DOCTOR OF PHILOSOPHY -PhD-

Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Untersuchungen zu...
Author: Emilia Esser
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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Zentrum für Systemische Neurowissenschaften

Untersuchungen zur Wirkung von Antiepileptika und zum Auftreten Depressions-assoziierten Verhaltens im fokalen Kainat-Modell in der Maus

These zur Erlangung des Grades eines

DOCTOR OF PHILOSOPHY -PhD-

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Sabine Klein aus Meyrin (CH)

Hannover 2014

Supervisor:

Prof. Dr. Wolfgang Löscher

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Wolfgang Löscher Prof. Dr. Alexandru Stan Prof. Dr. Kirsten Haastert-Talini

1. Gutachten:

Prof. Dr. Wolfgang Löscher Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Prof. Dr. Alexandru Stan Institut für Pathologie Johannes Wesling Kliniken Minden

Prof. Dr. Kirsten Haastert-Talini Institut für Neuroanatomie Medizinische Hochschule Hannover

2. Gutachten:

Prof. Dr. Heidrun Potschka Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Ludwig-Maximilians-Universität München

Datum der mündlichen Prüfung:

28.03.2014

Diese Arbeit wurde durch das Bodelschwingh-Stipendium der Gesellschaft für Epilepsieforschung e.V. sowie durch ein Promotionsstipendium der FAZIT-Stiftung unterstützt.

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................... 1 2 Phänomenologie und Stand der Forschung ................................... 3 2.1 Epilepsie ....................................................................................................... 3 2.1.1 Definition und Bedeutung .......................................................................................... 3 2.1.2 Temporallappenepilepsie ........................................................................................... 4

2.2 Allgemeine Aspekte der Pharmakotherapie bei Epilepsiepatienten ............ 5 2.3 Spezifische Aspekte der verwendeten Antiepileptika ................................. 8 2.3.1 Carbamazepin ............................................................................................................ 8 2.3.2 Diazepam ................................................................................................................... 8 2.3.3 Levetiracetam ............................................................................................................. 9 2.3.4 Phenobarbital ............................................................................................................. 9 2.3.5 Phenytoin ................................................................................................................. 10 2.3.6 Valproat.................................................................................................................... 11

2.4 Pharmakoresistenz...................................................................................... 11 2.4.1 Definition und Bedeutung ........................................................................................ 11 2.4.2 Mögliche Ursachen .................................................................................................. 13 2.4.3 P-Glykoprotein ......................................................................................................... 14

2.5 Psychiatrische Komorbiditäten bei Epilepsie ............................................ 18 2.6 Tiermodelle ................................................................................................ 20 2.6.1 Epilepsiemodelle ...................................................................................................... 20 2.6.2 Intrahippocampales Kainat-Modell ......................................................................... 21 2.6.3 Genetisch veränderte Mäuse .................................................................................... 22 2.6.4 Modelle für Depressions-assoziiertes Verhalten ..................................................... 24

3 Ziele und Arbeitshypothesen ......................................................... 27 4 Material und Methoden ................................................................. 29 4.1 Versuchstiere .............................................................................................. 29 4.2 Ablauf der Studie ....................................................................................... 29 4.3 Stereotaktische Operation zur Induktion des Status epilepticus ................ 30

I

4.4 EEG- und Video-Überwachung ................................................................. 35 4.4.1 Aufzeichnung ........................................................................................................... 35 4.4.2 Substanzapplikationen ............................................................................................. 36 4.4.3 Auswertung .............................................................................................................. 39

4.5 Sucrose-Preference-Test ............................................................................ 40 4.5.1 Vorversuche ............................................................................................................. 41 4.5.2 Versuchsablauf ......................................................................................................... 43

4.6 Statistische Auswertung ............................................................................. 44

5 Ergebnisse ........................................................................................ 45 5.1 Vergleich der FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäuse .................................... 45 5.2 Zeitlicher Verlauf der Anfälle .................................................................... 45 5.3 Vergleich verschiedener Auswertungsansätze: Anfallsanzahl und kumulative Anfallsdauer .................................................................................. 48 5.4 Wirkungen der Antiepileptika .................................................................... 50 5.4.1 Einsatz verschiedener Vehikel ................................................................................. 50 5.4.2 Antiepileptika........................................................................................................... 54

5.5 Responder-Nonresponder-Selektion .......................................................... 71 5.5.1 Ermittlung des Responderstatus ............................................................................... 71 5.5.2 Vehikel ..................................................................................................................... 72 5.5.3 Antiepileptika........................................................................................................... 75

5.6 Sucrose-Preference-Test ............................................................................ 85

6 Diskussion ........................................................................................ 89 6.1 Das fokale Kainat-Modell als Screening-Modell ...................................... 89 6.2 Pharmakoresistenz im Kainat-Modell........................................................ 91 6.3 Wirkungen von Diazepam ......................................................................... 97 6.4 Responder-Nonresponder-Selektion .......................................................... 98 6.5 Auswirkungen von P-Glykoprotein auf die Pharmakoresistenz .............. 102 6.6 Anhedonie ................................................................................................ 105 6.7 Ausblick ................................................................................................... 108

7 Zusammenfassung ........................................................................ 109

II

8 Summary........................................................................................ 113 9 Literaturverzeichnis ..................................................................... 115 10 Anhang ......................................................................................... 131 10.1 Ansatz der applizierten Substanzen und Lösungen ............................... 131 10.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte......................................................... 132 10.3 Originaldaten der Antiepileptika-Behandlungen ................................... 134 10.3.1 Carbamazepin 20 mg/kg ...................................................................................... 134 10.3.2 Carbamazepin 40 mg/kg ...................................................................................... 135 10.3.3 Diazepam 2 mg/kg (Faustan®) ............................................................................ 135 10.3.4 Diazepam 5 mg/kg (Faustan®) ............................................................................ 136 10.3.5 Diazepam 5 mg/kg in wässriger Lösung.............................................................. 136 10.3.6 Diazepam-Vehikel: enthält 0,19 % Ethanol......................................................... 137 10.3.7 Levetiracetam 400 mg/kg .................................................................................... 137 10.3.8 Levetiracetam 800 mg/kg .................................................................................... 138 10.3.9 Isotonische Natriumchloridlösung ....................................................................... 139 10.3.10 Phenobarbital 25 mg/kg ..................................................................................... 140 10.3.11 Phenobarbital 50 mg/kg ..................................................................................... 140 10.3.12 Phenytoin 20 mg/kg ........................................................................................... 141 10.3.13 30-prozentiges Polyethylenglycol 400 ............................................................... 141 10.3.14 Valproat 300 mg/kg ........................................................................................... 142

11 Danksagung ................................................................................. 143

III

Abkürzungsverzeichnis

#

Anzahl

°C

Grad Celsius

ANOVA

Varianzanalyse (Analysis of variance)

ATP

Adenosintriphosphat

bzw.

beziehungsweise

CA1

Cornu ammonis 1

d. h.

das heißt

ED50

In 50 % der Tiere effektive Dosis

EEG

Elektroenzephalogramm

g

Gramm

GABA

Gamma-Amino-Buttersäure

Hz

Hertz

ILAE

Internationale Liga gegen Epilepsie (International League against Epilepsy)

l

Liter

lx

Lux

MDR1

Multidrug resistance protein 1 des Menschen

mdr1

Multidrug resistance protein 1 der Maus

NaCl

Isotonische Natriumchloridlösung

Pgp

P-Glykoprotein

s

Sekunde

WHO

Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation)

wt

Wildtyp

IV

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1 Expression von Multidrug-Transportern ............................................................. 14 Abbildung 2 P-Glykoprotein .................................................................................................... 15 Abbildung 3 Ablauf der Studie ................................................................................................ 30 Abbildung 4 Lokalisation auf dem Mausschädel ..................................................................... 32 Abbildung 5 Lokalisation der Kainat-Injektion ....................................................................... 33 Abbildung 6 Aufbau der Ableitelektrode ................................................................................. 33 Abbildung 7 Maus mit Ableitelektrode .................................................................................... 34 Abbildung 8 Ablauf der Substanzapplikationen ...................................................................... 36 Abbildung 9 Beispiele für EEG-Veränderungen im fokalen Kainat-Modell ........................... 40 Abbildung 10 Sucrose-Preference-Test im Verlauf der Studie ................................................ 41 Abbildung 11 Seitenpräferenz des Wasserkonsums bei gesunden Mäusen ............................. 41 Abbildung 12 Bevorzugte Saccharose-Konzentration weiblicher FVB/N-wt-Mäuse ............. 42 Abbildung 13 Käfig mit 2 Trinkflaschen ................................................................................. 43 Abbildung 14 Ablauf des Sucrose-Preference-Test ................................................................. 44 Abbildung 15 Frequenz fokaler Anfälle in Dunkel- vs. Hellphase .......................................... 46 Abbildung 16 Zeitlicher Verlauf fokaler Anfälle bei einzelnen Mäusen ................................. 47 Abbildung 17 Frequenz vs. Dauer fokaler Anfälle in Dunkel- und Hellphase ........................ 49 Abbildung 18 Isotonische Natriumchloridlösung .................................................................... 51 Abbildung 19 Polyethylenglycol 400 ....................................................................................... 52 Abbildung 20 Diazepam-Vehikel............................................................................................. 53 Abbildung 21 Carbamazepin 20 mg/kg ................................................................................... 55 Abbildung 22 Carbamazepin 40 mg/kg ................................................................................... 56 Abbildung 23 Diazepam 2 mg/kg (Faustan®) ......................................................................... 58 Abbildung 24 Vergleich von Anfallsfrequenz und –dauer am Beispiel Diazepam ................. 59 Abbildung 25 Diazepam 5 mg/kg (Faustan®) ......................................................................... 60 Abbildung 26 Diazepam in wässriger Lösung ......................................................................... 62 Abbildung 27 Levetiracetam 400 mg/kg.................................................................................. 63 Abbildung 28 Levetiracetam 800 mg/kg.................................................................................. 65 Abbildung 29 Phenobarbital 25 mg/kg .................................................................................... 66 Abbildung 30 Phenobarbital 50 mg/kg .................................................................................... 67 Abbildung 31 Phenytoin 20 mg/kg .......................................................................................... 68

V

Abbildung 32 Valproat 300 mg/kg........................................................................................... 70 Abbildung 33 Ermittlung des Responderstatus ........................................................................ 72 Abbildung 34 Verlauf des Wasserkonsums ............................................................................. 85 Abbildung 35 Verlauf des Körpergewichts .............................................................................. 86 Abbildung 36 Saccharose-Präferenz im Sucrose-Preference-Test........................................... 87 Abbildung 37 Verlauf des Saccharose-Konsums ..................................................................... 88

VI

Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Applizierte Substanzen und Vehikel ........................................................................ 38 Tabelle 2: Einfluss generalisierter Anfälle auf die Frequenz fokaler Anfälle.......................... 48 Tabelle 3 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Diazepam-Vehikel .......................... 54 Tabelle 4 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Carbamazepin 40 mg/kg ................. 57 Tabelle 5 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Diazepam in wässriger Lösung ....... 62 Tabelle 6 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Levetiracetam 400 mg/kg ............... 64 Tabelle 7 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Levetiracetam 800 mg/kg ............... 64 Tabelle 8 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Valproat 300 mg/kg ........................ 69 Tabelle 9 Responder-Selektion: isotonische Natriumchloridlösung ........................................ 73 Tabelle 10 Responder-Selektion: 30-prozentiges Polyethylenglycol 400 ............................... 74 Tabelle 11 Responder-Selektion: Diazepam-Vehikel zu Faustan® ......................................... 74 Tabelle 12 Responder-Selektion: Carbamazepin 20 mg/kg ..................................................... 75 Tabelle 13 Responder-Selektion: Carbamazepin 40 mg/kg ..................................................... 76 Tabelle 14 Responder-Selektion: Diazepam 2 mg/kg (Faustan®) ........................................... 76 Tabelle 15 Responder Selektion: Diazepam 5 mg/kg (Faustan®) ........................................... 77 Tabelle 16 Responder-Selektion: Diazepam 5 mg/kg in wässriger Lösung ............................ 78 Tabelle 17 Responder-Selektion: Levetiracetam 400 mg/kg ................................................... 78 Tabelle 18 Responder-Selektion: Levetiracetam 800 mg/kg ................................................... 79 Tabelle 19 Responder-Selektion: Phenobarbital 25 mg/kg ...................................................... 80 Tabelle 20 Responder-Selektion: Phenobarbital 50 mg/kg ...................................................... 80 Tabelle 21 Responder-Selektion: Phenytoin 20 mg/kg ............................................................ 81 Tabelle 22 Responder-Selektion: Valproat 300 mg/kg ............................................................ 82 Tabelle 23 Übersicht Responder-Nonresponder-Selektion ...................................................... 83 Tabelle 24 Responderstatus aller Tiere und Substanzen .......................................................... 84

VII

VIII

Einleitung

1 Einleitung Epilepsie betrifft weltweit über 50 Millionen Menschen und zählt demzufolge zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen (WHO, 2005). Daher ist die Epilepsie nicht nur für den betroffenen Patienten, sondern auch ökonomisch von großer Bedeutung (OLESEN et al., 2012). Die Bezeichnung Epilepsie umfasst verschiedene Krankheitsbilder, denen das Auftreten spontaner, wiederkehrender Anfälle zentralen Ursprungs gemeinsam ist (CHANG & LOWENSTEIN, 2003; FISHER et al., 2005). Die Therapie erfolgt in der Regel durch die chronische Verabreichung von Antiepileptika, welche symptomatisch die epileptischen Anfälle unterdrücken (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Jedoch werden über 30 % der Epilepsiepatienten trotz einer adäquaten Pharmakotherapie nicht anfallsfrei (REGESTA & TANGANELLI, 1999; KWAN & BRODIE, 2000, 2010). In der Gruppe der Patienten mit Temporallappenepilepsie, welche die häufigste Epilepsieform bei Erwachsenen darstellt, sind sogar 75 % pharmakoresistent (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Einen von mehreren möglichen Erklärungsansätzen zu den Ursachen des unterschiedlichen Ansprechens auf Antiepileptika bei verschiedenen Patienten bietet die „TransporterHypothese“ (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Sie führt die Pharmakoresistenz auf eine Überexpression von Multidrug-Transportern in der Blut-Hirn-Schranke zurück, welche Substanzen aus dem Gehirn zurück ins Blut transportieren. Durch die erhöhte Expression kommt es zu verminderten Arzneimittelkonzentrationen im epileptischen Fokus und demzufolge zu einer ungenügenden Wirksamkeit der Medikamente. Ein bereits sehr gut untersuchter Multidrug-Transporter ist das von JULIANO & LING (1976) erstmals beschriebene P-Glykoprotein (Pgp), welches (unter anderem) verschiedene Antiepileptika transportieren kann (ZHANG et al., 2012). Es ist von entscheidender Bedeutung, die zugrunde liegenden Mechanismen genauer als bisher zu verstehen und damit speziell für pharmakoresistente Patienten bessere Therapieoptionen zu entwickeln. Auf diesem Weg spielen Tiermodelle eine unverzichtbare Rolle (STABLES et al., 2002; LÖSCHER, 2011). In der hier beschriebenen Studie sollte das erstmals von SUZUKI et al. (1995) beschriebene fokale Kainat-Modell in der Maus in unserer Arbeitsgruppe etabliert und in ihm mehrere Fragestellungen verfolgt werden. Zum einen sollte untersucht werden, ob das Modell eine schnelle Beurteilung der Wirksamkeit verschiedener Antiepileptika erlaubt und damit als ScreeningModell zur Entwicklung neuer Wirkstoffe geeignet ist. Zum anderen sollten die Einflüsse von

1

Einleitung

Pgp auf die Wirksamkeit verschiedener Antiepileptika untersucht werden, indem FVB/NWildtyp- (FVB/N-wt-) und mdr1a/b(-/-)-Mäuse, die kein Pgp exprimieren, in ihrem Ansprechen auf eine akute Behandlung verglichen werden. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob es in diesem Modell möglich ist, Responder, die auf eine Behandlung ansprechen, und Nonresponder, welche eine Resistenz zeigen, zu selektieren. Modelle mit dieser Unterscheidungsfähigkeit sind besonders geeignet, durch den direkten Vergleich zwischen Respondern und Nonrespondern neue Erkenntnisse über die Entstehung von Pharmakoresistenz bei Epilepsie zu gewinnen (LÖSCHER, 2011). In anderen Tiermodellen ist eine solche Selektion bereits gelungen (GLIEN et al., 2002; BRANDT et al., 2006; GASTENS et al., 2008; BANKSTAHL et al., 2012). Neben dieser rein pharmakologischen Thematik befasst sich die Arbeit auch mit dem gemeinsamen Auftreten von Epilepsie und Depressionen. Obwohl von einer bidirektionalen Verbindung ausgegangen wird, ist über die zugrunde liegenden Mechanismen bisher wenig bekannt (DEVINSKY, 2003; HESDORFFER et al., 2012). Daher sollte in dieser Arbeit auch geprüft werden, ob das Kainat-Modell geeignet ist, die Zusammenhänge zwischen Epilepsie und Depression weitergehend zu erforschen. Dazu musste zunächst ermittelt werden, ob Depressions-assoziiertes Verhalten bei den epileptischen Mäusen nachweisbar ist. Zu diesem Zweck wurde der Sucrose-Preference-Test genutzt, welcher bereits erfolgreich bei Nagern in Depressionsmodellen und bei epileptischen Ratten zum Einsatz kam (PUCILOWSKI et al., 1993; POTHION et al., 2004; MAZARATI et al., 2007; ELIZALDE et al., 2008; MAZARATI et al., 2008; EL YACOUBI et al., 2011; PARK et al., 2012). Dieser Test gilt als geeignet, eine Anhedonie, d. h. die Unfähigkeit an positiven Erlebnissen Freude zu empfinden, nachzuweisen. Eine solche Anhedonie ist ein charakteristisches Symptom depressiver Patienten.

2

Phänomenologie und Stand der Forschung

2 Phänomenologie und Stand der Forschung 2.1 Epilepsie 2.1.1 Definition und Bedeutung Epilepsie ist eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen, die beim Menschen, aber auch bei Hunden und Katzen mit einer Prävalenz von 0,5 - 1 % vorkommt (CHANG & LOWENSTEIN, 2003; LÖSCHER, 2003; WHO, 2005). Dies bedeutet, dass weltweit über 50 Millionen Menschen betroffen sind (WHO, 2005). Epilepsie ist damit eine auch ökonomisch bedeutsame Erkrankung, die allein in Europa im Jahr 2010 geschätzte Kosten in Höhe von etwa 13,8 Milliarden Euro verursacht hat (OLESEN et al., 2012). Diese setzen sich zusammen aus direkten Kosten, welche beispielsweise durch Arztbesuche und Medikamente verursacht werden, und aus indirekten Kosten, welche beispielsweise durch Arbeitsausfälle oder einen früheren Renteneintritt hervorgerufen werden (HAMER, 2011). Epilepsie stellt nicht eine einzelne Erkrankung dar, sondern umfasst verschiedene Erscheinungsformen (FISHER et al., 2005). Allgemein sind diese gekennzeichnet durch eine andauernde Prädisposition des Gehirns, spontane, wiederkehrende Anfälle zu entwickeln (CHANG & LOWENSTEIN, 2003; FISHER et al., 2005). Diese Prädisposition kann sich auf einen gewissen Zeitraum beschränken oder auch während des gesamten weiteren Lebens bestehen bleiben (ENGEL, 2006). Eine Epilepsie ist folglich eine chronische Erkrankung und verläuft dabei häufig progressiv (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Davon abzugrenzen ist ein einzelner epileptischer Anfall. Dieser ist durch vorübergehende Symptome aufgrund einer exzessiven oder synchronen Hirnaktivität definiert (FISHER et al., 2005). Ein solcher epileptischer Anfall kann jedoch auch im gesunden Gehirn durch eine vorübergehende Schädigung, wie beispielsweise eine Vergiftung, ausgelöst werden und wird dann nicht als Epilepsie bezeichnet (ENGEL, 2006). Die Internationale Liga gegen Epilepsie (ILAE) hat eine Klassifikation von epileptischen Anfällen erarbeitet (ENGEL, 2006; BERG et al., 2010). Demnach werden fokale Anfälle, welche in einem umschriebenen Bereich in nur einer Hemisphäre entstehen, und generalisierte Anfälle, die synchron in beiden Gehirnhälften beginnen, unterschieden. Der Ausgangspunkt des Anfalls bleibt bei fokalen Anfällen von Anfall zu Anfall stets konstant, bei primär generali3

Phänomenologie und Stand der Forschung

sierten Anfällen jedoch nicht (BERG et al., 2010). Fokale Anfälle können weiter in solche mit oder ohne Bewusstseinsstörung unterteilt werden. Diese als einfach bzw. komplex fokal zu bezeichnen, wie es lange praktiziert wurde, empfiehlt die ILAE jedoch nicht mehr. Primär fokale Anfälle können sich im Gehirn ausbreiten und sekundär generalisieren. Die symptomatische Manifestation fokaler Anfälle ist von der betroffenen Hirnregion abhängig (MCNAMARA, 1994). So können beispielsweise Anfälle, die im motorischen Kortex entstehen, klonische Zuckungen in den Körperteilen verursachen, welche normalerweise von dieser Kortexregion kontrolliert werden. Primär oder sekundär generalisierte Anfälle können als Absencen (mit Bewusstseinsverlust einhergehend), tonische (Streckkrämpfe), klonische (Ruderkrämpfe), tonisch-klonische oder myoklonische (Muskelzuckungen) Anfallsformen auftreten (MCNAMARA, 1994; ENGEL, 2006). Außerdem wird in der Klassifikation der ILAE der Status epilepticus als eigenständige Kategorie geführt. Ein Status epilepticus ist definiert als ein Anfall, welcher länger als fünf Minuten andauert, oder als Abfolge mehrerer Anfälle, zwischen welchen der Patient das Bewusstsein nicht wiedererlangt (LOWENSTEIN et al., 1999). Bei einem solchen Status epilepticus versagen die Mechanismen, welche normalerweise einen Anfall beenden (ENGEL, 2006). Er stellt somit eine Notfallsituation dar und kann bei einem Epilepsiepatienten jederzeit auftreten. Nach ihrer Ätiologie können Epilepsien in genetische und metabolisch-strukturelle Formen sowie solche unbekannter Herkunft unterteilt werden (BERG et al., 2010). Bei ersteren sind die epileptischen Anfälle das führende Symptom der genetischen Veränderung. Strukturellmetabolische Epilepsien werden durch andere Erkrankungen wie Schlaganfälle, Traumen oder Infektionen ausgelöst. Die früher verwendeten Bezeichnungen idiopathisch, symptomatisch und kryptogen werden ebenfalls nicht mehr von der ILAE empfohlen (BERG et al., 2010).

2.1.2 Temporallappenepilepsie Die Temporallappenepilepsie, die zu den fokalen Epilepsien zählt, stellt die am häufigsten auftretende Form bei Erwachsenen dar (ENGEL, 1996). Die Anfälle entstehen in verschiedenen Strukturen des Temporallappens wie dem Hippocampus, der Amygdala oder dem angrenzenden parahippocampalen Cortex (MCNAMARA, 1994; CHANG & LOWENSTEIN, 2003). Ein im Temporallappen entstehender Anfall führt zu typischen Symptomen wie epi4

Phänomenologie und Stand der Forschung

gastrischen Auren und emotionalen Veränderungen, welche häufig Angst umfassen (ENGEL, 1996). Diese Symptome können bei einer Generalisierung des Anfalls von verminderter Ansprechbarkeit, Innehalten in der Bewegung und Automatismen gefolgt sein. Nach diesen Anfällen tritt eine Amnesie des Anfalls auf. Außerdem kann es zu einer mehrere Minuten anhaltenden Desorientierung kommen (ENGEL, 1996). Die Temporallappenepilepsie wird außerdem von spezifischen histologischen Veränderungen, der sogenannten Hippocampussklerose, begleitet. Diese ist insbesondere durch Neuronenverlust und eine reaktive Gliose gekennzeichnet, welche zu einer Schrumpfung und Verhärtung des Hippocampus führt (CHANG & LOWENSTEIN, 2003; BERTRAM, 2009). Des Weiteren können ein Umbau der Moosfasern sowie eine Verbreiterung der Körnerzellschicht im Gyrus dentatus beobachtet werden (SUTULA et al., 1989; HUDSON et al., 1993). Ob die Hippocampussklerose jedoch die Ursache oder die Folge der epileptischen Anfälle darstellt, ist bisher umstritten (BLÜMCKE, 2010). Neben dem Hippocampus können bei Patienten mit Temporallappenepilepsie auch weitere Strukturen von histologischen Veränderungen betroffen sein (BERTRAM, 2009). So zeigt sich ein Neuronenverlust mit reaktiver Gliose beispielsweise auch in der Amygdala (HUDSON et al., 1993).

