es: Elson, Esteve W.;

k 19 ˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS k 2 156 703 kN´umero de solicitud: 009900219 kInt. Cl. : C07D 491/052, C07D 493/04 11 N´ umero de pub...
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19

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

k 2 156 703 kN´umero de solicitud: 009900219 kInt. Cl. : C07D 491/052, C07D 493/04

11 N´ umero de publicaci´on: 21

7

51

˜ ESPANA

C07D 311/22, C12P 17/18 C12N 1/14, A61K 31/535 A61K 31/365, A61P 31/04 //(C07D 491/052, C07D 311:00 C07D 213:16), (C07D 493/04 C07D 311:00, C07D 309:30) (C12N 1/14, C12R 1:645)

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12

SOLICITUD DE PATENTE

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22 Fecha de presentaci´ on: 03.02.1999

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71 Solicitante/s: SmithKline Beecham S.A.

C/ Valle de la Fuenfr´ıa, 3 28034 Madrid, ES

k

72 Inventor/es: Elson, Esteve W.;

k

74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 01.07.2001

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

01.07.2001

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D´ıez Monedero, Emilio; S´ anchez-Puelles, Jos´ e Mar´ıa; Hueso Rodr´ıguez, Juan Antonio; Macarr´ on Larumbe, Ricardo y Carranza L´ opez-Carpintero, Carmen

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k kResumen:

54 T´ıtulo: Derivados de benzopiranona como inhibidores de aminoacil ARN-t-sintetasas.

ES 2 156 703 A1

57

Derivados de benzopiranona como inhibidores de aminoacil ARN-t-sintetasas. La invenci´ on describe tres derivados relacionados de la benzopiranona, uno de los cuales se representa en la f´ ormula (I), y su uso como inhibidores de la enzima bacteriana histidil-tRNA sintetasa. Los compuestos son producidos por la fermentaci´on del hongo Chaetomium funicola. Los compuestos son ´utiles en el tratamiento de infecciones bacterianas.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

A1

ES 2 156 703 A1 DESCRIPCION Derivados de benzopiranona como inhibidores de aminoacil ARN-t-sintetasas. 5

10

15

20

25

30

35

La presente invenci´on se refiere a compuestos que se pueden obtener a partir de microorganismos, a los procedimientos para la producci´on de los mismos, a compuestos derivados por modificaci´on qu´ımica, enzim´atica o biol´ ogica de dichos compuestos, al uso de dichos compuestos en el tratamiento de infecciones bacterianas, y a las nuevas formulaciones farmac´euticas que incorporan dichos compuestos. Las infecciones bacterianas son muy comunes en la comunidad humana y son la causa de una gran variedad de enfermedades. Las cepas bacterianas est´an adquiriendo cada vez m´as resistencia a las terapias existentes, aumentando as´ı la necesidad de buscar nuevas estrategias para el tratamiento de tales enfermedades. Ciertas enzimas bacterianas que son esenciales para la supervivencia y el crecimiento de las bacterias suponen una diana viable para conseguir este objetivo. Las aminoacil-tRNA sintetasas son una familia de enzimas que desempe˜ nan un papel fundamental en la bios´ıntesis de prote´ınas. Existen veinte de estas enzimas que corresponden a los veinte amino´acidos que se usan para construir prote´ınas, y dichas enzimas son esenciales para que la c´elula funcione debidamente (Von der Haar et al., Angewandte Chemie, Intl. Eng. Ed., 217, 20, 1981). La diferencia entre las enzimas bacterianas (c´elulas procari´ oticas) y las enzimas que se encuentran en la c´elulas eucari´oticas de los mam´ıferos es suficientemente grande para permitir la inhibici´ on selectiva de la actividad enzim´atica bacteriana sin mayores consecuencias para el funcionamiento de las c´elulas de mam´ıferos. Por tanto, se anticipa que la inhibici´on selectiva de estas enzimas bacterianas no tenga efectos secundarios graves para mam´ıferos, pero tal inhibici´ on es mortal para la c´elula bacteriana, debido al papel fundamental de las enzimas bacterianas en el metabolismo de la c´elula. Por consiguiente, tal inhibidor enzim´ atico ser´a u ´ til en el tratamiento de infecciones bacterianas (Broom et al., Journal of Antibiotics, 1336, 48, 1995 y referencias en el mismo art´ıculo). En el transcurso de estudios, se ha descubierto que ciertos metabolitos microbianos pueden actuar como inhibidores selectivos de la enzima bacteriana histidil-tRNA sintetasa (HRS de ahora en adelante), un miembro de la familia de las aminoacil-tRNA sintetasas, y por tanto pueden ser u ´tiles para el tratamiento de infecciones bacterianas en seres humanos y otros animales. Estos compuestos son tambi´en inhibidores de beta-lactamasa (solicitud Espa˜ nola de patente pendiente, n´ umero de solicitud P9602366) De acuerdo con esto, la presente invenci´ on proporciona los compuestos SB236049, SB236050 y SB238569, y sales y derivados farmac´euticamente aceptables de los mismos, como inhibidores de HRS. El compuesto SB236049 tiene las siguientes caracter´ısticas:

40

(i) Puede obtenerse mediante el cultivo de microorganismos, que pueden ser t´ıpicamente cepas de hongos, especialmente las que pertenecen al g´enero Chaetomium o g´eneros taxon´omicamente relacionados. (ii) Es un inhibidor de enzimas y particularmente de HRS bacteriana.

45

(iii) Su peso molecular es 287 tal como se determina por espectrometr´ıa de masas con ionizaci´on por electrones (EI). (iv) Este peso molecular es consistente con la f´ormula molecular C14 H9 NO6 .

50

(v) Tiene la estructura (I) tal como se determin´o por cristalograf´ıa de rayos X. (vi) Tiene las propiedades espectrosc´opicas mostradas en la Tabla 1.

55

60

2

ES 2 156 703 A1 El compuesto SB236050 tiene las siguientes caracter´ısticas:

5

(i) Puede obtenerse mediante el cultivo de microorganismos, que pueden ser t´ıpicamente cepas de hongos, especialmente las que pertenecen al g´enero Chaetomium o g´eneros taxon´omicamente relacionados. (ii) Es un inhibidor de enzimas y particularmente de HRS bacteriana. (iii) Su peso molecular es 322 tal como se determina por espectrometr´ıa de masas con ionizaci´on por electrones (EI).

10

(iv) Este peso molecular es consistente con la f´ormula molecular C15 H14 O8 . (v) Tiene las propiedades espectrosc´ opicas mostradas en la Tabla 2.

15

(vi) Estas propiedades espectrosc´ opicas son consistentes con la estructura molecular II, aunque no se excluyen otras estructuras.

20

25

El compuesto SB238569 tiene las siguientes caracter´ısticas:

30

(i) Puede obtenerse mediante el cultivo de microorganismos, que pueden ser t´ıpicamente cepas de hongos, especialmente las que pertenecen al g´enero Chaetomium o g´eneros taxon´omicamente relacionados. (ii) Es un inhibidor de enzimas y particularmente de HRS bacteriana.

