezeichnung
Hersteller
Brutschrank
Heraeus BBD 6220
Thermo/Kendro
FACS-Gerät
FACS Calibur
Becton Dickinson
Gefrierschränke
-20 °C / -80 °C
Liebherr / Heraeus
LightCycler Instrument
Light Cycler 1.5
Roche GmbH
MACS Magnete
Separation Columns LS
Miltenyi Biotec
Mikroskope
Eclipse 50i und TS100
Nikon
Pipetten
Reference
Eppendorf
(2,5 µl, 10 µl, 100 µl, 1000 µl) Pipettierhilfe
Pipetus-Akku
Hirschmann
Präzisionswaage
GF-200
A & D Instruments
Sterilbank
Herasafe HS18
Thermo/Kendro
Ultrazentrifuge
Sorvall Discovery 90 SE
Sorvall
Vortexer
MS1 Minishaker
IKA-Works, Inc.
Wasserbad
Memmert WB7
Memmert
Zentrifuge
Centrifuge 5415D und 5415R
Eppendorf Thermo/
Multifuge 3S und 3S-R
Kendro
Tab. 2.1: Geräteliste
17
2.2 Verbrauchsmaterialien
2.2.1 Labormaterialien Labormaterial
Kennzeichen
Hersteller
FACS-Röhrchen
5 ml, 12 x 75 mm
Becton Dickinson
LightCycler Glaskapillaren
Roche GmbH
MACS-Trennsäulen
LS
Miltenyi Biotec
MT-Platten
6 Well / 24 Well / 96 Well
Hartenstein
Objektträger
Hartenstein
Pasteurpipetten
einzeln steril verpackt
Hartenstein
Pipettenspitzen
10 µl, 100 µl, 1000 µl
Zentrallager
Reaktionsgefäße
0,5 ml / 1,5 ml / 2 ml Tubes
Hartenstein
15 ml / 50 ml Falcontubes 25 cm2, 75 cm2, 175 cm2
Zellkulturflaschen
Hartenstein
Tab. 2.2: Liste der verwendeten Labormaterialien
2.2.2 Kits Kit
Hersteller
Light Cycler FastStart DNA Master Hybridization Probes
Roche GmbH
QIAshredder
QIAGEN
Quantitect Reverse Transcription Kit
QIAGEN
RNeasy Mini Kit
QIAGEN
Tab. 2.3: Auflistung der eingesetzten Kits
2.2.3 Medien Medium
Einzelkomponenten
RPMI-Medium (komplett)
500 ml RPMI 1640, 10% FCS 1,5 ml Refobacin
Tab. 2.4: Verwendete Medien
18
2.2.4 Reagenzien Reagenz
Hersteller
Dextran
Sigma
EDTA
Sigma
Ethanol 100 %
Roth
Ethidiumbromid
Sigma
FACS-Flow
Becton Dickinson
FACS-Rinse
Becton Dickinson
FACS-Safe
Becton Dickinson
FCS
Sigma
FICOLL
Biochrom AG
FITC
Sigma
Gentamycinsulfat (Refobacin® 80 mg)
Merck
HBSS Hanks’ Balanced Salt (1x)
GIBCO, Invitrogen Corp.
LPS (ultrarein)
Sigma / Invivogen
PBS (10x)
Sigma
RPMI 1640 Medium (+ Glutamaxx)
GIBCO, Invitrogen Corp.
Trypanblau 0,4 %
Sigma
β-Mercaptoethanol
Sigma
Tab. 2.5: Reagenzienliste
2.2.5 Zytokine und Immunsuppressiva Klinische Immunsuppressiva/ Zytokine
Stammlösung
Hersteller
GM-CSF (Leukine)
250 µg/ml Hanks
Berlex
Interleukin 4
10 µg/ml Hanks
R&D Systems
Mycophenolat
1 mg/ml Hanks
Novartis
1 mg/ml 100% Ethanol
Novartis
Everolimus , (RAD 40-O-(2hydroxyethyl-9-rapamycin)
Tab. 2.6: Zytokin- und Immunsuppressivaliste
19
2.2.6 Primer Gen
Primer
Sequenz (5’-3’)
IL-12p40
IL-12 F
CTC GTG GCC ATA TGG GAA C
IL-12 R
TGG CCA GCA TCT CCA AAC T
SCYB10 F
ACG TGT TGA GAT CAT TGC TAC AA
SCYB10 R
GAT TTT GCT CCC CTC TGG T
TNF-α F
GGC GTT TGG GAA GGT TGG AT
TNF-α R
CTC TGG CCC AGG CAG TCA GA
h-Alas F
AAT GAG TCG CCA CCC ACG
h-Alas R
CAG CTC CCG CTC TAA GTC CA
MIP-3α F
CTG TCT TGG ATA CAC AGA CCG TA
MIP-3α R
GGT TCT TTC TGT TCT TGG GCT A
IFN-γ F
GCA TCC AAA AGA GTG TGG AG
IFN-γ R
GCA GGC AGG ACA ACC ATT AC
SCYB10 TNF-α h-Alas MIP-3α IFN-γ
Tab. 2.7: Primer der Fa. TIB MOLBIOL (Berlin)
2.2.7 Sonden Gen
Sonde
Sequenz (5’-3’)
IL-12p40
IL-12 FL
GGT CCT CAC CTG TGA CAC CCC TGA
IL-12 LC
AAG ATG GTA TCA CCT GGA CCT TGG ACC
SCYB10 FL
AGT AAA TTC TTG ATG GCC TTC GAT TCT
SCYB10 LC
GAT TCA GAC ATC TCT TCT CAC CCT TCT
SCYB10
TTT TNF-α h-Alas MIP-3α IFN-γ
TNF-α FL
GCA TTG GCC CGG CGG TTC
TNF-α LC
CCA CTG GAG CTG CCC CTC AGC T
h-Alas FL
CCT GCC CCA GCA CCA TGT TGT TTC
h-Alas LC
GTG TCC ATA ACT GCC CCA CAC ACC
MIP-3α FL
GTT GTC TGT GTG CGC AAA TCC AAA
MIP-3α LC
CAG ACT TGG GTG AAA TAT ATT GTG CGT C
IFN-γ FL
TCC AAC GCA AAG CAA TAC ATG AAC TC
IFN-γ LC
TCC AAG TGA TGG CTG AAC TGT CG
Tab. 2.8.: Sonden der Fa. TIB MOLBIOL (Berlin)
20
2.2.8 Antikörper FACS Antikörper
Konjugation
Herkunft
Verdünnung
IgG1 Isotypkontrolle
PE
Maus
2,5 µl / 1x106
(Becton Dickinson)
Zellen
IgG2a Isotypkontrolle
FITC
(Becton Dickinson) IgG2a Isotypkontrolle
PE
(Becton Dickinson) α-CD1a IgG2a (DakoCytomation)
FITC
α-CD14 IgG2a (Becton Dickinson)
FITC
α-CD40 IgG1 (Immunotech)
PE
α-CD80 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
α-CD83 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
α-CD86 IgG1 (Becton Dickinson)
PE
Primäre Antikörper α-CD14 (Miltenyi)
Konjugation
Herkunft
Verdünnung
Microbeads
Maus
100 µl / 1x108 PBMCs
Tab. 2.9: Auflistung der verwendeten Antikörper unter Angabe der Konjugation, der Herkunft und der eingesetzten Verdünnung
21
3
Methoden
3.1 Gewinnung dendritischer Zellen Die beschriebenen Zellen wurden bei 37,0 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit im Brutschrank inkubiert.
3.1.1 Isolierung von Monozyten Zur Gewinnung mononukleärer Zellen, sogenannter peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), wurden Buffy Coats der Blutbank Frankfurt genutzt. Die Zellen für den Phagozytoseassay wurden aus sogenannten „Zapfen“ gewonnen, die vom Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Hämotherapie des Universitätsklinikums Würzburg bezogen wurden. Hierbei handelt es sich um leukoreduction system chambers (LRSC) – Leukozytenreduktionssysteme –, mit deren Hilfe Leukozyten aus dem Blut gefiltert werden. Das Blutprodukt wurde in einem 200 ml Zellkulturgefäß mit HBSS auf 150 ml aufgefüllt und vermischt. Je 25 ml davon wurden vorsichtig auf mit 20 ml Ficolllösung befüllte 50 ml-Falconröhrchen geschichtet und 20 min bei 2000 rpm ohne Bremse zentrifugiert. Durch den Dichtegradienten wanderten Erythrozyten und andere Zellen zum Boden des Gefäßes und in der Interphase sammelten sich die PBMCs. Diese wurden dann mittels einer Pasteurpipette abpipettiert und in einem neuen 50 mlFalconröhrchen gesammelt, auf 50 ml mit HBSS aufgefüllt und für 10 min bei 1300 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das Pellet aufgeschüttelt und mit HBSS auf 20 ml aufgefüllt. Nach gründlichem Mischen wurden die Zellen im Verhältnis 1:20 verdünnt und in einer Neubauer-Zählkammer gezählt (s. Abb. 3.1). Nach einer weiteren zehnminütigen Zentrifugation bei 1300 rpm wurde das Pellet mit HBSS aufgefüllt und so auf neue Falconröhrchen verteilt, dass sich in jedem Röhrchen nach Zugabe von 850 µl Suspension 1,5 x 108 Zellen befanden. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte mittels einer Neubauer-Zählkammer. Auf diesem Objektträger sind 9 mm² große Zählnetze eingraviert. Jedes Netz ist in neun 1 x 1 mm große Quadrate unterteilt. Jedes dieser Quadrate ist wiederum aus sechzehn
22
0,25 x 0,25 mm großen Quadraten zusammengesetzt. Dies ermöglicht einen einfacheren Zählvorgang unter dem Mikroskop. Um nur lebende Zellen zu erfassen, erfassen wurde Trypanblau verwendet. Dieser Stoff wird von lebenden Zellen nicht aufgenommen und zeigt somit nur abgestorbene Zellen an. Die Zellen wurden in einer 1:20 Verdünnung gezählt. Zu diesem Zweck musste zunächst der Zellaliquot mit HBSS H 1:10 und anschließend 1:2 mit Trypanblau verdünnt werden. Die Gesamtzellzahl errechnet sich aus der gezählten Zellzahl, der Gesamtzellzahl Gesamtzellza der Zellsuspension, der 1:20-Verdünnung Verdünnung sowie der Kammertiefe. Die Kammertiefe beträgt 0,1 mm. Somit ergibt sich bei einem 1 x 1 mm großen Quadrat ein Volumen von 1/104 ml. Also lautet die Formel für die Gesamtzellzahl:
Gesamtzahl = Zellzahl x 104 x Gesamtvolumen x 20
Abb. 3.1: Neubauer – Zählkammer [74]
Zur Isolierung von Monozyten wurden CD14-selektive CD14 selektive Microbeads benutzt. Es handelt sich dabei um Antikörper, die das für Monozyten charakteristische CD14CD14 Oberflächenmolekül binden. Die Antikörper Antikörper sind mit kleinen Metallelementen, den Microbeads, konjugiert. Durch Filterung in einer magnetischen MACS-Trennsäule, MACS an der die Microbeads – mit den an ihnen gebundenen Zellen – haften bleiben, sollen die antikörperbehafteten Monozyten von den anderen anderen Zellen getrennt werden.
