Objetivos propiedades físicas, químicas y biológicas(función) del ADN plasmídico y genómico
Interacción con el entorno y otras moléculas
Aplicación de los conceptos integrados:
condiciones de ruptura celular, extracción, purificación y detección específicas
Identificación de genes (Southern Blot), amplificacion de genes (PCR, DNA recombinante)
Abs. a 260 nm (efecto hipercrómico)
q(-) es su superficie
Desnaturalización y renaturalización cooperativa gran capa de hidratación en torno a P sensible a sales caotrópicas
ptes de H y empaquetamiento hidrofóbico en su interior
¿Qué efecto tiene el agregado de alcoholes en la estabilidad?
la alta cte dielectrica del H2O impide la formación de enlaces iónicos estables
el agregado de ALCOHOLES de menor constante dielectrica → precipitación
Efecto del PH El enlace fosfodiester y el enlace N-glicosídico son inestables a pH muy ácidos (pH 1 o menor) y temperatura ambiente. A pH alrededor de 4 el enlace N-glicosidico de las purinas se rompe (depurinización).
Efecto del PH
A pH alcalinos el DNA es estable hasta pH 11 pero el RNA se hidroliza a pH superiores a 7.5.
Unión a colorantes
Bromuro de etidio
Agente intercalente: diferente distorsión según el tipo de DNA
Unión a colorantes
Efecto del PH
Efecto del ph sobre los puentes de H
La urea y formamida compiten por los ptes de H entre
bases…pero como hacen para interaccionar con estas?
Constante ruptura y formación de los ptes de H entre bases por equilibrio térmico
esto permite la competicion de
por ptes de H
las bases que se separan en el eq. no se vuelven a aparear
Efecto hipercrómico
Fusión y enfriamiento de DNA
Por qué el DNA se comporta de este modo?? Cooperatividad: la estimulacion (o inhibicion) de un evento posterior a la ocurrencia del mismo evento en otra parte de la macromolecula Cuál es el evento que se repite?? Zipper model o modelo de cremallera
Fusión y enfriamiento de DNA
Zipper model o modelo de cremallera
El grado de cooperatividad depende
de la relación entre el ∆Gnucleacion y ∆Gpropagacion
Fusión y enfriamiento de DNA
Diferente estructura del mitadfundido resp. al mitad-renaturalizado
doble cadena (estabilizado por ptes de H y apilamiento de bases) simple cadena (favorecido entrópicamente y por repulsión de fosfatos) → proceso dependiente de la temperatura y la [sales] (dependencia de TM con [sales] )
+ + contraiones
+ + +
+
aumento de la estabilidad con el agregado de sales
Fusión y enfriamiento de DNA
La fusión de DNA se piensa generalmente en términos de ruptura de ptes de H pero lo que se obs. es la perdida del apilamiento de bases por absorción
→ TM
mide el desapilamiento
El desapilamiento tb. desestabiliza pares de bases apareados adyacentes a otro desapareado.
Fusión y enfriamiento de DNA La estabilidad del DNA depende de la estabilidad de c/par de bases.
Generalmente asoc. al pte de H extra La fundición se inicial en zonas T∙A
Fusión y enfriamiento de DNA La renaturalización es bimolecular tambien depende de la estabilidad de c/par de bases, mas probable en G∙C .
La renaturalización ( diferencia de la fusión) muestrea muchos estados termodinámicamente degenerados → aumenta S de estos estados. El DNA medio-fundido representa una distribución angosta de estructuras, pero el DNA medio-renaturalizado tiene una composición más heterogenea → la cooperatividad de TM es > que la de TA
La nucleación puede unir segmentos que no estén unidos en el DNA final !! Muestreo de un gran número de combinaciones previas. Si el enfriamiento es rápido, el sist queda atrapado en intermediarios de alta energía. Si la [cadenas simples] es muy baja → peligro de formacion de pares INTRAmoleculares.
La renaturalización depende de la concentración
La renaturalizacion del ADN sigue una cinética de segundo orden Etapa determinante
c/c0 vs c0t (curvas “cot”)
Curvas “cot” de distintas fuentes
Complejidad Número de nucleótidos en sequencias norepetidas
c0t es proporcional a la complejidad
Curva “cot” de DNA humano DNA medianamente Repetitivo horquillas
(genes que RNAt y RNAr, etc)
DNA de copia unica cruciforme (palindromes)
DNA altamente repetitivo
(mayoria de los genes que codifican proteina)
La cinética de reasociación tiene una T optima
1. El DNA se corta en fragmentos de aproximadamente 450bp (por ejemplo por sonicación)
2. El tamaño de los fragmentos se puede chequear por electroforesis. 3. Una determinada concentración de DNA se dispone en tubos
4. Se desnaturaliza el DNA 5. A una temperatura entre 20 y 25 grados menor a Tm, y en forma lenta se procede a la reasociación 6. Se calcula el % de ssDNA para determinar el valor de Cot
tubo con ADN
calentamiento
Dilución para frenar la reasociación
Incubar a Tm - 25C
todo el ADN se une
Eluye el ssDNA
Eluye el dsDNA
Se puede determinar la complejidad de un genoma Tomando como referencia la complejidad de otro
