Mal de Parkinson:

Un fragmento no tóxico de la toxina tetánica: probable alternativa en la terapéutica de esta enfermedad Ilhuicamina Daniel Limón, Aleidy Patricio, Liliana Mendieta, Berenice Venegas, José Aguilera e Isabel Martínez

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as enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de neuronas en regiones específicas del cerebro. James Parkinson propuso por primera vez en 1917 una enfermedad denominada “Parálisis agitante o parálisis temblorosa” la cual ahora lleva su nombre. Los síntomas característicos de la Enfermedad de Parkinson (EP) son: la bradicinesia, que se observa como lentitud y escasez de movimientos, la rigidez muscular del tronco y las extremidades dando como resultado posturas anormales, temblor en reposo, y trastornos del equilibrio postural, lo que genera alteraciones en la iniciación de la marcha y pérdida del equilibrio con caídas frecuentes (figura 1). La EP es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común ya que afecta del 1 al 2% de las personas mayores de 65 años de edad. En México se presenta en poco más de 50 personas por cada 100 mil habitantes, con prevalencia en el sexo masculino, según el Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía. En el laboratorio de Neurofarmacología de la

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BUAP, Parra Cid en el 2003 presentó un estudio fármaco epidemiológico de la incidencia de la EP en Puebla, realizado en tres unidades hospitalarias y reportó 54 casos entre los años 20002001. La mayor prevalencia fue en hombres mayores de 66 años.

Figura 1. Síntomas clásicos de la Enfermedad de Parkinson. Rigidez, temblor, trastorno en equilibrio postural y dificultad al caminar.

“…En Puebla, entre los años 2000-2001 se reportaron 54 casos de EP. La mayor prevalencia fue en hombres mayores de 66 años…” Artículos de Divulgación

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Si bien la etiología de la EP es principalmente idiopática (99.0 %), también se han asociado como factores de riesgo la exposición a contaminantes ambientales como insecticidas o metales pesados. Sólo 1% de los casos es de tipo genético, se han descrito dos mutaciones, una localizada en el gen de la proteína α-sinucleína en el cromosoma 4 y otra en el gen parkina, ubicado en el cromosoma 6 de las personas con parkinsonismo juvenil. Posteriormente se localizaron otras mutaciones genéticas en el cromosoma 2 (parkin 3) y en el cromosoma 4 (parkin 4), dichas mutaciones inducen disfunción celular, lo que conduce a la muerte neuronal. En 1960, Oleh Hornykiewicz encontró en cerebros de pacientes parkinsonianos una disminución severa de los niveles de dopamina (DA) -un neurotransmisor necesario para las conductas motoras-, en el núcleo caudado y putamen. Estos hallazgos dieron la pauta a que la terapia para dichos pacientes fuese a base de DA; a pesar de no atravesar la barrera hematoencefálica. En estos años, Arvid Carlsson inició una serie de experimentos utilizando la reserpina (una sustancia natural que se extrae de la raíz Rauwolfia serpentina y que vacía las vesículas de DA de las terminales nerviosas) produciendo un estado de parkinsonismo en animales de laboratorio, observando una gran disminución de movimientos espontáneos los cuales mejoraron al tratarlos con L-Dopa (el precursor de DA). Concluyó que las alteraciones causadas por la reserpina eran semejantes a la EP. Además mostró que la L-Dopa normalizaba los niveles de DA en zonas del cerebro carentes de este neurotransmisor. A partir de estas innovaciones se introdujo la L-Dopa en la terapéutica, la cual dio impresionantes mejorías en los pacientes y sigue siendo el fármaco por excelencia en esta patología. Si bien en los primeros años de tratamiento con la L-Dopa se generan grandes beneficios, ya que se revierte la acinesia y el temblor, dando como resultado la mejoría en los movimientos de estos pacientes. El problema surge después de varios años de tratamiento con l-dopa, ya que comienza a ser ineficaz y genera otros problemas motores, tales como las discinesias que se presentan 22

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como movimientos involuntarios anormales de las extremidades superiores o inferiores (Obeso y cols., 2000). Además, se genera un deterioro cognitivo debido a su posible efecto neurotóxico (Mendieta y cols. 2004). Por ello se recomienda el uso de L-Dopa, pero no al inicio del tratamiento, sino después del uso de fármacos anticolinérgicos o agonistas dopaminérgicos, entre otros.