23
Nach Zugabe von 150 µl CD14-selektiven Microbeads zu den 850 µl Zellsuspension und
einer
fünfzehnminütigen
Inkubationszeit
im
Kühlschrank
wurden
die
Falconröhrchen mit HBSS/FCS/EDTA auf 20 ml aufgefüllt und 10 min bei 1300 rpm zentrifugiert. Währenddessen wurden die magnetischen Trennsäulen aufgebaut und mit 3 ml HBSS/FCS/EDTA vorgespült. Die Pellets wurden in je 2 ml HBSS/FCS/EDTA gelöst, auf die Säulen gegeben und je dreimal mit 3 ml HBSS/FCS/EDTA gespült. Im Anschluss daran wurden die Trennsäulen aus dem Magneten genommen und der Inhalt mit je 2 ml HBSS/FCS/EDTA in ein 20 ml-Falconröhrchen gepresst. Es folgte eine Zählung der Zellen bei 1:20-Verdünnung und eine weitere zehnminütige Zentrifugation bei 1300 rpm. In einem weiteren Arbeitsschritt wurden dann je 2,5 x 106 Zellen pro Well auf 6-Well-Mikrotiterplatten pipettiert. Als Lösung diente RPMI, das mit Refobacin und 10 % FCS angereichert war.
3.1.2 Reifung der dendritischen Zellen Die Möglichkeit, mit Hilfe bestimmter Zytokine Monozyten zu DCs differenzieren zu lassen, wurde von verschiedenen Autoren beschrieben [24, 75]. Als Wachstumsfaktoren wurden 6 µl IL-4/Well und 1,2 µl GM-CSF/Well hinzugefügt. Je nach Versuchsaufbau wurden den Zellen die Immunsuppressiva Mycophenolat (MPA) oder Everolimus (RAD) hinzugefügt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, musste bei den RAD-Versuchen den Zellen ohne Medikament Ethanol in derselben Konzentration wie RAD gegeben werden, um einen Einfluss des Ethanols auszuschließen. Danach wurden die Wellplatten in den Brutschrank gestellt. Um den Verbrauch der Zellen an Medium und Zytokinen auszugleichen, wurde nach zwei bzw. fünf Tagen je ein Milliliter Medium pro Well entfernt und im Anschluss zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Daraufhin wurde das Pellet mit frischem Medium und - je nach Versuchsaufbau - frischem Immunsuppressivum vermischt und wieder in die Wells gegeben. Außerdem wurde die Zytokinkonzentration erhöht, indem zu dem einen Milliliter neuen Mediums die Zytokinkonzentration für drei Milliliter hinzugefügt wurde.
24
3.1.3 Nachweis der dendritischen Zellen Zum Nachweis, dass es sich bei den Versuchen tatsächlich um DCs handelte, wurde eine
FACS-Analyse
gemacht,
mit
dem
Ziel,
die
Zellen
auf
spezifische
Oberflächenmarker hin zu untersuchen (s. 4.2.1).
3.1.4 Infektion der DCs mit A. fumigatus-Keimschläuchen Am Tag der RNA-Isolation wurden die Zellen von den 6-Well-Platten mit Hilfe eines Zellschabers geerntet. Um möglichst viele Zellen zu gewinnen, wurden die Wells mit HBSS ausgespült. Nach Zentrifugation (10 min, 1300 rpm) wurden die Zellen bei 1:2Verdünnung (mit Trypanblau) in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Auf eine 24-WellPlatte wurden nun in jedes Well 1 x 106 in 1 ml RPMI/FCS gelöste Zellen pipettiert. Zusätzlich wurden Zytokine und Immunsuppressiva hinzugefügt. Der Versuchsaufbau war so gewählt worden, dass eine dreifache Bestimmung jedes Ansatzes möglich war:
kein Zusatz
MPA/RAD
A.fumigatus-KS
MPA/RAD
+ A.fumigatus-KS
Abb. 3.2: Versuchsaufbau Nachdem den entsprechenden Wells je 1 x 106 A. fumigatus-Keimschläuche zugefügt worden waren, wurden sie für sechs Stunden im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die zwölf Zellsuspensionen in je ein Eppendorf-Falcon pipettiert und bei 5400 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand konnte nun abpipettiert und zur weiteren Analyse bei -20 °C eingefroren werden.
25
3.2 Untersuchung
der
Zytokinexpression
dendritischer
Zellen
3.2.1 Isolierung der Total-RNA Die Isolierung der Total-RNA erfolgte unter Verwendung der Kits QIAshredder und RNeasy der Fa. QIAGEN. Die Zellen wurden in Tubes aufgenommen und bei 5400 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde eingefroren, das Pellet in 350 µl RLT-Puffer gelöst und mit dem Vortex vermischt, in die QIAshredder-Tubes (lila) überführt und 2 min bei 13200 rpm zentrifugiert. Dieser Schritt wird benötigt um die Zellen zu lysieren. Dem Überstand wurden 350 µl Ethanol (70%) beigemengt, die Mischung in die RNeasy-Tubes (rosa) pipettiert und 15 sec bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei lagert sich die RNA in den rosa Tubes ab und muss danach gewaschen werden. Dies erfolgte durch Zugabe von 700 µl RW-1 und 500 µl RPE, jeweils gefolgt von einer Zentrifugation bei 10000 rpm für 15 sec. Nach einer weiteren Spülung mit 500 µl RPE wurden die Tubes bei 10000 rpm für eine Minute zentrifugiert. Die Eluierung der RNA in ein neues Tube erfolgte durch Zugabe von 35 µl Wasser und einminütiges Zentrifugieren bei 10000 rpm. Die RNA wurde entweder sofort auf ihre Konzentration untersucht oder zunächst bei -80 °C eingefroren.
3.2.2 Untersuchung der RNA-Konzentration Die RNA wurde im NanoDrop Spectrophotometer untersucht. RNA hat ein Absorptionsmaximum von 260 nm. Zur Konzentrationsbestimmung wurden 2 µl RNA je zweimal bestimmt und für die weitere Verwendung die Mittelwerte errechnet.
3.2.3 Umschreibung von RNA in cDNA Die weitere Analyse der Genexpression erfolgte anhand von DNA. Deshalb musste die entstandene RNA mittels des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) in cDNA (copy DNA) umgeschrieben werden. Hierfür wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit von QIAGEN verwendet. Neben dem Enzym enthält dieses auch Primer und Nukleotide. Die Primer lagern sich der RNA an und dienen der RT als Startsequenzen.
26
Unter Verwendung der DNA-Nukleotide wird doppelsträngige cDNA gebildet. Um sicherzugehen, dass vor dem Umschreibevorgang alle genomische DNA eliminiert wird, muss man einen sogenannten DNA-Verdau durchführen. Den 500 ng RNA in 12 µl Wasser wurden 2 µl gDNA Wipeout Buffer hinzugefügt und das Ganze für 4 min bei 42 °C inkubiert. Die in dem Wipeout Buffer enthaltene DNase verdaut die noch vorhandene DNA. Nach der Inkubationszeit wurde der Mastermix pipettiert und für 25 min bei 42 °C inkubiert.
Reagenz
Volumen
Quantiscript Reverse Transcriptase
1 µl
Quantiscript RT Buffer
4 µl
RT Primer Mix
1 µl Tab. 3.1: Mastermix
Durch Erhitzen auf 95 °C für 3 min wurde die RT inaktiviert. Die cDNA wurde bei -20 °C gelagert. Als Negativkontrolle diente ein Tube, dem H2O statt der RT zugefügt wurde.
3.2.4 Quantitative Real-Time PCR Diese relativ neue Technik erlaubt die rasche Quantifizierung von DNA-Produkten. Sie beruht auf der von K. B. Mullis 1983 entwickelten Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR). Diese erlaubt die künstliche Vervielfältigung von DNA in mehreren Zyklen durch Verwendung der thermostabilen Taq-Polymerase (Thermus aquaticus). Mit der qrt-PCR kann man durch Messen der Fluoreszenz während jedes Zyklus’ – daher der Name real-time (Echtzeit) – die DNA quantitativ bestimmen. Je höher die detektierte Fluoreszenz, desto mehr DNA-Produkt liegt vor. Zur Messung der Fluoreszenz gibt es verschiedene Möglichkeiten. Hier wurden der LightCycler der Fa. Roche und die dafür erforderlichen LightCycler-Sonden verwendet.
Je zwei für das zu untersuchende DNA-Produkt spezifische Sonden werden mit Fluorescein und LC Red 640 gefärbt. Nur wenn beide Sonden in einem bestimmten Abstand voneinander, nämlich ein bis fünf Nukleotide, an das DNA-Amplifikat binden,
27
kommt es zum sogenannten fluorescence resonance energy transfer (FRET). Fluorescein wird angeregt und transferiert die Energie über den FRET auf LC Red 640. Hierbei emittiert LC Red 640 ein rotes Licht, welches einmal pro Zyklus vom Gerät detektiert wird. Dies geschieht in der Phase des Annealings, in der sich die Primer an die DNA-Sequenzen anlagern. Primer und ungebundene Sonden werden nicht erfasst.
