La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificador tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina

II y agonistas muscarínicos

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

Ricardo Duarte Jáquez Rector David Ramírez Perea Secretario General Manuel Loera de la Rosa Secretario Académico Daniel Constandse Cortez Director del Instituto de Ciencias Biomédicas Luis Enrique Gutiérrez Casas Coordinador General de Investigación y Posgrado Ramón Chavira Chavira Director General de Difusión Cultural y Divulgación Científica

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificador tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina

II y agonistas muscarínicos

Eduardo Iván Acosta Gómez

Ciencias Naturales y Exactas

Coordinación General de Investigación y Posgrado Lisbeily Domínguez Ruvalcaba Coordinadora de la colección

Acosta Gómez, Eduardo Iván. La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificad tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina II y agonistas muscarínicos / Eduardo Iván Acosta Gómez. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, 2013. (Colección Textos Universitarios, Serie Investigación) 44 p.; 30 cm. Incluye bibliografía Colección Reportes Técnicos de Investigación Isbn: 978-607-7953-80-7 Serie IIT, Vol. 8. ICB: 978-607-9224-98-1 Contenido: 1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados. 5.– Conclusión. 6.– Referencias. 7.– Anexos.

D. R. © Acosta Gómez, Eduardo Iván. La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección de Publicaciones.

Índice Resumen Palabras clave Abstract Keywords Usuarios potenciales Reconocimientos

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I. Introducción II. Planteamiento III. Metodología Cultivo celular Registros electrofisiológicos

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IV. Resultados Caracterización y viabilidad de neuronas del GCS de rata La BK mimetiza el efecto modulador de agonistas muscarínicos y de la Angio II sobre la IKV

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V. Conclusión VI. Referencias VII. Anexos Anexo A

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Resumen

E

s bien sabido que la Bradicinina (BK) vía receptores a la Bradicinina tipo 2 (B2), excita a las neuronas simpáticas. Los efectos de este péptido, imitan en parte las acciones estimuladoras de la angiotensina II (Angio II), agonistas muscarínicos o de la acetilcolina, sobre neuronas del ganglio cervical superior (GCS). Por ejemplo, la despolarización de estas neuronas conlleva a la subsecuente liberación de norepinefrina (NA). Agonistas muscarínicos (Oxo – M), Angio II y BK, modulan la corriente de potasio Tipo M (IKM), y la corriente de calcio Tipo N (ICaN). Recientemente hemos encontrado que receptores a la Angio II, así como agonistas muscarínicos, modulan a la corriente de potasio tipo rectificador tardío (IKV). Con base en lo anterior, en este proyecto se llevó a cabo, en primera instancia, la estandarización y posterior obtención de neuronas del GCS, en cultivo primario. Una vez hecho lo anterior, se llevaron a cabo experimentos de patch–clamp en fijación de voltaje, en la configuración de célula entera (whole–cell) en las neuronas mencionadas para ver en parte la viabilidad celular en estos cultivos. Lo anterior correspondió a la obtención de corrientes características de estas neuronas ya descritas a detalle por otros investigadores (INa, IK sensibles al calcio y por supuesto a IKM e IKV) que sugieren la viabilidad de estas células en cultivo primario. Posteriormente, se procedió a ver el efecto de la BK sobre la IKV en estas neuronas, se observó un incremento de esta corriente con una EC50= 59.3 nM, obtenida a partir de una curva dosis–respuesta. Apegado a lo anterior, se llevó un análisis más a detalle del efecto de la BK sobre la IKV donde se observa que hay un corrimiento de las curvas corriente–voltaje de la IKV control, y con BK hacia la izquierda de 4.9 ± 0.7 mV. Al ver que la BK (500 nM) mimetiza el efecto de la Oxo–M (10 μM) y de la Angio II (500 nM) de incrementar a la IKV con valores de 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 9) y 11.7 ± 1 (n= 7) pA/pF respectivamente a concentraciones supra molares. Y de igual manera, las constantes de tiempo (τ) obtenidas a partir del curso temporal del efecto de la BK, Angio II y Oxo–M, siendo éstas muy parecidas de 19.0 ± 4.1, 18.7 ± 2.2 y 17.7 ± 3.9 s, respectivamente. Estos resultados nos pueden estar sugiriendo que estos receptores utilizan las mismas o parte de las cascadas de señalización involucradas en la modulación de la IKV en neuronas GCS. Sabiendo esto, se comenzó al esclarecimiento de la cascada de señalización involucrada en la modulación de IKV por