“…La L-Dopa produce mejorias en la Enfermedad de Parkinson, sin embargo no logra disminuir la muerte neuronal…” Los fármacos anticolinérgicos son empleados para disminuir el desequilibrio entre la DA y la acetilcolina, como el biperideno y trihexifenidilo los cuales mejoran algunos síntomas al inicio de la patología, sin detener el progreso de la enfermedad. Otras alternativas son los inhibidores de las enzimas encargadas del metabolismo de la DA, como la monoaminoxidasa-B (MAO-B) y la catecol-orto-metiltransferasa (COMT), que llevan al incremento de los niveles de DA, como la selegilina facilitando las conductas motoras.

“…Es necesaria la busqueda de nuevos fármacos neuroprotectores que atenuen la muerte neuronal en la EP…” En los últimos años se ha sugerido el uso de antagonistas A2A y derivados de las xantinas como la cafeína para mejorar la sintomatología en la EP. Recientes estudios proponen el uso de factores neurotróficos, un grupo de proteínas que regulan el número de neuronas, plasticidad y diferenciación celular. Uno de los más importantes por sus propiedades de inducir efectos neuroprotectores es el factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), ya que no sólo promueve la supervivencia sino que contrarresta la muerte neuronal. Además, ha mostrado tener efectos neurorestauradores en modelos de EP, esto debido a que activa a receptores Trk, involucrados en la supervivencia y diferenciación celular, activando diferentes cascadas de señalización. Sin embargo, aunque el GDNF parece ser atractivo en la terapéutica de EP, no 2008

puede atravesar la barrera hematoencefálica, por lo que es necesario su administración local (Maxim M. y Mart., 2007). Debido a que los tratamientos hasta el momento no han detenido el proceso neurodegenerativo, actualmente se están buscando nuevos fármacos que ayuden tanto a retardar la muerte neuronal y/o a mejorar las funciones motoras de los pacientes parkinsonianos.

“…El GDNF y el fragmente Hc-TeTx inducen sobrevivencia celular…” Recientemente, se propone como una nueva alternativa al fragmento C-terminal de la tóxina tetánica (Hc-TeTx) como un agente neuroprotector, ya que se ha mostrado que es un fragmento atóxico de la toxina tetánica que puede ser transportado retroaxonalmente y acumularse en el Sistema Nervioso Central (SNC), conduciendo a la especulación de que fragmento Hc-TeTx se puede utilizar como un portador neurotrófico, además de poseer propiedades de transporte retro-axonal que le permiten llegar a todos los sistemas neuronales. Al evaluar los efectos del fragmento Hc-TeTx in-vitro, se encontró que disminuye la muerte de neuronas dopaminérgicas en cultivos. Actualmente, los primeros estudios sobre sus efectos en modelos animales han mostrado mejorías motoras (Mendieta, 2006), lo que ha alentado a continuar investigando sus efectos neuroprotectores.

La toxina tetánica es producida por la bacteria Clostridium tetani, causante del tétanos, una enfermedad que induce una fuerte contracción muscular conocida como parálisis espástica. Pertenece a la larga familia de las neurotoxinas clostridiales (NTC) y actúa sobre el sistema nervioso central y periférico, sin embargo la cadena ligera (L-TeTx) es la responsable de efecto tóxico. Recientes estudios han demostrado que un fragmento inocuo de esta toxina (Hc-TeTx) disminuye la muerte neuronal en cultivos celulares frente a MPP+.

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El fragmento c-terminal de la toxina tetánica como una estrategia farmacológica

La toxina tetánica (TeTx) es una de las más letales, es la responsable de inhibir la liberación de neurotransmisores, lo que induce la enfermedad conocida como tétanos. El dominio C-terminal es el que permite la unión de la TeTx a la membrana celular del SNC y periférico (SNP), entrando a las terminales neuronales por endocitosis y siendo transportada retroaxonalmente hasta las neuronas intercalares inhibidoras de la medula espinal (Schiavo, 1992), induciendo fuertes contracciones. El precursor de la TeTx es una cadena polipeptídica con un peso molecular aproximado de 150 kDa. La forma activa se produce por la hidrólisis del enlace peptídico produciendo dos cadenas unidas por un puente disulfuro: la cadena ligera L-TeTx (N-Terminal) de 50 kDa y la cadena pesada H-TeTx (C-terminal) de 100 kDa (figura 2). Posteriormente, la H-TeTx es cortada por una proteasa (papaína) produciendo dos fragmentos: el fragmento HN-TeTx y el fragmento Hc-TeTx. Tanto la TeTx y el fragmento HcTeTx entran a las terminales nerviosas por endocitosis. Se ha demostrado que el fragmento HcTeTx puede ser transportado por las neuronas de manera similar a la toxina nativa sin ocasionar los síntomas clínicos (Bizzini y cols., 1997). Por esta razón, este fragmento se pudiera utilizar como vehículo eficiente para transportar productos exógenos como lo son algunos fármacos.