Annealing
Detektion
470 nm
5 bp
Einzelstrang-DNA
Anregung 470 nm
Detektion Fluorescein
LC-Red
5 bp
Einzelstrang-DNA
470 nm
Elongation Fluorescein
Taq-Pol
Detektion
5 bp
Einzelstrang-DNA
Abb. 3.3: Vorgang des FRET bei der qrt-PCR, nach [76], (modifiziert)
Die PCR wurde mit dem LightCycler FastStart DNA Master HybrProbe Kit der Fa. Roche durchgeführt. Die hierin enthaltene Taq-Polymerase wurde vor ihrer Verwendung mit 60 µl Reaktionspuffer aktiviert. In den Kapillaren wurden jeweils 18 µl Mastermix mit 2 µl Proben-cDNA bzw. 2 µl H2O als Negativkontrolle gemischt.
Reagenz
Volumen
H2O (PCR-grade)
11,6 µl
MgCl2
2,4 µl
je Primer
0,5 µl
je Sonde
0,5 µl
Taq-Polymerase
2,0 µl
Tab. 3.2: Mastermix für die qRT-PCR im LightCycler
28
Die Kapillaren wurden für 5 sec bei 2000 rpm zentrifugiert und in das LightCyclerKarussel gesetzt. Anschließend lief die PCR unter folgenden Bedingungen ab:
Schritt
Zyklen
Temperatur
Zeit
Denaturierung
1
95 °C
10 min
Amplifikation
55
95 °C
9 sec
54 °C
15 sec
72 °C
20 sec
40 °C
5 sec
Kühlen
1
Tab. 3.3: PCR-Bedingungen für die qRT-PCR
Um die Ergebnisse vergleichbar zu machen, wurde das housekeeping-Gen h-Alas verwendet. h-Alas kodiert für die δ-Aminolaevulinsäure und wird unabhängig von Zelltyp und äußeren Einflüssen exprimiert. Gleichzeitig sagen die h-Alas-Werte auch etwas über die Qualität der Experimente aus. Sie sollten bei allen Proben den gleichen Wert haben (Abb. 3.4). Crossing Points h-Alas 100
10 I
II
III
IV
Abb. 3.4: Crossing Points von h-Alas (hier aus einem Versuch mit MPA) Um die Ergebnisse zu normalisieren wurden Crossing Points (Cp) errechnet. Diese zeigen an, wann das Fluoreszenzsignal signifikant steigt, und geben somit Auskunft über die ursprüngliche DNA-Menge.
29
44 42 40 38 Cycle Number
36 34 32 30 28 26 24 22 20 -1
0
1
2
3
4
5
6
Log Concentration
Abb. 3.5: Zusammenhang zwischen Crossing Points und Konzentration [77]
Die Normalisierung erfolgte mit folgender Formel nach Johnson und Krauter [78, 79]:
Normalisierter Wert = 2 (CP h-Alas – CP Zielgen) Dieser Wert wurde mit 100% festgelegt, um Vergleiche mit anderen Werten zu ermöglichen.
3.3 Durchflusszytometrische Untersuchungen an dendritischen Zellen
3.3.1 Durchflusszytometrie Dieses Verfahren, auch FACS (fluorescence activated cell sorting) genannt, wurde 1976 von Herzenberg beschrieben [80]. Es erlaubt das rasche Bestimmen verschiedener Zellen und ihrer Oberflächenmarker. Die Zellen werden, durch eine Kapillare fließend, einzeln von einem Laserstrahl erfasst. Dieser misst das Vorwärtsstreulicht (forward scatter) und das Seitwärtsstreulicht (sideward scatter) der Zelle. Ersteres erlaubt die Auftrennung nach Zellgröße, Letzteres nach Zellgranularität, also dem Zellinhalt. Zusätzlich kann man verschiedene Antikörper gegen CD-Oberflächenmarker mit Farbstoffen anfärben. Diese werden dann, soweit auf der Zelle vorhanden, von anderen Lasern erfasst. Dies erlaubt eine weitere Klassifizierung der untersuchten Zelle.
30
Abb. 3.6: Prinzip der Durchflusszytometrie, nach [81], (modifiziert)
3.3.2 Vorbereitung der Zellen für die FACS-Untersuchung Die Zellsuspension wurde aus den 6-Well-Platten in je ein FACS-Röhrchen pipettiert und 10 min bei 1300 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert. Nach der Zugabe von 500 µl HBSS/FCS wurde das Gemisch auf vier weitere FACS-Röhrchen verteilt, so dass nun fünf Röhrchen à 100 µl vorlagen. In diese wurden je 1,5 µl Antikörper pipettiert. Danach wurde der Inhalt gevortext und 20 min auf Eis gestellt. In einem weiteren Spülschritt wurde nach Zugabe von 1 ml HBSS/FCS erneut wie oben beschrieben zentrifugiert. Nach Abpipettierung des Überstandes wurden wiederum 250 µl HBSS/FCS pro Röhrchen zugegeben. Anschließend erfolgte die Untersuchung im FACS.
3.3.3 Untersuchte Antikörper Die zu untersuchenden Antikörper waren mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) oder PE (Phycoerythrin) konjugiert. Untersucht wurden folgende Antikörper: CD1a (FITC), CD83 (PE), CD14 (FITC), CD80 (PE), CD40 (PE), CD86 (PE). Die Isotypenkontrolle erfolgte mit 2aFITC und 1PE.
31
3.3.4 FITC-Dextran-Assay Die Zellen wurden auf sechs Ansätze verteilt und über sieben Tage gereift:
1.
ohne Zusatz
2.
mit Ethanol
3.
10 µM MPA
4.
1 µM MPA
5.
0,1 µM RAD
6.
0,01 µM RAD
Im Anschluss wurden die DCs geerntet, in sterilen FACS-Tubes gewaschen, in einem Milliliter resuspendiert und gezählt. Die sechs Ansätze wurden jeweils wieder in drei Ansätze unterteilt:
I.
negative Kontrolle bei 37 °C im Brutschrank, 5% CO2
II.
Inkubation bei 4 °C
III.
Inkubation bei 37 °C im Brutschrank, 5% CO2
Jedem FACS-Tube wurden 1 x 105 DCs zugefügt und diese mit je 100 µl des zuvor aufgehobenen Mediums aufgefüllt. Um die erforderlichen Temperaturen der einzelnen Ansätze zu garantieren, wurden die Ansätze I und III im Brutschrank und der Ansatz II bei 4 °C im Kühlschrank für 1,5 Stunden vorinkubiert. Den Ansätzen II und III wurden im Anschluss daran je 4 µM FITC-Dextran zupipettiert. Daran schloss sich eine weitere einstündige Inkubation an. Es folgten drei Waschschritte und die anschließende FACSAnalyse der in 150 µl HBSS gelösten Zellen. Die Waschschritte erfolgten unter Wahrung der erforderlichen Temperaturen.
3.4 Statistik Die Versuche mit Mycophenolat und RAD über 6 Stunden, zwei Tage und über vier Tage wurden mit zwei Spendern durchgeführt, ebenso die FACS-Analysen ohne Pilzzusatz. Sowohl die Versuche mit Mycophenolat über sieben Tage als auch die
32
FACS-Analysen mit A. fumigatus und die FITC-Dextran-Assays wurden mit je drei Spendern durchgeführt. Mittelwerte und Standardabweichungen errechneten sich aus den bekannten Formeln. Jeder Einzelversuch wurde dreifach bestimmt und der Mittelwert aus zwei von drei Ergebnissen errechnet. Jeder Versuch wird in Kapitel 4 exemplarisch anhand der Grafik eines Spenders oder als Diagramm nach Errechnung der Mittelwerte aller drei Spender dargestellt.
33
4
Ergebnisse
Da die Expression einzelner Zytokine von Spender zu Spender stark variiert, werden im folgenden Abschnitt jeweils exemplarisch Abbildungen einzelner Versuche gezeigt. Aus diesem Grund beziehen sich Durchschnittswerte auf prozentuale und nicht auf absolute Werte.
4.1 Zytokinexpression dendritischer Zellen unter der Wirkung von Mycophenolat Zur Generierung der erforderlichen Monozyten wurde jeweils ein Buffy Coat der Blutbank Frankfurt bestellt. Nach Separation durch Ficoll-Gradienten konnten mit Hilfe von CD14-Microbeads und einer Magnetsäule Monozyten selektiert und in ein Medium überführt werden. Durch anschließende Gabe von GM-CSF und IL-4 in steigender Konzentration wurden die Monozyten über sieben Tage zu DCs differenziert und im Anschluss für sechs Stunden mit A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Um den zeitlichen Einfluss von MPA auf die Differenzierung der Zellen untersuchen zu können, wurde das Medikament zu vier verschiedenen Zeitpunkten hinzugefügt: zeitgleich mit der Pilzstimulation, zwei Tage und vier Tage vorher sowie über den gesamten Differenzierungszeitraum von sieben Tagen.
4.1.1 Generierung und Nachweis von DCs aus Monozyten DCs wurden sieben Tage lang generiert und daraufhin sechs Stunden lang mit A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Im Anschluss wurde die RNA extrahiert und der Hälfte der Zellen ebenfalls über sechs Stunden MPA in der Konzentration 30 µM hinzugegeben.
Die Versuchsansätze erhielten die im Folgenden aufgelisteten Nummern (dies gilt für alle im Abschnitt 4.1 erläuterten Versuche):
I=
unstimulierte Zellen
III =
stimulierte Zellen
II =
unstimulierte Zellen + MPA
IV =
stimulierte Zellen + MPA
34
4.1.2 Sechsstündiger Einfluss durch Mycophenolat Die Versuche mit sechsstündiger MPA-Exposition wurden vor Beginn dieser Dissertation
durchgeführt
und
sind
hier
nicht
abgebildet.
Die
untersuchte
Zytokinausschüttung von TNF-α, IL-12, CCL20 sowie CXCL10 war nach Stimulation mit A. fumigatus stark erhöht. Im Vergleich zum Versuchsansatz ohne MPA zeigte sich beim Versuch mit MPA keine reduzierte Expression (Markus Mezger, persönliche Mitteilung).
