Dx HR-HPV Auto Assay 5 x 96 Tests

37010

Direktnachweis von 13 High-Risk-Typen des humanen Papillomavirus (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68) durch Real-Time PCR

INHALTSVERZEICHNIS

1.

VERWENDUNGSZWECK

2.

ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS

3.

PRINZIP DES VERFAHRENS

4.

REAGENZIEN

5.

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN

6.

PROBEN

7.

TESTVERFAHREN

8.

TESTEINSCHRÄNKUNGEN

9.

ERWARTETE WERTE

10.

LEISTUNGSMERKMALE

11.

LITERATUR

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1 - VERWENDUNGSZWECK Der Dx HR-HPV Auto Assay ist ein qualitatives In-vitro-Testkit zur Multiplex-Amplifikation von Nukleinsäuren zum Direktnachweis von 13 Hochrisiko (HR)-Typen des humanen Papillomavirus (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68) in klinisch gewonnenen endozervikalen Abstrichproben. 2 - ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTS Gebärmutterhalskrebs (Zervikalkarzinom) ist weltweit die zweithäufigste Ursache für Krebserkrankungen bei Frauen. Die kausale Rolle des humanen Papillomavirus (HPV) bei allen Karzinomen des Gebärmutterhalses ist biologisch und epidemiologisch gesichert. HPV lässt sich bei nahezu allen Gebärmutterhalskarzinomen nachweisen (99,7 %)1 ,2. HPV sind weit verbreitet. Es gibt mehr als einhundert Typen, darunter etwa 40 verschiedene Typen, die zur Infektion der Anogenitalregion in der Lage sind. Etwa 13 dieser HPV-Typen gelten als Hochrisiko-Typen, weil sie mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs und präkanzerösen Läsionen einhergehen. Die meisten, auf sexuellem Weg übertragenen Infektionen sind auf HPV zurückzuführen. Der Anteil der HPV-Infizierten liegt bei 10 bis 30 %, betroffen sind insbesondere junge, sexuell aktive Frauen. Die entstehenden Läsionen bilden sich in den meisten Fällen zurück, können aber zu einem invasiven Karzinom fortschreiten, insbesondere wenn es zu einer Integration der viralen DNA in das zelluläre Genom kommt. Das Fortschreiten der Krankheit wird möglicherweise durch weitere Faktoren wie genetische Prädisposition, Immunstatus, Sexualverhalten und Tabakkonsum beeinflusst2. Eine persistierende Infektion von Gebärmutterhalszellen durch HR-HPV ist Voraussetzung für die Entstehung präkanzeröser Läsionen und Gebärmutterhalskrebs3,4 und gilt deshalb als wichtigster Prädiktor für das spätere auftreten einer zervikalen Krebserkrankung. Die derzeit gängigste Screeningmethode ist der Pap-Test, jedoch sind hinsichtlich der Prävention und der Überwachung der Patientinnen Verbesserungen möglich. Was zytologische Methoden anbelangt, so ist deren Sensitivität häufig niedrig5, die Reproduzierbarkeit ist mangelhaft und es kommt zu Fehlauswertungen, vor allem bei atypischen Plattenepithelzellen unbestimmter Signifikanz (ASC-US) oder niedriggradigen squamösen intraepithelialen Läsionen (LSIL). Da es keine virale Kulturtechnik gibt, sind die aussichtsreichsten Methoden für den qualitativen oder quantitativen Nachweis und für die Typbestimmung dieser Viren molekulare Techniken auf der Grundlage des Nachweises viraler DNA6. 3 - TESTPRINZIP Der Dx HR-HPV Auto Assay umfasst zwei Hauptschritte: Probenvorbereitung und Amplifizierung/Nachweis der Ziel-DNA mittels Real-Time PCR. Die Amplifizierungsprodukte werden während der PCR mithilfe von Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen. Die Real-Time PCR erlaubt die Amplifikation und den gleichzeitigen Nachweis von 13 HR-HPV und der DNA des Globingens, ein Haushaltsgen der Zelle (HKG), mit der das Vorhandensein von Zellen in der Probe bestätigt wird. In jeder Probe wird eine interne Kontrolle auf dieselbe Weise wie die Ziel-DNA und das HKG systematisch extrahiert, amplifiziert und nachgewiesen. Dies ermöglicht die Kontrolle des Extraktionsverfahrens und die Feststellung einer möglichen PCR-Inhibition.

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PROBENVORBEREITUNG

Die automatische DNA-Extraktion wird bei Verwendung des Bio-Rad Dx Prep System und des Dx Automated Extraction Assay (Kat.-Nr. 37016) mit allen im Kapitel „Proben“ aufgeführten Probentypen durchgeführt. Nukleinsäuren werden mithilfe von Magnetkügelchen erfasst, anschließend gewaschen und eluiert und automatisch in eine Dx PCR Plate mit 96 Kavitäten überführt. Während der gesamten Probenvorbereitung wird eine Negativkontrolle mit den Proben mitgeführt. Zu Beginn der Probenvorbereitung wird jeder Probe und der Negativkontrolle eine interne Kontrolle (IC) zugegeben. Amplifikation und Nachweis mittels Real-Time PCR Das Dx Prep System von Bio-Rad gibt den Amplifikations-Mastermix sowie die extrahierte DNA automatisch in die Dx PCR Plate mit 96 Kavitäten. Bei der Real-Time PCR werden spezifische fluoreszierende Oligonukleotidsonden verwendet, um die DNA während der Amplifizierung durch Hybridisierung an die Amplikons nachzuweisen. Im Dx HR-HPV Auto Assay werden drei verschiedene Oligonukleotidsonden verwendet: [1]HPV-Sonden für die 13 HR-HPV, [2] eine HKG-Sonde für ein Fragment des humanen Globingens (HKG) als Nachweis für das Vorhandensein von Zellen in der Testprobe und [3] eine interne Kontrollsonde zur Überwachung der Extraktion und auf Vorhandensein von PCR-Inhibitoren. Wenn die Ziel-DNA einer bestimmten Oligonukleotidsonde nicht vorhanden ist, wird keine Fluoreszenz emittiert und somit erfolgt auch keine Signalerfassung. Ist die Ziel-DNA vorhanden, erhöht sich die Fluoreszenzintensität mit zunehmender Anzahl an Amplikons je Amplifikationszyklus. In jedem Annealing-Step misst das optische Modul des Dx Real-Time Systems die von jedem Fluorophor abgegebene Fluoreszenz und die dazugehörige Dx RealTime Software trägt die Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen auf. Am Ende des Assays nimmt die Dx Real-Time Software eine automatische Analyse der Ergebnisse aller Proben und Kontrollen vor.

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4 - REAGENZIEN 4.1 Inhalt des Dx HR-HPV Auto Assay-Kits Das Kit enthält ausreichend viele Reagenzien zur Durchführung von 480 Tests. Alle Reagenzien sind ausschließlich für die In vitro-Diagnostik bestimmt. Etikett R1

Amplification Mix

Beschreibung Konzentriertes Amplifikationsmix PCR-Puffer mit Primern, spezifischen Fluoreszenzsonden, dNTPs, MgCl2,TaqPolymerase, Konservierungsmittel: 0,03% ProClin

R2

C1

Amplification Mix Diluent

Verdünnungspuffer für Amplifikationsmix

Internal Control

Interne Kontrolle

PCR-Puffer mit MgCl2 Konservierungsmittel: 0,03% ProClin Heterologe DNA-Sequenz in Tris-HCl-EDTA-Puffer Konservierungsmittel: 0,03% ProClin

C2

Negative Control

Positive Control

10 x 150 µl

10 x 650 µl

5 x 300 µl

Negativkontrolle Tris-HCl-EDTA-Puffer. Konservierungsmittel: 0,03% ProClin

C3

DARREICHUNGSF ORM

10 x 100 µl

Positivkontrolle Nicht-infektiöse DNA-Sequenz von HPV 16 und DNA des humanen Globingens in Tris-HCl-EDTAPuffer, gelb gefärbt Konservierungsmittel: 0,03% ProClin

10 x 600 µl

4.2 Aufbewahrung und Haltbarkeit der Reagenzien Das Dx HR-HPV Auto Assay-Kit muss bei -20 °C eingefroren aufbewahrt werden. Bei Aufbewahrung bei dieser Temperatur können alle Reagenzien bis zum dem auf dem Etikett aufgedruckten Verfallsdatum verwendet werden. Inhalt C2

C3

C1 + Bindungspuffer (BB)

Aufbewahrung nach dem Öffnen

15 Tage bei 2-8 °C. Jedes Fläschchen kann zweimal verwendet werden. Falls eines dieser Reagenzien kontaminiert wird, muss es entsorgt werden. 1 Monat bei 2-8 °C. Jedes Fläschchen kann zweimal verwendet werden. Falls eines dieser Reagenzien kontaminiert wird, muss es entsorgt werden. 1 Monat bei 2-8 °C. Jedes Fläschchen kann bis zu 4 Mal verwendet werden. Falls eines dieser Reagenzien kontaminiert wird, muss es entsorgt werden. Der Bindungspuffer ist Teil des Dx Automated Extraction Assay (Kat.-Nr. 37016)

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R1+R2 (rekonstituiertes Gemisch)

2 Wochen bei -20 °C. Jedes Fläschchen kann zweimal verwendet werden.

Das rekonstituierte Gemisch darf nach dem Einfrieren nur einmal aufgetaut werden.