35

(iii) Su peso molecular es 320 tal como se determina por espectrometr´ıa de masas con ionizaci´on por bombardeo de a´tomos r´ apidos (FAB) que es consistente con la f´ ormula molecular C15 H14 O8 ; (iv) Tiene las propiedades espectrosc´opicas mostradas en la Tabla 3.

40

(v) Estas propiedades espectrosc´ opicas son consistentes con la estructura molecular III aunque no se excluyen otras estructuras.

45

50

TABLA 1 Propiedades f´ısicas y espectrosc´ opicas del Compuesto I (SB236049) 55

EI-MS

M+: 287 Peso molecular: 287,0439 F´ ormula molecular: C14 H9 NO6

60

UV (H2 O)

lmax 223, 289 nm,

3

ES 2 156 703 A1 TABLA 1 (Continuaci´on) Propiedades f´ısicas y espectrosc´ opicas del Compuesto I (SB236049) 5

umax (KBr)/cm-1

3350, 1666,4, 1643,3, 1613,4, 1457,1, 1378,1, 1295,1, 1192,9, 1113,8, 1038,6, 1002,0, 869,8, 852,5, 840,0, 794,6, 752,2,

10

1

H -RMN (d6 DMSO), 25◦C, 400 MHz

12,80 (1H, s ancho), 11,57 (1H, s ancho), 9,33 (1H, s ancho), 9,08 (1H, s), 7,44 (1H, s), 6,94 (1H, s), 2,59 (3H, s),

15

13

173,2 (C), 167,4 (C), 163,2 (C), 160,3 (C), 153,8 (C), 150,2 (C), 148,6 (CH), 140,7 (C), 120,8 (C), 114,7 (C), 111,1 (C), 110,6 (CH), 102,4 (CH), 24,3 (CH3 ),

20

C RMN (d6 DMSO),25◦ C, 100 MHz

IE = impacto electr´onico, RMN = resonancia magn´etica nuclear, DMSO = dimetilsulf´ oxido TABLA 2 Propiedades f´ısicas y espectrosc´ opicas del Compuesto II (SB 236050)

25

EI-MS

M+: 322 Peso molecular: 322,0712 F´ ormula molecular: C15 H14 O8

UV (H2 O)

lmax 220, 289(hombro), 312 nm,

umax (KBr)/cm-1

3350, 3000, 1627,8, 1572,9, 1482,2, 1463,9, 1398,3, 1262,3, 1090,7, 1048,3, 967,2, 936,4, 916,1, 867,0, 792,7, 692,4, 682,8,

1

H RMN (d6 DMSO), 25◦C, 400 MHz

6,84(1H, s), 5,35 (1H, s), 4,21 (1H, m), 3,37 (3H, s), 2,67 (1H, dd, J 4 Hz, 15 Hz), 2,56 (1H, dd, J 12 Hz, 15 Hz), 1,28 (3H, d, J 6 Hz),

13

172,2 (C), 167,8 (C), 162,4 (C), 152,5 (C), 150,3 (C), 141,9 (C), 119,0 (C), 115,0 (C), 112,2 (C), 102,3 (CH), 94,0 (CH), 61,9 (CH), 55,1 (CH3 ), 33,3 (CH2 ), 20,5 (CH3 ),

30

35

40

45

C RMN (d6 DMSO), 25◦C, 100 MHz

TABLA 3

50

Propiedades f´ısicas y espectrosc´ opicas del Compuesto III (SB238569) FAB-MS

M+: 320 F´ ormula molecular: C15 H12 O8

UV (H2 O)

lmax 214, 232(hombro), 330 nm,

55

60

4

ES 2 156 703 A1 TABLA 3 (Continuaci´on) Propiedades f´ısicas y espectrosc´ opicas del Compuesto III (SB238569) 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

umax (KBr)/cm-1

3500, 3100, 2950, 1637,7, 1593,3, 1577,9, 1556,7, 1496,9, 1467,9, 1294,3, 1195,9, 1087,9, 981,8

1

H RMN (d6 DMSO),25◦ C, 400 MHz

6,87 (1H, s), 6,17 (1H, s), 5,88 (1H, s), 3,43 (3H, s), 2,10 (3H, s),

13

171,6 (C), 167,9 (C), 163,1 (C), 158,1 (C), 151,9 (C), 149,5 (C), 141,8 (C), 119,2 (C), 112,9 (C), 103,2 (C), 102,7 (CH), 97,0 (CH), 94,1 (CH), 54,9 (CH3 ), 20,1 (CH3 )

C RMN (d6 DMSO),25◦ C, 100 MHz

En otro aspecto adicional, la presente invenci´ on proporciona procedimientos para la producci´ on de SB236049, SB236050 y SB238569 y otros metabolitos o derivados de los mismos que comprenden el cultivo de los microorganismos productores apropiados y, posteriormente, el aislamiento de los metabolitos activos o derivados de los mismos a partir de los cultivos. T´ıpicamente, los procedimientos apropiados incluir´ıan el crecimiento del organismo productor en un fermentador y, a continuaci´ on, el aislamiento del metabolito activo deseado mediante una combinaci´ on apropiada de una extracci´ on con disolvente y/o procedimientos de cromatograf´ıa en columna u otras t´ecnicas apropiadas de separaci´on para obtener un metabolito puro o parcialmente purificado. Se podr´ıan producir derivados del metabolito mediante una transformaci´ on qu´ımica o biol´ogica (por ejemplo enzim´atica) llevada a cabo en un metabolito sin purificar, parcialmente purificado, o puro. Se ha descubierto que microorganismos apropiados para el procedimiento de cultivo seg´un la invenci´ on incluyen cepas de hongos aisladas de or´ıgenes diversos. particularmente los que pertenecen a especies diferentes del g´enero Chaetomium, ;Chaetomium y especies de g´eneros relacionados con Chaetomium que son capaces de producir SB236049, SB236050 y SB238569 y otros compuestos del tipo benzopiranona. Ejemplos de estas cepas, y los productos que producen se detallan en la Tabla 5 m´ as adelante. Tambi´en se muestran los tiempos de retenci´ on de los compuestos de la invenci´on. Chaetomium funicola (c´odigo interno: TCF 6040) tambi´en forma parte de la presente invenci´on. Fue aceptado por el “International Mycological Institute” (IMI) el d´ıa 13 de septiembre de 1995. Le fue asignado el c´ odigo de dep´ osito IMI 368870. Los medios de fermentaci´on para el cultivo de Chaetomium funicola IMI 368870, y otras cepas productoras contienen convenientemente fuentes tanto de carbono como de nitr´ ogeno asimilables. Las fuentes adecuadas de nitr´ ogeno incluir´ıan sustancias bien org´ anicas o bien inorg´ anicas, solas o como mezclas apropiadas, por ejemplo extracto de carne, extracto de levadura, licor de ma´ız macerado, peptonas (por ejemplo triptosa, triptona, case´ına), a´cido glut´amico, glutamato monos´odico, glutamina, glicina, urea, sales de amonio tales como tartrato am´onico, sulfato am´onico, fosfato am´ onico, nitrato am´ onico, cloruro am´onico, sales de nitratos tales como nitrato pot´asico, nitrato s´odico, etc. Las fuentes adecuadas de carbono incluyen monosac´ aridos o disac´ aridos tales como glucosa, maltosa, glicerol, sacarosa, polisac´aridos tales como almidones u otras dextrinas, y celulosas, y l´ıpidos tales como ´acidos grasos naturales o sint´eticos, glic´eridos, etc. tales como aceite de semilla de algod´on, aceite de oliva, aceite de semilla de colza, aceites de pescado, etc., amino´acidos, p´eptidos y prote´ınas. Las fuentes m´ as complejas de carbono incluyen, por ejemplo, harina de soja, harina de ma´ız, triturado de avena, extracto de malta, harina de cebada. Tambi´en son apropiadas las fermentaciones en estado s´ olido que utilizan por ejemplo arroz, ma´ız o granos de trigo, o un medio l´ıquido combinado con un substrato s´ olido no metabolizable tal como la vermiculita.