4.1.3 Zweitägiger Einfluss von Mycophenolat Bei diesem Versuch wurde MPA in der Konzentration 30 µM am fünften Tag, also zwei Tage vor der RNA-Extraktion, beigegeben. TNF-α
IL-12
1000,00
1000,00 relative Expression
10000,00
relative Expression
10000,00
100,00 10,00 1,00
100,00 10,00 1,00 0,10
0,10 I
II
III
IV
I
II
III
IV
III
IV
CXCL10
CCL20 1000000,00
1000,00 relative Expression
relative Expression
100000,00 10000,00 1000,00 100,00 10,00
100,00 10,00 1,00
1,00 0,10
0,10 I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.1: Zytokinexpression der DCs nach zweitägigem Einfluss von MPA (exemplarisch) In
allen vier Diagrammen zeigt sich, dass nach der Pilzstimulation die
Zytokinexpression stark ansteigt, im TNF-α-Diagramm zum Beispiel um den Faktor 1000. Bei Behandlung mit MPA zeigt sich keine nennenswerte Verringerung von TNFα. Auch IL-12, CCL20 und CXCL10 sind unter MPA nicht verringert.
35
4.1.4 Viertägiger Einfluss von Mycophenolat In diesem Versuch wurde einem Teil der Zellen vier Tage vor der sechsstündigen Pilzstimulation MPA in der Konzentration 30 µM beigefügt. Der bei der Auffrischung des Mediums verlorene MPA-Anteil wurde ersetzt.
TNF-α IL-12 1000,00
relative Expression
relative Expression
1000,00 100,00 10,00 1,00 0,10
100,00 10,00 1,00 0,10
I
II
III
IV
I
II
III
IV
III
IV
CCL20 CXCL10 10000,00 1000,00 100,00 100,00
relative Expression
relative Expression
1000,00
10,00 1,00 0,10 I
II
III
10,00 1,00 0,10 I
IV
II
Abb. 4.2: Diagramme der vier untersuchten Zytokine nach Pilzstimulation und Gabe von MPA (30 µM) vier Tage zuvor (exemplarisch) Die Expression von TNF-α und IL-12 zeigt sich nicht verringert. Gleiches wurde bei CCL20 und CXCL10 beobachtet. Mycophenolat scheint über den genannten Zeitraum von vier Tagen keinen negativen Einfluss auf die Zytokinsekretion der DCs zu nehmen.
4.1.5 Gabe von Mycophenolat über die gesamte Differenzierungsdauer Bei dieser Versuchsreihe wurde unmittelbar nach der Monozytenisolierung MPA in der Konzentration 30 µM auf die Zellen gegeben. Nach sieben Tagen wurden die Zellen, wie in den anderen Versuchen auch, über sechs Stunden mit A. fumigatusKeimschläuchen stimuliert und untersucht. Es zeigte sich, dass die hier verwendete Konzentration von MPA über diesen längeren Zeitraum zu toxisch ist und aufgrund der
36
vielen abgestorbenen Zellen, trotz mehrfacher Wiederholungen, keine für die Folgeuntersuchungen ausreichende RNA-Menge gewonnen werden konnte. Aus diesem Grund wurde in Anlehnung an eine Arbeit von Čolić et al. die MPA-Konzentration auf 10 µM gesenkt [82]. Diese Konzentration entspricht laut Dubsky et al. auch derjenigen MPA-Plasma-Konzentration bei Verabreichung von 2 g MMF pro Tag (bis 10 µM) [83].
Abb. 4.3: Vergleich der DC-Population mit (rechts) und ohne (links) MPA
Die Abb. 4.3 zeigt den Einfluss von MPA (hier mit 10 µM) auf DCs. Im linken Bild ist die DC-Population mit einem Kreis markiert. Die Zellen wurden nicht mit MPA behandelt. Die zweite Subpopulation links unten im selben Bild besteht aus abgestorbenen Zellen. Das rechte Bild zeigt die mit MPA behandelten Zellen. Man sieht deutlich die stark vermehrte Subpopulation an toten Zellen im linken unteren Teil des Bildes.
Die oben beschriebenen Versuche mit siebentägiger MPA-Exposition wurden nun mit der Konzentration (10 µM) wiederholt. Hier verliefen die Versuche zufriedenstellend und ermöglichten eine Analyse der Ergebnisse.
Die Diagramme in Abb. 4.4 demonstrieren exemplarisch das Ergebnis eines Versuches. In Abb. 4.5 sind die durchschnittlichen Werte (in Prozent) und Standardabweichungen der drei Versuche angegeben.
37
TNF-a
IL-12 1000,00 relative Expression
relative Expression
1000,00 100,00 10,00 1,00
100,00 10,00 1,00 0,10
0,10
0,01 I
II
III
IV
I
II
IV
III
IV
CXCL10
CCL20 10000,00
1000,00
1000,00
relative Expression
relative Expression
III
100,00 10,00 1,00
100,00 10,00
0,10
1,00 0,10
I
II
III
IV
I
II
Abb. 4.4: Die untersuchten Zytokine nach siebentägigem MPA-Einfluss (exemplarisch)
TNF-α zeigte im Durchschnitt eine Reduktion von 52% ± 21% im Vergleich der MPAbehandelten Zellen mit den unbehandelten Zellen. Die IL-12-Expression unter MPA nach Pilzstimulation sank um 94% ± 2%. Nicht ganz so ausgeprägt zeigte sich die Reduktion von CCL20. Sie betrug 63% ± 25 %. Die CXCL10-Sekretion von Zellen unter MPA nach Pilzstimulation verringerte sich durchschnittlich um 92% ± 10% im Vergleich zu den stimulierten Zellen ohne MPA.
0,00 I
II
III
IV
-20,00
-40,00
-60,00
-80,00
-100,00
-120,00
Abb. 4.5: Durchschnittliche Reduktion der Zytokine TNF-α (I), IL-12 (II), CCL20 (III), CXCL10 (IV)
38
4.2 Einfluss von Mycophenolat auf die Entwicklung von DCs
4.2.1 FACS-Analyse unreifer DCs In diesem Versuch sollte überprüft werden, ob die mit GM-CSF und IL-4 stimulierten Monozyten nach sieben Tagen in iDCs differenziert waren. Hierzu wurde der Hälfte der zu untersuchenden Zellen ab dem ersten Tag MPA in der Konzentration 30 µM beigefügt. Beim Wechsel des Mediums wurde auch der Verlust an MPA ausgeglichen. Am siebten Tag wurden die Zellen für das FACS vorbereitet und das Gate (nur Zellen im Gate werden untersucht) auf die vermutete DC-Population gelegt.
Abb. 4.6: Gaten einer DC-Population bei einer Isotypenkontrolle
Die Zellen exprimierten den für iDCs spezifischen Oberflächenmarker CD1a, außerdem CD40 sowie die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Der für Monozyten charakteristische CD14-Marker fehlte. Dies zeigte zunächst, dass es sich bei den Zellen um DCs handelte. Da darüber hinaus auch der Reifemarker CD83 nicht vorhanden war, handelte es sich um iDCs. Die unter dem Einfluss von MPA generierten Zellen zeigten im Vergleich zu den unbehandelten Zellen eine Besonderheit: Die Oberflächenmarker vom Typ CD1a, CD40 und CD80 waren zwar vorhanden, in ihrer Expression aber vermindert.
39
CD83
CD1a
CD14
CD80
CD40
CD86
Abb. 4.7: Oberflächenmarkerexpression mit (rosa) und ohne (grün) MPA nach sieben Tagen
40
4.2.2 FACS-Analyse gereifter DCs In einer weiteren Versuchsreihe sollte herausgefunden werden, wie sich die Oberflächenmarkerexpression von mDCs unter MPA ändert. Die zu diesem Zweck gewonnenen Monozyten reiften in zwei 6-Well-Platten über sieben Tage zu iDCs. Einer Platte wurde ab dem ersten Tag MPA in der Konzentration 10 µM zugefügt. Am fünften Versuchstag wurden einem Drittel der Zellen bakterielles LPS, einem zweiten Drittel mit Ethanol inaktivierte A. fumigatus-Keimschläuche hinzugefügt. Das letzte Drittel diente als Kontrolle. Die FACS-Analyse erfolgte nach dem o. g. Schema am siebten Tag. Ziel dieses Versuches war es, herauszufinden, wie sich die verschiedenen Oberflächenmarker unter MPA nach Stimulation mit A. fumigatus-Keimschläuchen verändern. Um nachzuweisen, dass die Zellen adäquat auf Stimuli reagieren, diente LPS als Positivkontrolle.
Im Gegensatz zur Untersuchung von iDCs konnte eine Hochregulierung von CD83 beobachtet werden, was dafür spricht, dass sich die DCs nach Antigenkontakt zu mDCs entwickeln. In den mit drei Spendern durchgeführten Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass es bei allen untersuchten Oberflächenmarkern zu signifikanten Reduktionen unter MPA kam. CD1a war um 68,8% ± 12% reduziert, CD40 verringerte sich um 39,3% ± 5,8%. Auch CD80 (46,7% ± 1,3 %), CD83 (21,1% ± 6,3%) sowie CD86 (43,8% ± 2,5 %) waren weniger exprimiert. 90 80 Reduktion in %
70 60 50 40 30 20 10 0 CD1a
CD40
CD80
CD83
CD86
Abb. 4.8: Reduktion der einzelnen Oberflächenmarker unter MPA nach Stimulation mit A. fumigatus-Keimschläuchen im Vergleich zu der Kontrolle ohne MPA
41
4.2.3 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen Monozyten wurden auf drei verschiedene Ansätze verteilt:
1.
ohne Zusatz von MPA
2.
mit 10 µM MPA
3.
mit 1 µM MPA
Nach Reifung über sieben Tage wurden die Zellen in drei weitere Gruppen unterteilt: eine Negativkontrolle bei 37 °C, einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 37 °C sowie als weitere Kontrolle einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 4 °C, da Zellen bei dieser Temperatur nicht phagozytieren. Dieser Versuch diente dazu nachzuweisen, ob MPA die Phagozytose von iDCs hemmt.
Abb. 4.9: FITC-Dextran FACS-Analyse, unbehandelte Zellen (grün), MPA 10 µM (blau), MPA 1 µM (orange) und Negativkontrolle (rosa) In Abb. 4.9 sind exemplarisch die FACS-Ergebnisse eines Versuchs dargestellt. Man erkennt eine Reduktion der Phagozytose unter 10 µM MPA und eine etwa gleichbleibende Aktivität unter 1 µM MPA.
Wie in Abb. 4.10 zu sehen ist – die Abbildung entstand durch Mittelung der Versuchsergebnisse –, zeigten die mit 10 µM MPA behandelten Zellen eine um 45% (± 19%) niedrigere Phagozytoseaktivität, also eine deutliche Reduktion. Im Gegensatz dazu konnte bei Zellen unter 1 µM MPA nur eine leichte mittlere Reduktion bei relativ großer Standardabweichung beobachtet werden.