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BK. Primero se evaluó si el efecto de la BK sobre la IKV es sensible a la diálisis de 2 a 4 minutos, y se encontró que hay una caída del incremento generado por la BK sobre la IKV de 15.9 ± 1.4 a 8.6 ± 1.3 pA/pF (n= 5 para ambos casos). Este dato es muy similar a lo reportado por Acosta y cols., 2007, sobre el efecto de la diálisis en el incremento de la IKV por Angio II. Conjuntamente, se quiso evaluar la participación de la vía del adenosin mono fosfato cíclico (AMPc), en la modulación de la BK sobre la IKV y con esto empezar a indagar cuál proteína G pudiera estar involucrada. Lo anterior se llevó a cabo con un activador de la adenilato ciclasa, Forskolina; sin embargo, se encontró un efecto de bloqueo sobre la corriente rápido y reversible, al parecer independiente del AMPc, sugiriéndonos un bloqueo directo del fármaco sobre el canal generador de la IKV.

Palabras clave:

Bradicinina, Corrientes de potasio, Mimetización.

La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificador tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina II y agonistas muscarínicos

Abstract

I

t is well known that Bradykinin (BK) imitates some of the stimulating actions of Angiotensin II (Angio II), muscarinic agonists and acetylcholine, over neurons of the superior cervical ganglion (SCG). For example, these neurons depolarization, leads to the subsequent norepinephrine (NA) secretion. Muscarinic agonists (Oxo–M), Angio II and BK modulate the potasium current type M (IKM) and the calcium current type N (ICaN). Recently we have found that the receptors for Angio II, as Oxo–M, modulate the delayed rectifier type potassium current (IKV). Based on the above, this proyect started first of all with the standardization and extraction of neurons from the SCG, and placed on the primary culture. Once the above took place the experiment with patch–clamp technique with the voltage clamp, and the whole cell fixation of the mentioned neurons, this last remark with the purpose of proving the cell viability in the culture. The preview corresponded to the derivation of characteristic currents from this neurons already widely described by other investigators (INa, IK calcium sensitive and of course to IKM and IKV as well) that suggest the viability of these cells in a primary culture. After this we proceeded to observe the BK effect over the IKV of these neurons, we observed an increase of this current with an EC50= 59.3 nM, obtained from a dose– response curve. Along with the previously stated a more detailed analysis was made on the effect of the BK over the IKV where it was observed that there is a current curve shifting–IKV control voltage and a shift to the left of 4.9 + 0.7 mV with BK. As we observe that the BK (500 nM) mimics the Oxo–M (10 µM) and Angio II (500 nM) increasing IKV effect with values of 13.9 ± 1.1 (n= 7), 10.4 ± 0.9 (n= 9) y 11.7 ± 1 (n= 7) pA/pF respectively to supramolar concentrations. Likewise for the time constants (τ) obtained from the natural temporal course of the BK, Angio II and Oxo–M effect, this lasts being very similar to 19.0 ± 4.1, 18.7 ± 2.2 y 17.7 ± 3.9 s respectively. These results may be suggesting that these receptors use the same or a part of the signaling cascade involved in the modulation of IKV in the SCG neurons. With this acknowledgement we began the clarification of the signaling cascade involved in the modulation of IKV by BK. First we evaluated if the effect of the BK over the IKV is sensitive to a 2 to 4 minutes dialysis, in which it was found that there was a fall in the increase generated by the BK over the IKV of 15.9 ± 1.4 to 8.6 ± 1.3 pA/

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pF (n= 5 for both cases). This is a fact similar to the one reported by Acosta and cols. 2007, about the dialysis effect in the IKV increase by Angio II. Jointly, we wanted to evaluate the cyclic adenosine monophosphate (AMPc) participation in the nodulation of the BK over the IKV and with that begin to search which protein G could be involved. This last remark took place with adenylate cyclase activator, Forskolin, however we found a blocking effect over the fast current and also reversible, apparently AMPc independent, suggesting a direct block from the block over the IKV generator channel.

Keywords:

Bradikinin, Potassium Current, Mimic.

Usuarios potenciales:

Fisiólogos, farmacólogos, médicos, alumnos de licenciatura y posgrado en áreas básicas y de la salud.

Reconocimientos:

En primera instancia un reconocimiento al Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, ya que es la que nos brindó tanto las instalaciones como equipo necesario. También es importante mencionar al PROMEP, ya que gracias a esta institución se obtuvieron los rubros necesarios para la compra de reactivos y material consumible utilizados. De igual manera un agradecimiento muy especial al M. en C. Blas Humberto Ibarra Retana, por su apoyo incondicional en los problemas que surgieron durante la realización de este proyecto de investigación. Por último, a la médico Edith Sandoval por la traducción del resumen.