5 - Warnhinweise und VORSICHTSMAßNAHMEN In-vitro-Diagnostikum. 5.1. HYGIENE- UND SICHERHEITSVORSCHRIFTEN •

Beim Umgang mit Reagenzien und Patientenproben Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen.

•

Nach der Arbeit mit Reagenzien und Proben die Hände gründlich waschen. In ausgewiesenen Arbeitsbereichen nicht trinken, essen oder rauchen.

•

Alle Proben gemäß den GLP-Richtlinien als potenziell infektiös handhaben.

•

Chemikalien gemäß den GLP-Richtlinien verwenden und entsorgen.

•

Ein Sicherheitsdatenblatt ist auf Anfrage von Ihrer örtlichen Bio-Rad-Vertretung erhältlich.

5.2 VORSICHTSMAßNAHMEN IN ZUSAMMENHANG MIT DEM VERFAHREN •

Dieses Kit ist nur für die Verwendung mit dem Dx Real-Time System (Bio-Rad, Kat.-Nr. 94000) und dessen Dx Real-Time Software bestimmt.

•

Die automatische DNA-Extraktion muss mit dem Dx Automated Extraction Assay-Kit (BioRad, Kat.-Nr. 37016) auf dem Dx Prep System (Bio-Rad, Kat.-Nr. 94500) durchgeführt werden.

•

Zur Gewinnung von endozervikalen Proben darf nur das Dx Collection System 50-F (BioRad, Kat.-Nr. 37012) verwendet werden.

•

In Hologic - PreservCyt™ entnommene Proben müssen in ein Dx Transfer SystemRöhrchen (Bio-Rad, Kat.-Nr. 37014) überführt werden, um in das Dx Prep System geladen werden zu können.

•

Das Dx Collection System 50-F nicht verwenden, wenn die Packung beschädigt oder Transportmedium aus dem Röhrchen ausgelaufen ist. Unbenutzte, beschädigte oder undichte Systeme müssen gemäß den GLP-Richtlinien gehandhabt und entsorgt werden.

•

Wenn das Labor eine Abstrichprobe erhält, die nicht mit den Dx Collection System 50-F entnommen wurde, oder ein Abstrichprobentransportröhrchen ohne Tupfer oder mit zwei Tupfern, kann die Probe nicht angenommen werden.

•

Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden.

•

Keine Reagenzien aus Kits anderer Chargen gegeneinander austauschen, vermischen oder kombinieren.

•

Das Testverfahren darf nicht geändert werden.

•

Bei der Handhabung der Proben sorgfältig auf Vermeidung von Kreuzkontaminationen achten: darauf achten, dass sich die Probenbehälter nicht berühren; in Kontakt mit Proben gekommene Handschuhe sofort wechseln.

•

Den Amplifikationsmix vorsichtig auflösen und jegliche Kontamination vermeiden.

•

Pipetten und Geräte auf Genauigkeit und korrekte Funktion prüfen.

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•

Nach Möglichkeit Proben oder probehaltige Lösungen nicht verschütten. Verschüttete Proben müssen mit 10%iger Natriumhypochloritlösung gespült werden. Das für die Reinigung verwendete Material muss in einem Behälter für kontaminierte Rückstände entsorgt werden.

•

Arbeitsflächen, Pipetten und sonstige Gerätschaften müssen regelmäßig mit auf 1 % verdünnter Bleichelösung dekontaminiert werden.

6 - PROBEN 6.1 Mit dem Dx Collection System 50-F von Bio-Rad entnommene Abstrichproben Der Dx HR-HPV Auto Assay ist nur für die Verwendung mit endozervikalen Abstrichproben bestimmt, die mit dem Dx Collection System 50-F entnommen und transportiert werden. Weitere Informationen zur Entnahme und zum Transport von Proben sind der Packungsbeilage des Dx Collection System 50-F (Bio-Rad, Kat.-Nr. 37012) zu entnehmen. Ein Transportröhrchen, das einen nicht von Bio-Rad stammenden Tupfer, mehrere Tupfer oder keinen Tupfer enthält, kann nicht mit dem Dx HR-HPV Auto Assay verwendet werden. Entnommene Proben können transportiert und bei Raumtemperatur (18-30 °C) oder bei 2-8 °C 8 Wochen aufbewahrt werden. 6.2 In Hologic - PreservCyt™ Medium (20 ml) entnommene endozervikale Proben Zervikalproben, die nach den Empfehlungen des Herstellers entnommen wurden, können mindestens 5 Monate bei 18-30 °C gelagert werden, bevor der HPV-Test durchgeführt wird. Ein Aliquot von 1,5 ml bis 3 ml LBC in ein Dx Transfer-Röhrchen (Bio-Rad Kat.-Nr. 37014) überführen. Dieses Röhrchen wird in das Dx Prep System geladen. Überführte Proben können verschlossen bei 18-30 °C oder bei 2-8 °C 8 Wochen aufbewahrt werden. 7 - TESTVERFAHREN 7.1 Erforderliches Material 7.1.1Im Lieferumfang enthaltenes Material •

Dx HR-HPV Auto Assay (Kat.-Nr. 37010)

7.1.2 Separat erhältliches Material •

Dx Prep System (Kat-Nr. 94500) und Zubehör (Kat.-Nr. 94500)

•

Dx Automated Extraction Assay (Kat.-Nr. 37016)

•

Dx Real Time System und Zubehör (Kat.-Nr. 94000)

•

Dx Strip Cap Tool, im Lieferumfang des Dx Real Time Systems

•

Dx Collection System 50-F (Kat.-Nr. 37012) oder validierte Flüssigzytologieröhrchen

•

Dx Transfer System (Kat-Nr. 37014) zum Überführen von Flüssigzytologieproben

• •

Capture Cap Set zum Wiederverschließen von Probenröhrchen nach der Verwendung (Kat.Nr. 37017) Dx PCR Plates & Caps (Kat.-Nr. 94023)

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7.1.3 Erforderliches Zusatzmaterial •

Verstellbare Mikropipetten (P1000 µl), kalibriert, und sterile Spitzen mit Filter

•

Ungepuderte Einweghandschuhe

•

Vortex-Mischer

7.2 REAGENZIENVORBEREITUNG Zugabe der internen Kontrolle (C1) zum Bindungspuffer (BB): Nehmen Sie eine Flasche Bindungspuffer (BB) aus dem Dx Automated Extraction Assay und ein Fläschchen interne Kontrolle (C1) aus dem Dx HR-HPV Auto Assay. Geben Sie 1200 µl interne Kontrolle (C1) in die Flasche mit Bindungspuffer (BB) und mischen Sie den Inhalt vorsichtig, indem Sie die Flasche umdrehen. Heben Sie das leere Fläschchen der internen Kontrolle (C1) auf: es wird in das Dx Prep System geladen. Dieses Gemisch „Bindungspuffer + interne Kontrolle“ ist bei 2-8 °C ein Monat lang stabil. Rekonstitution des Amplifikationsmix Ampulle Fläschchen R1 (konzentrierter Amplifikationsmix) und R2 (Verdünnungspuffer für Amplifikationsmix) müssen vor der Rekonstitution 5 Sekunden lang auf dem Vortex gemischt und anschließend 15 Sekunden lang zentrifugiert werden. Geben Sie 640 µl Verdünnungspuffer für Amplifikationsmix (R2) in eine Fläschchen mit konzentriertem Amplifikationsmix (R1). Mischen Sie 10 Sekunden auf dem Vortex und zentrifugieren Sie anschließend kurz. Eine Fläschchen mit rekonstituiertem Amplifikationsmix (R1+R2) reicht aus für 48 Real-Time PCR-Reaktionen. Bereiten Sie die benötigte Anzahl an Ampullen Fläschchen mit rekonstituiertem Amplifikationsmix (R1 + R2) vor (z. B. 2 Fläschchen, wenn 96 Tests durchgeführt werden sollen). Der rekonstituierte Amplifikationsmix (R1 + R2) kann sofort verwendet oder aliquotiert und bis zu 2 Wochen lang bei -20 °C aufbewahrt werden. Jedes Fläschchen kann zweimal verwendet werden. Das rekonstituierte Gemisch darf nach dem Einfrieren nur einmal aufgetaut werden. 7.3 ASSAYVERFAHREN 7.3.1. Automatisierte DNA-Extraktion und Vorbereitung der PCR 1. Schalten Sie zuerst das Dx Prep System und dann den Computer ein. Vergewissern Sie sich, dass die Frontklappe des Dx Prep System geschlossen ist. 2. Die Dx Prep Software startet automatisch. Geben Sie im Fenster „Login“ (Anmelden) Benutzername und Kennwort ein. 3. Öffnen Sie die Abdeckung des Dx Prep System, um das Instrument zu beladen. 4. Laden der Proben: Hinweis: Vergewissern Sie sich vor dem Laden der Proben, dass das Probenvolumen im Transportröhrchen mindestens 1 ml beträgt. a. Mischen Sie den Inhalt jedes Probenröhrchens auf dem Vortex. b. Klopfen Sie die Probenröhrchen vorsichtig auf den Tisch.