Figura 2. Esquema de la obtención del fragmento HcTeTx a partir de la toxina tetánica.

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Para entender la acción del fragmento HcTeTx en SNC se evaluó en cultivos celulares, lo que llevó al hallazgo de que dicho fragmento activa cascadas de señalización como los factores de crecimiento (NGF o BDNF), que mejoran los procesos de supervivencia celular. Estudios realizados por el grupo de Aguilera (comunicado personal) dieron las primeras evidencias de los efectos del Hc-TeTx frente al daño por MPP+ y determinaron que prolonga la supervivencia celular posiblemente por la acción protectora del fragmento, es por ello que el estudio de éste permitirá evaluar si ejerce un efecto neuroprotector y mejora las conductas motoras en un modelo in vivo.

“…La conducta de giro ha mostrado ser un modelo eficaz para evaluar nuevos fármacos antiparkinsonianos…”

En experimentos in vitro, realizados por el grupo del Dr. Aguilera, mostraron que al aplicar el fragmento Hc-TeTx en neuronas granulares de cerebelo a las cuales se les indujo muerte por estrés, éstas sobreviven más que las no tratadas, ya que se activan vías de protección frente al daño de forma similar al efecto causado por factores de crecimiento celular (ChaibOükadour y cols., 2004). Por ahora, nuestros resultados refuerzan la hipótesis del posible efecto como antiparkinsoniano del fragmento Hc-TeTx, ya que mejora las conductas motoras, y posiblemente retarde el proceso neurodegenerativo. Sin embargo, es necesario continuar con el estudio de sus efectos, tanto en modelos in-vitro como in- vivo, para poder dilucidar su mecanismo de protección y sus efectos en el modelo de lesión unilateral con 6-OHDA.

Por otra parte, la 6-Hidroxidopamina (6OHDA) es una neurotoxina que resulta útil para estudiar la fisiopatología y nuevas terapéuticas para la EP. Esta sustancia, al ser inyectada de forma unilateral, produce una asimetría motora en los animales, la cual puede ser evaluada por medio de la prueba de conducta de giro. Esta última se evalúa al administrar metanfetamina, produciendo la liberación de DA e induciendo giros dirigidos hacia el lado lesionado (ipsilaterales). Dicha prueba refleja la lesión dopaminérgica en la SNpc y estriado asociado con una pérdida neuronal de aproximadamente un 90%. En el 2006, en el Laboratorio de Neurofarmacología FCQ-BUAP, Mendieta mostró que la administración del fragmento Hc-TeTx a diferentes dosis mejora las conductas motoras en ratas lesionadas con 6-OHDA en vías nigroestriatales, entre las cuales los mejores resultados se encontraron a la dosis de 2 μM (figura 4). Los resultados que se obtuvieron en el modelo anterior nos indican que el número de giros ipsilaterales disminuye en las ratas administradas con Hc-TeTx/6OHDA en comparación del grupo administrado sólo con 6-OHDA. Esta información muestra que hay mejorías motoras en el modelo de EP, probablemente debido a que esta fracción ayuda a incrementar la eficacia en la neurotransmisión dopaminérgica y a su efecto neuroprotector. 24

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Figura 3. Número total de giros ipsilaterales durante la prueba de asimetría motora. Los grupos Hc-TeTx/6OHDA a una dosis de 2 μM del fragmento muestran una disminución significativa del número total de giros en 60 min respecto a su control 6-OHDA.