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I. Introducción

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a coordinación de las funciones celulares reside en las habilidades que tienen las células para traducir un estímulo extracelular a respuestas celulares apropiadas. Estas respuestas celulares están dictaminadas por la naturaleza de las vías de señalización intracelular que inicialmente desencadenan los receptores celulares. Sin embargo, en las células, el número de proteínas de señalización intracelular es limitado, siendo estas proteínas blancos moleculares de múltiples receptores de membrana (Delmas y cols., 2002). Durante décadas se ha preguntado cómo los mismos receptores, que se acoplan a proteínas traductoras de información y sistemas de segundos mensajeros idénticos, pueden producir señales diferentes, o bien, varios receptores diferentes puedan llevar a cabo cascadas de señalización iguales. En relación a la excitabilidad celular, se puede decir que la modulación de canales iónicos por receptores acoplados a proteínas G, es uno de los principales mecanismos para la regulación de excitabilidad neuronal (Hille B. 1994). Por ejemplo la BK, un péptido generado en el plasma sanguíneo por daño tisular y que es formado a partir de kininógenos, por la acción de las kalicreínas. Este péptido contribuye a la estimulación de neuronas simpáticas (Lewis y Reit., 1965, 1966) y en parte gracias a esto, es un potente mediador de la inflamación y de la hiperalgesia. Dado lo anterior, que es un modulador de la actividad simpática y, por ende, de muchos procesos fisiológicos que están en cercana relación con el sistema nervioso autónomo, es bien sabido que este efecto lleva a un aumento de la excitabilidad, con el subsecuente aumento de la liberación de noradrenalina. Lo anterior ha sido estudiado en varios animales de experimentación (Chulak y cols., 1995). Este efecto específicamente se debe a que es un potente inhibidor de la IKM (corriente de potasio de bajo umbral, que es uno de los mayores componentes que mantiene el potencial de reposo en la membrana) en neuronas simpáticas (Jones S y cols., 1995). El efecto estimulador de la BK sobre el receptor B2, así como muchos otros receptores (estudiados a detalle), por citar alguno, al receptor muscarínicos tipo 1 (M1) y varios receptores estimulados por péptidos como la Angio II (AT1), inhiben de similar manera a corrientes de potasio Tipo M, vía segundos mensajeros (Byung-Chang y cols., 2004; Zaika y cols., 2006; Jones y cols., 1995; Cruzblanca y cols., 1998; Scholze y cols., 2002). Sin

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embargo, estos neurotransmisores o péptidos, no sólo tienen efectos sobre la IKM, sino que también lo hacen sobre un sinnúmero de canales iónicos que no han sido estudiados a detalle, como la IKM y la ICaN. Un ejemplo de lo anterior es el caso de la corriente de potasio tipo rectificador tardío, IKV, parte central de este trabajo; recientemente se ha encontrado evidencia de que la IKV también es parte fundamental en el aumento de la excitabilidad celular, que se traduce como aumento en el número de potenciales de acción generados en neuronas del GCS de rata (Malin y Nerbonne, 2002), contribuyendo con esto en la modulación y mantenimiento de la presión arterial. Se sabe al respecto que la Oxo–M, así como la Angio II, tienen efecto modulador sobre esta corriente (Cruzblanca H., 2006; Acosta y cols., 2007). Por otra parte, poco o nada se conoce respecto a la modulación de la BK sobre la IKV , sin embargo, toda la evidencia apunta a que la estimulación de estos receptores podría estar utilizando las mismas o parte de las cascadas de señalización para la modulación de la IKV

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II. Planteamiento

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a función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje interno a través de distintos mecanismos de señalización celular. Estos mecanismos transmiten señales que resultan en la regulación de funciones celulares determinadas, dependiendo de los receptores membranales que reciben señales específicas y llevan a la célula a seguir un mecanismo específico de señalización. Actualmente se sabe que múltiples cascadas de señalización en una misma célula comparten numerosos componentes. Esta promiscuidad puede entenderse por el hecho de que todas estas vías se encuentran interconectadas y, con esto, las respuestas pueden generarse de forma más rápida y eficiente (Pujades, 2000). Comprender cómo la célula recibe y coordina señales del entorno inmediato y de otras células del organismo, es esencial para entender los procesos fisiológicos celulares básicos. Este conocimiento a nivel celular es indispensable para comprender cómo se regulan variables fisiológicas sistémicas como la presión arterial, la osmolaridad del plasma sanguíneo o la excitabilidad del sistema nervioso. La modulación de canales de K+ es uno de los más importantes mecanismos usados por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), para regular la excitabilidad neuronal. Por mencionar alguno, en neuronas simpáticas de rata del ganglio cervical superior (GSC) los receptores muscarínicos M1, angiotensina II AT1 y Bradicinina B2, incrementan la probabilidad de disparo de potenciales de acción, a través de la inhibición de la corriente de potasio tipo M (IKM) (Delmas y Brown, 2005). En relación a la modulación muscarínica por los GPCR para cerrar a los canales M (Kv7.2/Kv7.3) y con esto inhibir a la IKM, son ya identificados. Se acepta que la señal que inhibe a los canales M es la disminución de la concentración del fosfolípido fosfatidil inositol 4-5bifosfato (PIP2) (Suh y Hille, 2002; Suh y cols., 2004; Zhang y cols., 2003; Zaika y cols., 2006; Winks y cols., 2005). La depleción del PIP2 se debe a la activación de la proteína Gq y de una fosfolipasa tipo C (PLC) (Delmas y Brown, 2005). La identificación de las moléculas involucradas en la modulación de IKM se ha llevado a cabo fundamentalmente en las neuronas GSC. Se sabe que esta corriente de K+ es modulada por el receptor M1, dado que la inhibición que produce este receptor es bloqueada por el

