Ciencias Agronómicas Artículo Original / Recibido 24/09/2010 - Aceptado 03/05/2011

R E V I S TA D E I N V E S T I G A C I O N E S D E L A FA C U LTA D D E C I E N C I A S A G RA R I A S - U N R

Efecto del hidroximetil furfural sobre el crecimiento de hongos en pan de molde Effect of hydroxymethylfurfural on fungi growth in sliced bread 1

1

RUIZ GARCÍA, M. ; RAMÍREZ DE LARA, M.C. ; ANTOLÍN GIRALDO, G.

1,2

1 CARTIF Centro Tecnológico, División Químico-Alimentaria. Parque Tecnológico de Boecillo, Parcela 205. 47151 Valladolid. (España) 2 Universidad de Valladolid, Departamento Ingeniería Química y Medioambiental E.T.S.I.I. de Valladolid, (España) [email protected]

Resumen

Abstract

A partir de ensayos previos de fermentación en estado sólido de cortezas de pan de molde para enriquecimiento proteico realizados con cuatro cepas de hongos filamentosos, se observó cómo su crecimiento se veía inhibido en mayor o menor medida. Para comprobar si el hidroximetilfurfural (HMF) era el causante de esta inhibición, se determinó la concentración a la que estaba presente en las muestras (miga y corteza de pan de molde). La extracción del HMF se realizó utilizando dos procedimientos de extracción, y se puso a punto un método cromatográfico de análisis (HPLC-UV) para la cuantificación del HMF en los extractos. Por último, los hongos se sembraron sobre placas de PDA sin HMF y con HMF a dos concentraciones diferentes, así como placas de PDA con discos de papel de filtro empapados en tres concentraciones diferentes de HMF. Los resultados mostraron que las concentraciones de HMF ensayadas no resultaron inhibitorias sobre el crecimiento de los hongos.

From previous solid state fermentation (SSF) tests for protein enrichment of sliced bread crusts, carried out with four strains of filamentous fungi, it was observed that fungal growth was inhibited to a certain extent in all of them. In order to verify if hydroxymethylfurfural (HMF) was relevant in this inhibitory effect, a procedure to extract the HMF from the samples (crumb and crust) was carried out following two different protocols, along with a the fine-tuned chromatographic method (HPLCUV) to quantify HMF in the extracts. Finally, the fungi studied were cultivated on PDA plates added with HMF at two different concentrations, and on PDA plates with paper discs soaked in three different concentrations of HMF. The results showed that the tested concentrations of HMF were not inhibitory of fungal growth. Keywords: hydroxymethylfurfural, sliced bread, , filamento us fungi

Palabras clave: hidroximetilfurfural, pan de molde, hongos filamentosos

Introducción La fabricación del pan implica tres etapas: mezclado de la masa (harina, agua, levadura, y sal), la fermentación de la masa, y el horneado. Durante el proceso de horneado, el almidón se gelatiniza y las proteínas se desnaturalizan a una temperatura interna de 60-80ºC y entonces la masa cruda se transforma en un producto ligero, poroso, y digestible. Las reacciones químicas implicadas en este proceso son principalmente la reacción de Maillard y la caramelización. La reacción de Maillard se favorece en alimentos con alto contenido en proteína y carbohidratos y un contenido intermedio en humedad a temperaturas superiores a 50ºC y a un pH entre 4-7, produciendo cambios en el color (melanoidinas), sabor (aldehídos y cetonas), propiedades funcionales, y valor nutricional (bloqueo o destrucción de lisina). La caramelización (degradación de azúcares) necesita condiciones más drásticas (temperaturas superiores a 120ºC, pH 9, y baja Aw). La distribución del contenido de agua y la temperatura juegan un papel importante en el desarrollo de las características sensoriales de estos productos. Durante el horneado, el contenido de agua sobre la superficie del trozo llega a ser inferior que en el medio y esto, combinado con la alta temperatura, es uno de los factores que hace la corteza diferente de la miga. El hidroximetilfurfural, HMF o 5-(Hidroximetil)furfural es un aldehído y un furano, intermediario en la reacción de Maillard que también se forma por la degradación de azúcares a elevadas