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c. Öffnen Sie die Probenröhrchen und entsorgen Sie Deckel und Tupfer. Stellen Sie die Röhrchen in die Dx Prep Sample Racks. d. Laden Sie die Dx Prep Sample Racks in das Dx Prep System auf dem Gerät (blinkende Lämpchen). e. Wenn ein Dx Prep Sample Rack nicht voll ist, bestätigen Sie dies, indem Sie es in der Dx Prep Software auswählen und anschließend die Schaltfläche „Confirm rack“ (Rack bestätigen) klicken. Hinweis: Da der Dx HR-HPV Auto Assay das Vorhandensein einer negativen Kontrolle und einer positiven Kontrolle pro Durchgang erfordert, können pro Durchgang nicht mehr als 94 Proben geladen werden. 5. Klicken Sie auf die Schaltflächen „Extraction“ (Extraktion) und „Defining test orders“ (Festlegung der Testreihenfolge) der Dx Prep Software. 6. Wählen Sie in der Liste „Analyte group(s)“ (Analygruppe(n)) die Option „HPV“. 7. Vergewissern Sie sich, dass die Testzuordnung für alle Proben korrekt ist. 8. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Defining the Run“ (Durchgang definieren). 9. Wählen Sie in den Listen „Extraction“ (Extraktion) und „PCR setup“ (PCR-Setup) die Option „HPV“. Hinweis: Sie können auch lediglich den Extraktionsschritt ohne PCR-Vorbereitung durchführen. Soll nur eine Extraktion durchgeführt werden, können die eluierten Proben in der Elutionsplatte bei Raumtemperatur bis zu 16 Stunden oder bei 2-8 °C bis zu 7 Tage lang aufbewahrt werden. Weitere Informationen finden Sie in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System. 10. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Loading Plates“ (Platten laden). 11. Ziehen Sie das Plattenfach heraus und laden Sie die Dx Processing Plate, die Dx Elution Plate und die Dx PCR Plate in das Dx Prep System, indem Sie die Anweisungen der Dx Prep Software befolgen. 12. Schließen Sie das Plattenfach. Das Dx Prep System liest automatisch die Barcodes der Platten. 13. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Loading Reagents“ (Reagenzien laden). 14. Nehmen Sie einen Satz der Dx Automated Extraction Assay-Reagenzien (Magnetkügelchen, Bindungspuffer, Proteinase K, Waschpuffer und Elutionspuffer). Hinweis: Es können auch 2 Reagenziensets geladen werden (beispielsweise ein bereits geöffnetes Set + ein neues Set). Ausführlichere Anleitungen befinden sich in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System. 15. Mischen Sie den Inhalt der MB-Flasche 5 Sekunden auf dem Vortex und die Fläschchen mit PK, WB und EB durch Umdrehen. 16. Stellen Sie die Dx Automated Extraction Assay-Reagenzien, den vorbereiteten Bindungspuffer und das leere Fläschchen der internen Kontrolle (C1) in das Dx Prep Extraction Rack des Dx Prep Systems und gehen Sie dabei nach den Anweisungen in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System vor. 17. Laden Sie das Dx Prep Extraction Rack in das Dx Prep System und achten Sie dabei auf die Anzeige am Instrument (blinkende Lämpchen). 18. Wenn das Rack nicht voll ist, bestätigen Sie dies, indem Sie es in der Dx Prep Software auswählen und anschließend die Schaltfläche „Confirm rack“ (Rack bestätigen) klicken. 19. Wird die Kit-Charge des Dx Automated Extraction Assay oder des Dx HR-HPV Auto Assay

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erstmalig verwendet, klicken Sie auf die Schaltfläche „Kit Lot Input“ (Kitchargeneingabe) und lesen Sie die Chargendaten von der jeweiligen Chargenkarte mithilfe des Barcode-Lesegeräts ein. Ausführlichere Anleitungen befinden sich in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System. 20. Mischen Sie die negative Kontrolle (C2) und die positive Kontrolle (C3) kurz auf dem Vortex und zentrifugieren Sie die Fläschchen anschließend kurz. 21. Stellen Sie die Fläschchen mit der negativen Kontrolle (C2), der positiven Kontrolle (C3) und dem rekonstituierten Amplifikationsmix (R1+R2) in das Dx Prep PCR Rack des Dx Prep Systems und gehen Sie dabei nach den Anweisungen in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System vor. 22. Laden Sie das Dx Prep Extraction Rack in das Dx Prep System und achten Sie dabei auf die Zeichen am Instrument (blinkende Lämpchen). 23. Wenn das Rack nicht voll ist, bestätigen Sie dies, indem Sie es in der Dx Prep Software auswählen und anschließend die Schaltfläche „Confirm rack“ (Rack bestätigen) klicken. 24. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Loading Tips“ (Spitzen laden). 25. Ziehen Sie das Spitzenfach heraus und laden Sie ggf. die Spitzenplatten: Ist die Anzahl der bereits geladenen Spitzen nicht ausreichend, klicken Sie auf „Show loading selection“ (Ladeauswahl zeigen), laden Sie die Spitzen entsprechend dem Vorschlag der Dx Prep Software und klicken Sie anschließend auf „Accept suggestion“ (Vorschlag übernehmen). Schließen Sie das Spitzenfach. Hinweis: Es gibt 3 Spitzengrößen: 50 µl (gelber Kasten), 300 µl (brauner Kasten) und 1100 µl (grauer Kasten). Laden Sie nur den von der Dx Prep Software vorgeschlagenen Kastentyp. Abweichungen von dem Vorschlag müssen validiert werden, indem auf die entsprechende Stelle in der Dx Prep Software geklickt wird und dann die Spitzengröße und Anzahl der Spitzen in dem Kasten eingegeben werden. 26. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Checking Waste“ (Abfall prüfen). 27. Die Dx Prep Software zeigt dann den Füllstand des Fest- und des Flüssigabfalls an. a. Wenn der Füllstand des Festabfalls zu hoch ist, wird eine Meldung „Failed“ (Fehler) angezeigt. Setzen Sie dann einen neuen Abfallbehälter ein und klicken Sie auf die Schaltfläche „Change bin“ (Behälter wechseln). b. Ist der Füllstand des Flüssigabfalls zu hoch, wird eine Meldung „Failed“ (Fehler) angezeigt; leeren Sie den Abfall unter Einhaltung der guten Laborpraxis, stellen Sie ihn dann wieder in das System und klicken Sie auf „Empty waste“ (Abfall leeren). 28. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Final Check“ (Abschlussprüfung). 29. Bei korrekter Ladung zeigt die Dx Prep Software dann im Fenster „Run Status“ (Analysenstatus) das Wort „Passed“ (Bestanden) an. 30. Schließen Sie die Abdeckung und klicken Sie auf die Schaltfläche „Run Status“ (Analysenstatus). 31. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start run“ (Durchgang starten). Hinweis: Während des Durchgangs darf die Frontklappe des Dx Prep System keinesfalls geöffnet werden. Die Abdeckung kann NUR DANN geöffnet werden, wenn die Schaltfläche „Unload samples“ (Proben entladen) in der Dx Prep Software aktiviert ist, und auch dann nur für begrenzte Zeit. Weitere Informationen befinden sich in der Gebrauchsanweisung für das Dx Prep System. 32. Öffnen Sie am Ende des Laufs die Abdeckung des Dx Prep System und ziehen Sie das Plattenfach heraus.