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antagonista del receptor M1 pirenzepina, pero no por el antagonista del receptor M2, himbacina (Bernheim y cols., 1992; Marrion y cols., 1989). Este hallazgo fue confirmado cuando el gene que codifica al receptor M1 fue eliminado genéticamente (Hamilton y cols., 997); sin embargo, con lo que respecta a la modulación de IKM por agonistas muscarínicos, en las neuronas del hipocampo de este mismo ratón Knock-out, la inhibición muscarínica de IKM permanece intacta (Rouse y cols., 2000). Lo anterior indica que más de un tipo de receptor muscarínico puede contribuir a la modulación de IKM. El análisis de las proteínas G involucradas en la modulación muscarínica de la IKM mostró que el principal mediador es la proteína Gq. Este hallazgo fue reiterado en neuronas del GSC, donde se utilizaron los antisentidos contra Gα11, Gαq o Gαo, para bloquear transitoriamente la expresión de sus respectivos genes. En estas condiciones la inhibición de IKM sólo fue significativamente reducida en aquellas células inyectadas con el antisentido contra Gα (Haley y cols., 1998). En un estudio posterior se encontró que en la ausencia de Gαq, Gα11 puede sustituir a la primera para mantener intacta la inhibición muscarínica de IKM (Haley y cols, 2000b). No obstante que Gαq y Gα11 estimulan a la fosfolipasa C-β (PLCβ), con la 2+ consecuente producción de diacilglicerol (DAG), inositol trifosfato (IP3) y liberación de Ca, estos segundos mensajeros no parecen intervenir en la inhibición muscarínica de IKM (Cruzblanca y cols., 1998; del Río y cols. 1999). En el mismo sentido, también se ha estudiado a detalle el efecto de la Angio II, que mimetiza a los agonistas muscarínicos, sobre la excitabilidad, y de igual manera, inhibe a la IKM de las neuronas GCS. Una de estas acciones consiste en disminuir la conductancia total de la membrana debida a la inhibición de la IKM (Shapiro y cols., 1994). En estas neuronas simpáticas, la Angio II también inhibe a la corriente de calcio (Ica), vía el receptor AT1 y una proteína G insensible a la PTX (Shapiro y cols., 1994). Al respecto, se propone que ambas corrientes iónicas son moduladas por similares vías de señalización. Algunos datos sugieren que en la acción de la Angio II está involucrada una proteína Gq, esto debido a que: a. datos indirectos han demostrado que Gq interviene en la inhibición muscarínica de IKM (Haley y cols., 1998; Haley y cols., 2000). b. datos indican que el péptido, antagonista GP-2A, así como la sobreexpresión de RGS2 (bloquean específica a Gq/11) reducen la modulación angiotensinérgica de IKM (Acosta, 2004, Acosta, 2007b). Un estudio realizado por Zaika y colaboradores en el 2006 sostienen que la modulación angiotensinérgica de la IKM también se debe a la depleción del PIP2 por la PLC e independiente de aumento del calcio intracelular. Hoy la comunidad científica acepta que la inhibición de la IKM por agonistas muscarínicos, así como por Angio II, es debida a la depleción de los niveles de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) de la membrana celular (Suh y cols., 2006; Winks y cols., 2005; Zaika y cols., 2006). Con lo que respecta a la modulación de la IKM por la BK en neuronas GCS, esta