temperaturas. Este indicador, utilizado para evaluar los efectos del calor inducidos durante el tostado del pan de molde (Ramírez-Jiménez et al, 2000), se ha identificado en una amplia variedad de alimentos procesados incluyendo leche, jugos de frutas, bebidas alcohólicas, miel, etc., se conoce como mutagénico y carcinogénico, y puede formarse durante las reacciones el pardeamiento no enzimáticas, en forma de reacciones de condensación entre los aminoácidos y los azúcares reductores. Por otra parte, se sabe que entre los inhibidores de algunos procesos de fermentación, se encuentran los compuestos furánicos y en concreto el furfural y el HMF, de los que se ha demostrado que reducen la velocidad específica de crecimiento de diversos microorganismos (Navarro, 1994), el rendimiento de masa celular sobre el ATP (Palmqvist et al., 1999) y el rendimiento volumétrico (Navarro, 1994). En estos casos, estos compuestos inhibidores de la fermentación posterior se generan durante tratamientos térmicos o hidrolíticos previos que son necesarios para que los microorganismos fermentativos puedan acceder a los azúcares. Entre los intentos para evitar el efecto negativo de los inhibidores presentes en los hidrolizados, los métodos mejor establecidos para la detoxificación del hidrolizado incluyen la adición de resinas de intercambio iónico (Horváth et al., 2004), la adición de carbón activo, la detoxificación enzimática utilizando lacasa (Jönsson et al., 1998) y la adición de cal. A pesar de sus beneficios, estos

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métodos tienen ciertas limitaciones como la producción de residuos o el aumento siginificativo de los costes de producción (Zaldivar et al., 1999). Por el contrario, la reducción por métodos microbiológicos genera menos residuos, y puede realizarse directamente en el reactor previamente al proceso de fermentación. Sin embargo, hasta la fecha se han estudiado pocos procesos de tratamiento biológico. Entre ellos, se ha descrito cómo el tratamiento con el hongo Trichoderma reesei degrada inhibidores en un hidrolizado de hemicelulasa consumiendo completamente durante la fermentación las concentraciones de HMF y furfural presentes en el hidrolizado (Palmqvist et al., 1997). Por otra parte, también se ha descrito cómo un hidrolizado de biomasa agrícola fue detoxificado en presencia del hongo Coniochaeta ligniaria NRRL 30616 (teleomorfo) o su estado Lecythophora (anamorfo), siendo después utilizado el sustrato en procesos de fermentación industrial, especialmente en tratamientos de sacarificación para la producción de bioetanol (Nichols et al., 2006); también en otros estudios se ha demostrado cómo este organismo es capaz de reducir de forma significativa los niveles tóxicos, especialmente el nivel de furanos y particularmente del 5-Hidroximetilfurfural (5-HMF) (M.J. López et al., 2004). Hasta el momento se han utilizado varios métodos para extraer y cuantificar el HMF en alimentos. En matrices simples, como miel o zumos de frutas, se ha propuesto un método colorimétrico basado en la reacción del HMF con ácido tiobarbitúrico (TBA), pero este método carece de especificidad ya que otros compuestos carbonilo presentes o formados durante el proceso pueden también reaccionar con el TBA, lo cual explica la

sobreextimación del HMF en algunos artículos. Así, en matrices más complejas como los productos de cereales, leche y frutas se utiliza normalmente una extracción con agua seguida de la clarificación por Carrez (I y II) o ácido tricloroacético, antes de la cuantificación por HPLC-UV (Ramírez-Jiménez et al., 2001). El uso de técnicas HPLC permite obtener resultados más precisos y además analizar varios compuestos en el mismo análisis. El presente trabajo se deriva de una investigación anterior cuyo objetivo era el enriquecimiento proteico de los residuos de corteza de pan de molde, mediante un proceso de fermentación en estado sólido llevado a cabo por varias cepas de hongos previamente seleccionadas. A partir de los resultados de este estudio, se observó que el crecimiento de los hongos sobre cortezas de pan de molde se veía inhibido en mayor o menor medida. Como consecuencia, se planteó la posibilidad de que existiera algún compuesto en el pan de molde que inhibiera total o parcialmente el crecimiento de los hongos en estudio, o resultara tóxico para ellos. Dado que entre los métodos de inhibición de crecimiento de hongos se incluyen la adición de compuestos como el 5-hidroximetilfuraldehído (HMF), y que la formación de este compuesto durante la etapa de horneado del pan de molde es un hecho constatado, las sospechas se centraron en él. El objetivo del estudio fue por tanto determinar la concentración de HMF en las diferentes muestras de pan para evaluar si la inhibición del crecimiento observada en las cepas de hongos en estudio se debía a la presencia de este compuesto.