2.2 Allgemeine Aspekte der Pharmakotherapie bei Epilepsiepatienten Die Therapie der Wahl zur Behandlung von Epilepsien stellt die chronische Verabreichung von Antiepileptika dar, welche symptomatisch die epileptischen Anfälle unterdrücken (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Dabei gilt als ideales Behandlungsziel die vollständige Anfallsfreiheit ohne beeinträchtigende Nebenwirkungen (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Die meisten Antiepileptika zeigen keine Wirkung auf die Epileptogenese, d. h. auf die Entwicklung einer Epilepsie nach einem Hirninsult (DANNHARDT & KIEFER, 2007). Da die pharmakologische Therapie von Epilepsie in der Regel keine Heilung erreichen kann, müssen Antiepileptika oft lebenslang eingenommen werden (LÖSCHER, 2003; SHORVON, 2009). Hier sei angemerkt, dass Antiepileptika neben ihrer eigentlichen Indikation auch noch bei anderen Erkrankungen, wie beispielsweise Migräne, neuropathischen Schmerzen, bipolaren Störungen und Schizophrenie, eingesetzt werden (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004b). Antiepileptika bilden eine chemisch sehr heterogene Arzneimittelgruppe (HERDEGEN, 2010). In den letzten Jahrzehnten wurden viele neue Antiepileptika entwickelt, um eine ver5

Phänomenologie und Stand der Forschung

besserte Pharmakokinetik, eine verbesserte Verträglichkeit und verminderte Arzneimittelinteraktionen zu erreichen (BIALER, 2012). Die große Anzahl verfügbarer Antiepileptika hat jedoch die Auswahl für den Kliniker nicht einfacher gemacht, da bisher kaum signifikante Unterschiede in ihrer Wirksamkeit gefunden wurden, und die Wirksamkeitsstudien der verschiedenen Substanzen häufig nicht vergleichbar sind (GLAUSER et al., 2006; CRAMER, 2012). Wichtige Aspekte bei der Auswahl des Antiepileptikums sind neben den zu behandelnden Anfallstypen auch Nebenwirkungen, mögliche teratogene Effekte, Alter und Geschlecht des Patienten, weitere Erkrankungen und Medikationen sowie weltweit auch die finanzielle Belastung der Betroffenen, welche durch die Behandlung verursacht wird, bzw. das Bestehen einer Krankenversicherung (GLAUSER et al., 2006). Antiepileptika können ihre Wirkung entweder über eine Verstärkung der inhibitorischen oder über eine Verminderung der exzitatorischen Mechanismen entfalten, deren Zusammenspiel bei einer Epilepsie gestört ist (HERDEGEN, 2010). Dazu setzen sie an unterschiedlichen Zielstrukturen an: So können sie spannungsabhängige oder ligandengesteuerte Ionenkanäle, Transporter von Neurotransmittern oder auch Enzyme des Neurotransmittermetabolismus beeinflussen (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Zu den spannungsabhängigen Ionenkanälen gehören Natrium-, Calcium- und Kaliumkanäle (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Die Natriumkanäle sind für die Depolarisation der Plasmamembran bei der Bildung eines Aktionspotentials verantwortlich. Dadurch stellen sie einen geeigneten Angriffspunkt für die Wirkung verschiedener Antiepileptika dar (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Stoffe, die hier binden, blockieren frequenzabhängig abnorme repetitive Entladungen. Daher haben sie nur geringe Effekte auf die Bildung physiologischer Aktionspotentiale (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Calciumkanäle sind für die Regulation der Neurotransmitterausschüttung in den synaptischen Spalt verantwortlich (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Antiepileptika können diese Calciumkanäle hemmen und so die Ausschüttung exzitatorischer Neurotransmitter verhindern (BRODIE, 2010). Kaliumkanäle sind an der Repolarisation der Plasmamembran nach einem Aktionspotential beteiligt (KWAN et al., 2001). Durch eine Aktivierung der Kaliumkanäle können Antiepileptika folglich eine Hyperpolarisation der Membran und somit eine verminderte Erregbarkeit erreichen (BRODIE et al., 2011). Antiepileptika können auch auf den Metabolismus des Neurotransmitters Gamma-AminoButtersäure (GABA) zielen (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). GABA ist der wichtigste 6

Phänomenologie und Stand der Forschung

hemmende und Glutamat der wichtigste erregende Neurotransmitter im Gehirn (KWAN et al., 2001). Die Biosynthese von Glutamat und GABA ist eng gekoppelt (DANNHARDT & KIEFER, 2007): Glutamat wird durch die Glutamatdecarboxylase zu GABA umgebaut. Dieses wird anschließend von der GABA-Transaminase und der Succinylsemialdehyddehydrogenase zu Bernsteinsäure abgebaut, welche dann in einem negativen Feedback-Mechanismus die Glutamatdecarboxylase hemmt (DANNHARDT & KIEFER, 2007). Antiepileptika können in diesen Kreislauf eingreifen und durch die Steigerung der Aktivität der Glutamatdecarboxylase oder durch die Hemmung der GABA-Transaminase zu einer Erhöhung der GABAKonzentration und damit zu einer inhibitorischen Wirkung führen (DANNHARDT & KIEFER, 2007). Einige Antiepileptika wirken auch direkt auf den GABAA-Rezeptor, der einen ligandenabhängigen Chloridkanal öffnet und dadurch eine Hyperpolarisation der Zellmembran auslöst (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Dieser Rezeptor weist eine selektive Barbituratbindungsstelle auf. Die Bindung eines Barbiturates kann über diese Bindungsstelle einerseits die Wirkung von GABA verstärken und andererseits den Kanal direkt öffnen (RHO et al., 1996). Der GABAA-Rezeptor weist außerdem eine Benzodiazepinbindungsstelle auf, über welche ebenfalls die inhibitorische Wirkung von GABA verstärkt werden kann (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Die therapeutische Breite von Antiepileptika ist im Allgemeinen eher gering (HERDEGEN, 2010). Nebenwirkungen können dabei beispielsweise zentralnervöse Dämpfung, kognitive Defizite, Wesensveränderungen, Depressionen, Exantheme und sogar kardiale Rhythmusstörungen sein. Viele Antiepileptika weisen außerdem eine Hemmung oder Induktion des Cytochrom-P450-Systems auf (HERDEGEN, 2010). Dies spielt eine wichtige Rolle bei Kombinationstherapien mit weiteren Antiepileptika oder anderen Medikamenten, da Dosierungen entsprechend angepasst werden müssen, um Vergiftungserscheinungen oder Wirkungsverluste zu vermeiden. Die Nebenwirkungen spielen für den Erfolg einer Therapie immer eine entscheidende Rolle, da sie die Compliance der Patienten maßgeblich beeinflussen (CRAMER, 2012).

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Phänomenologie und Stand der Forschung

2.3 Spezifische Aspekte der verwendeten Antiepileptika In diesem Abschnitt wird ausschließlich auf die in dieser Studie verwendeten Antiepileptika etwas spezifischer eingegangen. Es handelt sich dabei um Carbamazepin, Diazepam, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin und Valproat.

2.3.1 Carbamazepin Carbamazepin ist eines der weltweit am häufigsten verordneten Antiepileptika, welches auch von der ILAE zur Behandlung von neu diagnostizierten, fokalen Epilepsien empfohlen wird (GLAUSER et al., 2013). Es wirkt über eine Verminderung exzitatorischer Prozesse durch eine Blockierung spannungsabhängiger Natriumkanäle (HERDEGEN, 2010). Außerdem weist es eine strukturelle Ähnlichkeit mit den trizyklischen Antidepressiva wie Imipramin auf, wodurch auch seine zusätzliche stimmungsaufhellende und antriebsteigernde Wirkung erklärt werden kann (HERDEGEN, 2010; BIALER, 2012). Ein großer Vorteil von Carbamazepin gegenüber Phenobarbital besteht darin, dass es keine sedative Wirkung aufweist (LÖSCHER & SCHMIDT, 2011). Carbamazepin wird zur Behandlung von fokalen und generalisierten Epilepsien eingesetzt sowie zur Anfallsprophylaxe bei Alkoholentzug oder zur Phasenprophylaxe bei bipolaren Störungen (HERDEGEN, 2010). Als Nebenwirkungen können beispielsweise allergische Reaktionen, Psychosen oder Gewichtszunahmen auftreten. Außerdem kann Carbamazepin Überleitungsstörungen am Herzen verstärken, da es auch dort in der Lage ist, Natriumkanäle zu hemmen, sodass bei einer entsprechenden Vorerkrankung eine eindeutige Kontraindikation besteht. Durch eine Induktion des Cytochrom-P450-Systems hat Carbamazepin außerdem einen erheblichen Einfluss auf seine eigene Verstoffwechselung in der Leber sowie auch auf die anderer Medikamente, sodass eine sorgfältige Dosisanpassung erforderlich wird (HERDEGEN, 2010). Carbamazepin kann auch prokonvulsive Effekte auslösen, wodurch beispielsweise bei der juvenilen myoklonischen Epilepsie eine Verschlechterung der Symptome hervorgerufen werden kann (BIALER, 2012).

2.3.2 Diazepam Diazepam ist der Prototyp der Benzodiazepine und wurde zunächst nur als Hypnotikum und Sedativum auf den Markt gebracht. Erst später wurde auch sein antikonvulsives Wirkpotenzial entdeckt. Diazepam bindet direkt an der Benzodiazepinbindungsstelle des GABAA8

Phänomenologie und Stand der Forschung

Rezeptors und verstärkt dadurch die hemmende Wirkung von GABA (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Zur chronischen Behandlung von Epilepsiepatienten wird Diazepam aber selten eingesetzt: Zum Einen kommt es zu einer raschen Toleranzentwicklung, die einen Verlust der antikonvulsiven Wirkung zur Folge hat (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Zum Zweiten hat Diazepam starke sedative und muskelrelaxierende Nebenwirkungen, die die Lebensqualität des Patienten deutlich einschränken. Bei plötzlichem Absetzen nach einer chronischen Verabreichung besteht des Weiteren ein erhebliches Risiko von Entzugsanfällen (HERDEGEN, 2010). Aus diesen Gründen wird Diazepam hauptsächlich zur akuten Behandlung eines Status epilepticus eingesetzt. Hierfür wird es in der Regel in einer ethanolhaltigen Lösung verwendet.

2.3.3 Levetiracetam Levetiracetam ist ein neueres Antiepileptikum, das durch einen einzigartigen Wirkmechanismus charakterisiert ist, welcher noch nicht vollständig aufgeklärt ist (MEEHAN et al., 2011). Es wurde bereits nachgewiesen, dass Levetiracetam an das Synaptische Vesikelprotein 2A bindet und so wahrscheinlich eine Wirkung auf die calciumabhängige Neurotransmitterausschüttung ausübt (LYNCH et al., 2004; ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004a). Levetiracetam ist sowohl gegen fokale als auch gegen generalisierte Anfälle wirksam (MEEHAN et al., 2011). Es wird hauptsächlich zur Add-on-Therapie bei fokalen Anfällen eingesetzt, ist aber auch zur Monotherapie zugelassen (DANNHARDT & KIEFER, 2007; HERDEGEN, 2010). Vorteilhaft bei Levetiracetam sind der rasche Wirkungsbeginn sowie die geringen Arzneimittelinteraktionen. Es besteht keine Beeinflussung des Cytochrom-P450Systems (DANNHARDT & KIEFER, 2007). Außerdem gibt es Hinweise auf eine antiepileptogene, d. h. die Entwicklung einer Epilepsie verhindernde oder zumindest bremsende Wirkung (SASA, 2006). Als Nebenwirkungen können aber Angst, depressive Symptome und Schlafstörungen auftreten (HERDEGEN, 2010). Da die Halbwertszeit von Levetiracetam nur bei etwa sieben Stunden liegt, ist außerdem täglich eine mehrfache Einnahme erforderlich (DANNHARDT & KIEFER, 2007).

2.3.4 Phenobarbital Phenobarbital wurde zunächst als Schlafmittel entwickelt und eingesetzt. Erst 1912 wurde die antikonvulsive Wirkung zufällig bei stationär behandelten Epilepsiepatienten, welche nachts

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Phänomenologie und Stand der Forschung

ruhig gestellt werden sollten, entdeckt (BRODIE, 2010). Phenobarbital ist aufgrund seiner geringen Kosten und breiten Wirkung das weltweit am häufigsten eingesetzte Antiepileptikum (KWAN & BRODIE, 2004). In industrialisierten Ländern wird es jedoch aufgrund seiner Nebenwirkungen nur noch als Reservemedikament bei Mehrfachtherapie sowie beim Status epilepticus eingesetzt (HERDEGEN, 2010). So können unter der Behandlung starke Sedierung, Pseudodemenz, Wesensveränderungen und bleibende kognitive Schäden auftreten. Außerdem wird das Cytochrom-P450-System stark induziert, wodurch Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten verursacht werden können (HERDEGEN, 2010). Phenobarbital verstärkt über die Barbituratbindungsstelle des GABAA-Rezeptors inhibitorische Prozesse, indem es auf der einen Seite die Wirkung von GABA potenziert, aber auf der anderen Seite auch selbst fähig ist, den an den Rezeptor gekoppelten Chloridkanal zu öffnen (RHO et al., 1996). Phenobarbital weist eine sehr lange Halbwertszeit von 72 – 96 Stunden auf (DANNHARDT & KIEFER, 2007). Obwohl das Ausschleichen des Medikaments dringend empfohlen wird, kann diese lange Halbwertszeit unter Umständen bei plötzlichem Absetzen vor Entzugsanfällen schützen (KWAN & BRODIE, 2004). Dies spielt vor allem in Ländern der Dritten Welt eine Rolle, wo die Verfügbarkeit von Medikamenten plötzlich abbrechen kann.

2.3.5 Phenytoin Phenytoin ist das erste durch gezielte Tierversuche entwickelte Antiepileptikum (BRODIE, 2010). Dabei wurde nach einem Medikament gesucht, welches nur eine gering ausgeprägte Sedierung verursacht. Phenytoin wirkt über eine Hemmung von spannungsabhängigen Natriumkanälen (HERDEGEN, 2010). In Deutschland wird Phenytoin eher als Reservemedikament eingesetzt, aber weltweit wird es wegen niedriger Kosten noch häufig verwendet (HERDEGEN, 2010). Bei plötzlichem Absetzen besteht ein hohes Risiko für Entzugsanfälle. Außerdem kann es zu Nebenwirkungen wie Depressionen, irreversiblen neurotoxischen Symptomen und Anämien kommen. Während der Schwangerschaft besteht zudem das Risiko von Neuralrohrdefekten (HERDEGEN, 2010). Auch Phenytoin induziert das Cytochrom-P450-System.

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2.3.6 Valproat Valproate sind Salze der Valproinsäure und haben eine völlig andere chemische Struktur als die bisher genannten Antiepileptika (BIALER, 2012). Bei Valproinsäure handelt sich um eine lipophile Flüssigkeit, weshalb sie als Lösungsmittel für andere Substanzen, welche auf ihr antikonvulsives Potenzial untersucht werden sollten, verwendet wurde. Nur zufällig wurde damals erkannt, dass das Lösungsmittel selbst antikonvulsiv wirkte (BIALER, 2012). Valproat, das in der Regel als Natriumsalz verwendet wird, wirkt einerseits über eine Hemmung der Natrium- und Calciumkanäle und ist außerdem in der Lage, die GABATransaminase, welche GABA abbaut, zu hemmen und so die GABA-Konzentration zu erhöhen (HERDEGEN, 2010). Es hat das größte Wirkungsspektrum der bisher besprochenen Antiepileptika und wird zusätzlich auch zur Behandlung von bipolaren Störungen und zur Migräneprophylaxe eingesetzt (ROGAWSKI & LÖSCHER, 2004b; HERDEGEN, 2010). Es wirkt nur wenig sedierend und greift nicht in kognitive Prozesse ein, kann aber zu schweren Leberschäden führen, weshalb es bei Vorschädigungen nicht eingesetzt werden darf (HERDEGEN, 2010). Außerdem kann es während der Schwangerschaft schwere Neuralrohrdefekte verursachen, sodass es bei Frauen im gebärfähigen Alter nicht als Mittel der ersten Wahl anzusehen ist. Des Weiteren handelt es sich um einen starken Hemmstoff des Cytochrom-P450-Systems, sodass die Dosierungen von anderen eingenommenen Medikamenten unbedingt angepasst werden müssen, um Vergiftungserscheinungen zu verhindern (HERDEGEN, 2010).

2.4 Pharmakoresistenz 2.4.1 Definition und Bedeutung Obwohl in den letzten Jahren viele neue Antiepileptika auf den Markt gekommen sind, haben über 30 % der Epilepsiepatienten trotz einer adäquaten Pharmakotherapie weiterhin Anfälle (REGESTA & TANGANELLI, 1999; KWAN & BRODIE, 2000, 2010). Dabei kann kein Unterschied zwischen älteren und neueren Antiepileptika belegt werden (KWAN & BRODIE, 2000; LÖSCHER & SCHMIDT, 2011). Patienten mit Temporallappenepilepsie, welche die häufigste Epilepsieform bei Erwachsenen darstellt, sind sogar zu 75 % als pharmakoresistent einzustufen (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Eine Therapieresistenz geht häufig auch mit einem geringeren Ausbildungs- und beruflichen Leistungsniveau und mit vermehrten Proble-

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men im psychischen und sozialen Bereich einher (MACHLEIDT, 2004; KWAN & BRODIE, 2010). Das Fehlen einer allgemein akzeptierten Definition von Pharmakoresistenz hat lange zu einer schlechten Vergleichbarkeit verschiedener wissenschaftlicher Studien geführt (REGESTA & TANGANELLI, 1999). Dies erschwert maßgeblich die Erforschung möglicher Ursachen von Pharmakoresistenz. Außerdem wird auch die klinische Behandlung der Patienten beeinflusst, da Daten zur bestmöglichen Wahl weiterer Therapieoptionen häufig nicht ausreichend belegt sind. Falscheinschätzungen der Wirksamkeit von Medikamenten durch Diagnosefehler, Behandlungsfehler, falsche Beurteilung der Wirksamkeit und mangelnde Compliance der Patienten erschweren zusätzlich vergleichbare Aussagen (REGESTA & TANGANELLI, 1999). Die ILAE hat daher kürzlich eine Definition der pharmakoresistenten Epilepsie erarbeitet, um den Nutzen und die Vergleichbarkeit weiterer Studien zu erhöhen (KWAN et al., 2010). Demnach wird ein Patient als pharmakoresistent bezeichnet, wenn durch adäquate Behandlungsversuche mit zwei tolerierten und angemessen ausgewählten und angewendeten Antiepileptika als Mono- oder Kombinationstherapie keine anhaltende Anfallsfreiheit erreicht wird. Die Definition macht außerdem Vorgaben, welche Kriterien ein Behandlungsversuch erfüllen muss, um als adäquat zu gelten. In dieser Definition wird nur die Anfallsfreiheit als erfolgreiche Therapie gewertet, da auch selten auftretende Anfälle die Lebensqualität der Patienten deutlich senken. Deshalb wird die eventuell vorhandene Zufriedenheit der Patienten mit einer deutlichen Anfallsreduktion nicht berücksichtigt (KWAN et al., 2010). Bisher gibt es keinen verlässlichen Biomarker für Pharmakoresistenz (WIEBE, 2013). Es wird jedoch diskutiert, ob verschiedene klinische Symptome wie ein früher Beginn der Anfälle innerhalb des ersten Lebensjahres, eine lange Zeitspanne zwischen dem ersten Anfall und Beginn der Therapie, eine hohe Anfallsfrequenz, fieberhafte Anfälle, bestimmte Anfallstypen (60 % der pharmakoresistenten Patienten haben partielle Anfälle), eine lange Zeitspanne mit weiteren Anfällen unter Behandlung, das Auftreten eines Status epilepticus, Hirnschäden und familiäre Prädisposition der Epilepsie als prognostische Kriterien für das Auftreten einer Pharmakoresistenz genutzt werden können (REGESTA & TANGANELLI, 1999). In einer Studie konnte nachgewiesen werden, dass von Patienten, die das erste verabreichte Antiepileptikum wegen mangelnder Wirksamkeit abgesetzt haben, nur 11 % in der weiteren Therapie anfallsfrei wurden (KWAN & BRODIE, 2000). Dagegen erreichten von Patienten, die ihr erstes Antiepileptikum wegen zu starker Nebenwirkungen absetzen mussten, im weiteren 12

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Therapieverlauf 42 % eine Anfallsfreiheit. Solche prognostischen Symptome könnten es in Zukunft ermöglichen, Risikopatienten frühzeitig zu erkennen und ihre Therapie entsprechend anzupassen.

2.4.2 Mögliche Ursachen Die Mechanismen, welche zu einer Pharmakoresistenz führen, sind noch nicht ausreichend untersucht (LÖSCHER, 2006). Es handelt sich dabei aber sicher um ein multifaktorielles Geschehen (REGESTA & TANGANELLI, 1999; KWAN & BRODIE, 2002). Ein genaueres Verständnis der Pharmakoresistenz ist jedoch unabdingbar, um die Therapie von betroffenen Patienten zu verbessern (LÖSCHER & SCHMIDT, 2011). Es werden momentan hauptsächlich zwei Hypothesen zur Entstehung einer Pharmakoresistenz diskutiert (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Die „Target-Hypothese“ besagt, dass eine Veränderung der Zielstrukturen der Antiepileptika, wie beispielsweise der Ionenkanäle, die Sensibilität für die Medikamente senkt und so deren Wirkung vermindert (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). So konnte beispielsweise bereits nachgewiesen werden, dass im Tiermodell das Bindungsverhalten von GABAA-Rezeptoren bei pharmakoresistenten Ratten verändert ist (VOLK et al., 2006). Bei pharmakoresistenten Patienten konnten Veränderungen der Wirksamkeit von Carbamazepin an Natriumkanälen gezeigt werden (REMY et al., 2003). Gegen diese Hypothese spricht jedoch, dass die meisten Patienten, die gegen ein Antiepileptikum resistent sind, auch nicht auf eine Behandlung mit Antiepileptika anderer Wirkmechanismen ansprechen (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002; SISODIYA, 2003). Daher müssen weitere unspezifischere Mechanismen an der Entstehung der Pharmakoresistenz beteiligt sein. Nach der „Transporter-Hypothese“ kommt es bei pharmakoresistenten Patienten zu einer Überexpression von Multidrug-Transportern in der Blut-Hirn-Schranke (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Diese transportieren Substanzen aus dem Gehirn zurück ins Blut und dienen dem Schutz des Gehirns vor toxischen Substanzen. Durch eine Überexpression kommt es jedoch zu einem verstärkten Transport von Antiepileptika und damit zu verminderten Arzneimittelkonzentrationen im epileptischen Fokus. Diese verminderten Konzentrationen reichen nicht mehr aus, um eine antikonvulsive Wirkung zu erreichen. Bei einer solchen Überexpression treten Multidrug-Transporter neben ihrer physiologischen Lokalisation in Endothelzellen zusätzlich in Neuronen und Astrozyten auf (SISODIYA et al., 2002; VOLK et al., 2004; SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Dadurch reduzieren sie nochmals die Arzneimit-

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Phänomenologie und Stand der Forschung

telkonzentration in den Zielzellen. Abbildung 1 zeigt die Überexpression von MultidrugTransportern entsprechend der Transporter-Hypothese. B: Überexpression

A: Normale Expression

Diffusion der Antiepileptika Multidrug-Transporter mit Transportrichtung

Abbildung 1 Expression von Multidrug-Transportern Multidrug-Transporter (mdt) sind normalerweise in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke lokalisiert und transportieren Antiepileptika aus diesen zurück ins Blut (A). Bei einer Überexpression treten die Multidrug-Transporter vermehrt in den Endothelzellen, aber auch in Neuronen und Gliazellen auf und führen zu verminderten Arzneimittelkonzentrationen im Gehirn (B). Modifiziert nach LÖSCHER & POTSCHKA (2005).

2.4.3 P-Glykoprotein Pgp ist der bekannteste und am besten charakterisierte Multidrug-Transporter, der von JULIANO & LING (1976) erstmals beschrieben wurde. Es ist in der Lage, seine Substrate entgegen eines Konzentrationsgradienten zu transportieren (SCHINKEL & JONKER, 2003). Die dazu benötigte Energie gewinnt es aus der Spaltung von Adenosintriphosphat (ATP) und wird daher zur Familie der ATP-binding-casette-Transporter gezählt. Wie Abbildung 2 zeigt, ist Pgp ein Polypeptid, das aus zwei homologen Hälften aufgebaut ist, die jeweils sechs Transmembrandomänen und eine ATP-Bindungsstelle enthalten (SCHINKEL & JONKER, 2003).

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Extrazellulär

ATP

ATP

Intrazellulär Abbildung 2 P-Glykoprotein Pgp besteht aus zwei homologen Hälften, die jeweils sechs Transmembrandomänen und eine ATPBindungsstelle enthalten. Modifiziert nach SCHINKEL & JONKER (2003).

Physiologischerweise dient Pgp dem Schutz des Organismus vor toxischen Substanzen (SCHINKEL & JONKER, 2003; SCHMIDT & LÖSCHER, 2009). Es kommt im Darm, der Leber, der Niere und in Blut-Gewebe-Schranken, wie der Blut-Hirn- oder der Plazentarschranke, vor (SCHINKEL, 1999). So kann es die Aufnahme von Substanzen in den gesamten Körper limitieren, indem es die Resorption im Darm vermindert und die Ausscheidung über Leber und Niere verstärkt. Dieser Mechanismus hat sich wahrscheinlich entwickelt, um Intoxikationen durch Nahrungsbestandteile oder durch Stoffe, die von Darmbakterien gebildet werden, zu vermeiden. Außerdem schützt Pgp besonders empfindliche Gewebe wie das Gehirn oder den Fötus noch einmal zusätzlich, indem es in den entsprechenden Blut-GewebeSchranken seine Substrate aus dem Gewebe zurück ins Blut transportiert und so eine Akkumulation im Gewebe verhindert (SCHINKEL, 1999). In der Blut-Hirn-Schranke kommt Pgp in der apikalen Plasmamembran der Endothelzellen vor (SCHMIDT & LÖSCHER, 2009). Diese kleiden im Gehirn anders als in anderen Organen die gesamte Wand der Gefäße aus und sind durch Tight Junctions untereinander eng verbunden, sodass endogene und exogene Substanzen die Schranke nur transzellulär penetrieren können (SCHINKEL et al., 1994; SCHINKEL & JONKER, 2003). Der metabolische Bedarf des Gehirns wird daher durch spezifische Transporter in der Blut-Hirn-Schranke gedeckt,

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welche beispielsweise Glukose oder Aminosäuren in das Gehirn transportieren. Lipophile Substanzen wie Koffein, Ethanol oder Nikotin können die Blut-Hirn-Schranke durch passive Diffusion jedoch einfach überwinden (SCHINKEL et al., 1994). Pgp wurde zunächst als Transporter von Zytostatika beschrieben und für Resistenzen von Krebszellen gegen Medikamente mit unterschiedlichem Wirkmechanismus verantwortlich gemacht (SCHINKEL & JONKER, 2003). Daraus abgeleitet wird auch bei Epilepsiepatienten vermutet, dass eine Überexpression von Pgp entsprechend der Transporter-Hypothese eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Pharmakoresistenz spielt. SISODIYA (2003) hat entsprechend den Koch‘schen Postulaten für Bakterien vier Kriterien entworfen, welche erfüllt werden müssen, um eine Hypothese über Entstehungsmechanismen der Pharmakoresistenz zu bestätigen: 

Der Mechanismus muss in epileptischem Gewebe nachweisbar sein.



Der Mechanismus muss eine ausreichende Funktionalität aufweisen.



Der Mechanismus muss bei Pharmakoresistenz aktiv sein.



Eine Unterdrückung des Mechanismus muss zu einer Verminderung der Pharmakoresistenz führen.

Die Erfüllung dieser Kriterien konnte in Bezug auf Pgp und die Transporter-Hypothese bereits nachgewiesen werden (SCHMIDT & LÖSCHER, 2009). So konnte an Tieren bereits gezeigt werden, dass 

die Expression von Pgp im Gehirn sowohl bei Labornagern als auch bei Hunden nach einem Status epilepticus vorübergehend und bei Labornagern in der chronischen Phase der Epilepsie dauerhaft erhöht ist (RIZZI et al., 2002; SEEGERS et al., 2002; VAN VLIET et al., 2006; VAN VLIET et al., 2007; PEKCEC et al., 2009; BANKSTAHL et al., 2011).



diese erhöhte Expression mit einer geringeren Konzentration von Antiepileptika im Gehirn einhergeht (RIZZI et al., 2002; VAN VLIET et al., 2007; BANKSTAHL & LÖSCHER, 2008).



die Expression von Pgp im Hirngewebe pharmakoresistenter Labornager höher ist als bei solchen, die auf eine Pharmakotherapie ansprechen (VOLK & LÖSCHER, 2005). Entsprechend konnte auch bereits in reseziertem Gewebe pharmakoresistenter menschlicher Patienten eine Überexpression des Multidrug-Transporters Pgp nachgewiesen werden (DOMBROWSKI et al., 2001).

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durch eine selektive Hemmung der Multidrug-Transporter die Pharmakoresistenz in Tiermodellen aufgehoben werden kann (BRANDT et al., 2006; VAN VLIET et al., 2006; VAN VLIET et al., 2007).

Man kann also die Schlussfolgerung ziehen, dass Multidrug-Transporter wie Pgp eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Pharmakoresistenz spielen (SCHMIDT & LÖSCHER, 2009). Welche Antiepileptika von Pgp transportiert werden, ist noch nicht vollständig aufgeklärt. ZHANG et al. (2012) haben Antiepileptika nach den in der Literatur vorhanden Daten eingeteilt in definitive, wahrscheinliche, mögliche und unwahrscheinliche Substrate von Pgp und solche Antiepileptika, die nicht von Pgp transportiert werden. Sie geben dafür folgende Definition vor: 

Definitive Substrate: Der Transport durch Pgp wurde in vivo (Tiermodell oder Mensch) und in vitro nachgewiesen.



Wahrscheinliche Substrate: Der Nachweis für Transport wurde in vitro erbracht, aber es liegen keine Daten zu in vivo Studien vor oder der Nachweis für Transport wurde in vivo erbracht, aber es liegen keine Daten zu in vitro Studien vor.



Mögliche Substrate: In vivo und in vitro Studien widersprechen sich.



Unwahrscheinliche Substrate: In vitro konnte kein Transport nachgewiesen werden und es liegen keine Daten zu in vivo Studien vor oder in vivo konnte kein Transport nachgewiesen werden und es liegen keine Daten zu in vitro Studien vor.



Kein Transport: Weder in vivo noch in vitro konnte ein Transport nachgewiesen werden.