60

5

ES 2 156 703 A1 TABLA 5 Producci´ on de los compuestos de la invenci´ on por cepas de hongos 5

Cepa

C´ odigo alternativo

Taxonom´ıa

Compuestos producidos∗

Origen

I

II

III

+

+

+

10

TCF 06040

IMI 368870

HPLC picos y tiempos de retenci´ on (mins)

Chaetomium funicola

India

TCF 18505

Chaetomium nigrocolor

Cuba

23,4

TCF 18550

Chaetomium globosum

Brasil

15,4, 16,1, 19,7, 20,8

TCF 18603

Chaetomium sp

Egipto

14,4

TCF 18685

Chaetomium atrobruneum

Chile

15

20

25

30

35

19,7, 20,8

TCF 19263

IMI 335670

Chaetomium indicum

India

+

TCF 19264

IMI 234370

Chaetomium funicola

India

+

TCF 19265

IMI 82766

Chaetomium funicola

India

+

TCF 19266

IMI 33911

Chaetomium funicola

Ghana

TCF 19269

IMI 267938

Chaetomium funicola

Venezuela

14,2, 19,8, 25,4

TCF 19270

IMI 87410

Chaetomium funicola

Filipinas

7,7, 17,5, 19,8, 23,1

TCF 19271

IMI 12264

Chaetomium funicola

Tennessee/ US

40

+

19,4, 20,8, 23,6, 26,2

23,4

14,0

45

50

55

60

6

+

ES 2 156 703 A1 TABLA 5 (Continuaci´on) Producci´ on de los compuestos de la invenci´ on por cepas de hongos Cepa

5

C´ odigo alternativo

Taxonom´ıa

Compuestos producidos∗

Origen

I 10

TCF 19274

ATCC 46459

Chaetomium funicola

TCF 19288

ATCC 10417

Eupenicillium brefeldianum

Jap´ on

II

III

HPLC picos y tiempos de retenci´ on (mins) 19,8, 23,8

15

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25

30

35

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45

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18,3, 19,2, 20,8

La metodolog´ıa de cromatograf´ıa l´ıquida de alta presi´ on (HPLC) se describe en el Ejemplo 1f.

Puede resultar beneficiosa la adici´ on de sales inorg´anicas como fuentes de f´osforo o de azufre al medio de fermentaci´ on. Convenientemente, el medio de cultivo tambi´en incluye iones de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), iones de hal´ ogeno (por ejemplo, cloruro) e iones de metales alcalinot´erreos (por ejemplo, calcio y magnesio), as´ı como elementos traza tales como hierro, manganeso y cobalto y otros elementos traza. El cultivo se puede realizar convenientemente a una temperatura en el intervalo de 5 a 40◦C, ventajosamente de 15 a 30◦ C y t´ıpicamente de 23 a 28◦C. Los cultivos pueden crecer en cualquier recipiente apropiado que, para trabajar a peque˜ na escala, podr´ıa ser t´ıpicamente en un medio s´ olido en placas Petri o en cultivos inclinados o en medios l´ıquidos en matraces de cristal. Para la producci´on a gran escala, se utiliza normalmente un fermentador. T´ıpicamente, la fermentaci´ on puede agitarse y airearse y el pH se puede controlar mediante la adici´ on de soluciones de a´cido o base. Se pueden a˜ nadir nutrientes adicionales durante el transcurso de la fermentaci´ on. La producci´ on de espuma en el fermentador se controla convenientemente mediante la adici´on de un agente antiespumante. La producci´ on del metabolito buscado se controla convenientemente mediante un ensayo de cromatograf´ıa de alta presi´on (HPLC) o un ensayo de actividad biol´ ogica (por ejemplo, frente actividad inhibitoria de HRS) y el cultivo se recoge cuando se considera que el nivel del metabolito buscado parece haber alcanzado su nivel m´ aximo de producci´ on. Las fermentaciones podr´ıan comenzar con la adici´ on al medio de cultivo est´eril de una preparaci´ on de esporas o de un in´ oculo con un crecimiento vegetativo apropiado. Normalmente, es beneficioso utilizar un cultivo in´ oculo para comenzar las fermentaciones a gran escala, que podr´ıan crecer en matraces o en un fermentador de escala intermedia. El producto o derivado del mismo deseado se puede aislar a partir del cultivo y purificar utilizando t´ecnicas convencionales. Como el grueso del metabolito buscado se excreta a menudo fuera de las c´elulas en el caldo de cultivo, la primera etapa de la purificaci´ on es t´ıpicamente la separaci´on de las c´elulas microbianas del caldo de cultivo mediante un procedimiento de centrifugaci´on o de filtraci´ on para dar un caldo clarificado. Como medida opcional se puede a˜ nadir un agente que favorezca la floculaci´ on de las c´elulas para facilitar este procedimiento. Por otra parte el metabolito se puede extraer directamente del cultivo completo sin eliminar las c´elulas. Los procedimientos descritos m´as adelante, utilizados tal cual o en combinaciones adecuadas, son apropiados para la preparaci´ on del metabolito descrito anteriormente en formas parcialmente o sustancialmente puras. Estos procedimientos se usan t´ıpicamente para el aislamiento y purificaci´ on del metabolito deseado a partir del caldo clarificado, pero muchos se pueden aplicar eficazmente al caldo completo o a la extracci´on de compuestos de las c´elulas. Durante los procedimientos de purificaci´ on, el compuesto deseado puede ser f´ acilmente identificado en las etapas del procedimiento mediante el ensayo de la actividad inhibitoria de HRS y/o controlando su presencia con un an´ alisis de HPLC. Los materiales de alto peso molecular no deseados se pueden eliminar del caldo mediante ultrafiltraci´on.