Materiales y métodos Muestras Las muestras sometidas a estudio consistieron en miga y corteza de pan procedente de una planta de pan de molde de Grupo Siro (España). Las muestras se secaron y molieron en la planta de producción y se enviaron a Cartif para su tratamiento y análisis. Microorganismos Para comprobar el efecto de las concentraciones de HMF determinadas mediante el método propuesto se utilizaron cuatro cepas de hongos, dos de la especie Rhizopus oryzae (cepas 1 y 2), una cepa de la especie Rhizopus stolonifer (cepa 3) y una cepa de Aspergillus niger (cepa 4), todas ellas procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Determinación de la concentración de HMF en las muestras en estudio Para la determinación de las concentraciones de HMF presentes en las muestras, se siguió un protocolo de extracción utilizando dos procedimientos diferentes, y posteriormente, se puso a punto un método cromatográfico (HPLC-UV) para cuantificar el HMF en los extractos obtenidos. Se utilizaron reactivos químicos de grado analítico. La solución de clarificación consistió en Carrez I y Carrez II, y el patrón externo utilizado en el análisis cromatográfico fue 5(hidroximetil)furfural (99%, Aldrich). La determinación de la humedad en todas las muestras se obtuvo por análisis gravimétrico después del secado en estufa a 105 ºC durante 24 horas. a) Métodos de Extracción de HMF: Se llevaron a cabo por duplicado los dos procedimientos de extracción que se describen a continuación.

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Procedimiento A: Según García-Villanova et al. (1993) la muestra molida (0,4 g) se pesó en un tubo de centrífuga de 10 ml al que se añadieron 7 ml de agua desionizada. El tubo de centrífuga fue agitado fuertemente durante 1 minuto y la muestra se centrifugó durante 10 minutos a 5000 rpm. El mismo procedimiento se realizó dos veces más. Los sobrenadantes fueron clarificados con 0,5 ml de solución Carrez I y Carrez II. La mezcla resultante se centrifugó durante 10 minutos a 5000 rpm. La solución se diluyó a un volumen total de 25 ml con agua desionizada. Se filtró una alícuota de 2 ml de esta solución a través de un filtro de disco de 0,2 micras antes de la inyección. Procedimiento B: Siguiendo el método descrito por Ait Ameur et al. (2006), la muestra molida (1 g) se pesó en un matraz de 25 ml y se suspendió en 10 ml de agua desionizada y clarificada con 0,5 ml de solución Carrez I y 0,5 ml de solución Carrez II. La mezcla se agitó fuertemente durante más de 5 minutos. El volumen de la suspensión se ajustó a 25 ml con agua desionizada y se centrifugó durante 8 minutos a 5000 rpm. b) Análisis Cromatográfico: La concentración de 5-hidroximetil furfural presente en los extractos obtenidos fue analizada por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC-UV). Previamente a su inyección en el sistema de cromatografía, todas las muestras fueron filtradas a través de un filtro de nylon de 0,45 µm (Scharlau, Barcelona). El cromatógrafo utilizado fue un equipo Agilent, modelo 1100. Se inyectaron 20 L de la solución filtrada en una columna Pursuit C-18 de 5 m (250 x 4,6 mm) (Varian, España) conectada a un detector UV (diode array) a 284 nm. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y la temperatura de columna de 30ºC, utilizándose como fase móvil agua desionizada. El HMF se separó en 8