42
0,0 I
II
-10,0
mittlere Reduktion
-20,0 -30,0 -40,0 -50,0 -60,0 -70,0
Abb. 4.10: FITC-Dextran-Versuch, mittlere Reduktion der Phagozytoseaktivität bei 10 µM MPA (I) und 1 µM MPA (II)
4.3 Lichtmikroskopische Aufnahmen Nach ihrer Entwicklung aus Monozyten wurden iDCs mit Hilfe des Lichtmikroskops untersucht. In Abb. 4.11 erkennt man in der linken Aufnahme zwei homogene Zellen und ihre baumähnlichen Ausläufer. Die Differenzierung der Zelle in der rechten Aufnahme erfolgte unter dem Einfluss von MPA. Man erkennt die inhomogene Struktur.
Abb. 4.11: iDCs im Lichtmikroskop
4.4 Einfluss
von
RAD
auf
die
Zytokinexpression
dendritischer Zellen Monozyten wurden mittels GM-CSF und IL-4 über sieben Tage zur Differenzierung in DCs angeregt. Im Anschluss daran folgte eine sechsstündige Stimulierung der Zellen
43
mit A. fumigatus-Keimschläuchen. RAD (1 µM) wurde analog zu den MPA-Versuchen zu den schon genannten Zeitpunkten hinzugefügt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, wurde den unbehandelten Zellen in gleicher Verdünnung Ethanol zugegeben. So sollten eventuelle Einflüsse des Ethanols auf die Ergebnisse ausgeschlossen werden.
Legende für die Diagramme im Abschnitt 4.4: I=
unstimulierte Zellen
II =
unstimulierte Zellen + RAD (1 µM)
III =
stimulierte Zellen
IV =
stimulierte Zellen + RAD (1 µM)
4.4.1 Sechsstündiger Einfluss durch RAD Bei diesem Versuch wurde RAD gleichzeitig mit der Pilzstimulation hinzugegeben. Wie in Abb. 4.12 zu sehen ist, zeigte die Sekretion von TNF-α keine nennenswerte Reduktion. Auch für IL-12, CCL20 und CXCL10 konnte keine Veränderung festgestellt werden. TNF-α
IL-12 100,00 relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
10,00
1,00
0,10
0,10 I
II
III
I
IV
CCL20
III
IV
III
IV
CXCL10
1000,00
100,00 relative Expression
relative Expression
II
100,00 10,00 1,00
10,00
1,00
0,10
0,10 I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.12: Zytokinexpression der Zellen nach sechsstündiger Stimulation und gleichzeitiger RAD-Gabe
44
4.4.2 Zweitägiger Einfluss durch RAD Bei diesem Versuch wurde DCs zwei Tage vor Ablauf der Differenzierungszeit RAD (1 µM) bzw. Ethanol beigefügt. Im Anschluss an die Stimulation und die RNAExtraktion erfolgte die Untersuchung der Zytokinexpression. Bei den untersuchten Zytokinen TNF-α, IL-12, CCL20 und CXCL10 konnten keine Unterschiede zwischen unbehandelten und mit RAD behandelten Zellen beobachtet werden. Dies galt sowohl für unstimulierte als auch für stimulierte Zellen (s. Abb. 4.13). TNF-α
Il-12 10000,00 relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
0,10
1000,00 100,00 10,00 1,00 0,10
I
II
III
IV
I
CCL20
III
IV
CXCL10
10000,00
100,00 relative Expression
1000,00 relative Expression
II
100,00 10,00 1,00
10,00
1,00
0,10
0,10 I
II
III
I
IV
II
III
IV
Abb. 4.13: Zytokinexpression nach sechsstündiger Pilzstimulation, RAD-Gabe zwei Tage zuvor
4.4.3 Viertägiger Einfluss durch RAD In diesem Experiment wurde der Hälfte der Zellen vier Tage vor der anschließenden Stimulation RAD in der Konzentration 1 µM, der anderen Hälfte Ethanol beigefügt. Wie im Methodenteil beschrieben, erfolgte beim Wechsel des Mediums (nach zwei und vier Tagen sowie vor der Pilzstimulation) ein anteiliger Ersatz an Wachstumsfaktoren sowie RAD bzw. Ethanol. Auch hier konnte für die vier untersuchten Zytokine TNF-α, IL-12, CCL20 und CXCL10 keine nennenswerte Änderung ihrer Expression erkannt werden.
45
TNF-α
IL-12 1000,00 relative Expression
relative Expression
100,00
10,00
1,00
0,10
100,00 10,00 1,00 0,10
I
II
III
IV
I
III
IV
III
IV
CXCL10
CCL20 100,00 relative Expression
1000,00 relative Expression
II
100,00 10,00 1,00 0,10
10,00
1,00
0,10 I
II
III
I
IV
II
Abb. 4.14: Expression der vier untersuchten Zytokine nach sechsstündiger Pilzstimulation und RAD-Gabe (1 µM) vier Tage zuvor
4.4.4 Gabe von RAD über die gesamte Differenzierungsdauer Die verwendeten Monozyten wurden wie bei den anderen Versuchen auch über sieben Tage mit GM-CSF und IL-4 zu DCs gereift. Hier wurde ab dem ersten Tag der Hälfte der Zellen RAD in der Konzentration 1 µM hinzugefügt und bei jedem Mediumwechsel anteilig ersetzt. Da RAD in Ethanol gelöst ist, musste den Zellen ohne RAD Ethanol in der gleichen Verdünnung hinzugefügt werden, um einen Einfluss von Ethanol auf das Messergebnis auszuschließen. Nach sieben Tagen Reifung wurden die iDCs über sechs Stunden mit A. fumigatus-Keimschläuchen stimuliert. Wie schon bei den Versuchen mit MPA zeigte sich auch bei den RAD-Versuchen über sieben Tage, dass die verwendete Konzentration über einen solchen Zeitraum zu toxisch für die Zellen ist. Nach sieben Tagen war der Anteil an untergegangenen Zellen so groß, dass trotz mehrfacher Wiederholung dieses Experiments keine adäquate Analyse der Zytokinexpression möglich war. Die sich anschließenden Experimente mit RAD wurden in der Forschungsgruppe weitergeführt. Hier zeigte sich bei Verwendung von 0,01 µM RAD eine Reduktion von TNF-α, IL-12 sowie CCL20 [84].
46
4.5 Einfluss von RAD auf die Entwicklung dendritischer Zellen
4.5.1 FACS-Analyse unreifer DCs Wie schon bei der MPA-Versuchsreihe sollten hier die Oberflächenmarker der Zellen untersucht werden; erstens, um festzustellen, ob es sich bei den untersuchten Zellen tatsächlich um DCs handelte, und zweitens, ob RAD einen Einfluss auf die Oberflächenmarkerstruktur der Zellen hat. Monozyten wurden über sieben Tage zu iDCs generiert. Der einen Hälfte der Zellen wurde über die gesamte Zeit RAD in der Konzentration 1 µM verabreicht und bei Mediumwechsel ersetzt. Der anderen Hälfte wurde in derselben Verdünnung Ethanol beigefügt. Nach sieben Tagen erfolgte die Untersuchung der Zellen am FACS auf ihre Oberflächenmarker. Alle Zellen exprimierten den für iDCs typischen Marker CD1a, außerdem CD40 und die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Der Monozytenmarker CD14 und der Marker für mDCs, CD83, wurden nicht exprimiert. Die mit RAD behandelten Zellen zeigten eine verminderte Expression von CD40. Außerdem waren CD80 und auch CD86, also beide kostimulatorischen Moleküle, verringert (Abb. 4.15). Weitergehende Forschungen der Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse auch für RAD mit der Konzentration 0,01 µM bestätigen [84].
47
CD1a
CD83
CD80
CD14
CD86
CD40
Abb. 4.15: FACS-Analyse der Oberflächenmarker nach sieben Tagen unter RAD 1 µM (rot) und ohne RAD (grün)
4.5.2 Phagozytose-Aktivität dendritischer Zellen unter RAD Monozyten wurden auf drei verschiedene Ansätze verteilt: 1.
mit Ethanol
2.
mit 0,1 µM RAD
3.
mit 0,01 µM RAD
48
Ein vierter Ansatz ohne Zusätze diente als Kontrolle. Nach Reifung über sieben Tage wurden die Zellen auf drei weitere Ansätze verteilt: auf eine Negativkontrolle bei 37 °C, einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 37 °C sowie auf einen Ansatz mit FITC-Dextran bei 4 °C, da Zellen bei dieser Temperatur nicht phagozytieren.
Abb. 4.16: FACS-Analyse des FITC-Dextran-Assays: RAD 0,1 µM (blau), RAD 0,01µM (orange), unbehandelte Zellen (grün), Negativkontrolle (rosa) In Abb. 4.16 ist die Analyse eines Versuchs exemplarisch dargestellt. Man sieht, dass die unter RAD entwickelten Zellen (blau, orange) deutlich weniger Dextran phagozytieren als die unbehandelten Zellen (grün). 0,0 -10,0
I
II
mittlere Reduktion
-20,0 -30,0 -40,0 -50,0 -60,0 -70,0 -80,0
Abb. 4.17: Phagozytoseaktivität der DCs im FITC-Dextran-Assay mit 0,1 µM RAD (I) sowie 0,01 µM RAD (II) Das in Abb. 4.17 gezeigte Diagramm ergibt sich aus den Mittelwerten der drei FITCDextran-Versuche. Deutlich zeigt sich eine starke Verminderung der phagozytotischen Aktivität der Zellen sowohl unter 0,1 µM um 56,2% (± 10,1%) als auch unter 0,01 µM RAD um 64,2% (± 9,6%).