Demnach sind Phenytoin, Phenobarbital, Lamotrigin und Oxcarbazepin definitive Substrate von Pgp. Wahrscheinlich sind auch Levetiracetam, Acetazolamid, Eslicarbazepin, Carbamazepin-10,11-Epoxid und Eslicarbazepinazetat Substrate von Pgp. Möglicherweise werden auch Carbamazepin, Topiramat, Felbamat und Valproat von Pgp transportiert. Für Gabapentin, Ethosuximid, Vigabatrin und Zonisamid ist ein Transport durch Pgp jedoch unwahrscheinlich (ZHANG et al., 2012). Diazepam gilt ebenfalls nicht als Substrat von Pgp (DORAN et al., 2005; CUCULLO et al., 2007; FENG et al., 2008). Aufgrund dieser Befunde wurden Phenytoin, Phenobarbital, Levetiracetam, Carbamazepin, Diazepam und Valproat für die vorliegende Arbeit ausgesucht.

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2.5 Psychiatrische Komorbiditäten bei Epilepsie Psychiatrische Komorbiditäten treten bei Epilepsiepatienten mit einer Prävalenz von 20 – 40 % auf (DEVINSKY, 2003; BRAGATTI et al., 2010). Bei pharmakoresistenten Patienten ist die Prävalenz sogar noch höher (DEVINSKY, 2003). Depressionen sind dabei die häufigste psychiatrische Komorbidität bei Epilepsiepatienten, gefolgt von Angststörungen und kognitiven Beeinträchtigungen (DEVINSKY, 2003; KANNER et al., 2012). Aber auch Psychosen, Persönlichkeitsstörungen, Aggressionsverhalten sowie Alkohol- und Drogenmissbrauch kommen vor (DEVINSKY, 2003). Aufgrund der beschriebenen psychiatrischen Komorbiditäten gehört Suizid zu den häufigsten Todesursachen bei Epilepsiepatienten (GILLIAM et al., 2004). Obwohl eine bidirektionale Verbindung zwischen Epilepsie und psychiatrischen Erkrankungen besteht, ist über die zugrunde liegenden Mechanismen bisher wenig bekannt (HESDORFFER et al., 2012). Depressionen bei Epilepsiepatienten können grundsätzlich nach dem Zeitpunkt ihres Auftretens in periiktale und interiktale Störungen unterteilt werden (KANNER, 2013). Diese Einteilung ist entscheidend für die Behandlung der Patienten: So werden periiktal auftretende Störungen hauptsächlich durch die pharmakologische Kontrolle der Anfälle therapiert, wohingegen interiktal auftretende Störungen gesondert durch eine antidepressive Pharmakotherapie oder psychotherapeutische Maßnahmen behandelt werden müssen (KANNER, 2013). Depressive Störungen können bei Epilepsiepatienten durch neurobiologische, iatrogene und psychosoziale Mechanismen oder eine Kombination aus diesen bedingt sein (KANNER, 2013). So gibt es immer mehr Hinweise auf gemeinsame Pathomechanismen von Epilepsien und Depressionen (KANNER, 2006). Dies kann strukturelle oder funktionelle Veränderungen oder auch Transmittersysteme betreffen. So konnten sowohl in epileptischen als auch in depressiven Patienten gleichartige Veränderungen des Serotonin-Systems nachgewiesen werden (DREVETS et al., 1999; SARGENT et al., 2000; MERLET et al., 2004). Außerdem wurde sowohl bei depressiven Patienten als auch bei Patienten mit Temporallappenepilepsie ein verringertes Volumen des Hippocampus beobachtet (CHANG & LOWENSTEIN, 2003; SHELINE, 2003; KANNER, 2006). Ein epilepsiebedingter Hypometabolismus im Temporallappen wird ebenfalls als wichtig für die Entwicklung einer Depression diskutiert (GILLIAM et al., 2004).

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Für die iatrogen induzierten Depressionen spielen drei Faktoren eine wichtige Rolle (KANNER, 2013): 

Die Behandlung mit einem Antiepileptikum, welches negative psychotrope Eigenschaften aufweist, kann depressive Symptome auslösen oder verstärken. So führen GABAerg wirkende Substanzen wie Phenobarbital oder Benzodiazepine auch zu einer verminderten Serotoninausschüttung, welche als Ursache für depressive Störungen verantwortlich gemacht wird. Auch Levetiracetam ist in der Lage, depressive Symptome hervorzurufen.



Das Absetzen von Antiepileptika, welche stimmungsstabilisierend wirken, kann ebenfalls zu einem Wiederaufflammen zuvor unterdrückter depressiver Symptome führen. Valproat, Carbamazepin, Lamotrigin und Oxcarbazepin weisen eine solche Wirkung auf. Auch die angstlösende Wirkung der Benzodiazepine sollte in diesem Fall stets berücksichtigt werden.



Bei einer Kombinationstherapie aus einem Antidepressivum und einem enzyminduzierenden Antiepileptikum muss unbedingt darauf geachtet werden, dass die Dosierung der antidepressiven Behandlung angepasst wird (KANNER, 2013).

Die psychosozialen Bedingungen tragen ebenfalls zur Entstehung von Depressionen bei Epilepsiepatienten bei (GILLIAM et al., 2004). So können Stress, soziale Stigmatisierung und verminderte Karrierechancen deutlichen Einfluss auf die Patienten ausüben. Durch den Verlust individueller Möglichkeiten und die Angst vor dem nächsten Anfall kann die Lebensqualität der Patienten stark eingeschränkt sein (MACHLEIDT, 2004). Psychiatrische Erkrankungen bei Epilepsiepatienten bleiben häufig unbeachtet und unbehandelt (KANNER et al., 2012). Gerade mildere Ausprägungen depressiver Störungen werden meist nicht therapiert, obwohl diese ebenfalls zu einer deutlich verminderten Lebensqualität der betroffenen Patienten führen (KANNER, 2013). Außerdem wird, wie bereits erwähnt, angenommen, dass psychiatrische Erkrankungen das Risiko epileptischer Anfälle erhöhen (KANNER, 2009). Daher stellt sich die Frage, ob eine frühzeitige Erkennung und Behandlung von depressiven Symptomen die Entwicklung von spontanen Anfällen in prädisponierten Personen nicht sogar verhindern kann (KANNER, 2006). Es ist daher sehr wichtig, die zugrunde liegenden Zusammenhänge und Mechanismen besser zu verstehen.

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2.6 Tiermodelle 2.6.1 Epilepsiemodelle Tiermodelle werden bei der Entwicklung von Antiepileptika vielfältig herangezogen (LÖSCHER, 2011): Sie werden verwendet, um 

neue Antiepileptika zu identifizieren,



das Wirkspektrum neuer Antiepileptika näher zu charakterisieren,



Pharmakoresistenz zu untersuchen,



Toleranzentwicklungen aufzudecken,



Unterschiede im Nebenwirkungsprofil bei gesunden und epileptischen Tieren zu untersuchen,



effektive Plasmakonzentrationen von neu entwickelten Antiepileptika zu ermitteln und so Vorhersagen für erste Studien bei Menschen zu ermöglichen,



antiepileptogene Mechanismen zu untersuchen.

Generell kann man die verwendeten Tiermodelle in einfache („akute“) Anfallsmodelle und chronische Epilepsiemodelle unterteilen (LÖSCHER, 2011). In akuten Anfallsmodellen wird in ansonsten gesunden Tieren elektrisch oder chemisch ein einzelner Anfall ausgelöst. In Epilepsiemodellen wird dagegen eine chronische Epilepsie mit spontan auftretenden Anfällen induziert. Die Epileptogenese kann dabei beispielsweise durch chemische oder elektrische Induktion eines Status epilepticus initiiert werden. Diese chronischen Modelle kommen dem Krankheitsbild beim Menschen wesentlich näher (LÖSCHER, 2011). Ein Modell für das Substanzscreening in der Arzneimittelentwicklung muss einfach und kostengünstig durchzuführen sein sowie die schnelle Untersuchung einer großen Anzahl von Substanzen ermöglichen und eine zuverlässige Vorhersage der Wirksamkeit im Menschen erlauben (STABLES et al., 2002; LÖSCHER, 2011). Mit diesem Ziel wurden bisher hauptsächlich zwei akute Anfallsmodelle (Maximal-Electroshock-Seizure-Test und subcutaner Pentylentetrazol-Test) verwendet. Trotz der großen Anzahl neuer, in diesen Modellen entwickelter Antiepileptika konnten bisher keine nennenswerten Fortschritte bei der Behandlung pharmakoresistenter Patienten erzielt werden. Daher stellt sich die Frage, ob diese beiden Modelle überhaupt in der Lage sind, Substanzen mit völlig neuen Wirkmechanismen zu identifizieren oder ob Substanzen, die eine verbesserte Wirksamkeit bei pharmakoresistenten Patienten aufweisen, übersehen werden (STABLES et al., 2002). So wäre beispielsweise die anti-

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konvulsive Wirksamkeit von Levetiracetam nicht entdeckt worden, wenn ausschließlich diese beiden Modelle zum Einsatz gekommen wären (LÖSCHER & SCHMIDT, 2011). Es ist deshalb unerlässlich, bessere Tiermodelle speziell für pharmakoresistente Epilepsien, die das Krankheitsbild beim Menschen gut widerspiegeln, zu etablieren und in die Arzneimittelentwicklung zu integrieren (STABLES et al., 2002; LÖSCHER, 2011). Zur Untersuchung der Pharmakoresistenz werden bisher zwei Ansätze verfolgt (LÖSCHER, 2011): Auf der einen Seite werden Modelle verwendet, die per se resistent gegen eine Pharmakotherapie sind, wie das 6-Hz-Modell in der Maus. Auf der anderen Seite gibt es Modelle, die eine Einteilung der Tiere ermöglichen in sogenannte „Responder“, die auf eine Behandlung ansprechen, und „Nonresponder“, die eine Resistenz zeigen (LÖSCHER, 2006; LÖSCHER, 2011). Diese Modelle scheinen besonders geeignet, um der Resistenz zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen, indem sie einen direkten Vergleich der identisch behandelten Responder und Nonresponder erlauben (LÖSCHER, 2011). Eine solche Differenzierung ist in unserer Arbeitsgruppe bisher an zwei chronischen Ratten-Modellen mit spontanen Anfällen (BLA-Modell und Pilocarpin-Modell) durchgeführt worden (GLIEN et al., 2002; BRANDT et al., 2004; BRANDT et al., 2006; GASTENS et al., 2008; BANKSTAHL et al., 2012). Die zum Teil geringe Anfallsfrequenz der Ratten bzw. das Auftreten der Anfälle in Clustern erzwingt jedoch sehr lange Überwachungsphasen zur Anfallsdetektion, um Effekte von Arzneimitteln zuverlässig beurteilen zu können. Eine verlässliche Auswertung der Anfallsfrequenz kann zudem bisher nur manuell erfolgen und ist durch die langen Überwachungszeiten extrem aufwändig. Daher ist der Einsatz dieser Modelle bislang nur sehr eingeschränkt möglich und in der Arzneimittelentwicklung faktisch nicht realisierbar.

2.6.2 Intrahippocampales Kainat-Modell In Bezug auf die genannten Einschränkungen anderer chronischer Modelle erscheint das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus sehr viel erfolgversprechender. Kainat ist ein Agonist an Glutamatrezeptoren vom Kainat-Subtyp und wirkt somit im Gehirn exzitatorisch (BOUILLERET et al., 1999). Durch Injektion von Kainat in den dorsalen Hippocampus lässt sich daher bei Mäusen ein nicht konvulsiver Status epilepticus auslösen, der über mehrere Stunden erhalten bleibt (SUZUKI et al., 1995; BOUILLERET et al., 1999; GRÖTICKE et al., 2008). Zwei bis drei Wochen nach der Induktion des Status epilepticus entwickeln die Mäuse spontane Anfälle, die über viele Monate konstant bestehen bleiben (SUZUKI et al., 1995;

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Phänomenologie und Stand der Forschung

BOUILLERET et al., 1999; ROUCARD et al., 2010; PERNOT et al., 2011). Die Anfälle treten entweder ohne Verhaltensänderungen auf oder sind durch ein Innehalten der Tiere gekennzeichnet (BOUILLERET et al., 1999). Generalisierte tonisch-klonische Anfälle kommen nur selten vor (PERNOT et al., 2011). Des Weiteren kommt es zu histologischen Veränderungen wie Neurodegeneration und Gliose im Hippocampus, Dispersion der Körnerzellschicht im Gyrus dentatus und Moosfaserumbau (BOUILLERET et al., 1999; PERNOT et al., 2011). Da die elektroenzephalischen und histologischen Veränderungen denen entsprechen, die bei humanen Patienten mit Temporallappenepilepsie beobachtet werden, scheint dieses Modell sehr gut geeignet, um Mechanismen der Temporallappenepilepsie zu untersuchen (BOUILLERET et al., 1999). Im Vergleich zu anderen „klassischen“ chronischen Epilepsiemodellen bietet das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus den entscheidenden Vorteil einer hohen Anfallsfrequenz (RIBAN et al., 2002). Daher erscheint es realistisch, Substanzeffekte nach einer einzelnen akuten Applikation beurteilen zu können, was bislang in keinem anderen chronischen Epilepsiemodell mit spontanen Anfällen möglich ist. Bisher gibt es jedoch nur wenige publizierte Untersuchungen zur pharmakologischen Intervention im fokalen Kainat-Modell bei der Maus (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ROUCARD et al., 2010; MAROSO et al., 2011). Diese Arbeiten geben Hinweise darauf, dass die Anfälle in diesem Modell resistent gegenüber einer akuten Behandlung mit bestimmten Antiepileptika sind. Daher erscheint das Modell außerdem anwendbar, um Resistenzmechanismen der humanen Temporallappenepilepsie zu untersuchen (GOUDER et al., 2003).

2.6.3 Genetisch veränderte Mäuse Ein großer Vorteil von Mäusen als Modell für menschliche Erkrankungen ist, dass sie einfach genetisch verändert werden können (DENNIS, 2005). Dadurch kann die Bedeutung eines bestimmten Gens und des von ihm kodierten Proteins für diese Erkrankung spezifisch untersucht werden, indem ein Vergleich zwischen genetisch veränderten Mäusen und deren Hintergrundstamm erfolgt. So können Mäuse, die kein Pgp exprimieren, zur Untersuchung der Transporter-Hypothese der Pharmakoresistenz bei Epilepsie von großem Nutzen sein. Beim Menschen wird Pgp durch die zwei Gene MDR1 und MDR3 kodiert (SCHINKEL et al., 1994). Im Gegensatz dazu weisen Mäuse drei für Pgp kodierende Gene auf: mdr1a, mdr1b und mdr2. Für die Pharmakoresistenz spielen jedoch nur MDR1 bzw. mdr1a und mdr1b eine

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Phänomenologie und Stand der Forschung

Rolle, da nur diese im Stande sind, Arzneimittel zu transportieren (SCHINKEL et al., 1994). MDR3 bzw. mdr2 sind in der Leber für den Transport von Phospholipiden verantwortlich und für eine physiologische Funktion der Leber unerlässlich (SMIT et al., 1993). Die beiden Isoformen der Maus mdr1a und mdr1b entsprechen in ihrer Verteilung der MDR1-Form des Menschen und erfüllen gemeinsam die gleiche Funktion (SCHINKEL et al., 1997; LÖSCHER & POTSCHKA, 2005). Im gesunden Gehirn tritt mdr1a in allen Regionen auf, während mdr1b hauptsächlich im Hippocampus vorkommt (KWAN et al., 2003). Im weiteren Verlauf dieser Arbeit bezeichnet Pgp immer das von MDR1 bzw. mdr1a und mdr1b kodierte Protein. SCHINKEL et al. (1994; 1997) gelang es, in mehreren Schritten zunächst das mdr1a-Gen und später auch das mdr1b-Gen sowie letztendlich beide im Mausstamm FVB/N zu inaktivieren. Die so genetisch veränderten Mäuse zeigten eine normale Entwicklung, Lebensfähigkeit und Fertilität (SCHINKEL et al., 1997). Es konnten keine Veränderungen physiologischer Parameter festgestellt werden. Dies zeigt, dass Pgp unter Laborbedingungen keine lebenswichtigen Funktionen übernimmt, sodass eine pharmakologische Hemmung von Pgp zur Überwindung der Pharmakoresistenz bei menschlichen Patienten ein interessantes Forschungsziel darstellt (SCHINKEL, 1999). In diesen Pgp-Knockout-Mäusen konnte bereits nachgewiesen werden, dass Pgp einen starken Einfluss auf die Gehirngängigkeit verschiedener Substanzen hat. SCHINKEL et al. (1994) zeigten, dass Ivermectin in mdr1a/b(-/-)-Mäusen in Dosierungen, welche für den Hintergrundstamm ungefährlich sind, hochgradig toxisch ist. Sie konnten außerdem nachweisen, dass die Gehirnkonzentration von Ivermectin in den genetisch veränderten Mäusen 90-fach erhöht war (SCHINKEL et al., 1994). RIZZI et al. (2002) fanden in mdr1a/b(-/-)-Mäusen eine deutlich erhöhte Konzentration des Antiepileptikums Phenytoin im Hippocampus, dem Cerebellum und dem Cortex im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen, obwohl sich die Plasmakonzentrationen nicht unterschieden. Daher war das Hippocampus-Plasma-Verhältnis bei den mdr1a/b(-/-)Mäusen 1,6-fach erhöht. Für das Antiepileptikum Carbamazepin konnte dagegen kein Unterschied im Gehirn-Plasma-Verhältnis zwischen Wildtyp- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen nachgewiesen werden (RIZZI et al., 2002).

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Phänomenologie und Stand der Forschung

2.6.4 Modelle für Depressions-assoziiertes Verhalten Es ist nicht möglich, in einem Mausmodell eine menschliche psychiatrische Erkrankung in seiner gesamten Komplexität darzustellen (DENNIS, 2005). Dennoch ermöglichen Mausmodelle, einzelne Symptome psychiatrischer Erkrankungen zu untersuchen. Dazu beschäftigen sich die verwendeten Tests jeweils mit einem bestimmten Aspekt des Verhaltens der Versuchstiere. So ist eine ganze Palette an Verhaltenstests erarbeitet worden, beispielsweise für Angst-assoziiertes Verhalten, Depressions-assoziiertes Verhalten, Exploration und Lokomotion oder Lernen und Gedächtnis. Zu den Tests für Depressions-assoziiertes Verhalten gehören der Porsolt-Forced-SwimmingTest, der Tail-Suspension-Test und der Sucrose-Preference-Test. Der Porsolt-ForcedSwimming-Test wurde bereits 1977 beschrieben und wird wahrscheinlich immer noch am häufigsten eingesetzt (PORSOLT et al., 1977; CRYAN et al., 2005). Der Test nutzt das Prinzip der erlernten Hilflosigkeit. Dazu wird das Versuchstier in einen wassergefüllten Glaszylinder gesetzt, aus dem es nicht entkommen kann. Währenddessen wird bestimmt, wie lange das Tier aktiv schwimmt und wie lange es sich nur treiben lässt. Letzteres wird als Depressions-assoziiertes Verhalten interpretiert, da das Tier den Versuch zu entkommen aufgegeben hat. Der Tail-Suspension-Test wurde vom Porsolt-Forced-Swimming-Test inspiriert und zunächst von STERU et al. (1985) beschrieben. Der gleichen Grundidee folgend wird das Tier an einem Stab am Schwanz aufgehängt und ebenfalls die Zeit bestimmt, in der das Tier nicht versucht zu entkommen. In beiden Tests konnte nachgewiesen werden, dass die Behandlung mit einem Antidepressivum die Immobilitätszeit der Tiere verkürzen kann (STERU et al., 1985; RIPOLL et al., 2003; BOURIN et al., 2005; CRYAN et al., 2005). Im intrahippocampalen Kainat-Modell und im Pilocarpin-Modell der Maus konnte jedoch in unserer Arbeitsgruppe kein Depressions-assoziiertes Verhalten in diesen beiden Tests nachgewiesen werden (GRÖTICKE et al., 2008; MÜLLER et al., 2009). Statt einer erwarteten verlängerten Immobilitätsphase zeigten die Mäuse hier sogar eine verkürzte Immobilität im Porsolt-Forced-Swimming-Test. Dies deutet darauf hin, dass diese Tests für die Untersuchung der epileptischen Mäuse nicht geeignet sind, da die Tiere aufgrund von pathologischen Veränderungen im Gehirn unter Umständen gar nicht mehr in der Lage sind, ihre ausweglose Situation überhaupt zu erkennen (GRÖTICKE et al., 2008). Der Sucrose-Preference-Test folgt einem anderen Prinzip. Ein charakteristisches Symptom depressiver Patienten ist das Auftreten einer Anhedonie, d. h. der Unfähigkeit, Freude an po-

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Phänomenologie und Stand der Forschung

sitiven Erlebnissen zu empfinden. Eine solche Anhedonie konnte auch bei Labornagern in verschiedenen Depressionsmodellen mit Hilfe des Sucrose-Preference-Test nachgewiesen werden (PUCILOWSKI et al., 1993; POTHION et al., 2004; ELIZALDE et al., 2008; EL YACOUBI et al., 2011; PARK et al., 2012). Die Tiere haben dabei die Wahl zwischen normalem Trinkwasser und einer süßen Saccharose- oder Saccharinlösung. Gesunde Tiere bevorzugen deutlich die süße Lösung, während Tiere, die an einer Anhedonie leiden, keine oder eine deutlich reduzierte Präferenz für die süße Lösung aufweisen. Die Anhedonie konnte durch eine pharmakotherapeutische Behandlung mit Antidepressiva in verschiedenen Studien auch wieder aufgehoben werden (WILLNER et al., 1987; EL YACOUBI et al., 2011). Auch in Epilepsiemodellen gelang es bereits mit diesem Test eine Anhedonie bei epileptischen Ratten nachzuweisen (MAZARATI et al., 2007; MAZARATI et al., 2008). Epileptische Mäuse wurden unseres Wissens bisher nicht im Sucrose-Preference-Test untersucht.

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Phänomenologie und Stand der Forschung

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Ziele und Arbeitshypothesen

3 Ziele und Arbeitshypothesen Über 30 % der Epilepsiepatienten haben trotz einer adäquaten, für die Mehrheit der Patienten positiv verlaufenden Pharmakotherapie weiterhin Anfälle und weisen damit eine Pharmakoresistenz auf (REGESTA & TANGANELLI, 1999; KWAN & BRODIE, 2000, 2010). Die Mechanismen, welche diese verursachen, sind bisher nicht ausreichend untersucht (LÖSCHER, 2006). Ein genaueres Verständnis der Pharmakoresistenz ist jedoch unabdingbar, um die Therapie von betroffenen Patienten zu verbessern (LÖSCHER & SCHMIDT, 2011). Zur Aufklärung spielen Tiermodelle für pharmakoresistente Epilepsien, die das Krankheitsbild beim Menschen gut widerspiegeln und gut in die Arzneimittelentwicklung integrierbar sind, eine wesentliche Rolle (STABLES et al., 2002; LÖSCHER, 2011). Es war das Ziel dieser Arbeit, ein solches Epilepsiemodell zu etablieren. Dabei sollte es sich um ein chronisches Modell handeln, um der Situation beim Patienten möglichst ähnlich zu sein. Damit es sich jedoch in die Arzneimittelentwicklung für mögliche neue Medikamente integrieren lässt, muss es außerdem eine hohe Anfallsfrequenz aufweisen, um Substanzeffekte durch akute Behandlungen mit kurzen EEG- und Video-Überwachungszeiten identifizieren zu können (STABLES et al., 2002). Nur so können viele Substanzen innerhalb kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem sollte das Modell eine Subgruppen-Unterteilung in Responder, die auf eine Behandlung ansprechen, und Nonresponder, die eine Resistenz zeigen, ermöglichen. Solche Modelle sind durch einen direkten Vergleich identisch behandelter Responder und Nonresponder besonders geeignet, zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen (LÖSCHER, 2011). Aufgrund der genannten Anforderungen wurde in dieser Arbeit das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus gewählt. Dieses ist durch eine außergewöhnlich hohe Frequenz fokaler Anfälle charakterisiert (RIBAN et al., 2002). Daher erscheint es im Gegensatz zu anderen „klassischen“ chronischen Epilepsiemodellen im fokalen Kainat-Modell möglich, Substanzeffekte nach einer einzelnen akuten Behandlung zu beurteilen. Die wenigen bislang publizierten Untersuchungen zur pharmakologischen Intervention im fokalen Kainat-Modell in der Maus lassen vermuten, dass es sich um ein sehr resistentes Modell handelt (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ROUCARD et al., 2010; MAROSO et al., 2011). Demzufolge erscheint es besonders geeignet, um Resistenzmechanismen der humanen Temporallappenepilepsie zu untersuchen (GOUDER et al., 2003).

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Ziele und Arbeitshypothesen

Einen möglichen Erklärungsansatz zur Entstehung der Pharmakoresistenz bietet die Transporter-Hypothese. Sie besagt, dass die Überexpression von Multidrug-Transportern wie Pgp in der Blut-Hirn-Schranke zu verminderten Arzneimittelkonzentrationen im epileptischen Fokus führt und so eine Pharmakoresistenz hervorrufen kann (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). Daher sollten in dieser Studie FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäuse, welche kein Pgp exprimieren, in ihrem Ansprechen auf verschiedene Antiepileptika verglichen werden, um den Effekt von Pgp im direkten Vergleich zu untersuchen. Als Antiepileptika wurden Substanzen gewählt, für die ein Transport durch Pgp nachgewiesen wurde (Phenytoin, Phenobarbital), wahrscheinlich ist (Levetiracetam), möglich ist (Carbamazepin, Valproat) oder keine Rolle spielt (Diazepam). Ein weiteres großes Problem in der Behandlung von Epilepsien stellen psychiatrische Komorbiditäten und hier insbesondere Depressionen dar (DEVINSKY, 2003; BRAGATTI et al., 2010). Die zugrunde liegenden gemeinsamen Mechanismen sind jedoch noch nicht ausreichend bekannt. Daher ist es sehr wichtig, den Zusammenhang zwischen Epilepsie und Depression im Tiermodell eingehender zu untersuchen. Aus diesem Grund sollte außerdem ein Test für Depressions-assoziiertes Verhalten in die Studie integriert werden, um festzustellen, ob das fokale Kainat-Modell für weitergehende Untersuchungen der Depression bei Epilepsie geeignet ist. Zusammenfassend ergaben sich folgende Arbeitshypothesen: 

Das fokale Kainat-Modell ist aufgrund seiner hohen Anfallsfrequenz als ScreeningModell für die Beurteilung antikonvulsiver Effekte unter akuter Behandlung geeignet.



Im fokalen Kainat-Modell treten Resistenzen gegenüber Antiepileptika verschiedener Wirkmechanismen auf.



Auch im fokalen Kainat-Modell lassen sich Responder und Nonresponder auf eine Antiepileptika-Therapie unterscheiden.



Die Effekte einiger Antiepileptika sind in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse stärker ausgeprägt oder treten bereits bei geringeren Dosierungen auf, da eine höhere Gehirnkonzentration von Pgp-Substraten erreicht wird.



Bei mdr1a/b(-/-)-Mäusen kommen keine oder weniger Nonresponder unter Behandlung mit Substraten von Pgp vor.



Die epileptischen Mäuse zeigen eine Depressions-assoziierte Anhedonie.



Die Anhedonie ist bei Nonrespondern stärker ausgeprägt als bei Respondern.

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Material und Methoden

4 Material und Methoden Hinweis: Im Anhang dieser Arbeit befindet sich eine Auflistung aller verwendeten Substanzen, Verbrauchsmaterialien und Geräte sowie deren Hersteller oder Bezugsquellen. Ferner sind alle Dosierungen, Lösungsmittel und Applikationsvolumina der Substanzen, welche an Tiere verabreicht wurden, genannt.