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minutos y el tiempo de ensayo fue de 15 minutos. Para la calibración se utilizó el método del patrón externo, a partir de una solución patrón madre se prepararon las soluciones patrón de trabajo (0,1-0,5 mg/L). Las concentraciones de la solución de HMF y la altura del pico obtenido se consideraron como las variables para obtener la ecuación de regresión lineal. Todos los análisis fueron realizados por duplicado. Los resultados se expresan como mg de HMF por Kg de muestra (corteza o miga) seca. Estudio del efecto del HMF sobre el crecimiento de los hongos Como ya ha quedado demostrado (Palmqvist & Hahn Hägerdal, 2000), la interacción entre diferentes compuestos del sustrato puede influir sobre el efecto inhibitorio del HMF en el crecimiento de los microorganismos. Por eso, y para evitar que el efecto del HMF quedara enmascarado, se utilizó como sustrato el medio semisintético PDA (Potato Dextrose Agar, composición en g/L: peptona de patata, 4,00; glucosa, 20,00; agar, 15,00), al que se añadió HMF en concentraciones definidas y similares a las obtenidas a partir de los análisis cromatográficos de los extractos. A) En medio PDA con HMF disuelto Se prepararon placas con medio de cultivo PDA, al que se añadió HMF en dos concentraciones diferentes: 4 mg/100 ml (H) y 2 mg/100 ml (H½) y placas con PDA sin HMF como control. En el centro de estas placas se sembraron discos de 3 mm de diámetro de un cultivo de cada una de las cuatro cepas en estudio (1-4), por triplicado, resultando al final un ensayo con 36 placas (Tabla 1). Para el cálculo de estas concentraciones de HMF se tomaron como referencia los valores obtenidos en la determinación cromatográfica de las muestras.

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La distribución de los discos en las placas de ensayo se muestra en el esquema de la Figura 1. En el centro de cada una de las placas así preparadas se sembró un disco de 3 mm de diámetro de un cultivo de las cepas de los hongos en estudio. Las placas se incubaron durante dos días a 24ºC. Tabla 1: Planteamiento del ensayo en placas de PDA (potato dextrose agar) con HMF (hidroximetilfurfural) disuelto. CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3 CEPA 4

Control (* )

CONCENTRACIÓN H½ (** )

CONCENTRACIÓN H

( *** )

1a

2a

3a

4a

1b

2b

3b

4b

1c

2c

3c

4c

1aH½

2aH½

3aH½

4aH½

1bH½

2bH½

3bH½

4bH½

1cH½

2cH½

3cH½

4cH½

1aH

2aH

3aH

4aH

1bH

2bH

3bH

4bH

1cH

2cH

3cH

4cH

3 Réplicas de cada ensayo (a, b, c) (*) Placas de PDA sin hidroximetilfurfural (HMF) (**) Placas de PDA con una concentración de 2 mg HMF/100 ml (***) Placas de PDA con una concentración de 4 mg HMF/100 ml Cepas 1 y 2 (Rhizopus oryzae), cepa 3 (Rhizopus stolonifer) y cepa 4 (Aspergillus niger) Figura 1: Esquema de la distribución de los discos impregnados en HMF (hidroximetilfurfural) en las placas de cultivo

B) En medio PDA con discos impregnados en HMF Para eliminar la posibilidad de que el efecto potencial inhibidor del HMF añadido fuese alterado al reaccionar con el medio, se realizó un nuevo experimento consistente en colocar en las placas de PDA, inoculadas posteriormente con las cuatro cepas, discos impregnados con una disolución de HMF a distintas concentraciones (0,5 g/l, 0,25 g/l y 0,05 g/l). Se colocó un cuarto disco en cada placa impregnado en agua estéril como control.

Resultados y discusión Determinación de la concentración de HMF en las muestras en estudio El uso de Carrez I y Carrez II como agentes de clarificación en lugar de los ácidos clásicos (tricloroacético, metafosfórico, sulfosalicílico) se recomienda en muchos estudios para productos de cereales, como es el caso del sustrato en estudio, debido a la posible producción de HMF a partir de la glucosa presente en las matrices a valores bajos de pH (Ramírez-Jiménez et al., 2000). Los extractos obtenidos por ambos procedimientos fueron analizados utilizando el método cromatográfico puesto a punto. En la Figura 2 se muestran dos cromatogramas correspondientes al análisis de dos extractos, de corteza (a) y miga (b) de pan respectivamente, obtenidos a partir del procedimiento de extracción B. Para el análisis de las diferentes muestras se utilizó el mismo método y condiciones cromatográficas. La identidad y pureza del HMF fue confirmada por un detector UV (diode array).