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33. Nehmen Sie die Dx PCR Plate aus dem Dx Prep System, stellen Sie sie auf den Labortisch und setzen Sie die Dx 8-Cap Strips auf die Dx PCR Plate. Hinweis: Setzen Sie die Caps auch dann hinein, wenn die letzte senkrechte Reihe der Dx PCR Plate leer ist, damit der beheizten Deckel des Dx Real-Time System gleichmäßig aufliegt. 34. Fahren Sie innerhalb von 30 Minuten nach Vorbereitung der Dx PCR Plate mit der Amplifikation/dem Nachweis mittels Real-Time PCR fort (siehe Abschnitt 7.3.2). 35. Entladen Sie die Proben aus dem Dx Prep System: entladen Sie die Probenracks, verschließen Sie die Probenröhrchen mit neuen Caps (Capture Cap Set, Bio-Rad, Kat.-Nr. 37017) und bewahren Sie sie auf oder entsorgen Sie sie nach GLP-Richtlinien. 36. Entladen Sie die Dx Prep Extraction und PCR Racks, verschließen Sie jedes Reagenz mit dem passenden Deckel und bewahren Sie die Reagenzien bei 2-8 °C auf, ausgenommen der rekonstituierte Amplifikationsmix, das bei -20 °C aufbewahrt werden muss. Leere Flaschen und Fläschchen sind nach GLP-Richtlinien zu entsorgen. 37. Entladen und entsorgen Sie die Dx Processing Plate nach GLP-Richtlinien. Die Dx Elution Plate kann gegebenenfalls bei Raumtemperatur bis zu 16 Stunden oder bei 2-8 °C bis zu 4 Tage aufbewahrt werden. Andernfalls entsorgen Sie sie nach GLP-Richtlinien. 7.3.2. Real-Time PCR-Amplifizierung/-Nachweis

Ausführlichere Anleitungen befinden sich in der Gebrauchsanweisung für das Dx RealTime System. 1. Schalten Sie erst den Computer und danach das Dx Real-Time System. Die Dx Real-Time Software öffnen. 2. Klicken Sie links auf die Schaltfläche „Run“ (Analyse) und anschließend im Fenster „Run“ (Analyse) auf „Open Lid“ (Deckel öffnen). 3. Laden Sie die Dx PCR Plate in das Dx Real-Time System und verwenden Sie das Dx Strip Cap Tool zum Aufsetzen der Dx 8-Cap Strips auf die geladene Dx PCR Plate. Die Dx Real-Time Software erkennt die Dx PCR Plate automatisch und importiert den Plattenbelegungsplan aus dem Dx Prep System. 4. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Close lid“ (Deckel schließen) und anschließend auf „Start run“ (Durchgang starten). 5. Nehmen Sie die Dx PCR Plate nach Abschluss der Real-Time PCR-Reaktion aus dem Dx RealTime System heraus, geben Sie sie in einen verschließbaren Plastikbeutel und entsorgen Sie sie nach GLP-Richtlinien. 6. 7.4 KALIBRIERUNG In jedem PCR-Zyklus misst das optische Modul des Dx Real-Time System während des Anlagerungs(Annealing)-Schrittes die von jedem Fluorophor abgegebene Fluoreszenz, und die dazugehörige Dx Real-Time Software trägt die Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der Zyklen auf. Am Ende des Experiments nimmt die Software eine automatische Analyse der Ergebnisse aller Proben und Kontrollen vor. Die Dx Real-Time Software verwendet einen patentierten mathematischen Algorithmus, um die Werte einer Reihe mathematischer Parameter (u. a. Ceep und Cmin) für jede PCR-Kurve zu berechnen, die dann in der Ergebnistabelle angezeigt werden.

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Das Modeling beruht auf der Annahme, dass die Effizienzrate der PCR-Reaktion zu Beginn der Reaktion maximal ist und nach einigen Zyklen abnimmt, was je nach Probe unterschiedlich verläuft. Der Cmin-Wert (Zyklusminimum) ist der Zyklus, ab dem das Fluoreszenzsignal beginnt, sich signifikant vom Rauschen abzuheben. Der Cmin-Wert ist umgekehrt proportional zur Anzahl der Zielkopien in der Probe (je höher der Cmin-Wert, desto niedriger ist die Anzahl der Zielkopien). Der Ceep („Cycle of end of exponential phase“)-Wert entspricht dem Zyklus, bei dem die Effizienz der PCR-Reaktion beginnt abzunehmen. Die Analyse der Testergebniss des Dx HR-HPV Auto Assay beruht auf den Cmin-Werten. 7.5 QUALITÄTSKONTROLLE Positiv- und Negativkontrollen In jedem Testdurchlauf müssen eine Negativ- und eine Positivkontrolle mitgeführt werden, um mögliche Fehler bei der Probenverarbeitung, der Amplifizierung oder dem Nachweis ermitteln zu können. Wenn die Cmin-Werte für die Positivkontrollen (PC) und Negativkontrollen (NC) nicht innerhalb der Akzeptanzbereiche liegen, erklärt die Dx Real Time Software den gesamten Durchgang für ungültig und zeigt eine der folgenden Meldungen an: Negativkontrolle (NC): Meldung

Beschreibung

IC_out

Interne Kontrolle (IC) ungültig

HPV_conta

Kontamination durch HPV-DNA

HKG_conta

Kontamination durch zelluläre DNA

HPVHKG_conta

Kontamination durch HPV-DNA und zelluläre DNA

Positivkontrolle (PC): Meldung

Beschreibung

HPV_out

HPV-Wert nicht im gültigen Bereich

HKG_out

HKG-Wert nicht im gültigen Bereich

HPVHKG_out

HPV- und HKG-Wert nicht im gültigen Bereich

Wenn eine dieser Warnmeldungen angezeigt wird, müssen alle Proben und Kontrollen ab dem Schritt der DNA-Extraktion erneut getestet werden. Nachweis einer Hemmreaktion in der Probe Zu Beginn des Schrittes der DNA-Extraktion wird jeder Probe eine interne Kontrolle zugegeben und während der Real-Time PCR-Reaktion mit einer spezifischen Sonde amplifiziert. Proben mit einem Cmin-Wert der IC über dem erwarteten Wert (mögliche Hemmreaktion in den Proben) werden von der Dx Real Time Software folgenderweise interpretiert: Probe positiv 'HPV_Pos', wenn der HPV Cmin-Wert < Cmin-Cutoff Probe „failed“ (ungültig), wenn der HPV Cmin-Wert > Cmin-Cutoff Kontrolle auf Vorhandensein von Zellen in der Probe

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Eine Probe wird akzeptiert bei Cmin-HKG ≤ 30. Umgekehrt wird jeder Probe, deren Cmin größer als dieser Wert ist, als wenig Zellen enthaltend 'Low_cells' oder keine Zellen enthaltend 'No_Cell' qualifiziert. Solche Proben werden von der folgenderweise interpretiert: Probe positiv 'HPV_Pos', wenn der HPV Cmin-Wert < Cmin-Cutoff Probe nicht validiert „Failed“ (Ungültig), wenn der HPV Cmin-Wert > Cmin-Cutoff 7.6 Kriterien für die Testvalidierung Der Test ist gültig, wenn: •

Die Positivkontrolle (PC) einen Cmin-Wert im erwarteten Bereich für die beiden HPV- und HKG-Ziele hat. Der PC-Statusbericht „Passed“ (Bestanden) lautet

UND die Negativkontrolle (NC) einen Cmin-Wert im erwarteten Bereich für das IC-Ziel hat. Der NC-Statusbericht „Passed“ (Bestanden) lautet. Wenn der Test gültig ist, gibt die Dx Echtzeit Real Time-Software den Status des Durchgangs als „Passed“ (Bestanden) an. Wenn eine oder beide Kontrollen ungültig ist/sind, gibt die Dx Echtzeit Real Time-Software den Status des Durchgangs als „Failed“ (Nicht erfolgreich) an. •

Bei einem „nicht erfolgreichen“ Status des Durchgangs werden alle Testergebnisse dieses Durchgangs als „ungültig“ angegeben, und alle Proben und Kontrollen müssen dann ab dem Schritt der DNA-Extraktion erneut verarbeitet werden. 7.7.Berechnung/Interpretation der Ergebnisse HPC-Cutoff: Auf der Grundlage klinischer Leistungsdaten wurde festgelegt, dass eine Probe mit einem CminWert ≤ 36 als HPV-positiv zu betrachten ist. Auswertung Der Test ist gültig, wenn: •

alle Proben (mit oder ohne Hemmreaktion, mit oder ohne Zellen) mit einem Cmin-Wert ≤ 36 für HPV als „positive“ angegeben werden.

•

alle Proben mit gültiger IC, gültigem HKG- und HPV-Cmin-Wert > 36 als „negative“ angegeben werden.

•

alle Proben mit Hemmreaktion und/oder unzureichender Zellzahl oder ohne Zellen und einem HPV-Cmin >36 als „failed“ (nicht erfolgreich) angegeben werden. Die entsprechende Probe muss dann ab dem Schritt der DNA-Extraktion (wenn nur eine Hemmreaktion vorliegt) oder ab der Probengewinnung (bei unzureichender Zellzahl) neu verarbeitet werden.

Die folgende Tabelle enthält eine Übersicht über die verschiedenen Situationen zur Auswertung von HPV-Tests samt der dazugehörigen Meldungen und deren Bedeutung.