4.1 Versuchstiere Für die Versuche wurden jeweils 30 weibliche FVB/N-wt- und 30 ebenfalls weibliche mdr1a/b(-/-)-Mäuse verwendet. Diese wurden im Alter von 5 – 6 Wochen bei Taconic (Ejby, Dänemark) erworben. In dieser Studie wurden weibliche Tiere verwendet, um eine möglichst gute Vergleichbarkeit zu bereits in unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Studien in verschiedenen Epilepsiemodellen an der Maus herzustellen, für welche ebenfalls weibliche Tiere genutzt wurden (GRÖTICKE et al., 2008; RÖMERMANN, 2012). Die Tiere wurden in Maushaltungsräumen, in denen sich während der gesamten Studie ausschließlich weibliche Tiere befanden, in Typ II Makrolonkäfigen einzeln gehalten. Die Einstreu aus Weichholzgranulat wurde einmal wöchentlich erneuert. Wasser und eine pelletierte Standardnagerdiät (Altromin 1324 Standarddiät) standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Das Wasser wurde einmal wöchentlich erneuert und gleichzeitig wurde das Futter aufgefüllt. Zur Standardisierung der Umweltbedingungen wurde die Temperatur gleichbleibend auf 22 - 24 °C gehalten. Durch ein automatisiertes Lichtregime wurde ein 12-stündiger Hell-Dunkel-Rhythmus erzeugt. Während der Hellphase (06:00 - 18:00 Uhr) betrug die Lichtstärke 19 – 30 lx in den Makrolonkäfigen. Um eine ausreichende Gewöhnung der Tiere an die neuen Umgebungsbedingungen zu gewährleisten, wurde mit den Versuchen erst zwei Wochen nach ihrer Ankunft begonnen. Alle Tierversuche wurden durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit genehmigt und unter dem Aktenzeichen 09/1769 durchgeführt. Die Leiden der Tiere wurden dabei so gering wie möglich gehalten.

4.2 Ablauf der Studie Die Studie begann mit der Induktion des Status epilepticus in einer stereotaktischen Operation. Acht Wochen danach wurde mit der EEG- und Video-Überwachung zur Untersuchung

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Material und Methoden

verschiedener Antiepileptika auf ihre antikonvulsive Wirkung begonnen. Von der 39. bis zur 47. Woche nach der Induktion des Status epilepticus fanden keine Überwachungen statt. Der Sucrose-Preference-Test wurde vor, während und nach der ersten Überwachungsphase durchgeführt.

Abbildung 3 Ablauf der Studie Die Studie begann mit der Induktion des Status epilepticus (SE). Anschließend folgten zwei Phasen der EEG- und Video-Überwachung. Parallel wurde mehrfach der Sucrose-Preference-Test (SP) durchgeführt.

4.3 Stereotaktische Operation zur Induktion des Status epilepticus Um eine chronische Epilepsie mit spontanen, wiederkehrenden Anfällen hervorzurufen, wurde unter Narkose durch eine Kainat-Injektion in den rechten dorsalen Hippocampus ein Status epilepticus ausgelöst. Dieser diente, wie bereits in der Literatur beschrieben, als initialer Hirninsult, der die Epileptogenese in Gang setzte (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ARABADZISZ et al., 2005; ROUCARD et al., 2010). Außerdem wurde eine Elektrode in die gleiche Lokalisation implantiert, um das Auftreten spontaner Anfälle im EEG überwachen zu können. Für die Kainat-Injektion wurde einmalig eine 20 mM Kainatlösung (1,5 mg Kainat gelöst in 352 µl isotonischer Natriumchloridlösung) angesetzt. Diese wurde zu jeweils 25 µl aliquotiert und bei -20 °C gelagert. An jedem Operationstag wurde ein frisches Kainat-Aliquot aufgetaut und vor der Verwendung gut durchmischt. Alle Operationen wurden an acht aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Vor Versuchsbeginn wurden die Tiere durch ein Losverfahren auf die beiden späteren Versuchsgruppen – Kontrolltiere und epileptische Tiere – aufgeteilt (für FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäuse jeweils 10 Kontrolltiere und 20 epileptische Tiere). Zwei Tage vor der Operation wurde mit einer antibiotischen Behandlung der Mäuse begonnen. Dazu wurden

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Material und Methoden

zweimal täglich 2 mg/kg Marbofloxacin subcutan verabreicht. Die Antibiose wurde nach der Operation für weitere fünf Tage fortgesetzt, um Infektionen zu vermeiden. Die Mäuse wurden initial mit einer Bolusapplikation Chloralhydrat (400 mg/kg, intraperitoneal) in Narkose gelegt. Während der Operation wurde die Narkosetiefe anhand der Atmung und des Zwischenzehenreflexes überprüft und bei Bedarf durch Nachinjektionen von Chloralhydrat (16 – 32 mg/kg) aufrechterhalten. Sobald eine ausreichende Narkosetiefe erreicht war, wurden die Haare auf der Kopfhaut der Tiere in der Operationsregion mit einer Schere entfernt. Anschließend wurden die Mäuse in einen stereotaktischen Apparat (Kopf bzw. Stölting) eingespannt. Dieser diente dazu, den Schädel der Tiere zu fixieren, um eine korrekte Lokalisation der Injektion und der Elektrode zu gewährleisten. Dazu wurden Ohrbalken beidseitig in den Gehörgang eingeführt und die Schneidezähne in einer Oberkieferhalterung befestigt. Das Schädelplateau wurde horizontal ausgerichtet, sodass sich die Kreuzungspunkte der Sutura sagittalis mit der Sutura coronalis (Bregma) sowie mit der Sutura lambdoidea (Lambda) auf einer Höhe befanden (PAXINOS, 2001). Um ein Auskühlen der Tiere während der Operation zu vermeiden, wurden sie auf eine Wärmematte gelegt. Außerdem wurde Bepanthen® Augen- und Nasensalbe zum Schutz der Augen aufgetragen. Die Haut im Operationsgebiet wurde zunächst mit 70-prozentigem Ethanol desinfiziert. Anschließend wurde sie mit Hilfe eines Skalpells durch einen sagittalen Schnitt entlang der Medianen eröffnet und von den Faszien gelöst. Mit vier Bulldog-Klemmen wurde die Haut seitlich des Operationsgebietes fixiert. Auf das Periost wurden zur Schmerzausschaltung ein bis zwei Tropfen Bupivacain gegeben und zwei Minuten einwirken lassen. Anschließend wurde das Periost mit einem Periostschaber entfernt. Die Schädeldecke wurde daraufhin mit 35-prozentiger Wasserstoffperoxid-Lösung behandelt, um die Knochennähte sichtbar zu machen. Zur genauen Lokalisation bestimmter Hirnregionen besitzt der stereotaktische Apparat einen beweglichen Arm, der entlang dreier Achsen auf bestimmte Koordinaten eingestellt werden kann. Mit Hilfe dieses Armes wurde nun der rostrale Kreuzungspunkt der Knochennähte Bregma mit einer Nadel angefahren und markiert. Die Lokalisationskoordinaten von Bregma wurden bestimmt und die Koordinaten für den Bohrpunkt der Injektion errechnet. Um den rechten dorsalen Hippocampus zu erreichen, wurden die Differenzen zu Bregma entsprechend RÖMERMANN (2012) übernommen: anterioposterior -1,8 mm und laterolateral -1,6 mm. Dieser Punkt wurde auf der Schädeldecke ebenfalls markiert. Mit Hilfe eines 1,1 mm starken Dentalbohrers wurde nun an dieser Position ein Loch für die Injektion gebohrt. Zwei weitere

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Material und Methoden

Löcher wurden für die Halteschrauben im Os frontale sinistrum bzw. dextrum und ein weiteres für die Erdungsschraube im Os parietale sinistrum gebohrt (siehe Abbildung 4).

Halteschraube Erdungsschraube Elektrode Abbildung 4 Lokalisation auf dem Mausschädel Ableitelektrode, Halte- und Erdungsschrauben wurden an Bregma ausgerichtet. Modifiziert nach PAXINOS (2001).

Für die Kainat-Injektion wurde eine 0,5-Mikroliter-Spritze in einer speziellen Halterung am stereotaktischen Apparat befestigt. Zur Ausrichtung wurde dann mit der Kanüle der Spritze erneut Bregma angefahren und die Koordinaten für die Injektion in den rechten dorsalen Hippocampus entsprechend berechnet. Die Differenzen zu Bregma betrugen nach RÖMERMANN (2012) für FVB/N-Mäuse anterioposterior -1,8 mm, laterolateral -1,6 mm und dorsoventral -2,0 mm. Die Lokalisation der Injektion im rechten dorsalen Hippocampus zeigt Abbildung 5. Vor dem Absenken der Spritze wurde ihre Durchgängigkeit überprüft, indem 0,05 µl der enthaltenen Lösung herausgedrückt wurden. Die Kainat-Injektion (50 nl, 20 mM; entspricht 213,2 ng Kainat) erfolgte über die Dauer von einer Minute. Anschließend wurde die Kanüle für weitere zwei Minuten im Gewebe belassen, um einen möglichen Rückfluss der Kainat-Lösung entlang des Stichkanals zu minimieren. Abschließend wurde die Spritze erneut auf ihre Durchgängigkeit überprüft. Den Kontrolltieren wurde entsprechend isotonische Natriumchloridlösung in gleicher Menge injiziert.

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Material und Methoden

Abbildung 5 Lokalisation der Kainat-Injektion Die Injektion erfolgte in die CA1-Region (Cornu ammonis 1) im rechten Hippocampus. Modifiziert nach PAXINOS (2001).

Nach der erfolgreichen Injektion wurden zwei Halteschrauben aus rostfreiem Stahl, die die stabile Befestigung des Elektrodenaufbaus am Schädel gewährleisten sollten, sowie die ebenfalls aus rostfreiem Stahl bestehende Erdungsschraube mit 1,25 Umdrehungen im Schädel verankert. Anschließend wurde zur Ableitung des EEGs eine bipolare Elektrode an derselben Stelle, an der bereits die Kainat-Injektion erfolgt war, im rechten dorsalen Hippocampus implantiert. Den Aufbau der Elektrode zeigt Abbildung 6.

Buchsenleiste

Bipolare Elektrode

Erdungsdraht

Abbildung 6 Aufbau der Ableitelektrode Die bipolare Elektrode bestand aus zwei umeinander gewundenen, isolierten Drähten (Durchmesser 200 µm). Lediglich die Spitzen der Drähte wiesen keine Isolation auf und durften sich daher nicht berühren. Der Erdungsdraht war nicht isoliert.

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Material und Methoden

Die Elektrode wurde in einer weiteren speziellen Halterung am stereotaktischen Apparat befestigt und mit den bereits genannten Koordinaten in Bezug zu Bregma positioniert. Der Erdungsdraht der Elektrode wurde anschließend um die Erdungsschraube gewickelt, sodass ein guter Kontakt sichergestellt war. Die Elektrode wurde dann mit einer ersten Schicht Dentalzement (Paladur®) befestigt. Dem Dentalzement wurde zusätzlich 0,5 % Marbofloxacin beigemischt, um einer Infektion vorzubeugen. Nach der Aushärtung des Dentalzements wurde die Elektrode aus der Halterung des stereotaktischen Apparats gelöst und S-förmig nach vorne umgebogen. Dadurch konnte der Elektrodenaufbau kleiner und leichter gehalten und so die Belastung für die Mäuse reduziert werden. Abschließend wurde die gesamte Elektrode mit Dentalzement ummantelt, sodass ein Aufbau ohne scharfe Kanten entstand (siehe Abbildung 7).

Abbildung 7 Maus mit Ableitelektrode

Nachdem der Dentalzement vollständig ausgehärtet war, wurde die Haut mit Knopfheften mit resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen. Nach der Operation wurden die Tiere noch während der Narkose durch Ohrlochung dauerhaft gekennzeichnet. Um postoperativ eine bessere Versorgung der Tiere mit Flüssigkeit und Nährstoffen zu erreichen, wurden den Tieren 0,5 ml Sterofundin® VG-5 subcutan injiziert. Außerdem wurden sie noch für eine weitere Stunde auf einer Wärmematte belassen, um einen Abfall der Körpertemperatur zu verhindern. Danach wurden die Tiere zur Überwachung des Status epilepticus an die EEG- und Video-Überwachung angeschlossen (siehe Kapitel 4.4 EEG- und VideoÜberwachung).

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Material und Methoden

4.4 EEG- und Video-Überwachung Die Mäuse wurden nach der Operation für 36 – 48 Stunden sowie im weiteren Studienverlauf vor und während der Substanzapplikationen EEG- und Video-überwacht. Da maximal 16 Tiere gleichzeitig überwacht werden konnten, wurden die Mäuse für die Substanzapplikationen in zwei Gruppen aufgeteilt, welche jeweils die Hälfte der FVB/N-wt- sowie der mdr1a/b(-/-)Mäuse umfassten.

4.4.1 Aufzeichnung Für die Aufzeichnung der EEGs und Videos wurden die Mäuse in speziellen Überwachungskäfigen einzeln gehalten. Diese Käfige wurden für die EEG- und Video-Überwachung in unserer Arbeitsgruppe von einem Feinmechaniker entworfen und angefertigt. Sie weisen eine Grundfläche von 20 cm x 18 cm oder von 29 cm x 19,5 cm und eine Höhe von 28 cm auf. Die Mäuse wurden randomisiert auf die großen und kleinen Käfige verteilt. Um die weißen Mäuse im Video besser beurteilen zu können, wurden die Tiere auf grauem Einstreu (Cellu Dri®) gehalten und die Käfige mit schwarzen Rückwänden versehen. Die EEGs und Videos wurden mit der Software LabChart6 (ADInstruments GmbH, Spechbach) simultan aufgezeichnet. Die Datenübertragung zwischen Tier und Datenerfassung erfolgte per Kabel. Um den Tieren eine möglichst große Bewegungsfreiheit zu gewähren, wurden rj10 Twist-Stops (Kabelentwirrer) im Käfigdeckel angebracht. Die Signalpegel der einzelnen Tiere wurden jeweils mittels eines Ein-Kanal-Verstärkers erhöht, über zwei AchtKanal-Analog-Digitalwandler mit einer Samplingrate von 200 Hz digitalisiert und in dieser Form an den Computer weitergeleitet. Softwareseitig wurden Signalfrequenzen oberhalb 60 Hz und unterhalb 0,1 Hz ausgefiltert. Um die Signale von 50 Hz-Anteilen aus Einstrahlungen des Stromnetzes zu bereinigen, wurde ein entsprechendes Notch-Filter eingesetzt. Die Videos wurden mit Hilfe von Infrarot-Kameras digital aufgezeichnet. Um auch während der Dunkelphase eine Videoaufnahme zu ermöglichen, wurden die relevanten Bereiche mit Infrarotdioden beleuchtet. Durch die simultane Aufzeichnung von EEG und Video standen in der späteren Auswertung beide Informationen zeitlich synchron zur Verfügung.

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Material und Methoden

4.4.2 Substanzapplikationen In dieser Studie sollte die Wirksamkeit verschiedener Substanzen im fokalen Kainat-Modell in FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen verglichen werden und eine Einteilung in Responder und Nonresponder erfolgen. Mit diesem Ziel wurden die Tiere für die Substanzapplikationen in die Überwachungsanlage verbracht. Da maximal 16 Tiere gleichzeitig überwacht werden konnten, mussten die Mäuse wie bereits erwähnt in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die zweite Tiergruppe verblieb jeweils im Maushaltungsraum. Außerdem wurden während der Substanzapplikationen nur die epileptischen Tiere an die EEG-Aufzeichnung angeschlossen. Die Kontrolltiere wurden dabei im selben Raum unter den gleichen Bedingungen gehalten. Alle Substanzen wurden sowohl den epileptischen Tieren als auch den Kontrolltieren injiziert, um eine Beeinflussung der zusätzlich durchgeführten Verhaltensversuche durch die Injektionen oder Substanzen zu vermeiden. Alle Substanzapplikationen erfolgten in einem Zeitraum von einem Jahr nach der Induktion des Status epilepticus nach dem gleichen Schema (siehe Abbildung 8). Nach einer Akklimatisationsphase von 36 – 48 Stunden, in der sich die Mäuse an die neue Umgebung gewöhnen konnten, wurden die Tiere an die EEG-Aufzeichnung angeschlossen. Nach 24 Stunden erfolgte dann die Substanzapplikation. Alle Substanzen wurden einmalig intraperitoneal in einem Applikationsvolumen von 10 ml/kg verabreicht. Nach der Substanzapplikation wurden die Tiere für weitere 24 Stunden überwacht.

Abbildung 8 Ablauf der Substanzapplikationen

Vor der nächsten Überwachungsphase erhielten die Tiere mindestens 48 Stunden Zeit zur Erholung. Da die Tiere bereits an die Umgebung gewöhnt waren, konnte die Akklimatisationsphase entfallen. Nach zwei bis drei Überwachungsphasen wurden die Tiergruppen ausgetauscht.

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Material und Methoden

In Tabelle 1 sind alle ausgewerteten Substanzen mit den jeweiligen Dosierungen und Applikationszeitpunkten in alphabetischer Reihenfolge gelistet. Die letzten Applikationen (Diazepam-Vehikel und Diazepam in wässriger Lösung) wurden nur noch an FVB/N-wt-Mäusen durchgeführt, daher erfolgte keine Aufteilung in Gruppen. Die Wirkstoffe wurden aus verschiedenen Gründen ausgewählt. Auf der einen Seite sollten Diazepam und Levetiracetam zur Anwendung kommen, für die eine Wirksamkeit im fokalen Kainat-Modell in der Maus bereits beschrieben wurde (RIBAN et al., 2002; ROUCARD et al., 2010). So sollte sichergestellt werden, dass eine pharmakologische Unterdrückung der Anfälle möglich ist, was eine Grundvoraussetzung für die Responder-Nonresponder-Selektion darstellt. Auf der anderen Seite wurde der Transport durch Pgp als Kriterium für die Auswahl herangezogen: So wurden Phenobarbital und Phenytoin genutzt, da sie definitiv Substrate von Pgp sind und es somit wahrscheinlich erschien, Unterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu ermitteln (ZHANG et al., 2012). Für Carbamazepin widersprechen sich die Ergebnisse verschiedener Studien im Tierversuch. Zum Transport durch Pgp von Valproat liegen bisher nur wenige Untersuchungen vor, welche ebenfalls widersprüchliche Ergebnisse aufweisen (ZHANG et al., 2012). Daher erschien eine Untersuchung von Carbamazepin und Valproat ebenfalls interessant. Ein weiteres Auswahlkriterium bestand darin, Antiepileptika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen zu untersuchen. Zusätzlich wurden drei Vehikelsubstanzen untersucht: isotonische Natriumchloridlösung, das Vehikel zum kommerziellen Diazepam-Präparat Faustan® sowie 30-prozentiges Polyethylenglycol 400 als Lösungsmittel von Carbamazepin. Die Dosierungen wurden anhand von Literaturdaten ausgewählt, welche eine Wirksamkeit in anderen Modellen oder auch bereits im fokalen KainatModell in der Maus nachweisen konnten. Alle Antiepileptika wurden unmittelbar vor der Verwendung frisch angesetzt. Carbamazepin wurde zunächst in 3 ml Polyethylenglycol 400 unter vorsichtigem Erwärmen auf einem Magnetrührer in Lösung gebracht. Anschließend wurden langsam 7 ml Aqua ad injectabilia zugegeben, sodass eine Konzentration des Polyethylenglycols 400 von 30 % erreicht wurde. Für die Applikation von Diazepam wurde anfangs das Fertigarzneimittel Faustan® verwendet, in welchem Diazepam mittels Ethanol gelöst ist. Dieses musste jedoch auf das angestrebte Applikationsvolumen von 10 ml/kg mit fünfprozentiger Glukosemonohydratlösung entsprechend der gewünschten Dosierung verdünnt werden, sodass bei der Dosierung von 5 mg/kg Diazepam eine Ethanolkonzentration von 0,19 % vorlag. Um Diazepam wässrig zu lösen, wurde

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Material und Methoden

es zunächst mit 40 µl Salzsäure (1 M) versetzt und anschließend wurde das Volumen tropfenweise mit Aqua ad injectabilia auf 10 ml aufgefüllt. Levetiracetam, Phenobarbital (als Phenobarbital-Natrium) und Valproat (als Natriumsalz) wurden bei Raumtemperatur in isotonischer Natriumchloridlösung entsprechend der gewünschten Dosierung gelöst. Phenytoin wurde bei Raumtemperatur zunächst in 0,3 ml Natriumhydroxidlösung (1 M) gelöst. Anschließend wurden 9,7 ml Aqua ad injectabilia langsam zugegeben. Tabelle 1 Applizierte Substanzen und Vehikel Substanz

Dosierung 20 mg/kg

Carbamazepin 40 mg/kg 2 mg/kg Diazepam (Faustan®)

Antiepileptika

5 mg/kg Diazepam in wässriger Lösung

5 mg/kg 400 mg/kg

Levetiracetam 800 mg/kg 25 mg/kg Phenobarbital

Vehikel

50 mg/kg Phenytoin

20 mg/kg

Valproat

300 mg/kg

Isotonische Natriumchloridlösung

10 ml/kg

Diazepam-Vehikel: enthält 0,19 % Ethanol (für verdünntes Faustan®)

10 ml/kg

Polyethylenglycol 400 (für Carbamazepin)

10 ml/kg

Tiergruppe

Zeitpunkt nach Status epilepticus

Tierzahl

Gruppe 1

14

29 Wochen

Gruppe 2

16

26 Wochen

Gruppe 1

13

37 Wochen

Gruppe 2

11

36 Wochen

Gruppe 1

16

8,5 Wochen

Gruppe 2

16

10,5 Wochen

Gruppe 1

16

9 Wochen

Gruppe 2

16

11 Wochen

FVB/N

9

50 Wochen

Gruppe 1

16

23 Wochen

Gruppe 2

0

/

Gruppe 1

13

33 Wochen

Gruppe 2

16

27 Wochen

Gruppe 1

16

12 Wochen

Gruppe 2

16

14 Wochen

Gruppe 1

16

12,5 Wochen

Gruppe 2

16

14,5 Wochen

Gruppe 1

16

13 Wochen

Gruppe 2

16

15 Wochen

Gruppe 1

14

28 Wochen

Gruppe 2

14

32 Wochen

Gruppe 1

16

8 Wochen

Gruppe 2

16

10 Wochen

FVB/N

9

48 Wochen

Gruppe 1

0

/

Gruppe 2

15

31 Wochen

38

Material und Methoden

4.4.3 Auswertung Die Auswertung der EEG- und Video-Daten erfolgte offline, also zeitlich getrennt von der Aufzeichnung. Dazu wurde ebenfalls die Software LabChart6 genutzt. Jedes EEG wurde visuell auf Anfälle hin inspiziert. Zu diesem Zweck wurde das EEG in einer 10-fachen Stauchung dargestellt. Eine paroxysmale Veränderung im EEG musste folgende Kriterien erfüllen, um als Anfall klassifiziert zu werden: 

Dauer mindestens 3 s



Spikefrequenz mindestens 1 Hz



Amplitude der Spikes mindestens doppelt so hoch wie die Amplitude der Basislinie

Das Ende eines Anfalls wurde durch das erneute Sichtbarwerden einer Basislinie definiert (siehe Abbildung 9). Alle Anfälle wurden manuell markiert. Das Programm LabChart6 gab Datum, Anfallsbeginn, Anfallsende und Anfallsdauer in Form einer Tabelle aus. Die Daten wurden anschließend in das Programm Microsoft Excel® 2010 (Microsoft, Redmond, USA) übertragen und weiterbearbeitet. In Vorversuchen sowie zu Beginn der Studie wurde das Verhalten der Mäuse während der im EEG sichtbaren Anfälle zusätzlich im Video analysiert. Es konnten wenige generalisierte Anfälle mit motorischen Störungen beobachtet werden, welche stets gut im EEG zu identifizieren waren (siehe Abbildung 9). Während der übrigen als fokale Anfälle eingestuften EEGVeränderungen konnten jedoch keine Verhaltensauffälligkeiten oder motorischen Störungen nachgewiesen werden. Daher wurde im weiteren Verlauf auf die Analyse der fokalen Anfälle im Video verzichtet. Generalisierte Anfälle wurden jedoch weiterhin im Video beurteilt und anhand der Skala nach RACINE (1972) charakterisiert. Racine unterteilt auftretende Anfälle bei gekindelten Ratten anhand der motorischen Anfallsintensität in fünf Stadien, wobei Stadium 1 – 3 fokale Anfallsgeschehen und Stadium 4 und 5 generalisierte klonische Anfälle beschreiben. Diese Einteilung der Anfallsschwere wird auch in anderen Ratten-Epilepsiemodellen sowie bei MausModellen angewendet. So konnte sie auch hier gut für die generalisierten Anfälle im fokalen Kainat-Modell bei der Maus übernommen werden: Stadium 4 ist dabei durch bilaterale Vorderbeinklonien gekennzeichnet, zu welchen bei Stadium 5 ein Verlust der Stellreflexe hinzu-

39

Material und Methoden

kommt. Repräsentative Beispiele für das typische Aussehen von fokalen und generalisierten Anfällen im EEG im fokalen Kainat-Modell sind in Abbildung 9 dargestellt.

A

5s

0,5 mV

B

5s

0,5 mV

C

5s

0,5 mV

Abbildung 9 Beispiele für EEG-Veränderungen im fokalen Kainat-Modell Dargestellt sind die Basislinie (A), fokale Anfälle (B) und ein generalisierter Anfall mit typisch hoher Spikefrequenz und erniedrigter Amplitude der Basislinie nach dem Anfall (C). Die Ableitungen erfolgten aus der CA1-Region des Hippocampus (aus der Region der Kainat-Injektion).

4.5 Sucrose-Preference-Test Mit Hilfe des Sucrose-Preference-Test sollte eine Depressions-bedingte Anhedonie der epileptischen Tiere untersucht werden. Die zugrundeliegende Hypothese besagt, dass die Anhedonie zu einer verminderten Präferenz der Mäuse für süße Lösungen führt. Der Test erfolgte wiederholt im Verlauf der Studie (siehe Abbildung 10). Während der ersten Überwachungsphase wurde der Test stets mit der Gruppe der Tiere durchgeführt, welche sich gerade nicht in der Überwachung befand. Daraus resultiert ein zeitlicher Versatz der Durchführung. Nach der ersten Überwachungsphase folgte zunächst eine Pause, um allen Tieren eine Akklimatisation an ihre Heimatkäfige zu ermöglichen. In der 40. Woche nach der Induk-

40

Material und Methoden

tion des Status epilepticus wurde der Sucrose-Preference-Test erneut mit allen Mäusen zeitgleich durchgeführt.

Abbildung 10 Sucrose-Preference-Test im Verlauf der Studie Der Sucrose-Preference-Test (SP) wurde im Verlauf der Studie mehrfach durchgeführt. Angegeben sind die Zeitpunkte seiner Durchführung nach der Induktion des Status epilepticus (SE) in Wochen.

4.5.1 Vorversuche Zu der vorliegenden Studie wurden im Rahmen dieser Arbeit bereits Vorversuche durchgeführt, um zunächst den Sucrose-Preference-Test in einem anderen Epilepsiemodell, welches in unserer Arbeitsgruppe genutzt wird, zu etablieren. Die Ergebnisse dieser Versuche sind bisher nicht veröffentlicht. Es konnte belegt werden, dass gesunde Mäuse, denen zwei mit Wasser gefüllte Trinkflaschen gleichzeitig angeboten werden, eine Präferenz für eine Seite zeigen (siehe Abbildung 11). Seitenpräferenz

Wasserkonsum [g / 24 h]

(n = 18)

*

5 4 3 2 1 0 links

rechts

Abbildung 11 Seitenpräferenz des Wasserkonsums bei gesunden Mäusen Der Wasserkonsum aus der rechten Flasche war im untersuchten Zeitraum signifikant höher als der Konsum aus der linken Flasche (p = 0,0141, Student’s t-Test). Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung.