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corriente también es inhibida, específicamente por el receptor B2; esto se encontró ya que cuando se utilizó un antagonista selectivo de los receptores B2 como es el Hoe 140, al estimular con BK no se observó ningún efecto inhibitorio de la IKM (Jones y cols., 1995). En la inhibición de la IKM por el receptor B2 está involucrada una proteína Gq/11; esto se concluye porque al utilizar un anticuerpo contra la subunidad Gαq/11 el efecto inhibitorio de la BK se reduce. En el ratón Knock-out para Gq el anticuerpo contra Gq/11 bloquea el efecto inhibitorio de la BK, indicando que el receptor B2 se acopla preferentemente con G11 para inhibir a la IKM (Haley y cols., 2000a). Al igual que con la vía muscarínica y angiotensinérgica, se conoce con razonable detalle el resto de la cascada de señalización usada por el receptor B2. Evidencia obtenida con antisentidos muestra que está involucrada específicamente la enzima fosfolipasa Cβ4; ya que en neuronas inyectadas con el antisentido contra la PLCβ4, no hubo ningún efecto inhibitorio de la BK. En contraste, sí se observó efecto en neuronas inyectadas con antisentidos contra la PLCβ1 y PLCβ3, ya que estas isoformas de fosfolipasas β también se expresan en las células GSC (Haley y cols., 2000b). Una vez activada la PLCβ4, ésta hidroliza al PIP2; al respecto, se ha demostrado que el IP3 y la posterior liberación de Ca2+ desde depósitos sensibles al IP3 es la señal que dispara la inhibición de IKM (Cruzblanca y cols., 1998). Esta conclusión se alcanzó porque: 1) al utilizar una concentración (20 mM) BAPTA el efecto inhibitorio de la BK fue menor en comparación con una baja concentración (0.1 mM) de BAPTA; 2) al medir la concentración de Ca2+ intracelular se observó que hay un aumento de este ión siguiendo un curso temporal similar al de la inhibición de la IKM (Cruzblanca y cols., 1998). Evidencia posterior apoya la idea de que el Ca2+ al unirse a la Calmodulina (CaM), dicho complejo interacciona con la región C-terminal de las subunidades KCNQ del canal M, particularmente en el dominio IQ, ya que éste contiene isoleucina y glutamina (Yus y cols., 2002; Wen y Levitan, 2002). Se sugiere que la CaM puede actuar como un sensor de Ca2+ y así puede mediar la modulación dependiente de Ca2+. Para poder demostrar lo anterior, se llevaron a cabo experimentos en neuronas GSC expresando un dominante negativo de la CaM, en donde no se observó un efecto significativo de la BK, por lo que se deduce que en la modulación de la IKM por la estimulación del receptor B2 el mensajero final es el complejo Ca2+- CaM (Gamper y Shapiro, 2003). También es bien sabido que las neuronas GSC expresan los dos tipos de receptores a la BK (Seabrook y cols., 1997); sin embargo, el receptor B2 es el más abundante y responsable de la mayoría de los efectos de la BK en estas neuronas. La estimulación de B2, al igual que el receptor AT1 y el M1, también estimula la liberación de noradrenalina e inhibe a la IKM a través de la fosfolipasa C y la subsecuente liberación de Ca2+ desde depósitos sensibles al IP3 (Jones y cols., 1995; Hamilton y cols., 1997; Cruzblanca y cols., 1998; Haley y cols., 2000a; Boehm y Kubista, 2002). Otras corrientes de K+ activadas por voltaje, que contribuyen a regular la excitabili-