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“…El fragmento Hc-TeTx ha mostrado activar vías de sobrevivencia celular y mejorar conductas motoras en modelos animales de EP…” Actualmente, en el laboratorio se desarrollan diversos experimentos en modelos de asimetría motora, con la finalidad de encontrar mas evidencias del papel trófico del fragmento Hc-TeTx en el sistema dopaminérgico en las conductas motoras en ratas hemiparkinsonianas. Los resultados han sido favorables hasta el momento, lo que abre nuevas expectativas para seguir con el estudio de dicho fragmento. Glosario

Acinesia: Ausencia o pérdida del poder de realizar movimientos voluntarios. Barrera hematoencefálica: Mecanismo selectivo que se opone al pasaje de la mayoría de los iones y compuestos con moléculas grandes desde la sangre al tejido cerebral localizado en una capa continua de células endoteliales unidas estrechamente. Endocitosis: Proceso por el cual una célula incorpora material por invaginación de la membrana plasmática. Espasmo muscular: Contracción muscular involuntaria; aumento de la tensión y disminución de longitud de un músculo que no puede liberarse voluntariamente y que impide el alargamiento de los músculos afectados. Metabolito: Cualquier producto del metabolismo, especialmente del catabolismo. Neurotransmisor: Sustancia química sintetizada por las células nerviosas y utilizada para comunicarse con otras células, inclusive nerviosas y musculares. Nigroestriado: Que guarda relación entre la conexión eferente de la sustancia negra y el cuerpo estriado. Proteasa: Enzima que fragmenta las proteínas en partes más pequeñas. Transporte retroaxonal: Transporte de materiales desde la terminal nerviosa al soma, por ejemplo: los factores de crecimiento nervioso que son transportados al cuerpo celular y estimulan el crecimiento neuronal.

Bibliografía 1. Bizzini B., Stoeckel K., Schwap M., (1977) “An antigenic polipeptide fragment isolated from tetanus toxin: chemical characterization, binding to gangliosides and retrograde axonal transports in various neuron systems”, J. Neurochem, 28: 529-542. 2. Chaib O., Gil C., Aguilera A., (2004) “The C-terminal domain of the heavy chain of tetanus toxin rescues cerebellar granule neurons from apoptotic death: involvement of 2008

phosphatidylinositol 3-kinase and mitogenactivated protein kinase pathways”, J. Neurochem, 90:1227-1236. 3. Maxim M., Mart S., (2007) “GDNF family complexes are emerging drug targets”, TRENDS Pharmacol Sciences, 28: 68-74. 4. Mendieta M., (2004). Tesis de licenciatura: Efectos de la administración crónica de L-Dopa en rata lesionada con 6-OHDA en la SNc sobre: A) La memoria B) El óxido nítrico, FCQ-BUAP. 5. Mendieta M., (2006). Tesis de Maestría: Efectos de la fracción Hc de la toxina tetánica sobre las conductas motoras y NFκB en rata lesionada con 6-OHDA, FCQ-BUAP. 6. Obeso J., Olanow C., Nutt J., (2000) “Levodopa motor complications in Parkinson’s disease”, TINS, 23:10 7. Parra C., (2003). Tesis de Maestría: Estudio fármaco terapéutico y búsqueda de una nueva alternativa farmacológica en la enfermedad de Parkinson con antagonistas A2A, FCQ-BUAP. 8. Schiavo G., Benfenati F., Poulain B., Rossetto O., DeLaureto P., Monteccuco C., (1992) “Tetanus toxin and botulinum-B neurotoxin neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin”, Nature, 359:832-835. Ilhuicamina Daniel Limón Pérez de León obtuvo el título de Quimicofarmacobiólogo por la Facultad de Ciencias Químicas (FCQ-BUAP), la Maestría en Ciencias en Farmacología Conductual UNAM 1994, cDr, Quimicobiologicas ENCB-IPN 2007. Actualmente es Profesor Investigador Titular “A” 1985-2008 y desempeña varios cargos dentro de la Facultad de Ciencias Químicas de la (BUAP). Es profesor perfil PROMEP-SEP 2008-2010, miembro del Padrón de Investigadores de la BUAP 2008-2012 y lleva a cabo proyectos en colaboración con el laboratorio de Enfermedades Neurodegenerativas del INNN; Laboratorio de Bioquímica de la Universidad de Barcelona España y con el Laboratorio de Pruebas de toxicología Pre-clínica ENCB-IPN. [email protected] Los autores Aleidy Patricio, Liliana Mendieta, Berenice Venegas e Isabel Martínez realizan investigaciones en colaboración con el Dr. Limón y pertenecen al laboratorio de Neurofarmacología FCQ-BUAP, México. El Dr. José Aguilera es investigador del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Barcelona, España.

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