41

Material und Methoden

Dazu wurde bei 18 naiven FVB/N-wt-Mäusen der Wasserkonsum über vier Tage alle 24 Stunden gemessen. Aus diesen vier Messungen wurde der mittlere Konsum jeder Maus für beide Käfigseiten berechnet. Das Studiendesign wurde daraufhin so konzipiert, dass der Einfluss einer Seitenpräferenz auf die Ergebnisse möglichst gering blieb (siehe Kapitel 4.5.2). Des Weiteren stellte sich in diesen Versuchen heraus, dass die Größe des Ausflussloches im Deckel der Trinkflaschen einen erheblichen Einfluss auf das Konsumverhalten der Tiere ausübte. Aus diesem Grund wurde die Lochgröße bei allen verwendeten Deckeln auf einen Durchmesser von 1,0 mm angeglichen. Außerdem verglichen ZEWELDI & BANKSTAHL (nicht publizierte Daten) die Beliebtheit verschiedener Saccharose-Konzentrationen bei weiblichen FVB/N-Mäusen. POTHION et al. (2004) zeigten bereits, dass es Unterschiede in der bevorzugten Konzentration zwischen Mäusen verschiedener Stämme gibt. Daher erschien es wichtig, für die folgenden Versuche die optimale Saccharose-Konzentration für weibliche FVB/N-Mäuse zu ermitteln. Der Saccharose-Konsum war dabei bei einer Konzentration von 4 % am größten. Daher wurden die folgenden Versuche mit dieser Konzentration durchgeführt.

n=4

Konsum [g]

40 30 20 10 0 H2O

1%

4%

8%

16 %

Abbildung 12 Bevorzugte Saccharose-Konzentration weiblicher FVB/N-wt-Mäuse Dargestellt ist der Konsum innerhalb von 24 Stunden für verschiedene Saccharose-Konzentrationen. Gezeigt sind Mittelwerte + Standardabweichung (ZEWELDI & BANKSTAHL).

42

Material und Methoden

4.5.2 Versuchsablauf Alle Mäuse erhielten direkt nach ihrer Ankunft zwei mit Wasser gefüllte Trinkflaschen an ihren Heimatkäfigen, die sie für die gesamte Dauer der Studie behielten (siehe Abbildung 13). Alle verwendeten Flaschen wurden eindeutig beschriftet.

Abbildung 13 Käfig mit 2 Trinkflaschen

Jeder Durchlauf des Sucrose-Preference-Test erfolgte nach dem gleichen Schema (siehe Abbildung 14) und wurde über einen Zeitraum von fünf Tagen durchgeführt. Da die Tiere zur EEG- und Video-Überwachung in anderen Käfigen gehalten wurden, wurde ihnen eine Akklimatisationszeit an ihre Heimatkäfige von mindestens einer Woche gewährt, sofern sie zuvor überwacht wurden. Der Konsum von Wasser bzw. Saccharoselösung wurde jeweils über einen Zeitraum von 24 Stunden gravimetrisch bestimmt. Dazu waren in den ersten 24 Stunden (Montag – Dienstag) beide Flaschen mit Wasser gefüllt, um den Basiskonsum zu ermitteln. In den folgenden 24 Stunden (Dienstag – Mittwoch) wurde die linke Wasserflasche durch eine mit Saccharoselösung gefüllte Flasche ersetzt. Da die konsumierte Gesamtflüssigkeitsmenge durch die angebotene Saccharoselösung stark anstieg, wurde eine 24-stündige Erholungsphase eingeplant, in der erneut beide Flaschen mit Wasser gefüllt waren (Mittwoch – Donnerstag). Anschließend wurde die rechte Wasserflasche durch eine mit Saccharoselösung gefüllte Flasche ersetzt

43

Material und Methoden

(Donnerstag – Freitag). Durch das zweimalige Angebot der Saccharoselösung auf verschiedenen Käfigseiten sollte ein Einfluss der Seitenpräferenz der Mäuse auf das Versuchsergebnis vermieden werden. Zusätzlich wurde bei jeder Messung das Körpergewicht der Mäuse ermittelt.

Abbildung 14 Ablauf des Sucrose-Preference-Test

In der Mehrzahl der Versuche wurde mit einer 4-prozentigen Saccharoselösung gearbeitet. Nur in der 23. bzw. 26. Woche nach der Induktion des Status epilepticus wurde der SucrosePreference-Test mit einer 1-prozentigen Saccharoselösung durchgeführt, da ermittelt werden sollte, ob ein geringerer Anreiz den anhedonischen Effekt verstärken könnte.

4.6 Statistische Auswertung Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm Microsoft Excel® 2010 (Microsoft, Redmond, USA). Die statistische Analyse sowie die Erstellung der Graphen wurde mit dem Programm GraphPad Prism® Version 5.01 für Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) durchgeführt. Zunächst wurden alle Daten mit dem Test nach D'Agostino-Pearson auf ihre Normalverteilung hin überprüft. Handelte es sich um normalverteilte Daten, fand eine One-Way-Analysis of Variance (ANOVA) Anwendung. Als post hoc Test wurde in diesem Fall der Bonferroni-Test für ausgewählte Paare verwendet. Lag jedoch keine Normalverteilung vor, wurde für die Analyse gepaarter Daten der Friedman-Test und für die Analyse ungepaarter Daten der Kruskal-Wallis-Test genutzt. In beiden Fällen fand der Dunn’s-Test als post hoc Test Anwendung. Auch in diesem Test wurden jeweils nur ausgewählte Paare verglichen. Das Signifikanzniveau wurde stets auf 5 % festgesetzt. In den Graphen ist jeweils der Mittelwert mit Standardabweichung gezeigt.

44

Ergebnisse

5 Ergebnisse 5.1 Vergleich der FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäuse Alle 20 epileptischen und 10 nicht-epileptischen FVB/N-wt-Mäuse überlebten die Operation und den darauffolgenden Status epilepticus. Von den ursprünglich ebenfalls 30 mdr1a/b(-/-)Mäusen starben hingegen während der Operation und in den folgenden 24 Stunden bereits neun Tiere. Auch im weiteren Verlauf der Studie verstarben mehr mdr1a/b(-/-)-Mäuse als FVB/N-wt-Mäuse spontan. Zu Beginn der Überwachung lebten daher nur noch 14 epileptische und 6 nicht-epileptische mdr1a/b(-/-)-Mäuse. Die letzten Versuche konnten nur noch mit FVB/N-wt-Mäusen durchgeführt werden, da die Gruppengröße der mdr1a/b(-/-)-Mäuse nicht mehr ausreichte, um statistisch abgesicherte Ergebnisse zu gewinnen. Verhaltensunterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnten nicht festgestellt werden. Diese Aussage beschränkt sich jedoch auf die Beobachtungen der Experimentatoren während der Versuchsdurchführung und wurde nicht durch weitere Verhaltensversuche abgesichert. Unterschiede zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen in Bezug auf die Frequenz fokaler Anfälle konnten ebenfalls nicht nachgewiesen werden.

5.2 Zeitlicher Verlauf der Anfälle Zunächst sollte das Auftreten fokaler Anfälle im Kainat-Modell über mehrere Stunden festgehalten werden, um das Ausmaß von Schwankungen in der Anfallsfrequenz zu beurteilen. Es sollte außerdem festgestellt werden, ob der Wechsel von der Dunkel- zur Hellphase einen Einfluss auf die Anfallsfrequenz ausübt. Dazu wurden die Anfälle von sechs Mäusen jeweils sechs Stunden vor und nach dem Einschalten des Lichts gezählt. Abbildung 15 zeigt die Anfallsanzahl je halbe Stunde im Zeitraum vor und nach dem Lichtwechsel. Es wird deutlich, dass Schwankungen der mittleren Anfallsanzahl zwischen 42 ± 17 und 61 ± 16 Anfällen in einer halben Stunde auftraten.

45

Ergebnisse

n=6 100

# Anfälle

80 60

!!

40

!! !! ! !!

!

!

!

!

!

20 0 -6 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5

+0,5 +1 +1,5 +2 +2,5 +3 +3,5 +4 +4,5 +5 +5,5 +6

Zeit [h]

Zeit [h]

Licht

Abbildung 15 Frequenz fokaler Anfälle in Dunkel- vs. Hellphase Dargestellt ist die Anzahl der Anfälle je halbe Stunde im Zeitraum von sechs Stunden vor bis sechs Stunden nach dem Einschalten des Lichts. Es traten geringe Schwankungen der Anfallsfrequenz auf, signifikante Unterschiede zwischen einzelnen halben Stunden ergaben sich jedoch nicht (FriedmanTest: p = 0,9819). Dargestellt sind die Mittelwerte der sechs Mäuse + Standardabweichung. Es wur(-/-)

den 4 FVB/N-wt- und 2 mdr1a/b

-Mäuse analysiert. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen ge-

neralisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Diese traten verteilt auf 5 Mäuse auf.

Die Anfallsanzahl in der analysierten Dunkelphase betrug demnach im Mittel insgesamt 615 ± 146 Anfälle und unterschied sich damit nicht von der Anfallsanzahl in der analysierten Hellphase, die 649 ± 134 Anfälle betrug (gepaarter t-Test: p = 0,5035). Die Häufigkeit von generalisierten Anfällen zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen Hell- und Dunkelphase bei diesen sechs Mäusen. Betrachtet man hingegen einzelne Mäuse, zeigt sich eine stärkere Schwankung der Frequenz fokaler Anfälle. Abbildung 16 zeigt beispielhaft den Verlauf der Anfallsanzahl je halbe Stunde in den sechs Stunden vor und nach dem Einschalten des Lichts für die Mäuse SKL-124 und SKL-158.

46

Ergebnisse

SKL-124 100

# Anfälle

80 60 40

!

20 0 -6 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5

Zeit [h]

+0,5 +1 +1,5 +2 +2,5 +3 +3,5 +4 +4,5 +5 +5,5 +6

Licht

Zeit [h]

SKL-158 100

# Anfälle

80 60 40

!!

!

20 0 -6 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5

+0,5 +1 +1,5 +2 +2,5 +3 +3,5 +4 +4,5 +5 +5,5 +6

Zeit [h]

Zeit [h]

Licht Abbildung 16 Zeitlicher Verlauf fokaler Anfälle bei einzelnen Mäusen Dargestellt ist die Anzahl der Anfälle je halbe Stunde im Zeitraum von sechs Stunden vor bis sechs Stunden nach dem Einschalten des Lichts. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum.

Während der ausgewerteten Zeitabschnitte traten bei einzelnen Mäusen immer wieder generalisierte Anfälle auf. Diese riefen jedoch unterschiedliche Auswirkungen auf die Frequenz fokaler Anfälle hervor. Tabelle 2 zeigt beispielhaft Mäuse, bei denen 

ein generalisierter Anfall eine Reduktion der Frequenz fokaler Anfälle bewirkt hat,



der generalisierte Anfall keinen Einfluss auf die Frequenz fokaler Anfälle hatte,



durch einen generalisierten Anfall eine Erhöhung der Frequenz fokaler Anfälle aufgetreten ist.

47

Ergebnisse

Tabelle 2: Einfluss generalisierter Anfälle auf die Frequenz fokaler Anfälle Gezeigt ist die Anzahl fokaler Anfälle in der halben Stunde vor und nach dem Auftreten eines generalisierten Anfalls an einigen Beispielen.

mdr1a/b(-/-)

FVB/N

# Anfälle vor TierMaus-Nr. generalisiertem gruppe Anfall

# Anfälle nach generalisiertem Anfall

Differenz

SKL-125 SKL-127 SKL-131 SKL-132 SKL-132

56 83 65 111 92

5 9 22 71 62

-51 -74 -43 -40 -30

SKL-135

50

4

-46

SKL-141

91

59

-32

SKL-142

76

174

98

SKL-142 SKL-143

67 50

100 78

33 28

SKL-148 SKL-151 SKL-164 SKL-165

97 101 35 36

93 134 19 20

-4 33 -16 -16

5.3 Vergleich verschiedener Auswertungsansätze: Anfallsanzahl und kumulative Anfallsdauer In Veröffentlichungen anderer Arbeitsgruppen wurde nicht nur die Anfallsfrequenz, sondern auch die kumulative Anfallsdauer über einen bestimmten Zeitraum ermittelt (ROUCARD et al., 2010). Daher sollten die beiden Auswertungsansätze verglichen werden. Abbildung 17 zeigt den zeitlichen Verlauf der Anfallsanzahl sowie der kumulativen Anfallsdauer sechs Stunden vor und nach Einschalten des Lichts. Die kumulative Anfallsdauer zeigte eine deutlich stärkere Schwankung der Mittelwerte von 337 ± 201 s bis 623 ± 168 s in einer halben Stunde. Dies bedeutet, dass eine Steigerung von der minimalen zur maximalen kumulativen Anfallsdauer in einer halben Stunde um 85 % vorlag. Diese Steigerung betrug bei der Auswertung der Anfallsanzahl nur 45 %. Eine höhere Schwankung kann die Beurteilung von Substanzeffekten nach einer akuten Behandlung erschweren.

48

Ergebnisse

Anfallsfrequenz (n = 6) 100

# Anfälle

80 60 40

!!

! !!

!! !!

!

!

!

!

!

20 0 -6 -5,5 -5 -4,5 -4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5

+0,5 +1 +1,5 +2 +2,5 +3 +3,5 +4 +4,5 +5 +5,5 +6

Zeit [h]

Zeit [h]

Licht

kumulative Anfallsdauer kumulative Anfallsdauer [s]

(n = 6) 1000 800 600 400

!!

!

!! !! !!

!

!

!

!

!

200 0 - 6 - 5,5 - 5 - 4,5 - 4 - 3,5 - 3 - 2,5 - 2 - 1,5 - 1 - 0,5

+ 0,5+ 1 + 1,5+ 2 + 2,5+ 3 + 3,5+ 4 + 4,5+ 5 + 5,5+ 6

Zeit [h]

Zeit [h]

Licht

Abbildung 17 Frequenz vs. Dauer fokaler Anfälle in Dunkel- und Hellphase Dargestellt sind die Anfallsanzahl bzw. die kumulative Anfallsdauer je halbe Stunde in den sechs Stunden vor und nach dem Einschalten des Lichts. Die Auswertung der kumulativen Anfallsdauer zeigt eine größere Schwankung insbesondere in der Dunkelphase, signifikante Unterschiede zwischen einzelnen halben Stunden ergaben sich jedoch nicht (Friedman-Test: p = 0,9819 für Frequenz, p = 0,8293 für Dauer). Gezeigt sind Mittelwerte + Standardabweichung. Es wurden 4 FVB/N-wt- und 2 (-/-)

mdr1a/b

-Mäuse analysiert. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im

entsprechenden Zeitraum. Diese traten verteilt auf 5 Mäuse auf.

Die Auswertung der Anfallsfrequenz erscheint außerdem im Hinblick auf klinische Aspekte sinnvoller, da durch eine antiepileptische Behandlung bei Patienten keine Verkürzung der

49

Ergebnisse

Anfallsdauer, sondern eine Unterdrückung der Anfälle erreicht werden muss, um die Lebensqualität nachhaltig zu verbessern. Daher wurden die beiden Auswertungsmethoden lediglich noch ein weiteres Mal für das erste untersuchte Antiepileptikum Diazepam verglichen, um zu überprüfen, ob Effekte mit beiden Auswertungsansätzen gleichermaßen nachweisbar sind (siehe Abbildung 24 S. 59). Für alle weiteren Untersuchungen wurde auf die Auswertung der kumulativen Anfallsdauer verzichtet.

5.4 Wirkungen der Antiepileptika 5.4.1 Einsatz verschiedener Vehikel Bei Mäusen kann bereits das Handling starken Stress verursachen. Daher ist es wichtig, mögliche stressbedingte Einflüsse auf die Anfallsfrequenz, die mit Substanzeffekten interferieren können, durch eine Vehikel-Applikation zu untersuchen. Da zum Lösen der meisten Substanzen isotonische Natriumchloridlösung verwendet wurde (siehe Anhang, Kapitel 10.1 S. 131), wurde diese auch zur Untersuchung der stressbedingten Effekte eingesetzt. Abbildung 18 zeigt, dass die Injektion von isotonischer Natriumchloridlösung weder in der Gruppe der 14 ausgewerteten FVB/N-wt- noch in der Gruppe der 12 beurteilten mdr1a/b(-/-)-Mäuse signifikante Veränderungen der Anfallsfrequenz hervorrief. Da die verschiedenen Substanzen im Verlauf eines Jahres untersucht wurden, kann die basale Anfallsfrequenz, die jeweils direkt vor der Behandlung ermittelt wurde, stark schwanken. Um den Vergleich zwischen den verschiedenen angewendeten Substanzen zu erleichtern, wurde daher für alle folgenden Auswertungen eine normierte Darstellung gewählt. Für die Auswertung wurde der Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung als basale Anfallsfrequenz definiert und mit der Anfallsanzahl jeder einzelnen der vier halben Stunden nach der Behandlung verglichen. Für die normierte Darstellung wurde der Mittelwert der basalen Anfallsfrequenz aller Mäuse für die jeweilige Substanz berechnet und als 100 % definiert. Eine Übersicht der absoluten Anfallszahlen in den vier halben Stunden vor und nach der Behandlung befindet sich zu jeder Substanz im Anhang (siehe Kapitel 10.3 S. 134). Um den großen Aufwand der Auswertung zu reduzieren, wurden die Effekte der Substanzapplikationen jeweils nur für eine Teilmenge der behandelten Tiere ausgewertet. Die dabei verwendeten Tierzahlen (8 – 10 Tiere) erschienen aufgrund der Erfahrung in anderen Epilepsiemodellen ausreichend, Veränderungen der Anfallsfrequenz in einer ersten Studie sichtbar

50

Ergebnisse

zu machen. Störungen der EEG-Aufzeichnung konnten jedoch nicht immer vermieden werden, sodass teilweise nicht alle Tiere ausgewertet werden konnten. Daher wurde bei einzelnen Substanzen die angestrebte Anzahl untersuchter Tiere nicht erreicht. mdr1a/b(-/-)

FVB/N

(n = 12)

200

200

150

150

100

Anfälle [%]

Anfälle [%]

(n = 14)

!

!

!!

!

100

50

!

50

0

0 MW

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

MW

NaCl

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

NaCl

Abbildung 18 Isotonische Natriumchloridlösung Die Applikation von isotonischer Natriumchloridlösung zeigte keinen Effekt auf die Anfallsfrequenz. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Anfallsfrequenz vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,0692 für FVB/N-wt, p = 0,0280 für (-/-)

mdr1a/b

).

Da Carbamazepin nicht wasserlöslich ist, wurde für diese Substanz 30-prozentiges Polyethylenglycol 400 als Lösungsmittel verwendet. Daher wurde auch dieses Vehikel auf mögliche Effekte auf die Anfallsfrequenz untersucht. Diese Untersuchung zeigte jedoch keine signifikante Veränderung der Anfallsfrequenz bei sieben FVB/N-wt- und fünf mdr1a/b(-/-)-Mäusen (siehe Abbildung 19). Außerdem wurde verglichen, ob Unterschiede zwischen der Applikation isotonischer Natriumchloridlösung und der Applikation von 30-prozentigem Polyethylenglycol 400 auftraten. Es konnte jedoch zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Substanzen festgestellt werden. Auch zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,5612).

51

Ergebnisse

FVB/N-wt NaCl (n = 14)

Anfälle [%]

200

PEG 400 (n =7)

150 100

!

!

! !!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

mdr1a/b(-/-) NaCl (n = 12)

Anfälle [%]

200

PEG 400 (n =5)

150 100

!

!

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 19 Polyethylenglycol 400 Veranschaulicht sind die Wirkungen von Polyethylenglycol 400 (PEG 400) und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,0787 für (-/-)

FVB/N-wt, p = 0,5133 für mdr1a/b

) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: (-/-)

p = 0,3192 für FVB/N-wt, p = 0,8288 für mdr1a/b

) auf.

Für die Untersuchung von Diazepam wurde zunächst die kommerziell erhältliche Injektionslösung Faustan® angewendet, die so verdünnt wurde, dass ein Applikationsvolumen von 10 ml/kg für die gewählte Dosierung erreicht wurde. Da Faustan® jedoch 18,6 % Ethanol als Lösungsmittel enthält, sollte für Diazepam ebenfalls eine Vehikelkontrolle durchgeführt werden. Die Ethanolkonzentration in der hier verwendeten Verdünnung lag bei einer Dosierung von 5 mg/kg Diazepam und einem Applikationsvolumen von 10 ml/kg bei 0,19 %. Daher wurde die Vehikelkontrolle mit dieser Ethanolkonzentration vorgenommen. Diese Untersu-

52

Ergebnisse

chung konnte nur an acht FVB/N-wt-Mäusen durchgeführt werden. Da sie zu einem späten Zeitpunkt im Verlauf der Studie vorgenommen wurde, waren bereits zu viele mdr1a/b(-/-)Mäuse gestorben, um eine aussagekräftige Untersuchung zu erlauben. Abbildung 20 zeigt, dass die 0,19-prozentige Ethanollösung in einem Applikationsvolumen von 10 ml/kg keinen Einfluss auf die Anfallsfrequenz gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung hat. Es konnte ebenfalls kein signifikanter Unterschied zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung festgestellt werden.

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Diazepam Vehikel (n = 8)

100

!

! !!!

!

!!

!!!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 20 Diazepam-Vehikel Veranschaulicht sind die Wirkungen des Diazepam-Vehikels (welches 0,19 % Ethanol enthält) und von isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,0636) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,1743) auf.

In den zwei Stunden vor der Behandlung traten drei generalisierte Anfälle, sowie in der zweiten halben Stunde nach der Behandlung ebenfalls drei und in der dritten halben Stunde nach der Behandlung ein generalisierter Anfall auf. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die generalisierten Anfälle die Frequenz fokaler Anfälle für einen gewissen Zeitraum senken. Daher zeigt Tabelle 3 die Anzahl der Anfälle in den vier halben Stunden vor und nach der Behandlung von allen Mäusen, bei denen generalisierte Anfälle auftraten. Dabei zeigt sich bei der Maus SKL-132 eher eine Senkung der Anfallsfrequenz, während die Mäuse SKL-141 und SKL-142 eher eine Erhöhung der Anfallsfrequenz erkennen lassen.

53

Ergebnisse

Tabelle 3 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Diazepam-Vehikel

FVB/N -wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-132 SKL-141

112 131

!

SKL-142

88

!

104 93 146

!

65 105

63 66

49 98

!!

91 74

144

89

57

!

91

!

88 116

69 131

177

75

Zusammenfassend kann man feststellen, dass keine der untersuchten Vehikelsubstanzen zu einer Veränderung der Anfallsfrequenz führte. In der normierten Auswertung konnten außerdem keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Vehikelsubstanzen gefunden werden. Im Folgenden wurden die Antiepileptika in ihrer Wirksamkeit mit der jeweiligen VehikelApplikation verglichen, sofern diese durchgeführt werden konnte. Andernfalls wurde die Applikation von isotonischer Natriumchloridlösung als Vergleich herangezogen.

5.4.2 Antiepileptika Die folgenden Ergebnisse sind alphabetisch nach den verwendeten Antiepileptika geordnet, um eine bessere Übersicht zu ermöglichen. Sie sind nicht nach der zeitlichen Abfolge der Behandlungen geordnet, da die Tiere aufgrund der eingeschränkten Überwachungskapazität in zwei Gruppen aufgeteilt werden mussten, und die Substanzen in beiden Gruppen nicht immer in der gleichen Reihenfolge angewendet werden konnten.

Carbamazepin Abbildung 21 zeigt, dass Carbamazepin in einer Dosierung von 20 mg/kg bei einer Gruppe von acht FVB/N-wt-Mäusen zu einer signifikanten Erhöhung der Anfallsanzahl in der zweiten halben Stunde nach der Applikation im Vergleich zum Mittelwert der Anfallsanzahl vor der Behandlung führte (MW: 100 % ± 20, zweite halbe Stunde: 123 % ± 18). Berechnet wurden jeweils der Mittelwert aller Mäuse sowie die Standardabweichung. Ebenso zeigte sich bei einer Gruppe von acht mdr1a/b(-/-)-Mäusen eine Erhöhung der Anfallsfrequenz in der ersten und zweiten halben Stunde nach der Behandlung im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung (MW: 100 % ± 50, erste halbe Stunde: 157 % ± 55, zweite halbe Stunde: 150 % ± 64). Im Vergleich zur Behandlung mit der als Vehikel verwendeten 30-prozentigen Polyethylenglycol-400-Lösung konnte jedoch in keiner der beiden Gruppen ein signifikanter Unterschied gezeigt werden. Auch zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen traten

54

Ergebnisse

keine signifikanten Unterschiede der Wirkung von Carbamazepin auf (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,6579). In den zwei Stunden vor der Behandlung traten zwei generalisierte Anfälle bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen auf.

Anfälle [%]

FVB/N-wt 250

PEG 400 (n = 7)

200

Carbamazepin 20 mg/kg (n = 8)

*

150 100

! 50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

mdr1a/b(-/-) PEG 400 (n = 5)

250 200

Anfälle [%]

*

*

Carbamazepin 20 mg/kg (n = 8)

150 100

!!

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 21 Carbamazepin 20 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Carbamazepin und 30-prozentiger Polyethylenglycol-400Lösung (PEG 400) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (-/-)

(p = 0,0589 für FVB/N-wt, p = 0,0022 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare

(p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Vehikelkontrolle (Kruskal-Wallis-Test: (-/-)

p = 0,3568 für FVB/N-wt, p = 0,7562 für mdr1a/b

).

Anschließend wurde eine höhere Dosierung von 40 mg/kg untersucht (siehe Abbildung 22). Dabei zeigte sich in der zweiten halben Stunde nach der Behandlung bei einer Gruppe von

55

Ergebnisse

acht untersuchten FVB/N-wt-Mäusen eine signifikante Erhöhung der Anfallsanzahl im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung (MW: 100 % ± 16,22, zweite halbe Stunde: 133,9 % ± 17,14).

Anfälle [%]

FVB/N-wt 250

PEG 400 (n = 7)

200

Carbamazepin 40 mg/kg (n = 8)

*

150 100

! 50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

mdr1a/b(-/-) PEG 400 (n = 5)

250

*

Anfälle [%]

200

*

Carbamazepin 40 mg/kg (n = 7)

150 100

!!!!

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 22 Carbamazepin 40 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Carbamazepin und 30-prozentiger Polyethylenglycol-400Lösung (PEG 400) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (-/-)

(p = 0,0250 für FVB/N-wt, p = 0,0500 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare

(p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Vehikelkontrolle (Kruskal-Wallis-Test: (-/-)

p = 0,0886 für FVB/N-wt, p = 0,4144 für mdr1a/b

).

Auch bei einer Gruppe von acht mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnte eine signifikante Erhöhung der Anfallsfrequenz in der zweiten und dritten halben Stunde nach der Applikation im Vergleich

56

Ergebnisse

zum Mittelwert vor der Behandlung festgestellt werden (MW: 100 % ± 32, zweite halbe Stunde: 146 % ± 53, dritte halbe Stunde: 143 % ± 49). Auch in dieser Dosierung konnten keine signifikanten Unterschiede der Wirksamkeit von Carbamazepin zwischen den FVB/N-wtund den mdr1a/b(-/-)-Mäusen gefunden werden (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,3787). Tabelle 4 zeigt aufgrund des Auftretens von vier generalisierten Anfällen vor der Behandlung in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse die absoluten Anfallszahlen der Tiere, bei denen generalisierte Anfälle im ausgewerteten Zeitraum auftraten. Beide Mäuse lassen eher eine Steigerung der Anfallsanzahl nach den generalisierten Anfällen erkennen. Da in dieser Gruppe jedoch eine prokonvulsive Wirkung von Carbamazepin gefunden wurde, wurde durch die Steigerung der basalen Anfallsfrequenz der berechnete Effekt wahrscheinlich eher abgeschwächt als verstärkt. Tabelle 4 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Carbamazepin 40 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

TierMaus-Nr. gruppe SKL-148 SKL-151

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h 94 88

141 !! 145 96 96 !