49
5
Diskussion
Das menschliche Immunsystem ist dem ubiquitär vorkommenden Schimmelpilz A. fumigatus ein Leben lang ausgesetzt. Jeden Tag atmet der Mensch mehrere hundert Konidien dieses opportunistischen Erregers ein [40]. Diese Exposition führt im Normalfall nicht zu einer Infektion, da das Immunsystem den Erreger eliminiert. Die Abwehr von inhalierten A. fumigatus–Sporen geschieht über verschiedene Wege. Von Seiten des angeborenen Immunsystems erfolgt als eine der ersten Abwehrmechanismen die Abtötung des Pilzes durch Alveolarmakrophagen, welche bis zu 90% der Konidien innerhalb weniger Stunden phagozytieren und somit deren Reifung zu Hyphen verhindern können [85, 86]. Die dennoch in die Blutbahn gelangten Hyphen werden unter anderem durch neutrophile Granulozyten phagozytiert und durch Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (oxidativer Burst) verdaut. Des Weiteren können Pilzantigene durch unreife DCs phagozytiert werden. DCs können sowohl Hyphen als auch Konidien phagozytieren, wobei Konidien eine längere Überlebensdauer in DCs aufweisen und zu einer unterschiedlichen Zytokinausschüttung führen als Hyphen [87]. Es konnte gezeigt werden, dass Dectin-1 ein wichtiger Rezeptor dendritischer Zellen für A. fumigatus ist und die Immunantwort der Zelle beeinflusst [27]. Der Antigenkontakt führt, wie bereits beschrieben, zur Reifung und Migration der DCs, welche in der Folge T-Lymphozyten, also Zellen des erworbenen Immunsystems, aktivieren. Hier helfen vor allem Th1-Zellen bei der Immunabwehr gegen den Pilz [88]. Anders ist dies bei immunsupprimierten Patienten. Für diese stellt die durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) eine lebensbedrohliche Situation dar. Die Tatsache, dass Pilzinfektionen in den letzten Jahren stark zugenommen haben, ist auf verbesserte medikamentöse Therapieoptionen sowie auf die längere Überlebenszeit der Patienten zurückzuführen. Zu den Risikofaktoren, die die Entstehung einer IA begünstigen, gehören unter anderem eine verlängerte oder schwere Neutropenie, der Einsatz von Glucokortikoiden und anderen Immunsuppressiva sowie eine lange Antibiotikatherapie. Auch die häufig nach Stammzelltransplantationen auftretende Graft-versus-Host-Disease (GvHD) führt vermehrt zu Pilzinfektionen. Es zeigt sich, dass meistens weniger die Krankheit an sich als deren Therapie zur IA führt [88]. Gerade deshalb ist es wichtig, das Risiko einer IA zu minimieren und ihr Auftreten
50
frühzeitig zu diagnostizieren, um eine Behandlung durchführen zu können. Neuere Forschungen zeigen auch, dass es genetische Polymorphismen zu geben scheint, die das Risiko, nach Stammzelltransplantation an einer IA zu erkranken, erhöhen [38, 89]. Patienten mit solchen Polymorphismen könnten in Zukunft von einer individualisierten Therapie profitieren.
Patienten nach Organtransplantation müssen lebenslang Immunsuppressiva einnehmen, beispielsweise Mycophenolat oder RAD, die beide die Funktion von T-Lymphozyten hemmen. Es lässt sich leicht nachvollziehen, dass durch die Beeinflussung des erworbenen Immunsystems die Abwehr von inhalierten A. fumigatus-Konidien beeinträchtigt wird und sich das Risiko, an einer IA zu erkranken, erhöht. Auf der Suche nach neuen Therapiemöglichkeiten sind in den letzten Jahren auch DCs in den Blickpunkt der Wissenschaft geraten [90-92]. DCs spielen im Immunsystem eine sehr wichtige Rolle, da sie Immunantworten induzieren können und ein Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Abwehr darstellen. Aktuelle Forschungen beschäftigen sich mit der Möglichkeit, iDCs mit Aspergillusantigenen zu beladen, um auf diese Weise einen Impfstoff gegen A. fumigatus zu entwickeln [93]. Schon seit längerem ist bekannt, dass immunsuppressive Substanzen auch auf DCs wirken und so unter anderem deren Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, beeinflussen können. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Glucokortikoide, wenn sie über den gesamten Reifungszeitraum gegeben wurden, die Differenzierung von Monozyten in DCs unterbinden [94]. Auch für MPA und RAD konnte, wie in den Abschnitten 5.1 und 5.2 noch beschrieben wird, ein Einfluss auf DCs nachgewiesen werden. Insofern war es das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welche Auswirkungen der Einsatz von MPA und RAD auf die Entwicklung und Reifung von DCs hat und inwieweit die Immunantwort dieser antigenpräsentierenden Zellen auf A. fumigatus beeinflusst wird.
51
5.1
Entwicklung dendritischer Zellen aus Monozyten und Infektion mit A. fumigatus-Keimschläuchen
Zur Gewinnung von Monozyten wurden Buffy Coats der Blutbank Frankfurt verwendet. Die Anzahl der gewonnenen Zellen variierte von Spender zu Spender. Die Zellen für den
FITC-Dextran-Assay
wurden
aus
„Zapfen“
(LRSC,
s.
3.3.1)
des
Universitätsklinikums Würzburg gewonnen. Diese neuere Art der Leukozytengewinnung liefert laut Dietz et al. eine höhere Anzahl an Monozyten, die dieselbe Qualität besitzen wie die aus Buffy Coats gewonnenen Zellen [95]. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente haben ebenfalls gezeigt, dass sowohl Buffy Coats als auch LRSC geeignete DCs liefern. Die Anzahl scheint bei den LRSC konstanter zu sein. Ein weiterer Vorteil sind die schnelle Verfügbarkeit und der kurze Zeitraum zwischen Blutentnahme und Verwendung im Labor. Zur Reifung wurden den Monozyten über einen Zeitraum von sieben Tagen die Zytokine IL-4 und GM-CSF hinzugefügt. Diese Methode der Gewinnung humaner DCs ist seit längerem beschrieben und wird häufig angewandt [24]. Das Medium wurde nach zwei und vier Tagen gewechselt und die Zytokinkonzentration hierbei erhöht. Um nachzuweisen, dass es sich nach der Reifung der Monozyten auch tatsächlich um DCs handelte, wurde ein Teil der Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Hierbei wurde geprüft, ob die Zellen die für DCs typischen Marker, wie zum Beispiel CD1a für iDCs bzw. CD83 für mDCs, besitzen. Ein sehr wichtiges Kriterium war, dass die untersuchten Zellen CD14-negativ waren, da dieses Oberflächenmolekül auf Monozyten, nicht aber auf DCs vorkommt. Diese Voraussetzungen konnten bei den untersuchten Zellen stets nachgewiesen werden. Die Infektion der DCs erfolgte mit A. fumigatus über sechs Stunden vor der RNA-Isolation. Im Fall der FACS-Analyse erfolgte die Infektion über 48 Stunden mit inaktivierten Pilzen. Diese Inaktivierung durch Ethanol war nötig, da eine Analyse der Experimente aufgrund des starken Pilzwachstums nach einem solchen Zeitraum nicht mehr möglich gewesen wäre. Offen bleibt, inwiefern Ethanol die Oberflächenstruktur der Pilze und somit die Stimulierbarkeit von DCs verändert.
Bei allen Versuchen konnte eine Reaktion der DCs auf A. fumigatus beobachtet werden. Diese zeigte sich bei den LightCycler-Experimenten in einer Erhöhung der
52
Zytokinexpression. Bei unbehandelten Zellen stieg beispielsweise die TNF-αAusschüttung
mindestens
um
den
Faktor
100.
Die
Einzelergebnisse
der
Expressionsanalysen waren teilweise sehr unterschiedlich. Dies lag zum einen an der Spendervariabilität, zum anderen an Schwankungen bei den LightCycler-Messungen. Letztere wurden minimiert, indem jede Probe eines Einzelversuches dreifach im LightCycler gemessen wurde und zwei dieser Ergebnisse gemittelt wurden. Absolute Werte entstanden durch Mittelung der Einzelversuche. Neben TNF-α wurde noch die Expression von IL-12, CCL20 und CXCL10 untersucht (zur Bedeutung der Zytokine in der Immunantwort der DCs gegen A. fumigatus s. Abschnitte 1.2.3, 1.2.4, 1.3.2). In den FACS-Analysen zeigte sich die Reaktion der DCs auf den Pilz an der Veränderung der Oberflächenstrukturen, beispielsweise durch eine Erhöhung des Reifemarkers CD83. Die Einzelergebnisse wiesen eine eindeutige Tendenz auf (s. 4.2.2).
5.2
Untersuchung des Einflusses von Mycophenolat auf DCs
Das immunsuppressive Medikament MPA wird vor allem nach Transplantationen eingesetzt. Seine Wirkung auf Lymphozyten ist seit langem bekannt: MPA hemmt die IMPDH, was zu einer Verminderung der de-novo-Purin-Synthese führt, auf welche vor allem Lymphozyten angewiesen sind [62]. In den letzten Jahren ist jedoch auch der Einfluss auf DCs in den Fokus der Forschung geraten [29, 96].