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Auswertung Ergebnis Positive Probe „HPV_Pos“

Kriterium HPV Cmin < 36 - IC und HKG gültig

Meldung Keine

HPV Cmin < 36 mit: IC außerhalb des erwarteten Bereichs oder Zu wenig Zellen in der Probe oder Positive Probe „HPV_Pos“

Keine Zellen in der Probe oder IC außerhalb des erwarteten Bereichs und zu wenig Zellen in der Probe oder IC außerhalb des erwarteten Bereichs und keine Zellen in der Probe

Negative Probe „HPV_Neg“

HPV Cmin > 36 - IC und HKG gültig

IC_out Low_Cell No_Cell ICout_LowCell ICout_NoCell Keine

HPV Cmin > 36 mit:

IC außerhalb des erwarteten Bereichs oder Zu wenig Zellen in der Probe oder Probe ungültig „Failed“

Keine Zellen in der Probe oder

IC_out Low_Cell No_Cell

IC außerhalb des erwarteten Bereichs und zu wenig Zellen in der Probe oder

ICout_LowCell

IC außerhalb des erwarteten Bereichs und keine Zellen in der Probe

ICout_NoCell

8. TESTEINSCHRÄNKUNGEN • Die optimale Leistung dieses Tests hängt direkt von der Probenqualität ab. Es ist daher wichtig, die Angaben im Kapitel „Entnahme und Handhabung der Proben“ zu befolgen. • Der Test sollte nur mit den angegebenen Probentypen durchgeführt werden. Andere Probentypen wurden nicht validiert. • Die Leistung des Dx HR-HPV Auto Assay wurde nicht bei Personen evaluiert, die gegen HPV geimpft sind. • Der Dx HR-HPV Auto Assay wird nicht zur Abklärung bei Verdacht auf sexuellen Missbrauch empfohlen. • Die Prävalenz von HPV-Infektionen in einer Population kann die Testleistung beeinflussen. Die positiven prädiktiven Werte verringern sich bei Testung von Populationen mit niedriger Prävalenz oder Personen ohne Infektionsrisiko. • Eine HPV-Infektion ist kein Indikator für eine zytologische HSIL oder eine zugrunde liegende hochgradige CIN und lässt auch keinen Schluss darüber zu, ob sich CIN2, CIN3 oder ein Karzinom entwickeln. Die meisten Frauen, die mit einem oder mehreren Hochrisiko-HPV-Typen infiziert sind, entwickeln weder CIN2 noch CIN3 noch ein Karzinom. • Die möglichen Auswirkungen anderer Faktoren, wie z. B. Vaginalausfluss, Verwendung von Tampons, Vaginalduschen, wurden nicht ermittelt. • Die Anwendung dieses Assays ist auf Personen beschränkt, die im Gebrauch des Dx HR-HPV Auto Assay, des Dx Prep Systems, des Dx Automated Extraction Assay, des Dx Real-Time Systems und der Dx Real-Time Software geschult worden sind. • Ein negatives Ergebnis schließt die Möglichkeit zytologischer Anomalien oder die künftige

14/25

Entwicklung von CIN2, CIN3 oder eines Karzinoms bzw. eine zugrunde liegende CIN2, CIN3 oder ein Karzinom nicht aus. • In seltenen Fällen kann der Dx HR-HPV Auto Assay zu HPV-falschpositiven Ergebnissen führen, wenn die Probe zwei Intermediate-Risk-HPV (HPV 67 und HPV 85) enthält. • Wie bei jedem diagnostischen Test sollten die Ergebnisse des Dx HR-HPV Auto Assays in Zusammenhang mit anderen Labor- und klinischen Befunden interpretiert werden. 9. ERWARTETE WERTE Die Leistung des Bio-Rad Dx HR-HPV Auto Assay wurde an 2 verschiedenen Prüfstellen in Frankreich getestet: Es wurden 704 Proben von Frauen zusammengestellt, die aufgrund mindestens eines auffälligen Pap-Tests zur Nachkontrolle überwiesen worden waren (Prüfstelle 1), sowie 500 Proben von Frauen, denen anlässlich einer Routineuntersuchung bei ihrem Gynäkologen ein Pap-Abstrich entnommen worden war (Prüfstelle 2). Die in Tabelle 1 aufgeführte Prävalenz von Hochrisiko-HPV-Patienten in den untersuchten Kollektiven richtet sich nach dem klinischen Bild, dem Alter, Risikofaktoren, dem Geschlecht und dem Testverfahren. Die mit dem Dx HR-HPV Auto Assay unter Verwendung des Dx Collection Systems in klinischen Studien an den beiden Prüfstellen beobachteten Häufigkeiten positiver Proben sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 1: Prävalenz von HR-HPV (Prüfstelle 1)

Alle

Prävalenz Prüfstelle 1 in % >= CIN 2 9 % (63/703)

Alter: 18 bis ≤ 30

9 % (32/341)

Alter: 31 bis ≤ 39

11 % (18/172)

Alter: 40 und älter

6 % (11/190)

Tabelle 2: Häufigkeit HR-HPV-positiver Proben (Prüfstelle 1 und 2) Alter (Jahre) Mittelwert Median (+/- SD) [min - max]

Positivitätsrate %

N

Prüfstelle 1

34 (+/- 11)

31 [19 - 74]

64 %

452 (704):

Prüfstelle 2

39 (+/- 11)

37 [19 - 78]

17 %

79 (500):

15/25

10.

LEISTUNGSMERKMALE

10,1. Präzision 10.1.1 Reproduzierbarkeit und intermediäre Präzision Entsprechend den CLSI-Anweisungen EP5A2 wurden zwei Probenpanels (eines in Hologic ThinPrep und eines in Dx Collection System-Transportmedium von Bio-Rad) aus negativen Proben und HPV-positiven Proben in verschiedenen Konzentrationen (niedrig, mittel und hoch) hinsichtlich der intermediären Präzision in 4 Durchgängen von 2 Anwendern extrahiert. Diese Studie wurde mit 2 Dx Automated Extraction Assay-Chargen mit 2 Dx Prep Systemen innerhalb von 5 Tagen mit 1 Durchgang pro Tag durchgeführt. Der Assay wurde über 15 weitere Tage mit 2 Dx Automated Extraction Assay-Chargen und 1 Dx Prep System von 1 Anwender fortgesetzt. Der Variationskoeffizienz für jedes Merkmal (Charge - Instrument - Tag - Replikat) wurden anhand einer geschachtelten (Nested) ANOVA-Funktion ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3, 4 und 5 dargestellt. Tabelle 3: HPV-Target: Ergebnisse der Gesamtpräzision, der Interassay-Präzision und der InterChargen-Präzision je Panelkomponente-Cmin-Wert bei positiven Proben HPV Panel

Probe

Dx Collection System

Niedrig Mittel Hoch

ThinPrepVorrichtung

Niedrig Mittel Hoch

Extraktionscharge/ HPV-Charge Charge 1 & Charge 2 Charge 1 & Charge 2 Charge 1 & Charge 2 Charge 1 & Charge 2 Charge 1 & Charge 2 Charge 1 & Charge 2

Intra-Assay

Inter-Assay

Inter-Chargen

Gesamt

N

Mittelwert Cmin

SD

VK %

SD

VK %

SD

VK %

SD

VK %

160

32

0,64

2,0 %

0,28

0,9 %

1,72

5,4 %

1,86

5,9 %

160

29

0,56

1,9 %

0,21

0,7 %

0,41

1,4 %

0,73

2,5 %

160

27

0,50

1,8 %

0,41

1,5 %

0,25

0,9 %

0,70

2,6 %

40

34

0,77

2,3 %

0,21

0,6 %

0,44

1,3 %

0,91

2,7 %

40

31

0,64

2,1 %

0,47

1,5 %

0,04

0,1 %

0,79

2,6 %

40

28

0,66

2,3 %

0,45

1,6 %

0,41

1,4 %

0,90

3,2 %

Tabelle 4: HKG-Target: Ergebnisse der Gesamtpräzision, der Interassay-Präzision, der Präzision beim Vergleich von Analysetagen und der Intra-Assay-Präzision je Panelkomponente-Cmin-Wert bei positiven Proben 80 Replikate pro Probe und Charge (4 Replikate x 20 Tage) HKG

Intra-Assay

Panel

Probe

Dx Collection System

Niedrig Mittel Hoch

Extraktionsc harge/ HPV-Charge Charge 2 Charge 1

Inter-Assay

Zwischen den Analysetagen

Gesamt

SD

VK %

SD

VK %

SD

VK %

SD

VK %

80 80

Mittel wert Cmin 24 22

0,50 0,79

2,1 % 3,6 %

0,11 0,00

0,5 % 0,0 %

0,38 0,61

1,6 % 2,7 %

0,64 1,00

2,7 % 4,5 %

Charge 2

80

20

0,59

3,0 %

0,16

0,8 %

0,28

1,4 %

0,67

3,4 %

Charge 1

80

19

0,79

4,3 %

0,40

2,2 %

0,32

1,7 %

0,94

5,1 %

Charge 2

80

17

0,63

3,8 %

0,34

2,0 %

0,15

0,9 %

0,73

4,4 %

Charge 1

80

16

0,81

5,1 %

0,00

0,0 %

0,22

1,4 %

0,84

5,3 %

N

Hinweis: Bei der Studie zur intermediären Präzision testeten 2 HKG-negative Proben positiv.