!

179 136

185 157

175 165

176 171

172 124

Diazepam Für die Untersuchung von Diazepam wurde zunächst die kommerziell erhältliche Injektionslösung Faustan® angewendet, die entsprechend der erwünschten Dosierung auf ein Applikationsvolumen von 10 ml/kg verdünnt wurde. Die Dosierung von 2 mg/kg führte zu keinem signifikanten antikonvulsiven Effekt bei den zehn ausgewerteten FVB/N-wt-Mäusen (siehe Abbildung 23). Bei den neun untersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäusen zeigte sich dagegen in den ersten beiden halben Stunden nach der Applikation eine signifikante zunächst starke dann schwächere Senkung der Anfallsfrequenz im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung (MW: 100 % ± 38, erste halbe Stunde: 28 % ± 32, zweite halbe Stunde: 62 % ± 68). Im Vergleich zu der Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung zeigte sich eine Verringerung der Anfallsfrequenz in der dritten halben Stunde nach der Applikation (NaCl: 134 % ± 42, Diazepam: 64 % ± 58). Vor der Behandlung trat ein generalisierter Anfall auf.

57

Ergebnisse

Ein Unterschied zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnte jedoch nicht mit einem Signifikanzniveau von 5 % bestätigt werden (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,4720). FVB/N-wt Diazepam-Vehikel (n = 8)

Anfälle [%]

200 150 100

Diazepam 2 mg/kg (n = 10)

! !!!

!!!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung mdr1a/b(-/-) NaCl (n = 12)

Anfälle [%]

200 150

*

Diazepam 2 mg/kg (n = 9)

#

!

100

!

!

*

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 23 Diazepam 2 mg/kg (Faustan®) Veranschaulicht sind die Wirkungen von Diazepam und dem Vehikel, welches 0,19 % Ethanol enthält, (-/-)

für die FVB/N-wt-Mäuse im Vergleich. Im Falle der mdr1a/b

-Mäuse konnte die Vehikelkontrolle nicht

mehr durchgeführt werden, daher erfolgt hier der Vergleich mit isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl). Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (p = 0,2946 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0012 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)), Rauten gegen-

über der Vehikel-Applikation zum gleichen Zeitpunkt (Kruskal-Wallis-Test (p = 0,0693 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0014 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen

symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum.

Im zeitlichen Verlauf der Studie war Diazepam das erste untersuchte Antiepileptikum. Daher sollte hier abgesichert werden, dass vorhandene Effekte sich ebenfalls in der Auswertung der

58

Ergebnisse

kumulativen Anfallsdauer nachweisen lassen. Zu diesem Zweck zeigt Abbildung 24 den Effekt von Diazepam in der Dosierung von 2 mg/kg bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen in beiden Auswertungen im Vergleich. Beide Auswertungsansätze lassen gleichermaßen eine antikonvulsive Wirkung in den ersten beiden halben Stunden nach der Behandlung im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung erkennen. Da hier kein Vergleich zu einer weiteren Substanz erfolgte, wurde in der Darstellung auf die Normierung der Ergebnisse verzichtet. mdr1a/b(-/-)

mdr1a/b(-/-)

(n = 9)

(n = 9)

*

80

# Anfälle

kumulative Anfallsdauer [s]

100

60

!

*

40 20 0 MW

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

1000 800

*

600 400

!

*

200 0 MW

Diazepam 2 mg/kg

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

Diazepam 2 mg/kg

Abbildung 24 Vergleich von Anfallsfrequenz und –dauer am Beispiel Diazepam Veranschaulicht ist die Wirkung von Diazepam auf Anfallsfrequenz und –dauer im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl/-dauer aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (p = 0,0012 für Anfallsfrequenz, p = 0,0021 für kumulative Anfallsdauer) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum.

Aufgrund des moderaten antikonvulsiven Effekts von Diazepam wurde die Dosierung auf 5 mg/kg erhöht (siehe Abbildung 25). Dies führte zu einer signifikanten Senkung der Anfallsfrequenz im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung und im Vergleich zur Behandlung mit dem ethanolhaltigen Vehikel in allen vier untersuchten halben Stunden bei den zehn FVB/N-wt-Mäusen.

59

Ergebnisse

FVB/N-wt Diazepam-Vehikel (n = 8)

Anfälle [%]

200 150

Diazepam 5 mg/kg (n = 10)

!

100

!!!

!

!!!

50

* #

*#

*

#

*#

0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Diazepam 5 mg/kg (n = 10) #

!

100

!

#

#

!

*#

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 25 Diazepam 5 mg/kg (Faustan®) Veranschaulicht sind die Wirkungen von Diazepam und dem Vehikel, welches 0,19 % Ethanol enthält, (-/-)

für die FVB/N-wt-Mäuse im Vergleich. Im Falle der mdr1a/b

-Mäuse konnte die Vehikelkontrolle nicht

mehr durchgeführt werden, daher erfolgt hier der Vergleich mit isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl). Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (p < 0,0001 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0005 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)), Rauten gegen-

über der Vehikel-Applikation zum gleichen Zeitpunkt (Kruskal-Wallis-Test (p < 0,0001 für FVB/N-wt, (-/-)

p < 0,0001 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen

symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum.

Bei den 10 mdr1a/b(-/-)-Mäusen trat eine signifikante Senkung der Anfallsfrequenz im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung nur während der ersten halben Stunde nach der Behandlung auf, während der Unterschied zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung ebenfalls in allen vier halben Stunden signifikant nachweisbar war. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen nachgewiesen werden (Kruskal60

Ergebnisse

Wallis-Test: p = 0,0140). Sowohl in der Gruppe der FVB/N-wt-Mäuse als auch in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse konnte jeweils ein generalisierter Anfall in den zwei Stunden vor der Behandlung beobachtet werden. Da die verdünnte kommerziell erhältliche Diazepamlösung Faustan® jedoch Ethanol enthielt und Diazepam und Ethanol eine synergistische antikonvulsive Wirkung aufweisen (HERDEGEN, 2010; LÜLLMANN et al., 2010), wurde Diazepam noch einmal in wässriger Lösung untersucht (siehe Abbildung 26). Dieser Versuch wurde jedoch nur bei FVB/N-wtMäusen durchgeführt, da er zu einem späteren Zeitpunkt im Verlauf der Studie stattfand. Zu diesem Zeitpunkt waren bereits so viele der mdr1a/b(-/-)-Mäuse gestorben, dass die Gruppengröße für eine Untersuchung antikonvulsiver Effekte nicht mehr ausreichte. Es konnten bei den acht verbliebenen FVB/N-wt-Mäusen weder im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung noch im Vergleich zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung Effekte der Behandlung auf die Anfallsfrequenz beobachtet werden. Auffällig war allerdings die große Anzahl von acht generalisierten Anfällen in den zwei Stunden vor der Behandlung. Daher sind in Tabelle 5 die absoluten Anfallsanzahlen in den vier halben Stunden vor und nach der Behandlung für die Tiere dargestellt, bei welchen die generalisierten Anfälle auftraten. Bei der Maus SKL-132 kann eine Senkung der Anfallsfrequenz durch die generalisierten Anfälle nicht ausgeschlossen werden, da die Auswertung erst kurz vor dem ersten generalisierten Anfall begonnen wurde, sodass die Anfallsanzahl in der halben Stunde vor dem generalisierten Anfall nicht beurteilt werden kann, und sich außerdem die Effekte der drei Anfälle eventuell überlappen. Bei den anderen vier Tieren ist jedoch keine starke Reduktion der Anfallsfrequenz erkennbar. Die Maus SKL-141 zeigt sogar eher eine Erhöhung der Anfallsfrequenz nach dem generalisierten Anfall.

61

Ergebnisse

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Diazepam 5 mg/kg (n = 8)

100

! 50

!

!!!! !!!!

!!

0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 26 Diazepam in wässriger Lösung Veranschaulicht sind die Wirkungen von Diazepam und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,5918) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,1464) auf.

Tabelle 5 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Diazepam in wässriger Lösung

FVB/N -wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-124 SKL-132 SKL-141

101 30 ! 114

SKL-142

108

SKL-143

78

110 33 ! 71 !

!

116 12 ! 79

98 58

!

127 22 140

121 24 69

97 18 94

103 38 84

95 33 53

149

55

72

73

65

71

69

74

85

121

80

63

! !

Levetiracetam Levetiracetam wurde in einer Dosierung von 400 mg/kg untersucht (siehe Abbildung 27). Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Anfallsfrequenz nachgewiesen werden, wobei zu beachten ist, dass nur sieben FVB/N-wt- und fünf mdr1a/b(-/-)-Mäuse ausgewertet werden konnten. Zwischen den beiden Gruppen konnte ebenfalls kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,7868).

62

Ergebnisse

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Levetiracetam 400 mg/kg (n = 7)

100

!

!!!!

! !!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Levetiracetam 400 mg/kg (n = 5) !

100

!

!!! 50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 27 Levetiracetam 400 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Levetiracetam und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,5820 für FVB/N-wt, p = 0,4995 (-/-)

für mdr1a/b

) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,3238 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,1783 für mdr1a/b

) auf.

Es fiel jedoch auf, dass in den zwei Stunden vor der Behandlung bei den FVB/N-wt-Mäusen vier und bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen drei generalisierte Anfälle auftraten. Auch in diesem Fall wurden die Anfallsanzahlen der Tiere mit generalisierten Anfällen daher noch einmal tabellarisch dargestellt (siehe Tabelle 6). Bei beiden FVB/N-wt Mäusen zeigte sich demnach eine Reduktion der Frequenz fokaler Anfälle nach dem Auftreten der generalisierten Anfälle. Dadurch kann ein antikonvulsiver Effekt des Levetiracetams unter Umständen kaschiert werden. Die Auswirkungen der drei generalisierten Anfälle bei der einen mdr1a/b(-/-)-Maus, kön-

63

Ergebnisse

nen nicht abschließend beurteilt werden, da keine Vergleichsdaten vor dem ersten generalisierten Anfall ausgewertet wurden. Tabelle 6 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Levetiracetam 400 mg/kg

FVB/N -wt

SKL-125 SKL-131

mdr1a/b(-/-)

TierMaus-Nr. gruppe

SKL-148

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h 92 87 !

73

!

66 67

!! !

49 24

49

!

66

!

7 52

2 67

0 55

48 56

69 54

98

90

96

43

56

Zusätzlich wurde Levetiracetam in einer Dosierung von 800 mg/kg untersucht, da diese bei ROUCARD et al. (2010) zu einer deutlicheren antikonvulsiven Wirkung geführt hatte. So konnte eine signifikante Erniedrigung der Anfallsfrequenz in der zweiten halben Stunde nach der Behandlung im Vergleich zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung bei acht untersuchten FVB/N-wt-Mäusen hervorgerufen werden (NaCl: 114 % ± 58, Levetiracetam: 57 % ± 44). Bei den acht ausgewerteten mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnte kein signifikanter Effekt auf die Anfallsfrequenz erreicht werden (siehe Abbildung 28). Hier bestand jedoch ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,4753). Da bei den FVB/N-wt-Mäusen vier generalisierte Anfälle vor der Behandlung auftraten, zeigt Tabelle 7 noch einmal die Anfallsanzahlen der Tiere mit generalisierten Anfällen. Bei drei der Mäuse erscheint die Anfallsfrequenz nach dem generalisierten Anfall erniedrigt, sodass ein vorhandener antikonvulsiver Effekt eher abgeschwächt als verstärkt wird. Tabelle 7 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Levetiracetam 800 mg/kg TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

FVB/N -wt

SKL-117 SKL-131 SKL-135 SKL-145

# Anfälle nach Behandlung

!

56

38

27

38

61

42 43

1 44

10 26

!

!

70

64

!

71

3

41

39

49

18

18

37

45

51

4 37

1 39

10 33

18 43

27 44

Ergebnisse

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Levetiracetam 800 mg/kg (n = 8) #

100

!

!!!!

! !!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Levetiracetam 800 mg/kg (n = 8) !

100

!

! 50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 28 Levetiracetam 800 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Levetiracetam und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Rauten markieren signifikante Unterschiede gegenüber der NaCl-Applikation zum gleichen Zeitpunkt (Kruskal-Wallis-Test (p = 0,0088 für (-/-)

FVB/N-wt, p = 0,4403 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausru-

fezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Anfallsfrequenz vor der Behandlung (Friedman-Test: (-/-)

p = 0,0739 für FVB/N-wt, p = 0,7750 für mdr1a/b

).

Phenobarbital Auch Phenobarbital wurde in zwei Dosierungen untersucht. Die niedrige Dosierung von 25 mg/kg führte jedoch weder bei den acht ausgewerteten FVB/N-wt- noch bei den acht un-

65

Ergebnisse

tersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu einer signifikanten Beeinflussung der Anfallsfrequenz (siehe Abbildung 29). Auch hier konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den FVB/Nwt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen gezeigt werden (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,2009). Bei den FVB/N-wt-Mäusen traten vor der Behandlung zwei generalisierte Anfälle auf.

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Phenobarbital 25 mg/kg (n = 8)

100

!

!!

! !!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Phenobarbital 25 mg/kg (n = 8) !

100

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 29 Phenobarbital 25 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Phenobarbital und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,2977 für FVB/N-wt, p = 0,0264 (-/-)

für mdr1a/b

) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,3792 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0762 für mdr1a/b

) auf.

Wie Abbildung 30 zeigt, führte die höhere Dosierung von 50 mg/kg bei den acht ausgewerteten mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu einer signifikant erniedrigten Anfallsfrequenz in der dritten halben Stunde nach der Behandlung im Vergleich zu isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl: 66

Ergebnisse

134 % ± 42, Phenobarbital: 51 % ± 60). Bei den acht untersuchten FVB/N-wt-Mäusen konnte eine dem Graphen nach zu urteilen möglicherweise ebenfalls vorhandene antikonvulsive Wirkung nicht statistisch abgesichert werden. Es traten keine generalisierten Anfälle auf. Auch hier konnten keine Unterschiede zwischen den Tiergruppen belegt werden (Kruskal-WallisTest: p = 0,6833).

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Phenobarbital 50 mg/kg (n = 8)

100

!

!

!!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Phenobarbital 50 mg/kg (n = 8)

#

!

100

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 30 Phenobarbital 50 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Phenobarbital und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Rauten markieren signifikante Unterschiede gegenüber der NaCl-Applikation zum gleichen Zeitpunkt (Kruskal-Wallis-Test (p = 0,0028 für (-/-)

FVB/N-wt, p = 0,0090 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausru-

fezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Anfallsfrequenz vor der Behandlung (Friedman-Test: (-/-)

p = 0,1209 für FVB/N-wt, p = 0,1137 für mdr1a/b

).

67

Ergebnisse

Phenytoin Wie Abbildung 31 zeigt, hatte die Applikation von Phenytoin in einer Dosierung von 20 mg/kg bei acht untersuchten FVB/N-wt-Mäusen einen prokonvulsiven Effekt in der dritten halben Stunde nach der Behandlung im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung (MW: 100 % ± 25, dritte halbe Stunde: 149 % ± 52). FVB/N-wt NaCl (n = 14)

250

*

Anfälle [%]

200

Phenytoin 20 mg/kg (n=8)

150 100

!

!

50

!

!!

!

0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung mdr1a/b(-/-) NaCl (n = 12)

250

*

Anfälle [%]

200

Phenytoin 20 mg/kg (n=8)

150

!

100

!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 31 Phenytoin 20 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Phenytoin und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test (p = 0,0284 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0334 für mdr1a/b

) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)). Ausrufezeichen

symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zur Vehikelkontrolle (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,1496 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,2029 für mdr1a/b

).

68

Ergebnisse

Auch bei den acht ausgewerteten mdr1a/b(-/-)-Mäusen zeigte sich ein prokonvulsiver Effekt. Dieser trat bereits in der zweiten halben Stunde nach der Behandlung im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung auf (MW: 100 % ± 27, zweite halbe Stunde: 161 % ± 44). Diese Effekte waren im Vergleich zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung nicht signifikant nachweisbar. Bei den FVB/N-wt-Mäusen konnte in den zwei Stunden vor der Behandlung und in der halben Stunde nach der Behandlung jeweils ein generalisierter Anfall beobachtet werden. Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den FVB/N-wtund den mdr1a/b(-/-)-Mäusen nachgewiesen werden (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,2020).

Valproat Die letzte untersuchte Substanz war Valproat in einer Dosierung von 300 mg/kg. Auch hier konnten keine signifikanten Effekte auf die Anfallsfrequenz bei jeweils acht ausgewerteten FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen beobachtet werden (siehe Abbildung 32). Auch zwischen den beiden Tiergruppen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,0681). In den zwei Stunden vor der Behandlung traten ein generalisierter Anfall bei den FVB/N-wtMäusen und drei generalisierte Anfälle bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen auf. Daher zeigt Tabelle 8 die Anfallsanzahl der mdr1a/b(-/-)-Mäuse mit generalisierten Anfällen. Bei der Maus SKL-170 zeigt sich eine Reduktion der Anfallsfrequenz. Tabelle 8 Anfallsanzahlen bei generalisierten Anfällen: Valproat 300 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

TierMaus-Nr. gruppe SKL-164 SKL-170

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h !

34 71

!

20 31

!

45 39

69

31 61

8 16

35 52

46 68

47 67

Ergebnisse

Anfälle [%]

FVB/N-wt 200

NaCl (n = 14)

150

Valproat 300 mg/kg (n = 8)

100

!

!

!

!!

50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Anfälle [%]

mdr1a/b(-/-) 200

NaCl (n = 12)

150

Valproat 300 mg/kg (n = 8) !

100

!

!!! 50 0 MW

+0,5

+1

+1,5

+2

Zeit [h]

Behandlung

Abbildung 32 Valproat 300 mg/kg Veranschaulicht sind die Wirkungen von Valproat und isotonischer Natriumchloridlösung (NaCl) im Vergleich. Dargestellt sind jeweils der normierte Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung (MW) und die normierten Einzelwerte der vier halben Stunden nach der Behandlung. Gezeigt sind Mittelwert + Standardabweichung. Ausrufezeichen symbolisieren jeweils einen generalisierten Anfall im entsprechenden Zeitraum. Es traten weder signifikante Unterschiede gegenüber dem Mittelwert vor der Behandlung (Friedman-Test: p = 0,0660 für FVB/N-wt, p = 0,0388 (-/-)

für mdr1a/b

) noch gegenüber der NaCl-Applikation (Kruskal-Wallis-Test: p = 0,1428 für FVB/N-wt, (-/-)

p = 0,0656 für mdr1a/b

) auf.

70

Ergebnisse

5.5 Responder-Nonresponder-Selektion Um Resistenzmechanismen zu untersuchen, sind insbesondere solche Modelle erstrebenswert, die eine Subgruppen-Einteilung der Tiere in Responder, die auf eine Behandlung ansprechen, und Nonresponder, die eine Resistenz zeigen, ermöglichen (LÖSCHER, 2011). Daher sollte in dieser Studie auch untersucht werden, ob im fokalen Kainat-Modell der Maus unter akuter Behandlung eine Einteilung in Responder und Nonresponder möglich ist.

5.5.1 Ermittlung des Responderstatus Zur Ermittlung des Responderstatus einer Maus wurde zunächst der Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der Behandlung berechnet. Dieser wurde dann mit der Anfallsanzahl der vier einzelnen halben Stunden nach der Behandlung verglichen. Um eine schnelle und einfache Erkennung des Responderstatus zu ermöglichen, wurden die Daten normiert dargestellt. Der Mittelwert der Anfallsanzahl vor der Behandlung wurde als 100 % definiert. Um als Responder eingestuft zu werden, musste eine Maus in mindestens einer der vier halben Stunden nach der Behandlung eine Reduktion der Anfallsanzahl um mindestens 75 % im Vergleich mit dem Mittelwert der Anfallsanzahl vor der Behandlung aufweisen. Abbildung 33 zeigt typische Responder und Nonresponder. Eine Übersicht über den ResponderStatus aller Tiere und Substanzen befindet sich am Ende dieses Kapitels (Tabelle 24 S. 84).

71

Ergebnisse

SKL-137

SKL-140 150

Anfälle [%]

Anfälle [%]

150

100

50

100

50

25

25

0

0 MW

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

MW

Diazepam 5 mg/kg

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

Diazepam 5 mg/kg

SKL-167

SKL-161 150

Anfälle [%]

150

Anfälle [%]

+0,5

100

50

100

50 25

25

0

0 MW

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

MW

+2

+0,5

+1 +1,5 Zeit [h]

+2

Diazepam 5 mg/kg

Diazepam 5 mg/kg Abbildung 33 Ermittlung des Responderstatus

Eine Maus wird als Responder definiert, wenn sie in mindestens einer der vier halben Stunden nach der Behandlung eine Reduktion der Anfallsanzahl um mindestens 75 % im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung zeigt. SKL-137 und SKL-140 sind daher in dieser Abbildung Responder, SKL-161 und SKL-167 dagegen Nonresponder.

5.5.2 Vehikel Die Ermittlung des Responderstatus der Mäuse wurde zunächst für die drei untersuchten Vehikelsubstanzen (isotonische Natriumchloridlösung, 30-prozentiges Polyethylenglycol 400 und Diazepam-Vehikel zu Faustan®) vorgenommen.

72

Ergebnisse

Tabelle 9 zeigt, dass bei einer Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung zwei Responder in der Gruppe der 14 untersuchten FVB/N-wt-Mäuse beobachtet werden konnten. In der Gruppe der 12 untersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäuse traten keine Responder auf. Tabelle 9 Responder-Selektion: isotonische Natriumchloridlösung

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N-wt

mdr1a/b (-/-)

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-117 SKL-123 SKL-125 SKL-127 SKL-130

109,8 10,7 152,9 57,4 69,8

133,8 30,4 186,0 130,4 154,0

98,4 66,1 73,9 100,9 133,3

109,8 91,1 150,3 109,6 134,9

NR R NR NR NR

SKL-132

82,8

100,0

103,5

101,7

NR

SKL-133

64,4

47,5

169,5

206,8

NR

SKL-135

49,4

32,1

103,7

108,6

NR

SKL-137

113,2

192,5

218,9

173,6

NR

SKL-140

207,3

77,7

134,4

136,0

NR

SKL-141

133,3

162,4

162,4

19,4

R

SKL-142

47,6

128,6

149,8

151,5

NR

SKL-143 SKL-146

94,3 52,0

138,4 92,0

91,3 132,0

35,0 138,0

NR NR

SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-157 SKL-158 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

106,2 25,8 27,3 89,3 161,8 97,7 40,0 134,2 55,4 128,4 86,1 127,7

130,9 145,2 50,0 98,6 137,7 118,0 104,0 162,4 103,1 128,4 159,6 181,6

142,6 258,1 161,4 106,1 118,0 160,4 114,7 130,2 176,1 112,2 87,9 87,9

90,2 61,3 175,0 70,7 109,3 156,7 176,0 98,0 171,1 79,7 86,1 139,0

NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR

Unter der Behandlung mit 30-prozentigem Polyethylenglycol 400, welches zur Lösung von Carbamazepin verwendet wurde, konnten weder in der Gruppe der sieben ausgewerteten FVB/N-wt-Mäuse noch in der Gruppe der fünf untersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäuse Responder beobachtet werden (siehe Tabelle 10).

73

Ergebnisse

Tabelle 10 Responder-Selektion: 30-prozentiges Polyethylenglycol 400

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

SKL-132 SKL-133 SKL-135 FVB/N-wt SKL-137 SKL-141

mdr1a/b (-/-)

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

51,2 122,5 45,1 66,2 54,6

146,8 126,3 86,5 82,4 125,5

156,2 103,8 111,6 100,0 157,9

SKL-142

75,8

89,9

SKL-146

125,1

88,7

SKL-164 SKL-167 SKL-168 SKL-169 SKL-170

65,4 131,9 110,8 132,9 113,4

95,6 100,4 119,5 120,7 158,8

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

118,5 100,0 91,5 98,5 146,1

NR NR NR NR NR

115,2

93,9

NR

107,7

113,3

NR

96,9 94,5 119,5 126,8 150,5

125,8 96,2 120,5 114,6 152,6

NR NR NR NR NR

Tabelle 11 zeigt, dass die Behandlung mit 0,19-prozentiger Ethanollösung, welche in der für Mäuse entsprechend verdünnten kommerziellen Diazepam-Lösung Faustan® enthalten ist, ebenfalls nicht zum Auftreten von Respondern in der Gruppe der acht untersuchten FVB/Nwt-Mäuse führte. Diese Behandlung erfolgte erst zu einem späten Zeitpunkt im Verlauf der Studie, sodass eine Behandlung der mdr1a/b(-/-)-Mäuse nicht mehr vorgenommen werden konnte. Tabelle 11 Responder-Selektion: Diazepam-Vehikel zu Faustan®

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-123 SKL-124 SKL-132 SKL-135 FVB/N-wt SKL-141

69,1 133,7 57,0 131,3 99,2

110,3 88,0 105,8 89,6 74,9

142,3 130,2 102,3 87,6 117,5

157,7 173,6 80,2 105,5 132,7

NR NR NR NR NR

SKL-142

48,8

77,9

151,6

64,2

NR

SKL-143 SKL-146

78,5 69,3

119,2 92,0

120,8 96,1

123,8 110,6

NR NR

74

Ergebnisse

5.5.3 Antiepileptika Es wurden verschiedene Antiepileptika in ein bis zwei Dosierungen untersucht. Die Ergebnisse sind auch in diesem Abschnitt alphabetisch sortiert. Tabelle 12 zeigt, dass Carbamazepin in einer Dosierung von 20 mg/kg in keiner der beiden Gruppen zum Auftreten von Respondern geführt hat. Es wurden jeweils acht FVB/N-wt- und acht mdr1a/b(-/-)-Mäuse ausgewertet. Tabelle 12 Responder-Selektion: Carbamazepin 20 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-127 SKL-131 SKL-132 SKL-133 FVB/N-wt SKL-137

128,9 147,9 140,9 106,3 68,5

102,1 108,1 181,1 115,6 143,6

150,6 125,1 176,1 103,7 134,8

135,6 100,5 156,0 116,9 117,1

NR NR NR NR NR

SKL-140

120,8

125,0

58,3

91,7

NR

SKL-141 SKL-145

87,5 108,4

126,8 108,4

87,5 142,2

110,7 90,7

NR NR

SKL-148 SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-164 SKL-165 SKL-169 SKL-170

150,4 190,8 132,2 117,4 400,0 179,0 148,9 156,9

134,1 143,6 140,6 138,2 226,4 120,3 168,4 227,5

135,3 102,6 143,9 104,0 98,1 137,1 127,8 117,6

119,0 155,9 165,7 110,1 309,4 111,9 102,3 70,6

NR NR NR NR NR NR NR NR

mdr1a/b (-/-)

Auch in einer Dosierung von 40 mg/kg konnten durch Carbamazepin keine Responder in acht FVB/N-wt- und sieben mdr1a/b(-/-)-Mäusen erzeugt werden, wie Tabelle 13 zeigt. Bei der Behandlung mit Diazepam (Faustan®) in einer Dosierung von 2 mg/kg konnten fünf von zehn FVB/N-wt-Mäusen als Responder eingestuft werden (siehe Tabelle 14). Die Wirkung war insbesondere in den ersten beiden halben Stunden nach der Applikation zu erkennen. Von den neun mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnten ebenfalls fünf als Responder eingestuft werden. In dieser Gruppe zeigte sich die Wirkung in allen vier halben Stunden.