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dad de las neuronas GCS, incluyen: 1) la rápida activación e inactivación de la corriente de K+ tipo A (IA); 2) otro tipo de IA pero con una inactivación lenta (IAS); 3) La IKV (Malin y Nerbonne, 2000). El relativo nivel de densidad de corriente de cada una de estas corrientes de K+ y su cinética, da el tipo de patrón de disparo en las células del GCS. (Malin y Nerbonne, 2000, 2002; Wang y McKinnon, 1995). Además, hay diferencias sutiles a nivel molecular, que las neuronas GCS expresan IA e IKV, este último es generado por canales homoméricos formados por Kv2.1 y Kv2.2, donde sólo el Kv2.1 contribuye a la IKV, de tal modo que en estas células se expresan IA, IAS, IKV (Malin y Nerbonne, 2002). Los canales formados por Kv2.1 constituyen el mayor componente de la corriente de K+, tipo rectificador tardío en globo pálido, hipocampo y neuronas corticales piramidales (Baranauskas y cols., 1999; Murakoshi y Trimmer, 1999). En estas neuronas centrales, los canales conformados por Kv2.1 preferentemente se localizan en el cuerpo celular y dendritas proximales (Hwang y cols., 1993; Misonou y cols., 2004); aquí regulan la excitabilidad somato-dendrítica dependiente de frecuencia (Du y cols., 2000). En neuronas del GCS, se sabe que agonistas muscarínicos y la Angio II incrementan, por un lado, a la IKV y, por otro, los mismos receptores anteriores, así como la BK, inhiben a la corriente de potasio tipo M (IKM). Estas dos corrientes iónicas en particular, al parecer son fundamentales para la estabilización de potenciales de acción de manera tónica (Malin y Nerbonne, 2002; Acosta y cols., 2007; Cruzblanca, 2006), sin embargo, el impacto de esta regulación por receptores acoplados a proteínas G o fármacos sobre estos canales involucrados en la generación de disparos o potenciales de acción repetitivos, no ha sido bien entendido y estudiado. En la actualidad se sabe con precisión muchos de los mecanismos y las cascadas de señalización que estos receptores emplean para inhibir a IKM e incrementar a la IKV. Un dato de suma importancia es que, al igual que la IKM, la IKV también contribuye a definir los patrones de disparo neuronal, a través de su modulación por receptores muscarínicos y a neuropéptidos (Sumners y Gelband, 1998). Estudios posteriores han mostrado que la Oxo–M y la Angio II también modulan a la IKV generada por las neuronas GSC (Cruzblanca H, 2006; Acosta y cols., 2007). Se conoce que en neuronas del hipocampo, particularmente de la región CA1, los agonistas muscarínicos incrementan la corriente de K+ tipo rectificador tardío. En esta modulación se encontró que está involucrada una proteína G, ya que al utilizar el GTPγS hubo un incremento progresivo de la amplitud de la corriente de K+ y, al aplicar el agonista muscarínico carbacol, hubo un efecto de oclusión (Zhang y cols., 1992). En contraste, en neuronas donde se estimuló con el mismo agonista pero dializadas aquellas con el GDPβS, un inhibidor general de las proteínas G, no se observó dicho aumento de la corriente. Aparentemente, la fosfolipasa C es la vía que interviene en el aumento del rectificador tardío, dado que: a) la diálisis del IP3 ocluye el efecto del carbacol; b) al utilizar un quelante de Ca2+ (BAPTA), el efecto del carbacol no se observaba; c) los esteres de forbol que activan directamente a la proteína cinasa C dependiente de Ca2+ (PKC), también ocluyen el efecto del carbacol; d) por último se sugiriere que la modulación de IKV es dependiente de fosforilación. Para esto, dializaron en neuronas análogos del ATP (AMP-PNP o ATPγS), que subse-

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cuentemente se estimularon con carbacol, observándose un decremento de la corriente con respecto al tiempo (Zhang y cols., 1992). Resuminedo lo anterior, en la modulación de la IKV por receptores muscarínicos en neuronas hipocampales, está involucrada una proteína G, la formación del IP3, con una subsecuente liberación de Ca2+ desde cisternas intracelulares sensibles al IP3, donde posteriormente una PKC muy probablemente es la que modula a la proteína responsable de la corriente de potasio tipo rectificador tardío. Sólo falta conocer la identidad del receptor muscarínico involucrado en la modulación del rectificador tardío de las neuronas del hipocampo. Contrario a lo que sucede en el hipocampo, en las neuronas ventromediales del hipotálamo, el carbacol inhibe al rectificador tardío, efecto mediado por la subunidad α de la proteína G11. Este hallazgo es consistente con que: a) la diálisis del GDPβS reduce el efecto del carbacol; b) la toxina pertusis (PTX) y la toxina del cólera no bloquean el efecto del carbacol, lo que descarta a las proteínas Go, Gi y Gs; c) en neuronas inyectadas con el antisentido contra Gq no bloquea la inhibición del rectificador tardío. Esto nos habla, entonces, de que en esta cascada de señalización está involucrada una proteína G11 (Ffrench-Mullen y cols., 1994). Dado que G11 normalmente activa la vía de la fosfolipasa C, queda por confirmar la participación de esta cascada bioquímica en la inhibición del rectificador tardío. Los ejemplos anteriores indican que la cascada de la fosfolipasa C, tiene un efecto opuesto, en las neuronas del hipocampo y del hipotálamo, sobre el mismo rectificador tardío. Se desconoce la razón de esta discrepancia, aunque una posibilidad es que la constitución molecular de los canales iónicos que generan la corriente rectificadora tardía, sea diferente en ambos tipos de neuronas centrales. Alternativamente, los efectos del carbacol pueden estar mediados por distintos receptores muscarínicos. Otro ejemplo de dualidad se ha reportado en la acción de la Angio II sobre el rectificador tardío generado en neuronas de rebanadas mixtas de hipotálamo y tallo cerebral. En estas células la estimulación del receptor AT2 se traduce en aumento del rectificador tardío, mientras que el receptor AT1 tiene un efecto inhibitorio. El grupo de Sumners se ha dedicado a identificar las cascadas de señalización respectivas. Al respecto, hay suficiente evidencia de que la acción del AT1 está mediada por la proteína Go y el resto de la cascada lo integran la fosfolipasa Cγ, el complejo Ca2+-CAM y las proteínas cinasas PKC y CAMII (Sumners y cols., 1996; Wang y cols., 1997a, 1997b; Zhu y cols., 1999). Por su parte, el receptor AT2 utiliza una proteína G PTX insensible que se acopla a la fosfolipasa A2 y la rama 12-HETE de la vía del ácido araquidónico (Kang y cols., 1994; Zhu y cols., 1998; Zhu y cols., 2000). En lo que respecta a estudios recientes, hemos reportado que en las neuronas GSC la corriente de K+ tipo rectificador tardío IKV es blanco de los agonistas muscarínicos y de la Angio II. Por el momento, hemos identificado los receptores involucrados y caracterizado parcialmente sus respectivas cascadas de señalización. En estas neuronas, el receptor muscarínico del tipo M2 y el receptor AT1 tienen el efecto de aumentar la IKV (Cruzblanca, 2006; Acosta y col., 2007a). Esto mismo sucede cuando se aplica el neuropéptido BK. Sin embargo, se desconoce la identidad del receptor involucrado, como los