Zuerst wurde der zeitliche Einfluss auf die Zytokinexpression von DCs nach Pilzstimulation untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass MPA keinen Einfluss auf die Zytokinexpression der DCs hat, wenn es sechs Stunden oder zwei bzw. vier Tage vor der Stimulation hinzugefügt wird (s. 4.1.2, 4.1.3, 4.1.4). Zu diesen Zeitpunkten kann man davon ausgehen, dass sich ein Großteil der Monozyten schon zu iDCs ausdifferenziert hat. Nachdem erste Versuche mit 30 µM MPA durchgeführt worden waren, stellte sich diese Konzentration über sieben Tage als zu toxisch heraus, so dass in Anlehnung an Čolić et al. für diese Versuche die Konzentration 10 µM verwendet wurde. Trotzdem zeigte sich, dass viele unter MPA gereifte Zellen absterben (s. Abb. 4.3). Die Normalisierung der Ergebnisse mittels h-Alas bei der LightCycler-Analyse
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sowie das genaue Gaten der vitalen Zellpopulation bei der FACS-Analyse (s. Abb. 4.5) sollten dazu führen, dass nur lebende Zellen in die Analyse mit einbezogen wurden. Ein über die verschiedenen Ansätze stabiler h-Alas-Wert wurde als Beleg für eine gute Normalisierung angesehen (s. Abb. 3.4). Den Einfluss von MPA auf die gesamte Differenzierungszeit der DCs untersuchten Geng et al. bei Experimenten an mit LPS gereiften murinen DCs. Sie beschreiben eine Reduktion von TNF-α und IL-12 [97]. Einen ähnlichen Effekt für TNF-α und IL-12 beschreiben Čolić et al. für humane moDCs [82]. Auch hier wurde zum Reifen der DCs bakterielles LPS benutzt. Sie berichten des Weiteren, dass MPA in den untersuchten DCs den programmierten Zelltod, die sogenannte Apoptose, induziert [82]. In der vorliegenden Arbeit konnte nun nachgewiesen werden, dass bei humanen, unter MPAEinfluss entwickelten moDCs nach Reifung durch Stimulation mit A. fumigatusKeimschläuchen sowohl TNF-α und IL-12 als auch CCL20 und CXCL10 vermindert sind (s. 4.1.5). Die Zytokinsekretion der Zelle ist hier offenbar gestört. In der Folge wurden Analysen der Zelloberfläche mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, um den genauen Einfluss von MPA auf die Differenzierung und Reifung besser verstehen zu können. Im Jahr 2000 wurde diesbezüglich eine Reduktion von CD40, CD80 und CD86 bei DCs von Mäusen beschrieben [96]. Čolić et al., die mit inaktivierten und LPS-aktivierten humanen moDCs arbeiteten, wiesen bei iDCs eine Verminderung von CD40, CD54 und CD80, und bei mDCs eine Verminderung von CD80, CD83 und CD86 nach [82]. Wie aus Abschnitt 4.2.1 hervorgeht, konnten diese Ergebnisse sowie eine Verringerung von CD1a für iDCs bestätigt werden. Die mit A. fumigatus stimulierten mDCs wiesen hier jedoch eine Reduktion aller untersuchten CDMoleküle auf (s. 4.2.2). Hier sieht man, dass nicht nur die Zytokinantwort der Zellen, sondern auch der Reifungsprozess nach Antigenkontakt durch MPA beeinträchtigt ist. Weitere Untersuchungen zeigten, dass MPA-beeinflusste Zellen eine verringerte Fähigkeit besitzen, T-Zellen zu aktivieren [83]. Dies lässt sich durch die auch in dieser Arbeit beschriebene verminderte Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 erklären. Außerdem konnte ermittelt werden, dass MPA – wie bei Lymphozyten – auf das Enzym IMPDH der DCs wirkt und auch deren GTP-Haushalt
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beeinflusst. Diese Wirkung konnte interessanterweise auch nach Zugabe von MPA nach mehreren Tagen der Entwicklung beobachtet werden [83]. In weiteren Experimenten mittels des FITC-Dextran-Assays wurde nachgewiesen, dass unter MPA-Einfluss differenzierte iDCs eine deutlich reduzierte Phagozytosekapazität aufweisen (s. Abb. 4.9). Dies ist insofern interessant, als DCs ein Antigen erst durch Phagozytose aufnehmen müssen, um es dann im Anschluss den Lymphozyten zu präsentieren. Da dieser Versuch aufgrund der vorgeschriebenen, verschiedenen konstant zu haltenden Temperaturen der einzelnen Ansätze störanfällig war, wurden die Ergebnisse durch zwei Negativkontrollen (4 °C und 37 °C) abgesichert (s. 4.2.3). In einem weiteren Schritt müsste untersucht werden, wie die Phagozytose von A. fumigatus durch DCs unter immunsuppressiver Einwirkung beeinflusst wird.
Es wird hier also deutlich, dass die Differenzierung von moDCs unter dem Einfluss von MPA beeinträchtigt ist, was dazu führt, dass die entstandenen DCs die ihnen zugedachte Rolle im Immunsystem nicht wie gewünscht ausführen können. Es konnte gezeigt werden, dass diese Wirkung zu einer veränderten Reaktion der DCs in ihrer Immunantwort auf A. fumigatus führt. Die Erkenntnis, dass MPA die Entwicklung von DCs beeinflusst, ist insofern von klinischer Relevanz, als im menschlichen Körper täglich neue DCs gebildet werden. In dieser Arbeit wurden ausschließlich moDCs untersucht, also nur einer von mehreren DC-Subtypen.
Die Verwendung von MPA scheint das Risiko, an einer IA zu erkranken, also nicht nur durch Hemmung der Lymphozyten, sondern auch durch Hemmung der Reifung von DCs zu erhöhen. Aber auch andere Zellen werden durch MPA beeinflusst. Hochegger et al. berichten über ein entzündliches Syndrom mit Fieber und Oligoarthritis, welches vermutlich durch die Wirkung von MPA auf Granulozyten ausgelöst wird und nach Absetzen des Medikaments abklingt [67]. In Übereinstimmung mit o.g. Arbeit zeigten die in der eigenen Forschungsgruppe durchgeführten Experimente, dass MPA die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, den sogenannten oxidative burst, aus Granulozyten erhöht [98]. Interessanterweise beeinflusste dies die Abtötungseffizienz gegenüber Keimschläuchen nicht.
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Hier bedarf es also weiterer Forschung, um die komplexe Wirkung von Mycophenolat auf den Organismus besser verstehen zu können.
5.3
Untersuchung des Einflusses von RAD auf DCs
Das immunsuppressive Medikament Everolimus (RAD) ist eine Weiterentwicklung von Rapamycin (RAPA) [99]. Beide werden unter anderem nach Transplantationen verwendet, um das Abstoßen des Spenderorgans zu verhindern.
Wie schon bei den Experimenten mit MPA wurde auch bei RAD ein stark zytotoxischer Effekt beobachtet. Dieser war noch ausgeprägter als bei MPA und bei den Experimenten über sieben Tage so hoch, dass auch hier eine Reduktion der RADKonzentration angebracht war. Nach eigenen Versuchen mit 1 µM RAD wurden die Versuche mit 0,01 µM fortgeführt. Wie in Abschnitt 5.2 beschrieben, wurde auch hier versucht, den Einfluss abgestorbener Zellen durch Normalisierung der DC-Population mit h-Alas und Gaten der DC-Population im FACS zu minimieren. Ähnliche, mit dieser Arbeit vergleichbare Versuche wurden bis heute fast ausschließlich an RAPA durchgeführt. Woltman et al. beschreiben, dass RAPA in moDCs die Apoptose auslöst. Diese Wirkung bestehe aber nicht bei Monozyten [100]. In einer weiteren Arbeit zeigen sie, dass DCs durch GM-CSF vor der Apoptose geschützt werden. Diese Interaktion erfolgt über den mTOR-Pathway, der durch RAPA blockiert wird. So wird die erhöhte Apoptoserate von DCs unter Rapamycintherapie erklärt [101]. Wurde RAD in der Konzentration 1 µM sechs Stunden, zwei bzw. vier Tage vor der Pilzstimulation zugefügt, konnte trotz der hohen Zytotoxizität keine Reduktion der Zytokinexpression der DCs beobachtet werden (s. 4.4.1, 4.4.2, 4.4.3). Hier scheinen also RAD wie auch MPA keinen Einfluss auf sich entwickelnde DCs zu nehmen. Anders sieht dies bei den Versuchen aus, in denen RAD über die gesamte Differenzierungszeit hinzugefügt wurde. In Versuchen an Ratten konnte nachgewiesen werden, dass RAPA bei aus Knochenmark stammenden DCs eine Verminderung der IL18- und IL-12-Sekretion nach Stimulation mit LPS auslöst [102, 103]. Die im Anschluss an die vorliegende Arbeit in der Forschungsgruppe durchgeführten Experimente mit Gabe von RAD in der Konzentration 0,01 µM über sieben Tage zeigen, dass die
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Zytokinexpression der humanen mDCs im Falle von TNF-α, IL-12 und CCL20 nach Stimulation mit A. fumigatus vermindert ist [84]. Des Weiteren konnte auch beobachtet werden, dass die Entwicklung von iDCs aus Monozyten durch RAD (hier 1 µM) beeinträchtigt wird. Die DCs exprimierten nicht nur weniger
CD40;
auch
CD80
und
CD86,
also
beide
kostimulatorischen
Oberflächenmoleküle, waren verringert (s. Abb. 4.1.4). In nachfolgenden, durch die Forschungsgruppe durchgeführten Experimenten wurden nach Reifung durch Pilzstimulation die Oberflächenmarker der mDCs ‒ analog zu den MPA-Versuchen – analysiert. Diese Experimente zeigten bei 0,01 µM RAD eine verringerte Expression von CD 40 und CD83 [84]. Ähnliche Forschungen bezüglich der Differenzierung und Oberflächenmarkerstruktur von DCs wurden von Monti et al. und Fedoric et al. mit RAPA durchgeführt. Sie beschreiben bei unter RAPA differenzierten moDCs eine verringerte Expression derselben Oberflächenmoleküle und zeigen, dass RAPA-DCs in geringerem Maße TZellen aktivieren können als unbehandelte Zellen [104, 105]. Da die kostimulatorischen Moleküle eine sehr wichtige Rolle in der Interaktion mit der T-Zelle spielen, kann man schließen, dass auch für die unter RAD entwickelten DCs die Aktivierung von T-Zellen zumindest erschwert wird. Diese Annahme müsste durch weitergehende DC-Funktionstests speziell für RAD untersucht werden. Wie in dieser Arbeit gezeigt, führt RAD bei iDCs in den Konzentrationen 0,1 µM und 0,01 µM zu einer starken Einschränkung der Phagozytose (s. 4.1.6). Auch hier sollte mittels weiterer Experimente erforscht werden, wie sich die Aufnahmefähigkeit von A. fumigatus-Konidien verändert, da die Aufnahme von Antigenen Grundvoraussetzung ist, um diese den Lymphozyten zu präsentieren.
Der Vergleich der beiden Medikamente MPA und RAD ergibt zum einen, dass beide eine zytotoxische Wirkung auf Monozyten und DCs ausüben. Dieser Effekt zeigte sich bei RAD deutlich ausgeprägter als bei MPA. Beide Medikamente beeinflussen zum anderen die Entwicklung von moDCs und deren Reifung nach Antigenkontakt. Dies spiegelt sich sowohl in einer Reduktion der Zytokinexpression der mDCs als auch in einer Veränderung der Oberflächenmarker von iDCs und mDCs wider. Die beschriebene verminderte Zytokinantwort konnte weder bei MPA noch bei RAD
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beobachtet werden, wenn die Zugabe der Medikamente auf bereits entwickelte DCs erfolgte. Diesbezüglich sollten weitere Experimente angestrebt werden.