75

Ergebnisse

Tabelle 13 Responder-Selektion: Carbamazepin 40 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-123 SKL-125 SKL-127 SKL-131 FVB/N-wt SKL-133

118,2 165,1 105,6 157,5 116,6

123,4 131,5 155,8 150,8 136,9

114,3 60,4 171,6 111,7 141,2

135,1 128,9 157,1 99,4 118,7

NR NR NR NR NR

SKL-140

95,4

126,0

139,4

72,2

NR

SKL-142 SKL-146

152,6 116,6

160,3 100,2

132,1 100,2

129,5 93,3

NR NR

SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-164 SKL-167 SKL-168

132,4 151,0 117,8 160,9 166,6 89,1 193,2

125,2 158,7 77,8 138,2 211,1 113,2 189,8

125,9 164,4 120,0 109,9 194,1 107,7 185,3

123,1 119,2 188,9 172,2 167,9 91,9 171,8

NR NR NR NR NR NR NR

mdr1a/b (-/-)

Tabelle 14 Responder-Selektion: Diazepam 2 mg/kg (Faustan®)

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N-wt

mdr1a/b (-/-)

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-117 SKL-124 SKL-127 SKL-130 SKL-133

121,6 58,5 22,1 121,5 16,7

150,5 45,3 9,5 35,6 60,6

142,3 34,0 41,1 126,3 81,8

138,1 54,7 61,7 59,9 83,3

NR NR R NR R

SKL-135

4,6

9,2

78,2

48,3

R

SKL-137

12,9

81,7

58,1

58,1

R

SKL-140

186,8

138,0

146,3

132,4

NR

SKL-141 SKL-142

17,1 46,7

19,0 105,0

5,7 93,3

5,7 98,3

R NR

SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

10,5 32,2 0,0 0,0 30,9 51,7 62,1 9,8 16,1

0,0 59,8 3,6 0,0 82,3 156,9 113,0 43,9 8,1

10,5 98,1 7,2 3,5 86,9 147,4 83,5 47,6 10,7

39,8 116,5 0,0 7,0 92,6 179,9 90,6 68,3 13,4

R NR R R NR NR NR R R

76

Ergebnisse

Durch der Erhöhung der Dosierung von Diazepam auf 5 mg/kg zeigten alle zehn untersuchten FVB/N-wt-Mäuse und acht von zehn mdr1a/b(-/-)-Mäusen eine Senkung der Anfallsfrequenz von mindestens 75 % (siehe Tabelle 15). Der Effekt war bei den FVB/N-wt-Mäusen insbesondere in den ersten drei halben Stunden nach der Applikation ausgeprägt. Tabelle 15 Responder Selektion: Diazepam 5 mg/kg (Faustan®)

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N-wt

mdr1a/b (-/-)

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-132 SKL-135

0,0 4,1 12,1 3,8 2,5

17,9 4,1 2,0 21,0 7,6

17,9 12,2 8,1 80,0 27,7

35,8 10,2 66,7 76,2 50,3

R R R R R

SKL-137

0,0

0,0

0,0

0,0

R

SKL-140

0,0

1,7

17,2

49,8

R

SKL-141

2,3

2,3

0,0

0,0

R

SKL-142 SKL-143

0,0 8,9

49,2 3,6

60,3 23,1

8,9 3,6

R R

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-158 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

5,0 0,0 0,0 20,0 2,3 50,4 5,2 46,9 4,2 0,0

23,1 13,3 4,5 42,2 0,0 116,0 103,9 106,3 59,3 6,6

44,6 22,8 4,5 88,9 0,0 95,8 140,3 84,7 0,0 2,2

43,0 22,8 18,0 46,7 0,0 94,1 127,3 79,3 38,1 19,8

R R R R R NR R NR R R

Um mögliche synergistische antikonvulsive Effekte zwischen Diazepam und Ethanol zu untersuchen, wurde Diazepam auch in einer wässrigen Lösung appliziert. Hier konnte von acht Mäusen jedoch nur eine als Responder eingestuft werden (siehe Tabelle 16). Dieser Versuch wurde zu einem späten Zeitpunkt im Verlauf der Studie durchgeführt und konnte dadurch wie bereits erwähnt nur noch mit den verbliebenen FVB/N-wt-Mäusen erfolgen.

77

Ergebnisse

Tabelle 16 Responder-Selektion: Diazepam 5 mg/kg in wässriger Lösung

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-123 SKL-124 SKL-132 SKL-135 FVB/N-wt SKL-141

119,4 106,6 99,0 18,7 68,3

133,0 85,5 74,2 67,5 93,1

146,6 90,7 156,7 49,9 83,2

131,1 83,7 136,1 69,6 52,5

NR NR NR R NR

SKL-142

70,2

71,2

63,4

69,3

NR

SKL-143 SKL-146

121,9 42,2

173,5 25,8

114,7 34,0

90,3 43,4

NR NR

Tabelle 17 zeigt, dass die Applikation von 400 mg/kg Levetiracetam in der Gruppe der sieben ausgewerteten FVB/N-wt-Mäuse zum Auftreten von zwei und in der Gruppe der fünf untersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäuse zum Auftreten eines Responders geführt hat. Die Wirkung trat hierbei in den ersten beiden halben Stunden nach der Applikation auf. Tabelle 17 Responder-Selektion: Levetiracetam 400 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N

Pgp-ko

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

SKL-117 SKL-122 SKL-125 SKL-126 SKL-127 SKL-130 SKL-131

47,46 134,78 3,74 77,36 0,00 66,87 116,52

205,65 145,65 0,00 75,47 73,33 87,54 95,65

SKL-148

125,87

134,27

SKL-151

107,98

120,25

SKL-153

41,60

51,20

SKL-154

46,00

SKL-157

27,41

140,11 104,35 89,72 109,43 113,33 103,34 97,39

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

142,37 143,48 128,97 58,49 96,67 37,69 93,91

NR NR R NR R NR NR

60,14

78,32

NR

142,33

125,15

NR

73,60

64,00

NR

114,00

128,00

108,00

NR

19,94

95,95

77,26

R

Bei der höheren Dosierung von 800 mg/kg Levetiracetam konnten vier Responder bei den acht untersuchten FVB/N-wt-Mäusen und zwei Responder bei den acht beurteilten mdr1a/b(-/-)-Mäusen beobachtet werden (siehe Tabelle 18). Auch hier zeigte sich die Wirkung vor allem in den ersten beiden halben Stunden nach der Behandlung. Eine der mdr1a/b(-/-)-

78

Ergebnisse

Mäuse zeigte jedoch auch eine Reduktion der Anfallsanzahl erst in der vierten halben Stunde nach der Substanzapplikation. Tabelle 18 Responder-Selektion: Levetiracetam 800 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N

Pgp-ko

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-117

5,11

69,79

66,38

83,40

R

SKL-125

135,90

2,56

46,15

69,23

R

SKL-131

50,00

102,78

125,00

141,67

NR

SKL-132

48,40

48,40

71,17

59,79

NR

SKL-133

107,92

72,73

72,73

64,52

NR

SKL-135

7,02

70,18

126,32

189,47

R

SKL-137 SKL-145

0,00 104,00

4,21 88,00

58,95 114,67

84,21 117,33

R NR

SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-164 SKL-167 SKL-168 SKL-169 SKL-170

115,09 67,26 120,00 96,97 90,96 64,00 113,24 117,48

106,67 10,62 104,00 290,91 41,64 97,33 180,82 139,86

68,77 148,67 100,00 157,58 73,42 89,33 146,12 55,94

112,28 116,81 124,00 218,18 78,90 81,33 23,74 142,66

NR R NR NR NR NR R NR

Phenobarbital führte in der Dosierung von 25 mg/kg zum Auftreten von zwei Respondern unter den acht ausgewerteten FVB/N-wt-Mäusen (siehe Tabelle 19). Nur eine der acht untersuchten mdr1a/b(-/-)-Mäuse konnte als Responder eingestuft werden. Die höhere Dosierung von 50 mg/kg zeigte einen deutlich stärkeren Effekt (siehe Tabelle 20). So konnten sieben von acht FVB/N-wt-Mäusen und fünf von acht mdr1a/b(-/-)-Mäusen als Responder eingestuft werden. Die Effekte waren dabei in allen vier halben Stunden nach der Substanzapplikation sichtbar.

79

Ergebnisse

Tabelle 19 Responder-Selektion: Phenobarbital 25 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-124 SKL-125 SKL-127 SKL-135 FVB/N-wt SKL-137

42,9 48,0 17,8 227,3 102,4

55,1 216,0 126,2 33,3 121,7

71,4 160,0 110,2 109,1 115,9

24,5 144,0 119,1 127,3 100,5

R NR R NR NR

SKL-140

121,1

107,0

98,2

112,3

NR

SKL-141 SKL-143

62,2 69,3

145,0 144,0

124,3 88,9

129,1 60,4

NR NR

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-168 SKL-169

27,8 30,8 86,2 81,9 96,6 85,2 110,7 143,8

152,8 105,5 92,7 214,2 142,5 161,7 142,9 89,6

113,9 124,5 81,3 66,1 108,0 142,1 76,8 62,5

8,3 74,7 73,2 207,9 108,0 65,6 100,0 72,9

R NR NR NR NR NR NR NR

mdr1a/b (-/-)

Tabelle 20 Responder-Selektion: Phenobarbital 50 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-124 SKL-125 SKL-127 SKL-130 FVB/N-wt SKL-132

8,2 8,6 11,8 134,1 124,4

43,3 74,9 48,7 110,6 36,6

20,6 87,7 32,5 72,9 2,4

53,6 92,0 69,4 91,8 24,4

R R R NR R

SKL-137

49,0

206,5

5,2

43,9

R

SKL-141 SKL-143

11,4 2,0

94,8 10,1

111,8 120,6

123,2 80,4

R R

SKL-148 SKL-153 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-169

12,7 8,8 6,3 59,5 108,5 99,6 132,8 37,6

0,0 50,0 0,0 16,7 40,7 151,1 116,6 33,8

0,0 94,1 0,0 26,2 0,0 145,8 50,2 56,3

5,4 158,8 0,0 35,7 105,1 145,8 118,1 50,7

R R R R R NR NR NR

mdr1a/b (-/-)

Phenytoin führte nur bei einem Tier in der Gruppe der acht untersuchten FVB/N-wt-Mäuse zu einer Anfallsreduktion um mindestens 75 % im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung 80

Ergebnisse

(siehe Tabelle 21). Der Effekt trat in den ersten beiden halben Stunden nach der Arzneimittelapplikation auf. Keine der acht beurteilten mdr1a/b(-/-)-Mäuse konnte als Responder eingestuft werden. Tabelle 21 Responder-Selektion: Phenytoin 20 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-133 FVB/N-wt SKL-135

48,5 122,4 211,8 70,7 7,5

101,8 167,3 94,1 165,9 3,7

123,6 140,8 194,1 192,7 63,6

109,1 146,9 194,1 161,0 48,6

NR NR NR NR R

SKL-137

148,2

141,2

160,0

136,5

NR

SKL-141 SKL-142

68,2 69,4

107,6 147,1

166,8 128,9

129,1 114,0

NR NR

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168

99,6 218,2 159,6 159,4 125,5 104,7 94,03 110,50

85,3 203,6 166,7 260,9 205,5 131,3 147,76 154,70

115,6 207,3 164,9 246,4 183,6 75,0 117,91 119,34

120,9 254,5 112,3 200,0 189,1 73,4 94,03 119,34

NR NR NR NR NR NR NR NR

mdr1a/b (-/-)

Unter der Behandlung mit Valproat konnten eine von acht FVB/N-wt- und zwei von acht mdr1a/b(-/-)-Mäusen als Responder definiert werden (siehe Tabelle 22). Die Anfallsreduktion trat bei allen Mäusen nur in der ersten Stunde nach der Applikation auf.

81

Ergebnisse

Tabelle 22 Responder-Selektion: Valproat 300 mg/kg

Tiergruppe

Maus-Nr.

Anfälle nach Behandlung [%] bezogen auf MW vor Behandlung 0 - 0,5 h

FVB/N

Pgp-ko

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

Responder/ Nonresponder (R/NR)

SKL-117 SKL-125 SKL-127 SKL-131 SKL-133 SKL-137 SKL-140 SKL-142

113,16 120,78 10,69 60,00 30,67 34,00 141,18 76,77

236,84 125,49 91,60 100,00 109,33 108,00 91,76 118,52

155,26 120,78 116,03 134,29 102,67 168,00 77,65 109,09

86,84 144,31 111,45 102,86 96,00 146,00 134,12 105,05

NR NR R NR NR NR NR NR

SKL-148

16,61

8,30

52,60

85,81

R

SKL-151

78,23

95,94

94,46

101,85

NR

SKL-153

33,85

144,62

113,85

52,31

NR

SKL-154

86,02

55,91

90,32

146,24

NR

SKL-157

71,83

118,31

92,96

83,10

NR

SKL-164

24,62

107,69

141,54

144,62

R

SKL-168

107,12

145,08

105,76

119,32

NR

SKL-170

31,68

102,97

134,65

132,67

NR

Zusammenfassend zeigt Tabelle 23, dass nur bei den Behandlungen mit 30-prozentigem Polyethylenglycol, dem ethanolhaltigen Diazepam-Vehikel und beiden verwendeten Dosierungen von Carbamazepin keine Responder gefunden werden konnten. Alle anderen Substanzen führten zum Auftreten von Respondern, jedoch meist nur in geringer Anzahl. Nur nach den Applikationen von Diazepam in beiden Dosierungen, Phenobarbital in einer Dosierung von 50 mg/kg und Levetiracetam in einer Dosierung von 800 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen konnten mindestens 50 % der Tiere als Responder definiert werden.

82

Ergebnisse

Tabelle 23 Übersicht Responder-Nonresponder-Selektion Substanz

0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h 0

0

0

0

Pgp-ko

0

0

0

0

FVB/N

0

0

0

0

Pgp-ko

0

0

0

0

Diazepam 2 mg/kg (Faustan®)

FVB/N

5

3

1

1

Pgp-ko

5

4

4

3

Diazepam 5 mg/kg (Faustan®)

FVB/N

10

9

7

5

Pgp-ko

8

5

5

4

Diazepam 5 mg/kg in wässriger Lösung

FVB/N

1

0

0

0

Pgp-ko









FVB/N

2

1

0

0

Pgp-ko

0

1

0

0

FVB/N

3

2

0

0

Pgp-ko

0

1

0

1

FVB/N

1

0

0

1

Pgp-ko

0

0

0

1

FVB/N

5

1

3

1

Pgp-ko

3

3

3

2

FVB/N

1

1

0

0

Pgp-ko

0

0

0

0

FVB/N

1

0

0

0

Pgp-ko

2

1

0

0

Isotonische Natriumchloridlösung

FVB/N

1

0

0

1

Pgp-ko

0

0

0

0

Diazepam-Vehikel: enthält 0,19 % Ethanol

FVB/N

0

0

0

0

Pgp-ko









30-prozentiges Polyethylenglycol 400

FVB/N

0

0

0

0

Pgp-ko

0

0

0

0

Carbamazepin 40 mg/kg

Antiepileptika

# Responder: 75 % Anfallsreduktion

FVB/N

Carbamazepin 20 mg/kg

Levetiracetam 400 mg/kg Levetiracetam 800 mg/kg Phenobarbital 25 mg/kg Phenobarbital 50 mg/kg Phenytoin 20 mg/kg Valproat 300 mg/kg

Vehikel

Tiergruppe

gesamt

0 0 0 0 5 5 10 8 1 — 2 1 4 2 2 1 7 5 1 0 1 2 2 0 0 — 0 0

n 8 8 8 7 10 9 10 10 8 — 7 5 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 14 12 8 — 7 5

Tabelle 24 zeigt den Responderstatus aller Tiere und Substanzen. Daran wird deutlich, dass keine „generellen Responder“ auftraten, die auf alle oder die meisten Behandlungen ansprechen. Ob es Tiere gibt, die generell auf gar keine Behandlung ansprechen, lässt sich bisher nicht abschließend beurteilen.

83

Ergebnisse

Tabelle 24 Responderstatus aller Tiere und Substanzen CBZ: Carbamazepin, DZP (F): Diazepam (Faustan®), DZP (W): Diazepam in wässriger Lösung, DZPVeh.: Diazepam-Vehikel, LEV: Levetiracetam, NaCl: isotonische Natriumchloridlösung, PB: Phenobarbital, PEG 400: Polyethylenglycol 400, PHT:Phenytoin, VPA: Valproat Ø: Nonresponder, : Responder, x: Tier wurde nicht behandelt

SKL-122

Ø

SKL-123



Ø

SKL-125

Ø

Ø

Ø Ø Ø

Ø

FVB/N

SKL-130 SKL-131 SKL-132 SKL-133

SKL-140 SKL-141

Ø Ø Ø

Ø Ø

SKL-142

   Ø  Ø

SKL-143 SKL-145

SKL-151

Ø Ø

SKL-153 SKL-154 mdr1a/b(-/-)

SKL-157

Ø Ø

SKL-161 SKL-165 SKL-168 SKL-169 SKL-170

Ø 

Ø Ø



Ø Ø Ø  

Ø Ø Ø

Ø

Ø

Ø



 Ø

Ø Ø



Ø Ø

PEG 400

NaCl

 

DZP-Veh.

VPA 300 mg

PHT 20 mg

PB 50 mg

PB 25 mg

 Ø

Ø Ø

Ø  Ø Ø Ø Ø Ø

 Ø 

     Ø

Ø Ø Ø Ø 

Ø Ø Ø

SKL-167

Ø

 

Ø  Ø Ø Ø

Ø Ø Ø Ø



Ø

 Ø

SKL-159

Ø Ø

Ø

Ø Ø Ø Ø Ø  Ø Ø

Ø

Ø Ø Ø

Ø Ø

Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø Ø

Ø

Ø

Ø

Ø Ø Ø Ø

Ø Ø Ø Ø Ø Ø

SKL-158

SKL-164

     

Vehikel



Ø

SKL-146 SKL-148

  

Ø

SKL-135 SKL-137

 Ø



 Ø  Ø Ø

SKL-126 SKL-127

Ø Ø Ø Ø

Ø

SKL-124

LEV 800 mg

Ø

SKL-117

LEV 400 mg

DZP (W) 5 mg

DZP (F) 5 mg

DZP (F) 2 mg

CBZ 40 mg

Maus-Nr.

CBZ 20 mg

Antiepileptika

Ø  Ø

 Ø

 Ø Ø

  

Ø Ø

Ø Ø

 Ø

Ø Ø 

Ø Ø Ø  

 Ø  

Ø Ø Ø  Ø

84

 Ø Ø Ø Ø

Ø Ø

Ø

Ø Ø Ø

Ø

Ø Ø

Ø Ø Ø Ø Ø

Ø Ø Ø Ø

Ergebnisse

5.6 Sucrose-Preference-Test Zur Untersuchung einer Depressions-assoziierten Anhedonie wurde in dieser Studie der Sucrose-Preference-Test eingesetzt. Der Test wurde im Verlauf der Studie mehrfach durchgeführt. Dabei wurde bei jedem Durchlauf zunächst der basale Wasserkonsum der Tiere ermittelt, während beide Flaschen am Käfig mit Wasser gefüllt waren. Abbildung 34 zeigt den Wasserkonsum der Mäuse an den fünf untersuchten Zeitpunkten. Dabei fällt auf, dass der Wasserkonsum der epileptischen mdr1a/b(-/-)-Mäuse sechs und 13 bzw. 15 Wochen nach der Induktion des Status epilepticus signifikant erhöht war im Vergleich zu beiden Gruppen der FVB/N-wt-Mäuse. Im späteren Verlauf der Studie konnten keine Unterschiede im Wasserkonsum zwischen den Tiergruppen gefunden werden. Die Mäuse konsumierten zwischen 4,14 ± 0,84 g und 6,71 ± 1,00 g Wasser in 24 Stunden. 10

Konsum [g]

8 6

* *

* *

4 2 0

6 Wochen

13/15 Wochen

23/26 Wochen

24/27 Wochen

40 Wochen

Zeit nach Status epilepticus

FVB/N-wt Kontrollen (n = 9 - 10)

mdr1a/b(-/-) Kontrollen (n = 6)

FVB/N-wt epileptisch (n = 17 - 20)

mdr1a/b(-/-) epileptisch (n = 8 - 15)

Abbildung 34 Verlauf des Wasserkonsums Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede (One way ANOVA (p = 0,0009 für 6 Wochen, p = 0,0004 für 13/15 Wochen, p = 0,8360 für 23/26 Wochen, p = 0,0973 für 24/27 Wochen, p = 0,7034 für 40 Wochen) + Bonferroni-Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)).

Das Körpergewicht der Mäuse wurde ebenfalls bei jedem Durchlauf des Sucrose-PreferenceTests bestimmt. Abbildung 35 zeigt, dass zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede im Körpergewicht zwischen den vier Tiergruppen ermittelt werden konnten.

85

Ergebnisse

Körpergewicht [g]

40 30 20 10 0

6 Wochen

13/15 Wochen

23/26 Wochen

24/27 Wochen

40 Wochen

Zeit nach Status epilepticus FVB/N-wt Kontrollen (n = 9 - 10)

mdr1a/b(-/-) Kontrollen (n = 6)

FVB/N-wt epileptisch (n = 17 - 20)

mdr1a/b(-/-) epileptisch (n = 8 - 15)

Abbildung 35 Verlauf des Körpergewichts Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede (Kruskal-Wallis Test (p = 0,6104 für 6 Wochen, p = 0,0791 für 13/15 Wochen, p = 0,7774 für 23/26 Wochen, p = 0,3503 für 24/27 Wochen, p = 0,0938 für 40 Wochen) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)).

Der Saccharosekonsum wurde jeweils zweimal pro Durchlauf ermittelt, um den möglichen Einfluss einer Seitenpräferenz der Tiere auszuschließen. Daher befand sich die mit Saccharoselösung gefüllte Flasche einmal auf der linken und einmal auf der rechten Käfigseite. Die jeweils andere Flasche war mit Wasser gefüllt. Zur Beurteilung des Konsums wurde jeweils der Mittelwert des Saccharose- und des Wasserkonsums aus beiden Tagen berechnet. Abbildung 36 zeigt die Ergebnisse des ersten Durchlaufs des Sucrose-Preference-Test sechs Wochen nach der Induktion des Status epilepticus. Es wird deutlich, dass alle Mäuse die Saccharoselösung dem Wasser deutlich vorgezogen haben. Es trat jedoch ein signifikanter Unterschied in der konsumierten Menge der Saccharoselösung zwischen den epileptischen Tieren und den Kontrolltieren sowohl in der Gruppe der FVB/N-wt-Mäuse als auch in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse auf. Insbesondere die Kontrolltiere zeigten dabei eine starke Erhöhung der Gesamtflüssigkeitsaufnahme im Vergleich zum basalen Wasserkonsum auf 28,48 g ± 6,09 bei den FVB/N-wt-Mäusen und 28,87 g ± 5,95 bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen, sodass die Tiere innerhalb von 24 Stunden teilweise mehr als ihr eigenes Körpergewicht an Saccharoselösung konsumierten. Diese Steigerung des Gesamtkonsums war bei den epileptischen Tieren gerin-

86

Ergebnisse

ger ausgeprägt, sodass die Gesamtflüssigkeitsaufnahme bei 10,82 g ± 6,16 bei den FVB/N-wtMäusen und bei 11,17 g ± 5,52 bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen lag.

1. Durchlauf

Konsum [g]

40

*

*

30 20 10 0

FVB/N-wt Kontrolle

FVB/N-wt epileptisch

mdr1a/b (-/-) Kontrolle

mdr1a/b (-/-) epileptisch

FVB/N-wt Kontrollen (n = 10)

mdr1a/b(-/-) Kontrollen (n = 6)

FVB/N-wt epileptisch (n = 20)

mdr1a/b(-/-) epileptisch (n = 15)

Abbildung 36 Saccharose-Präferenz im Sucrose-Preference-Test Der erste Durchlauf fand sechs Wochen nach der Induktion des Status epilepticus statt. Weiß bzw. gelb ist der Saccharosekonsum (4 %) dargestellt, blau bzw. grün jeweils der Wasserkonsum. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung. Sternchen markieren signifikante Unterschiede (KruskalWallis-Test (p < 0,0001) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)).

Da alle vier Gruppen stets eine deutliche Präferenz für die Saccharoselösung gezeigt haben, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit aus Übersichtsgründen auf die Darstellung des Wasserkonsums, der gleichzeitig zum Saccharosekonsum ermittelt wurde, verzichtet. Abbildung 37 zeigt, dass der Unterschied zwischen den epileptischen Tieren und den Kontrolltieren im Verlauf der gesamten Studie im Zeitraum von sechs Wochen bis 40 Wochen nach der Induktion des Status epilepticus erhalten blieb. In der 23. bzw. 26. Woche nach der Induktion des Status epilepticus wurde der Sucrose-Preference-Test mit einer geringeren Saccharosekonzentration von 1 % durchgeführt, um festzustellen, ob die Konzentration einen Einfluss auf den Konsum hat. Auch bei dieser Konzentration konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den Kontrolltieren und den epileptischen Tieren in beiden Gruppen ermittelt

87

Ergebnisse

werden. Die Flüssigkeitsaufnahme war jedoch deutlich geringer als bei der höheren Konzentration.

50

Konsum [g]

40

*

*

*

*

*

*

* *

30 20

*

*

10 0

6 Wochen 4%

13/15 Wochen 4%

23/26 Wochen 1%

24/27 Wochen 4%

40 Wochen 4%

Zeit nach Status epilepticus FVB/N-wt Kontrollen (n = 8 - 10)

mdr1a/b(-/-) Kontrollen (n = 6)

FVB/N-wt epileptisch (n = 15 - 20)

mdr1a/b(-/-) epileptisch (n = 8 - 15)

Abbildung 37 Verlauf des Saccharose-Konsums Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung des Saccharosekonsums innerhalb von 24 Stunden. Sternchen markieren signifikante Unterschiede (Kruskal-Wallis Test (p < 0,0001 für alle Zeitpunkte) + Dunn’s posthoc Test für ausgewählte Paare (p ≤ 0,05)).

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Diskussion

6 Diskussion Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Epilepsiemodells, das auf der einen Seite geeignet ist, Resistenzmechanismen zu untersuchen und so die Ursachen von Pharmakoresistenz besser zu verstehen, und das auf der anderen Seite ermöglicht, neue Therapieoptionen und Arzneimittel speziell für pharmakoresistente Patienten zu entwickeln. Dabei sollte es sich im Idealfall um ein chronisches Modell handeln, das eine hohe Anfallsfrequenz aufweist und eine Subgruppen-Unterteilung in Responder und Nonresponder ermöglicht. Aufgrund der genannten Anforderungen wurde in dieser Arbeit das fokale Kainat-Modell in der Maus gewählt, da in diesem Modell bereits die gewünschte hohe Anfallsfrequenz und eine Resistenz gegen verschiedene Antiepileptika nachgewiesen wurden (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ROUCARD et al., 2010; MAROSO et al., 2011). Eine Einteilung in Responder und Nonresponder wurde in diesem Modell bisher in keiner Studie vorgenommen.