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5

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15

Los metabolitos buscados se pueden extraer del caldo o de la soluci´ on acuosa parcialmente purificada en un disolvente org´ anico inmiscible con el agua tal como n-butanol, metil etil cetona, acetato de metilo o ´eter diet´ılico. Estos procedimientos se pueden realizar de forma discontinua o utilizando procedimientos de extracci´on continua. Por otra parte, el caldo se puede secar previamente a la extracci´on por evaporaci´on o liofilizaci´on, y los productos buscados se pueden extraer directamente de los s´ olidos desecados utilizando los disolventes mencionados anteriormente o por extracci´ on con disolventes miscibles con el agua, tales como alcoholes, por ejemplo met´ılico, et´ılico, n-prop´ılico, iso-prop´ılico con tetrahidrofurano o acetona. Otro m´etodo de purificaci´ on apropiado es el tratamiento del caldo o de la soluci´on acuosa parcialmente purificada del metabolito con una resina de intercambio ani´ onico, que puede estar en forma de base libre o puede contener un contrai´on apropiado, tal como un ion acetato. En condiciones apropiadas el metabolito se absorber´ a a la resina y, a continuaci´on, tras la eliminaci´on del caldo original o de la soluci´on, se puede eluir de la resina lavando con una soluci´ on que contiene un contrai´ on fuerte, tal como el ion cloruro o el ion hidroxilo. Dicho procedimiento se puede llevar a cabo por agitaci´on de la resina de intercambio ani´onico con el caldo o la soluci´on acuosa parcialmente purificada en forma discontinua, separando a continuaci´on las fases s´olida y l´ıquida por filtraci´ on o decantaci´ on o llevando a cabo todo el procedimiento en una columna de cromatograf´ıa. Ejemplos de resinas de intercambio ani´ onico disponibles comercialmente son Amberlite IRA458 o IRA68 de Rohm and Haas.

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45

Igualmente, ya que los metabolitos tienen una caracter´ıstica hidr´ofoba, pueden purificarse a partir de un caldo o de una soluci´ on acuosa parcialmente purificada mediante adsorci´ on y posterior desorci´ on en una resina hidr´ ofoba. T´ıpicamente pueden desorberse mediante el lavado de la resina con una soluci´ on acuosa de un disolvente miscible con el agua tal como el metanol. Este procedimiento se puede llevar a cabo agitando la resina con el caldo o soluci´ on parcialmente pura de forma discontinua y, a continuaci´ on, separando las fases s´ olida y l´ıquida por filtraci´ on o decantaci´ on, o realizando el procedimiento completo en una columna de cromatograf´ıa. Ejemplos de resinas hidr´ ofobas disponibles comercialmente apropiadas para este procedimiento son HP20, HP20SS, SP207 (de Mitsubishi), XAD-4, XAD-7 (Rohm and Haas). Los m´etodos cromatogr´aficos en columna que utilizan resinas de fase inversa, las cuales consisten t´ıpicamente en una matriz de s´ılice que se ha obtenido por derivatizaci´on qu´ımica con sustituyentes hidr´ ofobos, son tambi´en u ´ tiles para la purificaci´ on del metabolito buscado. Estos m´etodos cromatogr´aficos incluyen m´etodos de HPLC preparativos. Las resinas de fase inversa que son apropiadas para la purificaci´on del metabolito incluyen entre otras C18, C8, C2, CN y NH2 , y dichas resinas y las columnas de cromatograf´ıa que contienen dichas resinas, est´an disponibles en un gran n´ umero de proveedores comerciales. Las soluciones parcialmente purificadas del metabolito en el disolvente org´ anico se puede purificar m´as mediante cromatograf´ıa sobre gel de s´ılice, celulosa o al´ umina, eluyendo con mezclas apropiadas de disolventes org´ anicos. Estos procedimientos cromatogr´ aficos incluyen cromatograf´ıa en columna, cromatograf´ıa ultra-r´ apida, cromatograf´ıa de capa “gruesa” y “fina” y todas las t´ecnicas de HPLC. La purificaci´ on de soluciones del metabolito basada en tamices moleculares es posible tanto en soluciones acuosas como org´anicas, utilizando geles de cromatograf´ıa tales como Sephadex LH-20, Biogel P2, Sephadex G10, etc. Adem´as de los sistemas convencionales de evaporaci´on a vac´ıo, las soluciones acuosas del metabolito se pueden concentrar convenientemente por ´osmosis inversa.

50

Todos estos procedimientos de aislamiento y purificaci´ on se pueden realizar desde en fr´ıo hasta a temperatura ambiente, por ejemplo, a una temperatura dentro del intervalo desde 4 hasta 35◦C, conveaficos se pueden utilizar resinas de nientemente desde 15 hasta 25◦ C. En todos los procesos cromatogr´ tama˜ no de part´ıcula fina o gruesa dependiendo de la velocidad de flujo y resoluci´on requeridas.

55

La purificaci´ on del metabolito en la etapa final se puede llevar a cabo por cristalizaci´ on o precipitaci´on. T´ıpicamente, el producto parcialmente purificado se disuelve a saturaci´on a una temperatura elevada en un disolvente apropiado tal como el tetrahidrofurano, el metanol o el etanol, dej´ andolo enfriar posteriormente. Por otra parte, el producto parcialmente purificado se disuelve en un disolvente apropiado y se a˜ nade un segundo disolvente, en el que es menos soluble, tal como el agua. Otro m´etodo adicional es precipitar el compuesto deseado a partir de la soluci´ on, por adici´ on de una soluci´ on de un ion apropiado, de manera que se forma una sal insoluble del metabolito buscado por descomposici´ on doble.

60

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10

15

Otro aspecto adicional de esta invenci´ on incluye la derivatizaci´ on de los grupos funcionales del metabolito con el fin de facilitar su aislamiento. Esto se puede llevar a cabo qu´ımicamente o enzim´aticamente, pudiendo estar la enzima, por ejemplo, en forma purificada, contenida en un organismo o unida a un soporte. La derivatizaci´ on se puede llevar a cabo en las preparaciones del metabolito en bruto, parcialmente purificadas o sustancialmente purificadas. Los derivados apropiados incluyen sales inorg´ anicas y org´ anicas de los grupos carboxilato y amino, tales como sales con metales alcalinos y metales alcalinot´erreos, metales de transici´on, etc., sales de amonio, sales de aminas org´anicas y sales con otras bases org´ anicas, tales como piridina, etc., sales con aniones y radicales ani´ onicos, tales como haluros, sulfato, nitrato, fosfato, acetato, butirato, benzoato, etc., complejos con metales, tales como metales divalentes y metales de transici´on, por ejemplo, zinc, magnesio, calcio, n´ıquel, etc., complejos con radicales ani´onicos, tales como fosfato, sulfato, borato, bisulfato, etc., solvatos incluyendo hidratos, ´esteres, tio´esteres, ´eteres incluyendo ´eteres de sililo y ´eteres c´ıclicos, tio´eteres, amidas, tioamidas y carbonatos. Tales derivados est´an incluidos en el alcance de la presente invenci´on, tanto en forma pura como en formas parcialmente puras. La invenci´ on tambi´en proporciona procedimientos para el aislamiento y purificaci´ on de estos derivados. Estos m´etodos incluir´ an por ejemplo, aquellos descritos para la purificaci´ on del metabolito no derivatizado.

20

En otro aspecto adicional, la presente invenci´ on proporciona procedimientos para la producci´ on de SB236049, SB236050, SB238569 y otros metabolitos relacionados que inhiben HRS y derivados de los mismos mediante la s´ıntesis qu´ımica.

25

La presente invenci´on tambi´en proporciona formulaciones del metabolito que son farmac´euticamente aceptables e incluir´ an aquellos derivados que son farmac´euticamente aceptables. En concreto, la invenci´ on proporciona sales farmac´euticamente aceptables del metabolito y derivados que son f´ acilmente hidrolizables in vivo, tales como los ´esteres de los grupos carboxilo o fen´olicos, por ejemplo.