La Tabla 2 muestra el contenido de HMF que presentaron las muestras analizadas por cromatografía, correspondientes a miga y corteza sometidas a los dos procedimientos de extracción de HMF ensayados (A y B); los valores son la media de las réplicas analizadas, una vez corregidos por el factor de dilución. Como puede observarse, con el procedimiento A apenas existen diferencias entre los valores obtenidos de HMF en corteza y miga. Sin embargo, mediante el procedimiento B los niveles de HMF detectados, el valor de la corteza es más de cuatro veces superior que el de la miga, lo cual está más en consonancia con los datos que aparecen en otros trabajos consultados (RamírezJiménez et al., 2000). Estudio del efecto del HMF sobre el crecimiento de los hongos A) En medio PDA con HMF disuelto Para evaluar el efecto del HMF sobre el crecimiento de las cepas de hongos en estudio estaba previsto realizar la medida del diámetro medio de las colonias de cada cepa en cada placa. Sin embargo, al cabo de 48 horas el crecimiento llegó al borde de la

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placa en todos los casos, no observándose ninguna diferencia entre las placas con y sin HMF, por lo que no fue necesario realizar el análisis estadístico.

los discos por lo que no parece existir ningún efecto inhibitorio del HMF a las concentraciones ensayadas sobre el crecimiento de los hongos.

A continuación (Figura 3) se presentan algunas imágenes que muestran el aspecto de las placas correspondientes al crecimiento de los hongos sobre medio PDA con distintas concentraciones de HMF disuelto.

Los resultados obtenidos en ambos ensayos contrastan con lo que ocurrido en los experimentos previos de fermentación para enriquecimiento proteico realizados sobre pan de molde, en los que ninguna de las tres cepas del género Rhizopus fue capaz de crecer a diferencia de las cepas de Aspergillus.

B) En medio PDA con discos impregnados en HMF El objetivo fue observar si el crecimiento fúngico quedaba inhibido en contacto directo con una disolución de HMF y, si así fuera, a partir de qué concentración resultaba inhibitorio. En este caso, a partir de los resultados (Figura 4) se observa cómo a los dos días de la inoculación las cuatro cepas invadieron la placa siendo por tanto capaces de crecer perfectamente sobre

Además, los datos procedentes del análisis cromatográfico de los dos extractos (A y B) también parecen confirmar estos resultados, ya que los valores de concentración de HMF encontrados tanto en miga como en corteza, fueron inferiores a los niveles indicados en la bibliografía como inhibidores del crecimiento de hongos (Nichols et al., 2006).

Figura 2: Cromatogramas correspondientes los extractos de pan, corteza (a) y miga (b), respectivamente, obtenidos a partir del procedimiento B de extracción de HMF (hidroximetilfurfural) descrito en el artículo.

Tabla 2: Concentración de hidroximetilfurfural (mg HMF/kg pan seco) presente en las muestras analizadas, a partir de los dos procedimientos de extracción descritos en el artículo (A, y B). PROCEDIMIENTO A(mg HMF*/kg pan seco)

PROCEDIMIENTO B(mg HMF*/kg pan seco)

CORTEZA

4,12

11,97

MIGA

4,03

2,70

HMF* (hidroximetilfurfural)

Figura 3: Imágenes del aspecto del crecimiento de los hongos sobre placas de PDA a distintas concentraciones de hidroximetilfurfural (HMF). (a y b) Aspecto de dos cepas de hongos, de izquierda a derecha: control (sin HMF), concentración ½H (2 mg HMF/100 ml) y doble concentración H (4 mg HMF/100 ml); (c) Aspecto del crecimiento de cinco de las cepas ensayadas sobre placas de PDA; (d) Ensayo correspondiente a la cepa 1, donde el hongo creció por igual en las placas control (sin HMF) y en las placas adicionadas con HMF a las dos concentraciones anteriores, H y ½H.

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Figura 4: Imágenes del aspecto del crecimiento de las cuatro cepas sobre los discos impregnados en hidroximetilfurfural (a = Cepa 1, b= Cepa 2, c= Cepa 3, d= Cepa 4)

Conclusiones Tras el estudio realizado se puede concluir que la inhibición del crecimiento de las cepas ensayadas sobre el pan no está provocada por el hidroximetilfurfural presente en el sustrato ya que los niveles encontrados están lejos del mínimo propuesto por

otros autores. Habría que estudiar otros motivos que se relacionen con esta inhibición, para lo cual se propone continuar la investigación centrándose en las causas más probables establecidas en estudios previos.

Agradecimientos Este trabajo ha sido realizado para el Grupo Siro, en el marco del Proyecto CENIT “Acuicultura Sostenible” (2007-2010, ACUISOST), financiado por el Ministerio Español de Ciencia e Innovación.

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