16/25

10.1.2 Präzision zwischen Systemen Mit bis zu 3 Dx Prep Systems und bis zu 3 Dx Real-Time Systems (RTS) sowie 2 Dx Automated Extraction Assay-Chargen und 2 Dx HR-HPV Auto Assay-Chargen wurde an 1 Tag eine Studie zur Präzision zwischen Systemen durchgeführt. Die Studie zur Präzision zwischen Dx Prep SystemSystemen wurde anhand einer einseitigen ANOVA ausgewertet. Alle Akzeptanzkriterien waren korrekt: die negative Probe war negativ, die positiven Proben waren positiv; VK-Werte (berechnet ausgehend vom Cmin-Wert) der positiven Proben lagen hinsichtlich der Reproduzierbarkeit, der intermediären Präzision, der Gesamtpräzision und der Präzision zwischen Chargen und Systemen bei = 18 Jahre

Mit dem Bio-Rad Dx Collection System und Hologic ThinPrep-Flüssigkeit wurden Zytologieproben von 704 Frauen im Alter > 18 Jahren zusammengestellt, die aufgrund mindestens eines auffälligen Pap-Testergebnisses, einer HPV-Infektion oder aus anderen Gründen für Nachkontrollen überwiesen worden waren. Bei den meisten Proben lagen Ergebnisse aus der Zytologie und Histologie sowie Ergebnisse aus einem HPV DNA-Test (HPV-DNA) mit CE-Zeichen vor. In dem Testkollektiv wurden 4 Frauen aufgrund eines fehlerhaften Ergebnisses bei Verwendung des Dx Collection Systems sowie 1 Frau wegen wiederholten fehlerhaften Ergebnissen mit der ThinPrep- Systems von der Analyse ausgeschlossen. Die klinische Sensitivität und Spezifität hinsichtlich der Erkennung der Krankheit, definiert als zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN) 2 oder höher im Histologiebefund, wurden auch für das Gesamtkollektiv (unter Verwendung der beiden Probengewinnungssysteme) berechnet. a) Dx Collection System Tabelle 6: Ergebnisse mit dem Dx HR HPV Auto Assay von Bio-Rad und mit dem HPV DNA Assay mit CE-Zeichen verglichen mit dem zentralen Histologiebefund (mit Kolposkopiedaten) bei Frauen mit auffälliger Zytologie: Krankheitsverifizierungsstatus HPV DNA Assay Dx HR-HPV Auto Assay mit CE-Zeichen

< CIN2

CIN2

CIN 3

Gesamt

positiv

positiv

354

18

39

411

negativ

negativ

213

1

0

214

positiv

negativ

39

0

2

41

negativ

positiv

31

0

3

34

637

19

44

700

Gesamt

17/25

Tabelle 7: Übersicht über die Ergebnisse zur klinischen Leistungsmerkmale des Dx HR HPV Auto Assays von Bio-Rad und des HPV DNA Assays mit CE-Zeichen verglichen mit dem zentralen Histologiebefund (>=CIN2 und >=CIN3) bei Frauen mit auffälliger Zytologie: Dx HR-HPV Auto Assay Leistung ( %)

Mittelwert

95 % VI

Mittelwert

95 % VI

93,7 % (59/63)

(84,5; 98,2)

95,2 % (60/63)

(86,7; 99,0)

38,3 % (244/637)

(34,5; 42,2)

39,6 % (252/637)

(35,7; 43,5)

PPW

13,1 % (59/452)

(10,1; 16,5)

13,5 % (60/445)

(10,5; 17,0)

NPW

98,4 % (244/248) (95,9; 99,6) 9,0 % (63; 700)

Klinische Sensitivität Klinische Spezifität >=CIN2

Prävalenz

Klinische Sensitivität Klinische Spezifität >=CIN3

HPV DNA Assay mit CE-Zeichen

PPW NPW

98,8 % (252/255) (96,6; 99,8) 9,0 % (63; 700)

93,2 % (41/44)

(81,3; 98,6)

95,5 % (42/44)

(84,5; 99,4)

37,3 % (245/656)

(33,6; 41,2)

38,6 % (253/656)

(34,8; 42,4)

9,1 % (41/452)

(6,6; 12,1)

9,4 % (42/445)

(6,9; 12,5)

98,8 % (245/248) (96,5; 99,8) 6,3 % (44; 700)

Prävalenz

99,2 % (253/255) (97,2; 99,9) 6,3 % (44; 700)

PPW = Positiver prädiktiver Wert, NPW = Negativer prädiktiver Wert

Der Dx HR-HPV Auto Assay erzielte einen PPW von 13,1 % und 9,1 % bei einer klinischen Sensitivität von 93,7 % und 93,2 % innerhalb einer Zielbedingung >= CIN2 bzw. >=CIN3. Der HPV DNA Assay mit CE-Zeichen erzielte einen PPW von 13,5 % und 9,4 % bei einer klinischen Sensitivität von 95,2 % und 95,5 % innerhalb einer Zielbedingung >= CIN2 bzw. >=CIN3. Fünf CIN3-Proben (3 negative und 2 positive Proben) waren im Vergleich zwischen dem Dx HRHPV Auto Assay und dem HPV DNA Assay mit CE-Zeichen diskrepant. Von diesen 5 Proben wurden 4 genotypisiert (positiv), von denen 3 HPV-Typen aufwiesen, die im Dx HR-HPV Auto Assay nachgewiesen werden. Der Dx HR-HPV Auto Assay erkannte 2 dieser 3 Proben (HPV 16 und HPV 51), eine HPV16-Probe jedoch nicht, während der HPV DNA-Vergleichstest mit CE-Zeichen von diesen 3 Proben 1 HPV16Probe erkannte, zwei Proben (HPV 16 und HPV 51) jedoch nicht. b) Hologic ThinPrep-Abnahmesystem Tabelle 8: Ergebnisse mit dem Dx HR HPV Auto Assay von Bio-Rad und mit dem HPV DNA Assay verglichen mit dem zentralen Histologiebefund (mit Kolposkopiedaten) bei Frauen mit auffälliger Zytologie: Krankheitsverifizierungsstatus Dx HR HPV Assay

HPV DNA Assay mit CE-Zeichen

< CIN2

CIN2

CIN 3

Gesamt

positiv

positiv

348

18

39

405

negativ

negativ

228

1

1

230

positiv

negativ

25

0

1

26

negativ

positiv

39

0

3

42

640

19

44

703

Gesamt

18/25

Tabelle 9: Übersicht über die Ergebnisse zur klinischen Leistung des Dx HR HPV Auto Assays von Bio-Rad und des HPV DNA Assays mit CE-Zeichen verglichen mit dem zentralen Histologiebefund (>=CIN2 und >=CIN3) bei Frauen mit auffälliger Zytologie: Dx HR HPV Auto Assay Leistung ( %)

Mittelwert

95 % VI

Mittelwert

95 % VI

92,1 % (58/63)

(82,4; 97,4)

95,2 % (60/63)

(86,7; 99,0)

41,7 % (267/640)

(37,9; 45,7)

39,5 % (253/640)

(35,7; 43,5)

PPW

13,5 % (58/431)

(10,4; 17,1)

13,4 % (60/447)

(10,4; 16,9)

NPW

98,2 % (267/272) (95,8; 99,4) 9,0 % (63; 703)

Klinische Sensitivität Klinische Spezifität >=CIN2

Prävalenz

Klinische Sensitivität Klinische Spezifität >=CIN3

HPV DNA Assay mit CE-Zeichen

PPW NPW Prävalenz

98,8 % (253/256) (96,6; 99,8) 9,0 % (63; 703)

90,9 % (40/44)

(78,3; 97,5)

95,5 % (42/44)

(84,5; 99,4)

40,7 % (268/659)

(36,9; 44,5)

38,5 % (254/659)

(34,8; 42,4)

9,3 % (40/431)

(6,7; 12,4)

9,4 % (42/447)

(6,5; 12,0)

98,5 % (268/272) (96,3; 99,6) 6,3 % (44; 703)

99,2 % (254/256) (97,2; 99,9) 6,3 % (44; 703)

PPW = Positiver prädiktiver Wert, NPW = Negativer prädiktiver Wert

Der Dx HR-HPV Auto Assay erzielte einen PPW von 13,5 % und 9,3 % bei einer klinischen Sensitivität von 92,1 % und 90,9 % innerhalb einer Zielbedingung >= CIN2 bzw. >=CIN3. Der HPV DNA Assay mit CE-Zeichen erzielte einen PPW von 13,4 % und 9,4 % bei einer klinischen Sensitivität von 95,2 % und 95,5 % innerhalb einer Zielbedingung >= CIN2 bzw. >=CIN3. Vier CIN3-Proben (3 negative und 1 positive Probe) waren im Vergleich zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und dem HPV DNA Assay mit CE-Zeichen diskrepant. Von diesen 4 Proben wurden 3 genotypisiert (positiv), von denen 2 HPV-Typ 16 aufwiesen. Von diesen 2 HPV16-Proben wurde eine vom Dx HR-HPV Auto Assay und die andere von dem HPV DNA-Assay mit CE-Zeichen erkannt. 10.2.2 Nach Alter gestaffelte klinische Leistungsmerkmale: Bio-Rad Ergebnisse a) Dx Collection System von Bio-Rad: Die klinische Leistung des Dx HR-HPV Auto Assays von Bio-Rad bei Verwendung des Dx Collection Systems von Bio-Rad oder des ThinPrep-Abnahmesystems hinsichtlich einer Zielbedingung >= CIN2 wurde nach dem Alter der Patientinnen gestaffelt. Die ausgewählten Altersgruppen waren 18 bis ≤ 30; 31 bis ≤ 39 und 40 oder älter.