30

El compuesto de la invenci´on est´a pensado para el uso en composiciones farmac´euticas, y por tanto se proporcionan apropiadamente de forma sustancialmente pura, por ejemplo, pura en al menos 50 %, m´as convenientemente pura en al menos 60 % y ventajosamente pura en al menos 75 %, preferiblemente pura en al menos 85 %, m´ as preferiblemente pura en al menos 95 % y especialmente pura en al menos 98 % (los % son en peso por base de peso). Sin embargo, las preparaciones impuras o menos puras del compuesto de la invenci´on se pueden utilizar para la preparaci´ on de formas m´ as puras utilizadas en las composiciones de formas m´as puras utilizadas del mismo compuesto o de un compuesto relacionado (por ejemplo un derivado correspondiente) apropiado para el uso farmac´eutico.

35

La presente invenci´on tambi´en proporciona una composici´ on farmac´eutica que comprende el compuesto o un derivado del mismo y un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. El compuesto de la invenci´ on tiene actividad inhibitoria de enzimas, particularmente de HRS bacteriana, y como tal se anticipa su uso en el tratamiento de infecciones bacterianas. 40

En el uso terap´eutico, los compuestos de la invenci´ on suelen administrarse en una composici´ on farmac´eutica est´andar. Por lo tanto, la presente invenci´ on proporciona, en otro aspecto adicional, una composici´ on farmac´eutica que comprende un compuesto de la invenci´on y un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. 45

Las composiciones farmac´euticas apropiadas incluyen aquellas que se adaptan para administraci´ on oral, parenteral, t´ opica o como un supositorio o pesario.

50

55

60

Derivados del compuesto de la invenci´on que son activos cuando se administran por v´ıa oral pueden formularse como l´ıquidos, por ejemplo, jarabes, suspensiones o emulsiones, comprimidos, c´ apsulas o tabletas. Una formulaci´ on l´ıquida generalmente consta de una suspensi´ on o soluci´ on del compuesto o de la sal farmac´euticamente aceptable en un veh´ıculo l´ıquido apropiado por ejemplo, el etanol, la glicerina, un disolvente no acuoso por ejemplo, el polietilenglicol, aceites, o el agua con un agente suspensor, un conservante, agentes saborizantes y/o colorantes. Las composiciones en forma de comprimido pueden prepararse con uno o varios veh´ıculos farmac´euticamente aceptables, que se utilizan por rutina para la preparaci´ on de formulaciones s´ olidas, ejemplos de los cuales incluyen estearato de magnesio, almid´on, lactosa, sacarosa y celulosa. Las composiciones en forma de c´apsula pueden prepararse mediante procedimientos rutinarios de en9

ES 2 156 703 A1 capsulaci´on. Por ejemplo, p´ıldoras que contienen el ingrediente activo se pueden preparar con veh´ıculos est´andar con las cuales se rellena una c´apsula de gelatina dura. Por otra parte, se puede preparar una dispersi´on o suspensi´ on con cualquier veh´ıculo apropiado, por ejemplo gomas acuosas, celulosas, silicatos o aceites con las cuales se rellena una c´apsula de gelatina blanda. 5

10

Las composiciones parenterales t´ıpicas constan de una soluci´ on o suspensi´ on del compuesto de la invenci´on o un derivado del mismo en un veh´ıculo acuoso est´eril o aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de cacahuete o aceite de s´esamo. Por otra parte, la soluci´ on se puede liofilizar y a continuaci´ on se reconstituye con un disolvente apropiado justo antes de su administraci´on.

15

Un supositorio t´ıpico consta de una soluci´ on o suspensi´ on del compuesto de la invenci´ on o un derivado del mismo que es activo cuando se administra de esta manera, con un agente astringente y/o lubricante tales como glicoles polim´ericos, gelatinas o manteca de cacao u otras ceras vegetales y sint´eticas o grasas con un punto de fusi´ on bajo. Es preferible que la composici´on sea en forma de una dosis por unidad tal como un comprimido o una c´apsula.

20

25

30

Cada unidad de dosis para administraci´ on oral contiene preferiblemente desde 10 hasta 1000 mg (y en el caso de administraci´on parenteral desde 10 hasta 500 mg) del compuesto de la presente invenci´on o un derivado del mismo. El r´egimen de dosis diario para un paciente adulto puede ser, por ejemplo, una dosis oral de entre 25 mg y 2000 mg, preferiblemente entre 100 mg y 1000 mg, o una dosis por v´ıa intravenosa, subcut´ anea o intramuscular de entre 10 y 1000 mg, preferiblemente entre 20 mg y 500 mg, del compuesto de la invenci´on o un derivado del mismo, administr´andose el compuesto de 1 a 4 veces por d´ıa. Convenientemente se administrar´ an los compuestos para un per´ıodo de terapia continua, por ejemplo por una semana o m´ as. La presente invenci´on proporciona SB236049, SB236050 y SB238569 o derivados farmac´euticamente aceptables de los mismos para el empleo como agentes terap´euticos. Los siguientes ejemplos ilustran los procedimientos para la preparaci´ on de los compuestos de la invenci´on y sus propiedades:

35

Ejemplo 1 a) Medios de fermentaci´ on: los medios que a continuaci´ on se describen fueron los utilizados para realizar las fermentaciones donde se produjeron los compuestos objeto de la invenci´ on 40

Medio OA (Difco ref. 0552-01-1) g/l

45

Harina de Avena

60

Bacto-agar 50

12,5 Medio PDA g/l

55

60

Patata Deshidratada

22

Glucosa (Merck)

20

Agar (Pronadisa)

17

10

ES 2 156 703 A1 Medio MYS. g/l 5

10

15

Extracto de Malta (Difco)

20

KH2 PO4 (Merck)

1

Extracto de Levadura (Difco)

5

NaCl (Merck)

5

Agar (Pronadisa)

15 Medio BGA1

20

25

30

g/l Extracto de Carne (Oxoid)

5

Glicerol (Sigma)

10

Almid´ on (Sigma)

20

Ajustado a pH 6,5 antes de su esterilizaci´on Medio BGA2. g/l

35

Extracto de carne (Oxoid)

5

Glicerol (Sigma)

10

Almid´ on

40

40

Ajustado a pH 6,5 antes de su esterilizaci´on 45

Medio BGA3. g/l

50

55

Extracto de carne (Oxoid)

5

Glucosa

5

Almid´ on

30

Ajustado a pH 6,5 antes de su esterilizaci´on 60

11

ES 2 156 703 A1 Medio CNV(60). g/l 5

10

15

20

25

30

35

Glucosa

5

Almid´ on

15

(NH4 )2 SO4

0,629

CO3 Ca

10

K PO4 H2

2

NaCl

1

CaCl2 · 2H2 O

0,4

MgSO4 · 7H2 O

0,3

Elementos Traza(1)

1 ml/l

(1) Elementos Traza

g/l

ZnSO4 · 7H2 O

1,2

MnSO4 · H2 O

1,56

FeSO4 · 7H2 O

5

CoCl2 · 6H2 O

3,66

Medio GHAc1: 40

45

50

% Glicerol

5

Harina de semilla de algod´on

1

Aceite de Girasol

3

Ajustado a pH 6,5 antes de su esterilizaci´on

55

60

12

ES 2 156 703 A1 Medio RAULIN - THOM g/l 5

10

15

20

25

30

Az´ ucar de Ca˜ na

46,66

´ Acido Tart´ arico -(C4 H6 O6 )