5.4
Ausblick
Die Tatsache, dass die beiden immunsuppressiven Substanzen MPA und RAD auch auf DCs wirken, ist seit längerem bekannt. Die Hinwendung der Forschung in Richtung der DCs ist insofern berechtigt, als DCs und ihre Stellung im Immunsystem noch nicht ausreichend erforscht sind. Ahn et al. beschreiben, dass DCs anscheinend nicht nur TZellen aktivieren, sondern auch gezielt deren Immunantwort beeinflussen und regulieren können [106]. Ein weiterer Aspekt, der DCs in der Zukunft größere medizinische Bedeutung zukommen lassen könnte, ist die Möglichkeit, Zellen als Impfstoffe gegen Pilze, andere Erreger und sogar Tumoren einzusetzen [91, 107, 108]. Die praktische Anwendung vakzinierter DCs im klinischen Alltag als Mittel gegen Tumoren stellt sich jedoch, trotz vieler Studien, als schwierig heraus [109, 110]. Forschungen an Lymphozyten ergaben, dass es in vitro möglich ist, gegen A. fumigatus gerichtete T-Helferzellen zu produzieren [111]. Bezüglich der Therapie von Infektionen mit dem Zytomegalievirus (CMV), einem weiteren Erreger, der nach Transplantationen häufig Probleme bereitet, hat die Verwendung von T-Zellen als Heilmittel schon Einzug in den klinischen Alltag gehalten. In weiteren Forschungen wird an einer Verbesserung dieser Therapiemöglichkeit gearbeitet [112-114]. Zwei Reviews von Tacken et al. geben eine Übersicht über die Möglichkeiten und Probleme, DCs ein bestimmtes Antigen zu präsentieren [115, 116]. Das Verfahren, die T-Zell-Aktivierung durch DCs für therapeutische Zwecke zu beeinflussen, ist seit einigen Jahren bekannt und wird sicherlich in naher Zukunft zu neuen Behandlungsmöglichkeiten und Impfstrategien führen. Jedoch ist bis heute noch zu wenig über die Wirkung von immunsuppressiven Medikamenten auf DCs bekannt. Die in dieser Arbeit und anderen Veröffentlichungen verwendeten Medikamente MPA und RAD führen bei DCs zu einer Beeinträchtigung ihrer Immunantwort nach Kontakt mit A. fumigatus. Hier stellt sich deshalb die Frage, ob DCs als Vakzine gegen Pilzantigene bei immunsupprimierten Patienten ihre ihnen zugedachte Wirkung ausüben können.
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Um weitere Erkenntnisse über die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs zu gewinnen, bedarf es jedoch auch eines weitergehenden Verständnisses der anderen Komponenten. Vieles deutet darauf hin, dass MPA und RAD weit mehr auf den menschlichen Körper wirken, als bisher bekannt. Lagaraine et al. berichten zum Beispiel, dass DCs, denen während der Reifung von iDCs zu mDCs MPA zugesetzt wurde, einen regulatorischen Phänotyp entwickeln und unter Umständen eine Toleranz gegenüber einem Spenderorgan induzieren können [117]. Devyatko et al. sprechen sogar
davon,
dass
MPA
mehr
einen
immunmodulatorischen
denn
einen
immunsuppressiven Effekt hat [118]. Ähnliches gilt für RAPA und unter Umständen auch für RAD. Sordi et al. berichten, dass der Einfluss von RAPA zu einer Erhöhung von CCR7 auf DCs führt und diese daraufhin in Lymphknoten migrieren [119]. Hackstein spricht darüber hinaus auch von einer immunmodulatorischen Wirkung durch RAPA [120]. Die eingeschränkte Funktion von DCs, welche im Falle der IA unerwünscht ist, könnte man sich jedoch auch zunutze machen, da in Nagetierversuchen beschrieben wurde, dass zuvor mit RAPA behandelte DCs zu erhöhter Toleranz gegenüber Transplantaten führen können [121-123]. Aber auch andere Medikamente wie Glucokortikoide, Aspirin oder, wie kürzlich beschrieben, Pentoxiphyllin scheinen auf DCs zu wirken [29, 124]. Selbstverständlich bedarf es auch eines besseren Verständnisses der Entwicklung und Funktion von DCs. So scheint beispielsweise die Expression von CD1 und seinen Subtypen durch Serumlipide beeinflusst zu werden [125]. Auch hier könnte ein Zusammenhang zwischen Immunität und Lipidspiegel – welcher ja auch medikamentös reguliert werden kann – bestehen [126]. Diese hier genannten Beispiele zeigen, dass es durchaus lohnenswert erscheint, weitere Anstrengungen für ein besseres Verständnis von DCs zu unternehmen, um ihre Anwendung als Heilmittel verbessern zu können.
59
6
Zusammenfassung
In den letzten Jahren ist die Zahl immunsupprimierter Patienten aufgrund des stetigen Fortschritts in der Medizin stark angestiegen. Die bei diesen Patienten wegen ihrer hohen Mortalität gefürchtete, durch A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose (IA) hat trotz der Anwendung verbesserter Antimykotika zugenommen. Die beiden Medikamente
Mycophenolat
(MPA)
und
Everolimus
(RAD)
werden
zur
Immunsuppression verwendet. Sie wirken durch die Inhibition von B- und T-Zellen. Allerdings wurde auch der direkte Einfluss auf DCs beschrieben. Diese Entdeckung ist insofern von Relevanz, als DCs eine wichtige regulatorische Rolle bei der Abwehr von Erregern, so auch von Pilzen, spielen und als Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem fungieren. DCs sind außerdem in den vergangenen Jahren in den Fokus der Wissenschaft geraten, da sie möglicherweise als Impfstoffe gegen verschiedenste Krankheiten, darunter auch die IA, eingesetzt werden können. Da die IA vor allem Patienten mit geschwächtem Immunsystem trifft, ist es von Bedeutung, die Wirkung von Immunsuppressiva auf DCs besser zu verstehen.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von MPA und RAD auf die Entwicklung, die Reifung und die Immunantwort von aus Monozyten differenzierten DCs (moDCs) nach Kontakt mit A. fumigatus untersucht. Hierzu wurden die Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten der DC-Entwicklung hinzugefügt. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem der Entwicklungsprozess der DCs beeinträchtigt wird. Neben einer verminderten Zytokinexpression von DCs nach Kontakt mit A. fumigatus wurde auch eine Veränderung der Oberflächenmarkerstruktur sowohl bei unreifen DCs (iDC) als auch bei reifen DCs (mDC) festgestellt. Des Weiteren wurde die Fähigkeit von DCs zur Phagozytose durch die Medikamente vermindert. Beide Substanzen, vor allem aber RAD, zeigten zudem eine starke Zytotoxizität gegenüber den Zellen.
Es konnte in dieser Arbeit deutlich gemacht werden, dass sowohl MPA als auch RAD die Entwicklung und Reifung von moDCs beeinflussen, was zu einer Beeinträchtigung ihrer Immunantwort gegen A. fumigatus führt.
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Summary Over the past years, there has been an increasing amount of immunosuppressed patients due to substantial progress in medical research. Despite the development of more effective antifungal agents, those patients often suffer from invasive aspergillosis (IA) caused by the mold Aspergillus fumigatus. Mycophenolic acid (MPA) and Everolimus (RAD) are both immunosuppressive agents. They act through the inhibition of B- and T-cells. However, the direct influence on DCs has also been described which is important as DCs play an important role in pathogen defence and by linking innate and acquired immunity. In addition DCs have moved to the focus of science as they could also be used as vaccines against different diseases including IA. As IA mostly occurs in immunosuppressed
patients,
more
comprehension
about
the
impact
of
immunosuppressive agents on the functionality of DCs is needed.
Here, the impact of MPA and RAD on the differentiation, maturation and immunresponse of human monocyte derived DCs (moDC) during interaction with A. fumigatus was investigated. MPA and RAD were added during different times of DC development. Both medicaments showed an influence on DC differentiation. Beside a reduced expression of cytokines after interaction with A. fumigatus, a decreased expression of surface markers was shown for immature DCs (iDC) and mature DCs (mDC). Furthermore, the phagocytotic capacity of iDCs was reduced. In addition, MPA and even more RAD showed high cytotoxic effects on DCs.
In conclusion, a direct impact of MPA and RAD on the differentiation and maturation of moDCs and their immune response to A. fumigatus could be shown.
61
7
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8
Abkürzungen
APC
antigenpräsentierende Zelle
bp
base pairs (Basenpaare)
CD
cluster of differentiation
cDNA
copy DNA
Cp
Crossing Points
DC
dendritische Zelle
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
Fa.
Firma
FACS
fluorescence activated cell sorting (Durchflusszytometrie)
FCS
fetal calf serum (fetales Kälberserum)
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FRET
fluorescence resonance energy transfer
GM-CSF
granulocyte macrophage colony stimulating factor
GTP
Guanosintriphosphat
GvHD
Graft-versus-Host-Disease (Transplantat-Wirt-Reaktion)
HBSS
Hanks' Balanced Salt Solution
IA
invasive Aspergillose
iDC
immature DC (unreife dendritische Zelle)
IL
Interleukin
IMPDH
Inosinmonophosphat-Dehydrogenase
kD
Kilodalton
l
Liter
LC
LightCycler
LPS
Lipopolysaccharid
M
Molar
MACS
magnetic cell sorting (magnetische Trennsäule)
mDC
mature DC (reife DC)
MgCl
Magnesiumchlorid
MHC
major histocompatibility complex
min
Minute
69
ml
Milliliter
mm
Millimeter
MMF
Mycophenolat-Mofetil
moDC
monocyte derived DC (aus Monozyten gereifte DC)
MPA
Mycophenolsäure
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
mRNA
messenger (=Boten-) Ribonukleinsäure
PAMP
pathogen associated molecular pattern
PBMC
peripheral blood mononuclear cell
PCR
polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PE
Phycoerythrin
PRR
pattern recognition receptor
qRT-PCR
quantitative Real-Time-PCR
RAD
40-0-[2-Hydroxy-ethyl] rapamycin
RAPA
Rapamycin
RNA
Ribonukleinsäure
rpm
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
RPMI
Roswell Park Memorial Institute Medium
RT
Reverse Transkriptase
sec
Sekunde
TLR
Toll-Like-Rezeptor
TNF
Tumornekrosefaktor
VEGF
vascular endothelian growth factor
ZNS
Zentrales Nervensystem
70