19/25

Tabelle 10: Übersicht über die klinische Leistung des Dx HR-HPV Auto Assay bei Verwendung des Dx Collection Systems und der ThinPrep-Vorrichtung und nach Alter stratifiziert, verglichen mit dem zentralen Histologiebefund (>=CIN2) bei Frauen mit auffälliger Zytologie. Dx HR-HPV Auto Assay mit Dx Collection System >= CIN2 95 % VI

Dx HR-HPV Auto Assay mit ThinPrep-Vorrichtung 95 % VI >= CIN2

Alter: 18 bis ≤ 30 Klinische Sensitivität t: Klinische Spezifität: PPW NPW Krankheitsprävalenz:

90,6 % 34,6 % 12,6 % 97,3 %

75,0 % - 98,0 % 29,3 % - 40,2 % 8,6 % - 17,5 % 92,2 % - 99,4 % 9,4 %

90,6 % 38,2 % 13,2 % 97,5 %

75,0 % - 98,0 % 32,8 % - 43,9 % 9,0 % - 18,4 % 92,9 % - 99,5 % 9,4 %

Alter: 31 bis ≤ 39 Klinische Sensitivität: Klinische Spezifität:

95,0 % 36,8 %

75,1 % - 99,9 % 29,2 % - 45,0 %

90,0 % 42,1 %

68,3 % - 98,8 % 34,2 % - 50,4 %

PPW NPW Krankheitsprävalenz:

16,5 % 98,2 %

10,3 % - 24,6 % 90,6 % - 100 % 11,0 %

17,0 % 97,0 %

10,4 % - 25,5 % 89,5 % - 99,6 %

71,5 % - 100 % 38,5 % - -53,7 % 5,3 % - 17,8 % 95,6 % - 100 % 5,9 %

100,0 % 47,5 % 10,5 % 100,0 %

10,5 %

Alter: 40 und älter Klinische Sensitivität: Klinische Spezifität: PPW NPW Krankheitsprävalenz:

100,0 % 46,0 % 10,4 % 100,0 %

71,5 % - 100 % 40,0 % - 55,1 % 5,4 % - 18,0 % 95,8 % - 100 % 5,8 %

Im Vergleich zwischen der ThinPrep-Vorrichtung und dem Dx Collection System mit dem Dx HRHPV Auto Assay von Bio-Rad wurden äquivalente Ergebnisse erzielt. Die PPW-Ergebnisse für die Altersgruppe 31 bis ≤ 39 Jahre sind höher als für die übrigen Altersgruppen. Darüber hinaus wurden die besten Sensitivitäts- und NPW-Ergebnisse für die Altersgruppe ab 40 mit der niedrigsten Krankheitsprävalenz erzielt (5,8 % bzw. 5,9 %). 10.2.3 Klinische Leistung: Vergleich mit einem HPV DNA Test mit CE-Zeichen Der Hochrisiko-HPV-Status jeder Probe wurde durch Konkordanz zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und einem HPV-DNA-Test mit CE-Zeichen und einer Zusatzanalyse der Proben mit diskordanten Ergebnissen mit einem auf DNA-Amplifikation beruhenden Genotypisierungstest ermittelt. Es wurden die Sensitivität und die Spezifität des Nachweises von HPV-DNA bestimmt. Der Vergleichstest und der DNA HPV-Test wurden als Referenztests bezeichnet. a) Dx Collection System: 1204 verschiedene Proben von den beiden Prüfstellen wurden mit dem Dx HR-HPV Auto Assay und einem DNA HPV-Test mit CE-Zeichen analysiert. 96 Proben erwiesen sich beim Vergleich der beiden HPV-Assays als diskordant und wurden unter Verwendung von Ergebnissen aus ergänzenden Tests (HPV-Typisierungsassay oder mit dem zweiten HPV PCR-Vergleichstest) analysiert. Nach Klärung der Diskrepanz wurden 78 Probenergebnisse von der Berechnung der Empfindlichkeit und der Spezifität ausgeschlossen.

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Tabelle 11: Vergleich zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und dem Vergleichstest nach Disprepanzklärung Vergleichstests

Dx HR-HPV Auto Assay

Gesamt

negativ

positiv

negativ

616

16

632

positiv

12

482

494

Gesamt

628

498

1126*

*78 ausgeschlossene Ergebnisse = 67 Ergebnisse waren wegen Diskordanz zwischen dem DNA HPV-Test und den Vergleichstests nicht signifikant + einem „ungültigen“ Fall in ergänzenden Tests + 10 fehlgeschlagene Ergebnisse mit dem Dx HR-HPV Auto Assay

Diagnostische Spezifität: 98,1 % (616/628) mit 95 % VI [96,7 %; 99,0 %] Diagnostische Sensitivität 96,8 % (482/498) mit 95 % VI [94,8 %; 98,2 %] Übereinstimmung zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und Vergleichstests: 97,5 % (1098/1126) mit 95 % VI [96,4 %; 98,3 %] Von den 498 als Hochrisiko-HPV-positiv getesteten Proben wurden 482 Proben mit dem Dx HRHPV Auto Assay erkannt. Von den 628 Hochrisiko-HPVnegativen Proben testeten 616 Proben im Dx HR-HPV Auto Assay negativ. Die diagnostische Sensitivität des Dx HR-HPV Auto Assay bei Verwendung des Dx Collection Systems betrug 96,8 %. Die diagnostische Spezifität entsprach 98.1 % mit einer allgemeinen Übereinstimmung von 97,5 % mit den Vergleichstests. b) Hologic ThinPrep- Abnahmesystems: 804 verschiedene Proben von den beiden Prüfstellen wurden mit dem Dx HR-HPV Auto Assay und einem DNA HPV-Test mit CE-Zeichen analysiert. 71 Proben erwiesen sich beim Vergleich der beiden HPV-Assays als diskordant und wurden unter Verwendung von Ergebnissen aus ergänzenden Tests (HPV-Typisierungsassay oder mit dem zweiten HPV PCR-Vergleichstest) analysiert. Nach Klärung der Diskrepanz wurden 45 Probenergebnisse von der Berechnung der Sensitivität und der Spezifität ausgeschlossen. Tabelle 12: Vergleich zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und dem Vergleichstest nach Disprepanzklärung Vergleichstests negativ Dx HR-HPV Auto Assay

positiv

Gesamt

negativ

295

22

317

positiv

5

437

442

Gesamt

300

459

759*

* 45 ausgeschlossene Ergebnisse = 44 Ergebnisse wurden aufgrund von Diskordanz zwischen dem DNA HPV-Test und ergänzenden Assays ausgeschlossen + 1 fehlgeschlagenes Ergebnis Mit dem Dx HR-HPV auto Assay

Diagnostische Spezifität: 98,3 % (295/300) mit 95 % VI [96,2 %; 99,5 %] Diagnostische Sensitivität: 95,2 % (437/459) mit 95 % VI [92,8 %; 97,0 %] Übereinstimmung zwischen dem Dx HR-HPV Auto Assay und Vergleichstests: 96,4 % (732/759) mit 95 % VI [94,9 %; 97,6 %]

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Von den 459 als Hochrisiko-HPV-positiv getesteten Proben wurden 437 Proben mit dem Dx HRHPV Auto Assay erkannt. Von den 300 Hochrisiko-HPV negativen Proben testeten 295 Proben im Dx HR-HPV Auto Assay negativ. Die diagnostische Sensitivität des Dx HR-HPV Auto Assay bei Verwendung der Hologic ThinPrep-Abnahmesystems betrug 95,2 %. Die diagnostische Spezifität entsprach 98.3 % bei einer allgemeinen Übereinstimmung von 96,4 % mit den Vergleichstests. 10,3. Nachweisgrenze Die Ermittlung der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) erfolgte mithilfe der Probit-Analyse mit der entsprechenden Verdünnung mit einem positiven Niveau von 95 %. Für jeden Analyt wurde eine Verdünnungsreihe erstellt und 22 Mal getestet. Tabelle 13: LOD von 13 HR-HPV und LOD von HKG: In Dx Collection System

HPV

HPV 16

HPV 18

HPV 45

HPV 31

HPV 33

HPV 58

HPV 52

86

2912

479

165

851

176

225

95 % VI

60-184

2282-4424

353-793

117-329

643-1426

129-311

151-514

HPV

HPV 35

HPV 59

HPV 56

HPV 51

HPV 68

HPV 39

HKG

525

426

552

457

1833

153

272

418-753

343-622

454-1019

294– 993

1576-2439

113-339

210-433

LOD (Kopien/ml)

LOD (Kopien/ml) 95 % VI

10.4. Analytische Spezifität 10.4.1 Studie zur Kreuzreaktivität Die analytische Spezifität des Dx HR-HPV Auto Assays wurde mit einem Panel von vermutlich Nicht-Hochrisiko-HPV-Viren und anderen Mikroorganismen untersucht, die >=16 Krankheiten (viral) 32 Nichtrisiko-HPV und Intermediärrisiko-HPV und >= 135 Pathogene oder Mikroorganismen mit möglicher Kreureaktivität repräsentierten.