2,66

Tartrato am´onico-(C4 H12 N2 O6 )

2,66

Carbonato pot´ asico (K2 CO3 )

0,4

Hidrogeno fosfato bisam´onico ((NH4 )2 HPO4 )

0,4

Carbonato de magnesio (MgCO3 )

0,26

Sulfato am´ onico ((NH4 ) 2 SO4 )

0,16

Silicato pot´ asico

0,046

Sulfato de Zinc (ZnSO4 .7H2 O)

0,046

Sulfato ferroso heptahidratado (FeSO4 .7H2 O)

0,046

b) Mantenimiento de los cultivos Los cultivos se mantuvieron de la siguiente manera • en tubos de PDA agar mantenidos a +4◦ C

35

• en viales de glicerol (20 % glicerol) a -20◦ C • como viales liofilizados (10 % leche descremada, 2,5 % miel, 5 % sacarosa) mantenidos a temperatura ambiente

40

• en nitr´ ogeno l´ıquido c) Preparaci´ on de los in´ oculos para los cultivos realizados en matraces de 250 ml

45

Los cultivos se multiplicaron inicialmente en los medios OA o MYS y cuando la biomasa obtenida fue adecuada (normalmente alrededor de 7 d´ıas de incubaci´ on a 28◦C) se tomaron porciones de 2x2 cm del cultivo, conteniendo esporas y micelio y se utilizaron como inoculo de los matraces. d) Producci´ on de la actividad inhibitoria de HRS por diversos cultivos f´ ungicos

50

Las cepas productoras de actividad inhibitoria en el ensayo de HRS as´ı como el (los) medio(s) de fermentaci´ on, en los que dicha actividad fue detectada se describen en la siguiente tabla

55

60

13

ES 2 156 703 A1

5

10

C´ odigo interno

C´ odigo de dep´ osito

Taxonom´ıa

Origen

Medio

TCF 6040

IMI 368870

Chaetomium funicola

India

BGA1

TCF 19271

IMI 12264

Chaetomium funicola

Tennessee/US

BGA1

TCF 19265

IMI 82766

Chaetomium funicola

India

BGA1

TCF 19270

IMI 87410

Chaetomium funicola

Filipinas

CNV(60)

TCF 19264

IMI 234370

Chaetomium funicola

India

BGA2

TCF 19274

ATCC 46459

Chaetomium funicola

Jap´ on

BGA2

TCF 19266

IMI 33911

Chaetomium funicola

Ghana

GHAc1

TCF 19269

IMI 267938

Chaetomium funicola

Venezuela

GHAc1

TCF 19263

IMI 335670

Chaetomium indicum

India

BGA2, GHAc1

TCF 18505

Chaetomium nigrocolor

Cuba

BGA1

TCF 18685

Chaetomium atrobruneum

Chile

CNV(60)

TCF 18603

Chaetomium sp

Egipto

GHAc1

TCF 18550

Chaetomium globosum

Brasil

CNV(60)

15

20

25

30

35

TCF 19288

ATCC 10417

Eupenicillium brefeldianum

BGA1, BGA2, Raulin-Thom

40

Procedimientos de fermentaci´ on

45

50

55

60

Una u ´nica porci´ on de 2 x 2 cm de un cultivo crecido en medio MYS u OA agar fue utilizada para inocular un matraz de 250 ml, conteniendo 30 ml del medio de fermentaci´ on. El matraz fue incubado en on donde la humedad fue manteun agitador orbital a 250 r.p.m., durante 7 d´ıas a 28◦ C en una habitaci´ nida al 50 % de saturaci´ on. Despu´es de este periodo se a˜ nadi´ o n-propanol al caldo de fermentaci´ on para obtener una concentraci´ on final del solvente del 60 % (v/v) y se homogeneiz´ o. La mezcla homogeneizada o durante 15 min. se mantuvo a 250 r.p.m. y 28◦C durante 30 min en el agitador orbital y se centrifug´ a 1,300 x g. El sobrenadante fue alicuotado, secado a vac´ıo y mantenido a -80◦ C antes del ensayo. Las muestras obtenidas se redisolvieron en DMSO previamente al ensayo de actividad biol´ ogica y se diluyeron en un tamp´ on acuoso adecuado. En todos los casos la actividad inhibitoria de HRS se sigui´o en estas muestras utilizando el m´etodo descrito en el Ejemplo 1e. En el caso de la cepa TCF 19288 se prepararon fermentaciones siguiendo el protocolo descrito en el p´ arrafo anterior pero, se utilizaron 20 ml del caldo obtenido tras los 7 d´ıas de incubaci´ on para inocular matraces de 2 litros conteniendo 400 ml del medio Raulin-Thom. Esta fermentaci´on se incub´ o en agion donde la humedad fue mantenida al 50 % de tadores orbitales a 250 r.p.m. a 28◦C en una habitaci´ saturaci´on. Se tomaron regularmente muestras para medir su actividad biol´ogica y a los diez d´ıas mostr´o el m´aximo de actividad. Para poder analizar por HPLC la producci´on de SB236049, SB236050, SB238569 y otros compuestos con espectros de UV similar a estas benzopiranonas se utiliz´o un procedimiento de extracci´ on diferente. 14

ES 2 156 703 A1 4-5 ml de la fermentaci´ on se centrifugaron y se tom´o 1 ml del sobrenadante. A esta muestra se le a˜ nadieron 0,5 ml de metanol-´ac. trifluoroac´etico (1 %), se agit´o la mezcla y se centrifug´o y el sobrenadante se filtr´ o por un filtro de 0,45 µm. 20 µl de esta muestra filtrada se inyect´ o en HPLC y se analiza seg´ un el m´etodo descrito en el Ejemplo 1f. 5

e) Detecci´ on de actividad inhibitoria de HRS

10

Para el seguimiento de actividad los caldos se diluyeron a 0,6 % de su concentraci´on original. Para medir la potencia de los metabolitos puros de la invenci´ on los compuestos se disolvieron en un disolvente apropiado. El ensayo, basado en la incorporaci´ on enzim´atica de 3H-His en sus correspondientes m´ oleculas de tRNA, se llev´o a cabo en formato de placas de micropocillo (96 pocillos) como a continuaci´on se indica:

15

Mezcla de reactivos para el ensayo Se pesaron los siguientes reactivos:

20

25

KCl (Merck)

13,05 g.

Acetato de magnesio (Merck)

5,35 g.

TRIZMA Base (Sigma T1503)

6,05 g.

DTT (Sigma D0632)

0,77 g.