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elementos involucrados en la modulación de la IKV (Acosta, 2004). Por ahora podemos afirmar que la modulación muscarínica y angiotensinérgica de la IKV tienen las siguientes propiedades: a) la modulación es sensible al inhibidor general de las proteínas G, GDPβS; b) los receptores M2 y AT1 se acoplan a una proteína G insensible a la PTX; c) la modulación muscarínica y angiotensinérgica es reducida por el análogo no hidrolizable del ATP, AMP-PNP; d) la estimulación del receptor M2 ocluye la acción del AT1 y viceversa. Estos resultados indican que ambos receptores podrían estar empleando la misma cascada de señalización. A falta de demostrarlo, también podría estar utilizando esta cascada de señalización la BK. Por otra parte, hemos encontrado ciertas diferencias entre la modulación de IKV e IKM, particularmente la angiotensinérgica, que nos sugiere que en ellas participan distintas rutas bioquímicas. Por ejemplo: a. El curso temporal de la modulación de IKV (τ = 29.3 ± 2.8 seg) es ostensiblemente lento en comparación con la modulación de IKM (τ = 10.8 ± 0.5) (Acosta 2004). Sin embargo, en relación con la evidencia de la modulación de la IKM por los receptores AT1, M1 y el receptor B2, que comparten los mismos efectos celulares, es posible que este último también tenga una acción moduladora sobre la IKV. Esta posibilidad se refuerza, ya que en el músculo liso y en la línea celular HEK 293, los receptores AT1 Y B2 forman heterodímeros, y esta interacción directa se traduce en incremento en la activación de las proteínas G, a las cuales se acoplan (AbdAlla y cols., 2000). Por lo dicho, sería conveniente determinar si el efecto de la BK sobre IKV está mediado por la anterior vía de señalización, ya que es posible que la modulación peptidérgica de IKV , de igual manera que la IKM , sea parte de la respuesta celular que subyace al aumento del tono simpático inducido por Oxo–M, Angio II, y si de igual manera lo hace la BK. Poco se sabe o no se ha estudiado el efecto mediador de la BK y mucho menos los elementos involucrados para modular a la IKV. Si el receptor AT1 M1 y el receptor B2 comparten los mismos efectos celulares, es posible que este último también tenga una acción mimetizadora sobre la IKV. Es posible entonces que la modulación peptidérgica de IKV sea parte de la respuesta celular que subyace al aumento del tono simpático inducido por la agonistas muscarínicos, Angio II y la BK. Lo anterior es de suma importancia, ya que la evidencia muestra que la sobreestimulación del sistema nervioso simpático contribuye a la génesis y mantenimiento de la hipertensión (Guyenet, 2006), razón por la cual es de singular importancia conocer con precisión los mecanismos iónicos, bioquímicos y moleculares que facilitan la liberación de NA de las neuronas simpáticas. Además, conviene estudiar los mecanismos iónicos, bioquímicos y moleculares empleados por la BK en la modulación y control de la excitabilidad de estas neuronas ganglionares simpáticas, así como identificar los posibles paralelismos de los efectos de la BK con la acción colinérgica y angiotensinérgica.