Alle Stämme wurden kultiviert, auf 106 CFU/ml in Dx Collection System + Hologic ThinPrepVorrichtung kalibriert, extrahiert und mit dem Dx HR-HPV Auto Assay getestet. Von den 32 NichtHR-HPV lagen 106 Kopien/ml vor, von den anderen Viren 105 Kopien/ml.

Zwei Intermediärrisiko-HPV (HPV 67 und HPV 85) lieferten mit dem Dx Collection System und der Hologic ThinPrep-Vorrichtung ein positives Ergebnis, sodass eine Assayspezifität von 98,9 % VI 95 % [96,1 % - 99,9 %] erhalten wurde.

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Tabelle 14: Kreuzreaktivität mit Pathogenen Haemophilus parahemolyticus Saccharomyces griseus Pseudomonas aeruginosa Gemella haemolysans Streptococcus sanguinis Corynebacterium pseudodiphtheriticum Bacillus thuringiensis Rhodospirillum rubrum Klebsiella pneumoniae subsp. Ozaenae Aerococcus viridans Escherichia coli Actinomyces israelii Actinomyces naeslundii Staphylococcus epidermidis Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis Streptococcus pyogenes Chromobacterium violaceum Staphylococcus aureus Pasteurella multocida Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Salmonella enterica Serovar Enteritidis Neisseria meningitidis Neisseria flavescens(2) Flavobacterium (Elizabethkingia) meningosepticum Streptococcus salivarius Pseudomonas fluorescens Stenotrophomonas maltophilia Corynebacterium diphteriae Streptococcus agalactiae Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae Deinococcus radiodurans Gardnerella vaginalis Enterococcus avium Salmonella enterica serovar Typhimurium Plesiomonas shigelloides Candida albicans Neisseria flava Neisseria cinerea Neisseria (Bergeriella) denitrificans Achromobacter xerosis Neisseria perflava Lactobacillus brevis Staphylococcus saprophyticus Acinetobacter lwoffi Bordetella parapertussis Listeria monocytogenes Bifidobacterium breve Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium longum Paracoccus denitrificans Moraxella lacunata Staphylococcus saprophyticus Neisseria (Nocardia) asteroïdes Lactococcus lactis subsp. cremoris Agrobacterium (rhizobium) radiobacter (radiobacter) EBV Influenza B CMV HSV-1 HSV-2

Actinomyces (Arcanobacterium) pyogenes (pyogenes) Erysipelothrix rhusiopathiae Neisseria gonorrhoeae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Acinetobacter baumannii Neisseria mucosa (3) Moraxella osloensis Candida glabrata Aspergillus fumigatus Candida parapsilosis Acinetobacter calcoaceticus Eikenella corrodens Neisseria lactamica(9) Streptococcus mutans (carie) Moraxella (Branhamella) catarrhalis (catarrhalis) Lactobacillus jensenii Neisseria elongata (3) Fusobacterium nucleatum Saccharomyces cerevisiae Morganella morganii Bacteroides (Prevotella) melaninogenicus Peptostreptococcus anaerobius Ruminococcus (Blautia) productus (producta) Streptococcus constellatus Gemella morbillorum Rhodococcus (Gordonia) chubuensis (sputi) Lactobacillus acidophilus Pseudomonas putida Cryptococcus neoformans Corynebacterium genitalium Rahnella aquatilis Legionella pneumophila Legionella micdadei Erwinia (Pantoea) herbicola (agglomerans) Porphyromonas gingivalis Weissella paramesenteroides Streptococcus bovis Kingella kingae (denitrificans) Streptococcus anginosus Prevotella corporis Campylobacter jejuni Rhodococcus (Gordonia) aichiensis (aichiensis) Lactobacillus crispatus Ewingella americana Haemophilus ducreyi Streptococcus oralis Mobiluncus curtisii subsp. holmesii Actinomyces meyeri Corynebacterium xerosis Neisseria polysaccharea Corynebacterium xerosis Neisseria subflava Lactobacillus vaginalis Providencia stuartii Citrobacter braakii Bacillus subtilis HCV Varicella Zoster-Virus HBV Enterovirus

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Streptococcus mitis Streptococcuspneumoniae Propionibacteriumacnes Rhodococcusequi Proteusmirabillis Klebsiellaoxytoca Candidatropicalis Haemophilusparainfluenzae Aeromonashydrophila Pediococcusacidilactici Citrobacter freundii Leuconostocmesenteroides Proteusvulgaris Alcaligenesfaecalis Haemophilusinfluenzae Brevibacterium linens Yersinia enterocolitica Bordetella pertussis Neisseria sicca (3) Corynebacterium striatum Tatlockia micdadei HPV 11 HPV 13 HPV 26 HPV 30 HPV 32 HPV 34 HPV 40 HPV 42 HPV 44 HPV 53 HPV 57 HPV 62-1 HPV 62-2 HPV 66 HPV 67 HPV 6B HPV 70 HPV 72 HPV 73 HPV 74 HPV 7-7/4 HPV 81 HPV 82 HPV 84-2 HPV 85 HPV 86-1 HPV 87-5 HPV 89-3 HPV 90-3 HPV 91-4 HPV43.2A HPV54 HAV Adenovirus Typ 5 Adenovirus Typ 7A Adenovirus Typ 1 / Influenza A H1 West Nile-Virus HIV /

10.4.2 Studie zur Interferenz Gemäß der CLSI-Anweisung EP07-A2 wurde mittels endogener oder exogener Substanzen, die in verschiedenen Proben vorhanden sein könnten, auf mögliche Interferenzen mit dem Dx HR-HPV Auto Assay. Vierzehn Substanzen wurden auf verschiedene Endkonzentrationen verdünnt und einem Abstrichpool in Dx Collection System-Transportmedium oder einem Urinpool, welche die Zielorganismen HPV und HKG in einer Konzentration von ungefähr dem Dreifachen der Nachweisgrenze enthielten, sowie einem Abstrichpool in Dx Collection System-Transportmedium ohne diese 2 Zielorganismen zugegeben. Jede Bedingung wurde in 7 Replikaten getestet. Es wurden folgende Substanzen getestet: Tabelle 15: Interferierende Substanzen Interferierende Substanz Trophycreme (Östrogen) Sensilube (Gleitgel) Flagyl (bakterizid) Aciclovir (antiherpetisch) Gyno-Daktarin (antimykotisch) Polygynax (antimykotisch) Progesterone biogaran Fazol G (antimykotisch) Econazole (bakterizid und antimykotisch) Monazole (bakterizid und antimykotisch) Lomexin (antimykotisch) Pharmatex (spermizid) Essigsäure Blut

Konzentration

Matrix

5% 5% 5% 5% 5% 5% 5% 5%

Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium

5%

Transportmedium

5%

Transportmedium

5% 5% 5% 0,1 %

Transportmedium Transportmedium Transportmedium Transportmedium

Keine der potenziell wechselwirkenden Verbindungen bewirkte in den in der obigen Tabelle angegebenen Konzentrationen signifikante Diskordanz und eine Beeinflussung der Auswertung oder der Cmin-Ergebnisse im Dx HR-HPV Auto Assay. 11. LITERATUR 1- Monsonego, J., Bosch, F. X., Coursaget, P., Cox, J. T., Franco, E., Frazer, I. et al. Cervical cancer control, priorities and new directions. (2004). Int J Cancer 108: 329- 333. 2 Munoz, N., Castellsague, X., de Gonzalez, A. B., and Gissmann, L. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. (2006) Vaccine 24S3: S1-S10. 3- Koshiol J., Lindsay L., Pimenta JM., Poole C., Jenkins D., and Smith JS. Persistent Human Papillomavirus Infection and Cervical Neoplasia: A Systematic Review and Meta-Analysis. (2008) Am J Epidemiol 168:123–137 4- Dalstein, V., Riethmuller, D., Pretet, J. L., Le Bail, C. K., Sautiere, J. L., et al. Persistence and load of high-risk HPV are predictors for development of high-grade cervical lesions: a longitudinal French cohort study. (2003) Int J Cancer 106: 396-403. 5- Schiffman M., Wentzensen N., Wacholder S., Kinney W., Gage JC.,. Castle PE. Human Papillomavirus Testing in the Prevention of Cervical Cancer .(2011) J Natl Cancer Inst 103:368–383

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6- Rijkaart DC, Berkhof J., van Kemenade FJ. , Coupe VMH., Rozendaal L. et al . HPV DNA testing in population-based cervical screening (VUSA-Screen study): results and implications. (2012) British Journal of Cancer 106, 975 – 981

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