ATP (Sigma A5394)

6,89 g.

y se disolvieron en 700 ml de agua destilada. Se ajust´ o el pH a 7,9 antes de a˜ nadir agua para dar un volumen final de 800 ml y la disoluci´ on se guard´ o a -20◦C. Justo antes de llevar a cabo el ensayo la siguiente mezcla se prepar´o usando esta disoluci´on. 30

Disoluci´ on anteriormente preparada

35

1,76 ml

3H-His (1 mCi/ml, 54 Ci/mM) (Amersham TRK 199)

11 µl

tRNA E. coli MR600 (Boehringer 109550) 100 mg/ml

27 µl

Agua destilada

346 µl

Esta mezcla de reactivos se utiliz´o en el procedimiento descrito m´ as adelante. 40

Tamp´ on de enzima La HRS es una enzima recombinante (descrita en la solicitud de patente EP-785269). Justo antes de usar, 0,65 mg/ml de HRS (grado de pureza: 86 %) se diluy´ o 1/2000 en Tris-HCl 50 mM pH 7,9 (con DTT 2 mM, alb´ umina de suero bovina 0,2 mg/ml).

45

Procedimiento

50

20 µl de la mezcla de reactivos se a˜ nadieron a cada pocillo, que conten´ıa 15 µl de muestra a ensayar y 15 µl de tamp´ on de enzima, y las placas se incubaron durante 10 minutos a 37◦ C. A continuaci´on, 100 µl de ´acido tricloroac´etico (5 % p/v) con 10 % glicerol se a˜ nadieron a cada pocillo y la mezcla se dej´o reposar durante 5 minutos para precipitar. La mezcla se filtr´ o por un Unifilter GF/C (Packard) utilizando un Harvester (Packard) y los filtros se lavaron tres veces con 200 µl de una mezcla de agua/etanol. Tras evaporar el disolvente, 20 µl con una m´ aquina TopCount o Microbeta.

55

Controles

60

Controles de 100 % actividad enzim´ atica se prepararon de la manera indicada anteriormente, excepto que se us´o una mezcla de disolvente/agua en vez de una disoluci´ on de muestra a ensayar. Los blancos se prepararon mediante la adici´ on del tamp´ on de la enzima sin enzima. Los datos de inhibici´on se calcularon en relaci´on con los controles de 100 % tras restar las cuentas medias de los blancos de todos los datos primarios.

15

ES 2 156 703 A1 f) Detecci´ on de SB236049, SB236050, SB238569 por HPLC

5

10

Los compuestos descritos en la presente invenci´ on pueden ser detectados por HPLC usando una columna C18 Kromasil (5 µm de tama˜ no de part´ıcula; dimensiones 4,6 x 250 mm) y monitorizando la absorbancia en UV a 325 nm. La columna se eluye a un flujo de 1 ml/min con un gradiente de agua destilada, ajustada a pH 2 con a´cido trifluoroac´etico, y metanol. El gradiente utilizado es el siguiente: 6 % MeOH durante 6 minutos, despu´es se incrementa hasta 52 % MeOH en 10 minutos, se mantiene estacionario en estas condiciones durante 14 minutos; a continuaci´on se sube hasta 90 % MeOH en cinco minutos y se mantiene estacionario durante otros 10 minutos. Con estas condiciones, SB236049 tiene un tiempo de retenci´on de 12,2 minutos, SB244909 de 17,4 minutos y SB236050 de 26,1 minutos. Ejemplo 2 a) Producci´ on por fermentaci´ on y aislamiento de SB236049, SB236050 y SB238569

15

Preparaci´ on del inoculo

20

Dos matraces de dos litros de volumen total, conteniendo 400 ml del medio BGA1, fueron inoculados cada uno con 30 ml de caldo de fermentaci´ on de Chaetomium funicola IMI 368870 preparado seg´ un se ha descrito en el Ejemplo 1d pero incubando durante 72 horas a 28◦C y manteniendo el resto de los par´ ametros de fermentaci´on. Fermentaci´ on Final

25

30

35

40

45

20 litros del medio BGA2 conteniendo 0,02 % de Antiespumante de Silicona SAG 471 (Union Carbide) y 0,18 % de aceite de oliva fueron esterilizados a 121◦C durante 45 minutos en un fermentador MBR CH8620 (42 litros). Despu´es de bajar la temperatura hasta 28◦C se inocul´o el fermentador con 800 ml de in´ oculo preparado seg´ un se ha descrito en el p´arrafo anterior. La temperatura de incubaci´ on se on mantuvo en el fermentador a 28◦ C, manteniendo 0,5x105 Pa de sobrepresi´on, una velocidad de agitaci´ de 300 r.p.m. (1,35 m/s en el extremo de las palas de agitaci´on) y un flujo de aire de 10 litros de aire por minuto. El punto de consigna para la presi´ on de ox´ıgeno (pO2) se ajusto al 60 por ciento. Las condiciones de cascada se ajustaron para un m´ aximo de 750 r.p.m. y 10 litros/min de flujo de aire. El caldo de fermentaci´on fue recogido despu´es de 9 d´ıas de incubaci´ on en las condiciones descritas. b) Aislamiento de SB236049, SB236050 y SB238569 Se centrifugaron 60 litros de caldo (10 lotes de 6 litros cada uno, centr´ıfuga Beckman J6-MC, rotor o sobre placa filtrante de vidrio fritado TY JS 4,2, 4000 rpm, 20 min, 10◦ C) y el sobrenadante se filtr´ (N´ um. 1). El filtrado se carg´ o en una columna rellena con Diaion HP-20 (suministrada por Mitsubishi Chemical Ltd., Jap´ on) (15 l, 18 x 60 cm, 400 ml/min) estabilizada con agua. El percolado se recogi´ o en tres fracciones de 20 l. La columna se lav´o con 25 l de agua recogida en una u ´nica fracci´ on, seguido de 60 l de agua-MeOH (2:1) recogidos en tres fracciones, siempre a 400 ml/min. Los compuestos activos se eluyeron con agua-MeOH (1:1) (120 l) recogidos en 12 fracciones de 10 l cada una a 400 ml/min, y finalmente se lav´ o la columna con 25 l de MeOH. Las fracciones activas (50l) se concentraron a vac´ıo en un Rotavapor B¨ uchi R-153 (temperatura del ba˜ no 35◦C) para eliminar el MeOH. La fase acuosa se extrajo con ´eter diet´ılico (3 x 9 l). Las fases org´anicas se combinan y se evaporan a sequedad a vac´ıo para dar 3,7 g de un s´ olido amarillo.

50

Este s´olido se extrajo con 50 ml de cloroformo para dar un s´ olido amarillo oscuro y una fase l´ıquida. El s´olido se purific´ o por digesti´ on con 50 ml de THF para conseguir 200 mg de un s´ olido que se extrajo otra vez con THF para obtener 120 mg de SB236049 como un polvo amarillo >95 % puro por RMN.

55

Las aguas madres de SB236049 se evaporan a sequedad y se reextrajeron con 20 ml de tetrahidrofurano (THF). 35 mg de SB236049 se filtraron y el filtrado se trat´ o con agua para precipitar un s´ olido amarillo. Este s´olido se redisolvi´ o en MeOH caliente y una peque˜ na cantidad de SB236049 se filtr´ o en caliente. Al enfriar 65 mg de SB238569 precipitaron y se filtraron como un s´ olido amarillo >90 % puro por RMN.