La bradicinina incrementa una corriente de potasio tipo rectificador tardío en tiempo y forma, como lo hacen la angiotensina II y agonistas muscarínicos

III. Metodología

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Cultivo celular

os experimentos se realizaron en neuronas del ganglio cervical superior, mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas se anestesiaron con cloroformo y posteriormente se sacrificaron por decapitación; se disecaron rápidamente ambos ganglios, los cuales se encuentran a nivel de la bifurcación de las arterias carótidas. Una vez extraídos, los ganglios se limpian y se decapsulan cuidadosamente para evitar dañar a las neuronas contenidas en ellos. Con el fin de facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión enzimática, se realizaron varios cortes transversales del GCS. Las enzimas que se emplearon en la dispersión fueron: papaína (Roche; 20 U/ml), colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5 mg/ml), disueltas en solución de Hanks modificada (Tabla 1); las soluciones se mantuvieron frías y continuamente se oxigenaron hasta antes de su uso, ya que esto permite una mayor sobrevivencia de las neuronas. Después de haber incubado con las enzimas, los trozos de ganglio se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas pulidas al calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez lograda la disociación del tejido, las enzimas se diluyeron, añadiendo medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium; GIBCO); la suspensión se centrifugó a 1500 rpm durante 3 min. Posteriormente se resuspendieron las neuronas con sumo cuidado en medio fresco, conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFB), para la inactivación total de las enzimas utilizadas en la dispersión celular. Más aún, se centrifugó por segunda ocasión a 1500 rpm durante 3 min. Después, las neuronas fueron nuevamente resuspendidas en una pequeña cantidad de volumen, para posteriormente ser sembradas en fragmentos de vidrio (≈ 4 x 4 mm) tratados previamente con poli-lisina (500 ng/ml) (SIGMA); se dejaron reposar durante 2 horas para que las células se adhirieran al vidrio. Después de este periodo, a las neuronas se les adicionó DMEM + 10% SFB + una mezcla de antibiótico y antimicótico (ver soluciones) y se incubaron por lo menos durante 8 h. La incubación se llevó a cabo a 37 ºC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de su empleo, para la toma de fotografías de neuronas en cultivo primario de GCS de rata y registros electrofisiológicos.

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Registros electrofisiológicos Para el registro de las corrientes iónicas en las neuronas del GCS (INa, IK sensibles al calcio, IKM e IKV), se transfirió uno de los fragmentos de vidrio, conteniendo neuronas en cultivo primario, a una cámara de registro de capacidad de 200 μl y se bañaron con solución Ringer Normal (Tabla 1) a una tasa de 2.5 ml/min. Las corrientes iónicas se registraron mediante la técnica de “patch-clamp” en la configuración de “célula entera”, se utilizaron pipetas de vidrio con una resistencia de 1–2 MΩ. Los registros se realizaron con el amplificador EPC10 (HEKA elektronics). Para el registro de la IKV e IKM, se bloquearon previamente las corrientes de Na+ (INa) y Ca2+ (ICa) con 500 nM de Tetrodotoxina (TTX) y 200 μM de CdCl2, respectivamente, siendo ésta la solución control (Tabla 1); con el bloqueo de la ICa automáticamente se bloquearon las corrientes de potasio sensibles a calcio (IK) que pudieran contribuir tanto a la IKV e IKM. El aislamiento, la amplitud así como el efecto modulador sobre la IKV se generó con pulsos comando despolarizantes de 100 ms de duración, en el rango de -50 a 0 mV, como lo describe Cruzblanca en el 2006. El voltaje de sujeción fue de -50 mV, para la completa inactivación de la corriente de potasio tipo IA (Wang y McKinnon, 1995). Antes de su adquisición a 5 KHz, la IKV se filtró a 1 kHz. De igual manera, para la obtención de la curva corriente–voltaje se llevaron a cabo pulsos cada 4 segundos desde -60 a 60 mV con incrementos de 10 mV. Por otro lado, la amplitud de la IKM o la deactivación de los canales M, se generaron con pulsos depolarizantes de 500 ms de duración, en el rango de un voltaje de sujetación de -25 a -60 mV cada 4 segundos, como lo describe Cruzblanca y cols., 1997. Para la medición de las corrientes de cola generadas por las corrientes mencionadas anteriormente, se midieron las diferencias entre el promedio de un segmento de 2 ms al principio de la corriente de cola y un promedio durante los últimos 5 ms del registro de la corriente. La observación y registro electrofisiológico se llevó a cabo gracias a una cámara para mantener las neuronas en cultivo primario, montada a un microscopio invertido Nikon TE2000U con microscopia de contraste de fases con los objetivos 10, 20 y 40X. Las fotos obtenidas se hicieron gracias a una cámara de video digital, DXM 1200C, montada al mencionado microscopio. La estadística se llevó a cabo por promedios con sus respectivos errores estándar y éstos fueron comparados buscando significancia con la prueba de “t” Student entre dos grupos (P