60

La fracci´on soluble en cloroformo previamente mencionada se evapor´ o a sequedad y el residuo se extrajo con 50 ml de MeOH para conseguir un s´ olido amarillo p´ alido y una soluci´ on. El s´ olido se reprecipit´ o con agua de una soluci´ on de THF para dar un s´ olido amarillo p´ alido, que se reprecipit´o en la misma manera una vez m´ as para obtener 220 mg de SB236050 como un s´ olido amarillo p´ alido >95 % puro por 16

ES 2 156 703 A1 RMN. La actividad inhibitoria sobre HRS de los compuestos de la invenci´on tal como se determin´o seg´ un la metodolog´ıa descrita en el Ejemplo 1e se muestra en la Tabla 6. 5

TABLA 6 Inhibici´ on de HRS por compuestos de la invenci´ on

10

15

20

SB236049

SB236050

SB238569

Concentraci´on

% Inhibici´ on

Concentraci´ on

% Inhibici´ on

Concentraci´on

% Inhibici´ on

0,0977

14

0,0977

13

0,0977

21

6,25

40

6,25

52

0,3906

47

100

73

100

76

100

99

25

30

35

40

45

50

55

60

17

ES 2 156 703 A1 REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la f´ ormula (I) o un sal o derivado farmac´euticamente aceptable del mismo 5

10

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que se caracteriza adem´as porque tiene; un peso molecular de 287 uma, l´ıneas prominentes en el espectro de 1 H-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦C y 400 MHz a desplazamientos qu´ımicos de 12,80, 11,57, 9,33, 9,08, 7,44, 6,94 y 2,59 ppm, l´ıneas prominentes en el espectro de 13 C-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦C y 100 MHz a desplazamientos qu´ımicos de 173,2, 167,4, 163,2, 160,3, 153,8, 150,2, 148,6, 140,7, 120,8, 114,7, 111,1, 110,6, 102,4 y 24,3 ppm, un m´aximo en el espectro de UV registrado en H2 O a 223,3 nm, l´ıneas prominentes en el espectro de infrarojo a 3350, 1666,4, 1643,3, 1613,4, 1457,1, 1378,1, 1295,1, 1192,9, 1113,8, 1038,6, 1002,0, 869,8, 852,5, 840,0, 794,6 y 752,2 cm-1, es un inhibidor de bacteriana histidil-tRNA sintetasa, y se puede obtener mediante el cultivo de Chaetomium funicola IMI 368870. 2. Un compuesto de la f´ ormula (II) o un sal o derivado farmac´euticamente aceptable del mismo

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que se caracteriza adem´as porque tiene; un peso molecular de 322 uma, l´ıneas prominentes en el espectro de 1 H-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦C y 400 MHz a desplazamientos qu´ımicos de 6,84, 5,35, 4,21, 3,37, 2,67, 2,56 y 1,28 ppm, l´ıneas prominentes en el espectro de 13 C-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦C y 100 MHz a desplazamientos qu´ımicos de 172,2, 167,8, 162,4, 152,5, 150,3, 141,9, 119,0, 115,0, 112,2, 102,3, 94,0, 61,9, 55,1, 33,3 y 20,5 ppm, m´aximos en el espectro de UV registro en agua a 220, 289 y 312 nm, l´ıneas prominentes en el espectro de infrarojo a 3350, 3000, 1627,8, 1572,9, 1482,2, 1463,9, 1398,3, 1262,3, 1090,7, 1048,3, 967,2, 936,4, 916,1, 867,0, 792,7, 692,4 y 682,8 cm-1, es un inhibidor de bacteriana histidil-tRNA sintetasa y se puede obtener mediante el cultivo de Chaetomium funicola IMI 368870. 3. Un compuesto de la f´ ormula (III) o un sal o derivado farmac´euticamente aceptable del mismo

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que se caracteriza adem´as porque tiene; un peso molecular de 320 uma, l´ıneas prominentes en el espectro de 1 H-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦C y 400 MHz desplazamientos qu´ımicos de 6,87, 6,17, 5,88, 3,43 y 2,10 ppm, l´ıneas prominentes en el espectro de 13 C-RMN registrado en d6 -DMSO a 25◦ C y 100 MHz 18

ES 2 156 703 A1

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a desplazamientos qu´ımicos de 171,6, 167,9, 163,1, 158,1, 151,9, 149,5, 141,8, 119,2, 112,9, 103,2, 102,7, 97,0, 94,1, 54,9 y 20,1 ppm, m´aximos en el espectro de UV a 214, 232 y 330 nm, l´ıneas prominentes en el espectro de infrarojo a 3500, 3100, 2950, 1637,7, 1593,3, 1557,9, 1556,7, 1496,9, 1467,9, 1294,3, 1195,9, 1087,9 y 981,8 cm-1, es un inhibidor de bacteriana histidil-tRNA sintetasa y se puede obtener mediante el cultivo de Chaetomium funicola IMI 368870. 4. Un procedimiento para la producci´ on de un compuesto seg´ un la reivindicaci´ on 1, 2 o´ 3, caracterizado porque comprende el cultivo de un microorganismo productor y el posterior aislamiento del compuesto del cultivo.

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5. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 4, en el cual el microorganismo es Chaetomium funicola IMI 368870 ´o un mutante del mismo. 6. Chaetomium funicola IMI 368870 o´ un mutante del mismo, en forma biol´ ogicamente pura. 15

7. Una composici´on farmac´eutica que consta de una cantidad de un compuesto seg´ un la reivindicaci´on 1, 2 o´ 3, inhibitoria de bacteriana histidil-tRNA sintetasa, junto con un veh´ıculo o excipiente farmac´euticamente aceptable. 20

8. Un compuesto seg´ un la reivindicaci´ on 1, 2 o´ 3, para su uso en terapia. 9. Un compuesto seg´ un la reivindicaci´ on 1, 2 o´ 3, en la fabricaci´ on de un medicamento para usar en la inhibici´ on de bacteriana histidil-tRNA sintetasa.

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kES 2 156 703 kN. solicitud: 009900219 kFecha de presentaci´on de la solicitud: 03.02.1999 kFecha de prioridad:

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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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˜ ESPANA



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INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

k

51 Int. Cl.7 :

C07D491/052,493/04,311/22,C12P17/18,C12N1/14,A61K31/535,31/365,A61P31/04// (C07D491/052,311:00,213:16)(C07D493/04,311:00,309:30)(C12N1/14,C12R1:645)

DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa

Documentos citados

Reivindicaciones afectadas

E

ES 2143916 A (SMITHKLINE BEECHAM, S.A.) 16.05.2000, todo el documento.

1-9

A

ARAI, K. et al. ”Metabolites of Penicillium italicum WEHMER: Isolation and Structures of New Metabolites Including Naturally Occurring 4-Ylidene-acyltetronic Acids, Italicinic Acid and Italicic Acid”. CHEM. PHARM. BULL., Vol. 37, n◦ 12, 1989, p´aginas 3229-3235, todo el documento.

1-9

Categor´ıa de los documentos citados X: de particular relevancia

on no escrita O: referido a divulgaci´

Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la

on P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´

misma categor´ıa A: refleja el estado de la t´ecnica

de la solicitud es de la fecha E: documento anterior, pero publicado despu´ de presentaci´ on de la solicitud

El presente informe ha sido realizado × para todas las reivindicaciones Fecha de realizaci´ on del informe 30.05.2001

para las reivindicaciones n◦ : Examinador M. Novoa Sanjurjo

P´ agina

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