6.1 Das fokale Kainat-Modell als Screening-Modell Bei der Entwicklung neuer Antiepileptika sollen möglichst viele Substanzen auf ihre antikonvulsive Wirkung hin untersucht werden. Um dies zu ermöglichen, müssen Modelle kostengünstig und schnell anwendbar sein (STABLES et al., 2002; LÖSCHER, 2011). Der Maximal-Electroshock-Seizure-Test und das subcutane Pentylentetrazol-Modell erfüllen zwar diese Voraussetzungen und sind daher die in der Arzneimittelentwicklung am häufigsten verwendeten Modelle, aber ihr Einsatz hat bisher nicht zu wesentlichen Fortschritten in der Behandlung pharmakoresistenter Patienten geführt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass wirksame Therapieoptionen durch die einseitige Fokussierung auf diese akuten Anfallsmodelle übersehen wurden (STABLES et al., 2002). Das fokale Kainat-Modell in der Maus ist im Gegensatz zu den beiden genannten Modellen ein chronisches Epilepsiemodell. Es muss in einer stereotaktischen Operation ein Status epilepticus ausgelöst werden, damit die Tiere mehrere Wochen später spontane fokale Anfälle im EEG zeigen (RIBAN et al., 2002; ROUCARD et al., 2010). Die Untersuchung von Wirkstoffen zur symptomatischen Therapie von Anfällen kann erst in dieser chronischen Phase erfolgen. Dies bedeutet, dass im Vergleich zu klassisch in der Arzneimittelentwicklung angewendeten Anfallsmodellen ein relativ großer Arbeits- und Zeitaufwand erforderlich ist, bevor Untersuchungen beginnen können. Zeigen die Tiere jedoch eine chronische Epilepsie, ist die

89

Diskussion

beobachtete Frequenz fokaler Anfälle der Literatur zufolge sehr hoch, sodass eine zügige Untersuchung vieler Substanzen möglich erscheint (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ARABADZISZ et al., 2005; ROUCARD et al., 2010). Daraus ergab sich die zu testende Hypothese, dass das fokale Kainat-Modell in der chronisch epileptischen Phase als ScreeeningModell für die Beurteilung antikonvulsiver Effekte unter akuter Behandlung geeignet ist. In dieser Studie konnte eine hohe basale Anfallsfrequenz bestätigt werden (siehe Kapitel 5.1 S. 45). Der Mittelwert der Anfallsanzahl betrug im zeitlichen Verlauf von 12 Stunden in einer Gruppe von sechs Mäusen mindestens 42 ± 17 Anfälle in einer halben Stunde. Diese Daten stimmen mit den Ergebnissen anderer Studien überein (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ARABADZISZ et al., 2005; ROUCARD et al., 2010). Durch diese hohe Anfallsfrequenz war es in der vorliegenden Studie möglich, Effekte einer einmaligen akuten Behandlung zu beurteilen. So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit dem verdünnten, ethanolhaltigen Diazepam-Präparat Faustan® in einer Dosierung von 5 mg/kg eine deutliche Senkung der Anfallsanzahl über mindestens zwei Stunden nach der Behandlung bewirkte. In der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse konnte eine Senkung der Anfallsfrequenz durch das ethanolhaltige Diazepam-Präparat Faustan® auch bereits in einer Dosierung von 2 mg/kg nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung zeigte sich eine antikonvulsive Wirkung von Levetiracetam in einer Dosierung von 800 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen und von Phenobarbital in einer Dosierung von 50 mg/kg bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen. ROUCARD et al. (2010) konnten ebenfalls eine Reduzierung der kumulativen Anfallsdauer im fokalen Kainat-Modell durch Vigabatrin (50 und 100 mg/kg), Levetiracetam (400 mg/kg leichte Reduktion, 800 und 1000 mg/kg deutliche Reduktion), Pregabalin (50 und 100 mg/kg) und Diazepam (1, 2 und 3 mg/kg) belegen. Außerdem zeigten sie, dass Diazepam in einer Dosierung von 4 mg/kg pro Tag eine deutliche Senkung der Anfallsfrequenz über vier Tage bewirken konnte, bevor eine Toleranzentwicklung beobachtet wurde. Auch für die chronische Applikation von Levetiracetam zeigten ROUCARD et al. (2010) eine Reduktion der Anfallsanzahl, die jedoch ebenfalls nur über zwei Tage bestehen blieb. RIBAN et al. (2002) wiesen gleichfalls eine antikonvulsive Wirksamkeit von Diazepam von mindestens 40 Minuten Dauer im fokalen Kainat-Modell in der Maus nach. In der hier vorliegenden Studie wurden außerdem prokonvulsive Effekte durch Carbamazepin und durch Phenytoin induziert. Über prokonvulsive Wirkungen wurde für diese beiden Antiepileptika schon mehrfach sowohl im Tiermodell als auch bei humanen Epilepsiepatienten berichtet (PERUCCA et al., 1998; GENTON, 2000; HOLTKAMP, 2002; RIBAN et al., 2002; YAMAMURA et al., 90

Diskussion

2009). Im Gegensatz zu den hier vorliegenden Ergebnissen konnten ROUCARD et al. (2010) mit Carbamazepin in einer Dosierung von 100 mg/kg einen deutlichen antikonvulsiven Effekt erzielen, der jedoch mit Nebenwirkungen einherging. Die klinische Relevanz des Modells ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. In der hier vorliegenden Studie konnten keine Verhaltenskorrelate oder motorische Störungen festgestellt werden, welche die als fokale Anfälle definierten Veränderungen im EEG begleiteten. Daher kann nicht mit Sicherheit davon ausgegangen werden, dass eine Therapie der EEGVeränderungen eine gute Voraussagekraft für klinisch sichtbare Anfälle der Epilepsie bei humanen Patienten aufweist. Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass die in dieser Studie angewandte Videoanalyse die Beurteilung kleinerer Veränderungen (wie beispielsweise stereotypes Kauen) aufgrund einer ungenügenden Bildqualität nicht ermöglicht. Eine genauere Analyse möglicher Verhaltensauffälligkeiten sollte daher in weiteren Studien durchgeführt werden. Zusammenfassend ist es möglich, sowohl antikonvulsive als auch prokonvulsive Effekte von Wirkstoffen in diesem Modell nach einer einzelnen akuten Behandlung zu beurteilen und daher in der chronischen Phase der Epilepsie viele Substanzen innerhalb relativ kurzer Zeit zu prüfen. Die zu untersuchende Hypothese konnte demnach bestätigt werden, auch wenn das fokale Kainat-Modell im Vergleich zu den bisher verwendeten akuten Anfallsmodellen mehr Aufwand erfordert. Im Gegenzug kommt es jedoch dem menschlichen Krankheitsbild aufgrund seiner Chronizität deutlich näher. Im Vergleich zu anderen chronischen Epilepsiemodellen, die für den Einsatz in der Arzneimittelentwicklung aufgrund des sehr hohen Untersuchungsaufwands ungeeignet sind, ist der Arbeits- und Zeitaufwand erheblich reduziert.

6.2 Pharmakoresistenz im Kainat-Modell Pharmakoresistenz stellt ein großes Problem insbesondere in der Behandlung von Patienten mit Temporallappenepilepsie dar, welches im Tiermodell eingehender untersucht werden sollte. Aus den bisher publizierten negativen Ergebnissen zur Wirksamkeit von Antiepileptika im fokalen Kainat-Modell in der Maus ergab sich die Hypothese, dass in diesem Modell Resistenzen gegenüber Antiepileptika verschiedener Wirkmechanismen nachgewiesen werden können und es somit zur Untersuchung von Resistenzmechanismen geeignet ist.

91

Diskussion

Um sicherzustellen, dass keine auftretenden Effekte übersehen werden, wurden in der vorliegenden Studie zwei verschiedene Auswertungsansätze genutzt. So wurden die Anfallsanzahlen pro halbe Stunde nach der Behandlung auf der einen Seite mit dem Mittelwert der Anfallsanzahl aus den vier halben Stunden vor der jeweiligen Behandlung verglichen. Auf der anderen Seite erfolgte ein Vergleich mit der Behandlung mit einer Vehikelsubstanz im jeweils gleichen Zeitfenster nach der Behandlung. Mehrfach wurden Effekte nur in einer der beiden Auswertungen sichtbar. Beispielsweise konnten antikonvulsive Effekte auch gut im Vergleich zur Vehikelkontrolle nachgewiesen werden, während prokonvulsive Effekte nur im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung signifikante Unterschiede zeigten. Im Einklang mit der zu untersuchenden Hypothese konnte in der vorliegenden Arbeit keine Wirksamkeit mehrerer Antiepileptika nachgewiesen werden: Durch eine Behandlung mit Phenobarbital wurden in einer Dosierung von 25 mg/kg in beiden Tiergruppen und in einer Dosierung von 50 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen keine signifikanten Unterschiede der Anfallsfrequenz erzielt. Auch für Levetiracetam konnte keine signifikante Veränderung der Anfallsanzahl in einer Dosierung von 400 mg/kg und bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen auch in einer Dosierung von 800 mg/kg gefunden werden. Valproat zeigte in einer Dosierung von 300 mg/kg ebenfalls keine signifikante Beeinflussung der Anfallsfrequenz. Diesem negativen Ergebnis können jedoch verschiedene Ursachen zugrunde liegen. Zum einen kann tatsächlich eine Pharmakoresistenz vorliegen. So konnten auch RIBAN et al. (2002) keine Wirksamkeit von Carbamazepin, Phenytoin und Valproat nachweisen. Umgekehrt gelang es ROUCARD et al. (2010), durch die Untersuchung steigender Dosierungen mit Carbamazepin in einer Dosierung von 100 mg/kg und mit Valproat in einer Dosierung von 400 mg/kg eine antikonvulsive Wirkung zu erzielen. Diese Dosierungen waren jedoch so hoch gewählt, dass bereits starke Nebenwirkungen auftraten. Da bei der Behandlung von Patienten eine Anfallsfreiheit ohne deutliche Nebenwirkungen erreicht werden muss, um die Lebensqualität nachhaltig zu verbessern, kann dieses Ergebnis daher dennoch als Resistenz interpretiert werden. Auch Lamotrigin zeigte in der Studie von ROUCARD et al. (2010) bei einer antikonvulsiv wirksamen Dosierung von 90 mg/kg bereits deutliche Nebenwirkungen. Für Levetiracetam jedoch haben ROUCARD et al. (2010) schon mit der in der vorliegenden Studie genutzten niedrigen Dosierung von 400 mg/kg eine antikonvulsive Wirkung gefunden. Daher müssen noch weitere mögliche Ursachen für die in der hier angefertigten Studie fehlende Wirksamkeit diskutiert werden.

92

Diskussion

Die Wahl der richtigen Dosierung ist selbstverständlich von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung antikonvulsiver Effekte. Da pharmakologische Studien im fokalen KainatModell in der Maus bisher nur in geringem Umfang vorliegen, wurden die Dosierungen für diese Studie teilweise entsprechend ihrer in anderen Modellen festgestellten Wirksamkeit gewählt. So zeigten CITRARO et al. (2011) in C57BL/6-Mäusen, dass Carbamazepin im chronischen Pilocarpin-Modell die Anzahl und die Dauer spontaner Anfälle in einer Dosierung von 20 mg/kg senken kann. Im Maximal-Electroshock-Seizure-Test wurde in verschiedenen Untersuchungen eine bei 50 % der Tiere effektive Dosis (ED50) zwischen 9,7 und 14,8 mg/kg belegt (KOROLKIEWICZ et al., 1996; KOROLKIEWICZ et al., 1998; BOROWICZ et al., 2002; BOROWICZ et al., 2006; CZUCZWAR et al., 2011; LUKAWSKI et al., 2012). Da ROUCARD et al. (2010) eine Wirksamkeit von Diazepam im fokalen Kainat-Modell bereits für Dosierungen ab 1 mg/kg nachweisen konnten und auch RIBAN et al. (2002) eine deutliche antikonvulsive Wirkung bereits durch eine Dosierung von 2,5 mg/kg erreichten, wurde in der vorliegenden Studie zunächst eine Dosierung von 2 mg/kg gewählt. Da mit dieser Dosierung nur eine schwache Wirkung erreicht werden konnte, wurde sie anschließend auf 5 mg/kg erhöht. Für Levetiracetam wurden die Dosierungen entsprechend den Ergebnissen von ROUCARD et al. (2010) verwendet, die ab 400 mg/kg eine antikonvulsive Wirksamkeit feststellen konnten. Auch im 6-Hz-Modell ab Mäusen konnte ein Effekt von Levetiracetam in Dosierungen von 17 und 170 mg/kg nachgewiesen (KAMINSKI et al., 2009). BARTON et al. (2001) untersuchten ebenfalls im 6-Hz-Modell den Einsatz verschiedener Stromstärken und konnten für Levetiracetam bei 22 mA eine ED50 von 4,6 mg/kg, bei 32 mA eine ED50 von 19,4 mg/kg und bei 44 mA eine ED50 von 1089 mg/kg belegen. Bei dem Einsatz von 44 mA konnte außer Levetiracetam nur Valproat eine vollständige Unterdrückung der Anfälle erreichen. Daher gilt auch dieses Modell als besonders resistent und erscheint folglich geeignet, um bessere Behandlungsstrategien für pharmakoresistente Patienten zu entwickeln. Die in verschiedenen Untersuchungen ermittelte ED50 für Phenobarbital lag im MaximalElectroshock-Seizure-Test zwischen 13,9 und 23,5 mg/kg (BOROWICZ et al., 2002; BOROWICZ et al., 2006; LUSZCZKI et al., 2006; CZUCZWAR et al., 2011; LUKAWSKI et al., 2012). Die für diese Studie gewählte niedrige Dosierung von 25 mg/kg lag damit bereits leicht über den wirksamen Dosierungen im Maximal-Electroshock-Seizure-Test. 93

Diskussion

Phenytoin zeigte in diesem Test eine ED50 zwischen 5,6 und 12,1 mg/kg (LUSZCZKI et al., 2006; ROWLEY & WHITE, 2010; CZUCZWAR et al., 2011; LUKAWSKI et al., 2012). RIBAN et al. (2002) konnten jedoch in Swiss Mäusen im fokalen Kainat-Modell keine Wirksamkeit von Phenytoin in Dosierungen von 25 und 50 mg/kg nachweisen. Dennoch wurde für die vorliegende Arbeit zunächst eine Dosierung von 20 mg/kg gewählt, die die wirksamen Dosierungen im Maximal-Electroshock-Seizure-Test bereits übersteigt. Auch die Wirksamkeit von Valproat wurde bereits mehrfach im Maximal-ElectroshockSeizure-Test überprüft. Dabei lag die ED50 zwischen 178 und 249,2 mg/kg (LÖSCHER et al., 1999; BOROWICZ et al., 2006; LUSZCZKI et al., 2006; LUKAWSKI et al., 2012). ROWLEY & WHITE (2010) untersuchten Valproat außerdem im Cornea Kindling- und im 6 HzModell sowie im Maximal-Electroshock-Seizure-Test und im subcutanen PentylentetrazolTest und fanden in diesen Modellen eine ED50 zwischen 105 und 228 mg/kg. Da es sich bei dem fokalen Kainat-Modell vermutlich um ein sehr resistentes Modell handelt, wurde die Dosierung für die hier durchgeführten Versuche für Valproat ebenfalls ein wenig höher gewählt. Zusammenfassend kann man also sagen, dass die in dieser Studie verwendeten Dosierungen durchaus in der Lage sind, antikonvulsive Effekte bei Mäusen in verschiedenen Modellen zu erreichen. Von einer generell zu niedrigen Dosierung ist daher nicht auszugehen. Bei der Betrachtung der Untersuchungsergebnisse folgender Wirkstoffe erscheint die Anfallsfrequenz nach der Behandlung erniedrigt, was jedoch nicht mit einem statistischen Signifikanzniveau von 5 % bestätigt werden konnte: 

Diazepam in einer Dosierung von 2 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen,



Levetiracetam in einer Dosierung von 400 mg/kg,



Phenobarbital in einer Dosierung von 50 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen,



Valproat in einer Dosierung von 300 mg/kg.

Da geringe Effekte in der statistischen Schwankung leicht untergehen können und gleichzeitig Anzeichen für Effekte durchaus vorhanden sind, muss erwogen werden, die Aussagekraft der Studie durch eine größere Anzahl untersuchter Mäuse deutlich zu verbessern. Insbesondere bei der Applikation von Phenobarbital in der Dosierung von 50 mg/kg konnten bei der Mehrzahl der einzelnen Mäuse starke antikonvulsive Effekte nachgewiesen werden, die jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Applikation auftraten (siehe Kapitel 6.4 S. 98). Da diese sich also zeitlich nur teilweise überlagern, tritt die Wirkung in der Gruppe nicht so deut-

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Diskussion

lich zu Tage. Es ist jedoch zu vermuten, dass bei einer ausreichend großen Anzahl untersuchter Tiere der antikonvulsive Effekt in der gesamten Tiergruppe ebenfalls mit einem Signifikanzniveau von 5 % bestätigt werden könnte. Insbesondere bei Substanzenapplikationen, deren Ergebnisse den Anschein erwecken, dass eine antikonvulsive Wirkung vorliegen könnte, obwohl diese bisher nicht statistisch abgesichert werden konnte, muss auch diskutiert werden, dass auftretende Fehlinjektionen in den Darm zu einer verminderten Wirksamkeit bei einzelnen Tieren geführt haben können (HACK et al., 2010). Eine Injektion in den Darm führt im Vergleich zu einer intraperitonealen Injektion zu einer verlangsamten Resorption. Dadurch steigt der Plasmaspiegel langsamer an und Resorption und Elimination überlagern sich stärker. Zusätzlich vermindert der First-PassEffekt in der Leber bei einer Resorption aus dem Darm die Bioverfügbarkeit der Substanz. So wäre es möglich, dass wirksame Plasmakonzentrationen gar nicht erreicht werden. Treten bei einzelnen Tieren solche Fehlinjektionen auf, wirkt sich dies natürlich auf die Auswertung relativ kleiner Tiergruppen deutlich aus. Bei Mäusen ist es jedoch aufgrund ihrer geringen Körpergröße und des damit verbundenen geringen Blutvolumens nicht möglich, die Plasmakonzentrationen bei mehreren aufeinander folgenden Untersuchungen jeweils durch eine Blutprobe zu kontrollieren. Da Fehlinjektionen jedoch nur in geringerem Umfang auftreten, können ihre Auswirkungen ebenfalls durch die Erhöhung der Anzahl untersuchter Mäuse eingeschränkt werden. Des Weiteren kann zum Teil ein Einfluss ebenfalls auftretender generalisierter Anfälle auf die Frequenz fokaler Anfälle nur schwer ausgeschlossen werden. So wurde in dieser Studie mehrfach beobachtet, dass die Frequenz fokaler Anfälle nach dem Auftreten eines generalisierten Anfalls gesenkt wurde. Es zeigten sich beispielsweise bei einem Tier in der halben Stunde vor einem generalisierten Anfall 84 fokale Anfälle und in der halben Stunde danach nur noch 9 fokale Anfälle (siehe Kapitel 5.1 S. 45). Ein solcher Effekt trat aber nicht nach jedem generalisierten Anfall auf. So zeigte ein anderes Tier vor einem generalisierten Anfall 97 und nach dem generalisierten Anfall 93 fokale Anfälle. Und es konnte ebenfalls der umgekehrte Effekt, also eine Steigerung der Anfallsanzahl, beobachtet werden. So wurden bei einem weiteren Tier vor einem generalisierten Anfall 67 und danach 100 fokale Anfälle gezählt. Treten jedoch gleichgerichtete Effekte infolge von generalisierten Anfällen bei mehreren Tieren vor der Applikation der zu untersuchenden Substanz auf, kann die basale Anfallsfrequenz verändert sein. Dadurch können mögliche Substanzeffekte kaschiert werden.

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Diskussion

Eine systematische Beurteilung des Einflusses generalisierter Anfälle war bisher jedoch nicht möglich, da in den jeweiligen Untersuchungszeiträumen nur vereinzelte generalisierte Anfälle auftraten. Im Verlauf der Studie nahm die Anzahl der beobachteten generalisierten Anfälle zwar in geringem Maße zu, ob dies jedoch ein zufälliger Befund ist oder aber eine Progression der Epilepsie beschreibt, kann nicht beurteilt werden, da die Tiere nicht dauerhaft überwacht wurden und die kurzen untersuchten Zeitabschnitte nicht für eine statistische Beurteilung der Anzahl generalisierter Anfälle ausreichen. Treten mehrere generalisierte Anfälle hintereinander auf, ist eine Beurteilung des Effekts eines einzelnen Anfalls ebenfalls nicht möglich. Dabei muss außerdem erwähnt werden, dass auch ein Auftreten generalisierter Anfälle kurz vor dem ausgewerteten Zeitraum möglicherweise zu einer Beeinflussung der basalen Anfallsfrequenz führen kann. In der hier vorliegenden Studie wurden lediglich die zwei Stunden vor der Behandlung auf Anfälle hin untersucht. Eine Kontrolle, ob vorher bereits generalisierte Anfälle auftraten, erfolgte nicht. Auch dies sollte im Rahmen der systematischen Beurteilung generalisierten Anfälle vorgenommen werden. Aufgrund des eventuellen Einflusses generalisierter Anfälle stellt sich die Frage, ob Tiere, die innerhalb der Auswertung und während eines gewissen Zeitraums davor generalisierte Anfälle zeigen, von der Auswertung auszuschließen sind. Dieses Vorgehen würde ebenfalls größere Tiergruppen zur Untersuchung erfordern, die Schwankungen der Anfallsanzahl aber eventuell reduzieren. Andererseits ist es jedoch nicht erstrebenswert, Tiere, die eine besonders schwere Epilepsie zeigen und daher häufiger generalisierte Anfälle aufweisen als andere, von der Auswertung auszuschließen, da sie möglicherweise eine Patientenpopulation widerspiegeln, die ebenfalls besonders schwer betroffen ist. Gerade für diese Patienten sollten aber neue Behandlungsstrategien entwickelt werden. Durch eine Erhöhung der Anzahl untersuchter Tiere könnte der Einfluss einzelner generalisierter Anfälle auch bereits an Bedeutung verlieren. Eine systematische Beurteilung des Effekts generalisierter Anfälle in diesem Modell stellt folglich eine wichtige Aufgabe für zukünftige Untersuchungen dar. Dabei sollte unbedingt ein Vergleich zwischen Tieren mit vielen bzw. wenigen generalisierten Anfällen erfolgen sowohl in Bezug auf die Frequenz fokaler Anfälle als auch im Hinblick auf die Wirksamkeit verschiedener Antiepileptika. Zusammenfassend kann man folgern, dass sich das fokale Kainat-Modell in der Maus sehr resistent gegenüber einer Behandlung mit Antiepileptika verschiedener Wirkmechanismen 96

Diskussion

erwiesen hat. In dieser Studie konnte zwar ein Einfluss von Fehlinjektionen und generalisierten Anfällen bei der Beurteilung einzelner Substanzen nicht mit letzter Sicherheit ausgeschlossen werden, da sich aber trotz der vielen untersuchten Substanzen und Dosierungen kaum antikonvulsive Effekte zeigten und auch andere Arbeitsgruppen bereits Resistenzen nachweisen konnten, kann mit großer Sicherheit auf eine vorhandene Resistenz geschlossen werden.

6.3 Wirkungen von Diazepam Eine so deutliche Wirkung, wie sie sich bei der Behandlung mit Diazepam in ethanolhaltiger Lösung in einer Dosierung von 5 mg/kg nachweisen ließ, konnte in dieser Studie durch keine andere Substanz erzielt werden. Diazepam und Ethanol wirken jedoch beide am GABAARezeptor und verursachen bei einer gleichzeitigen Gabe überadditive Wirkungen (HERDEGEN, 2010; LÜLLMANN et al., 2010). Daher lag die Vermutung nahe, dass hier ebenfalls eine synergistische antikonvulsive Wirkung vorlag, obwohl die verwendete Lösung bei einer Dosierung von 5 mg/kg Diazepam lediglich einen Alkoholgehalt von 0,19 % aufwies. Dies ergibt bei einem Applikationsvolumen von 10 ml/kg eine Ethanoldosis von 15 mg/kg Körpergewicht (Für die Berechnung der Ethanoldosis wurde die Dichte von Ethanol von 790 g/l berücksichtigt). Aus Kontrollgründen sollte zunächst sichergestellt werden, dass Ethanol selbst nicht bereits eine antikonvulsive Wirkung hervorruft. Diese Untersuchung konnte jedoch aufgrund des späten Zeitpunkts im Verlauf der Studie nur noch an FVB/N-wt-Mäusen durchgeführt werden. In dieser Gruppe zeigte sich wie erwartet kein antikonvulsiver Effekt der Ethanolbehandlung. Daher wurde anschließend Diazepam in wässriger Lösung untersucht. Es ist ganz eindeutig, dass Diazepam in wässriger Lösung keine so starke Wirkung aufweist, wie in der Kombination mit Ethanol. Daher kann der synergistische Effekt als bestätigt angesehen werden. Ob aber eine schwache eigene Wirkung vorliegt, kann wegen des Auftretens von acht generalisierten Anfällen in den zwei Stunden vor der Behandlung bei nur acht Mäusen nicht sicher ausgeschlossen werden, wie bereits im letzten Abschnitt diskutiert. Die acht auftretenden generalisierten Anfälle verteilen sich auf fünf Mäuse. Bei vier dieser Mäuse war keine Reduktion der Anfallsfrequenz nach den generalisierten Anfällen zu erkennen. Eine Maus zeigte jedoch drei generalisierte Anfälle, die sich auf drei halbe Stunden verteilten, sodass eine unabhängige Beurteilung nicht möglich war. Daher kann nicht sicher ausgeschlossen

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Diskussion

werden, dass bei diesem Tier die Frequenz fokaler Anfälle erniedrigt war. Insgesamt schien der Einfluss der generalisierten Anfälle in dieser Tiergruppe jedoch eher gering auszufallen. Zusammenfassend kann man also sagen, dass der starken Wirkung von Diazepam definitiv ein antikonvulsiver Synergismus mit Ethanol zugrunde liegt. Ob auch durch Diazepam alleine geringe Effekte zu erzielen sind, muss in weiteren Untersuchungen abschließend überprüft werden. Dazu wurde im Verlauf dieser Untersuchungen auch bereits Diazepam-®Lipuro in einer Dosierung von 5 mg/kg appliziert. Dabei handelt es sich um eine kommerziell erhältliche Emulsion zur Injektion, welche kein Ethanol enthält. Die Auswertungen zu dieser Substanz sind aus Zeitgründen noch nicht abgeschlossen. Außerdem ist geplant, die Diazepamkonzentration im Blutplasma nach Verabreichung der verschiedenen Diazepamzubereitungen bei Mäusen zu bestimmen.

6.4 Responder-Nonresponder-Selektion Modelle, die eine Einteilung der Tiere in Responder und Nonresponder erlauben, bieten große Vorteile: Im Vergleich zu per se resistenten Modellen sind sie der menschlichen Erkrankung deutlich näher, da auch bei humanen Patienten nur ein gewisser Anteil nicht auf eine Pharmakotherapie anspricht. Daher kann ihre Aussagekraft als besser eingeschätzt werden. Des Weiteren erlaubt der direkte Vergleich der identisch behandelten Responder und Nonresponder Rückschlüsse auf die Ursachen der Pharmakoresistenz. Außerdem können in Nonrespondern neue Behandlungsansätze zur Überwindung der Pharmakoresistenz spezifisch entwickelt werden. Auch im Hinblick auf weitere Aspekte, wie das vermehrte Auftreten psychiatrischer Komorbiditäten in pharmakoresistenten Patienten, erscheinen solche Modelle sehr hilfreich. Demzufolge sollte in dieser Studie die Hypothese untersucht werden, dass sich im fokalen Kainat-Modell in der Maus Responder und Nonresponder auf eine Behandlung mit Antiepileptika unterschiedlicher Wirkmechanismen selektieren lassen. In der vorliegenden Studie wurden Responder in Anlehnung an andere Arbeiten definiert als Mäuse, die eine Reduktion der Anfallsanzahl um mindestens 75 % in einer der vier halben Stunden nach der Behandlung im Vergleich zum Mittelwert vor der Behandlung zeigten (BETHMANN et al., 2008; GASTENS et al., 2008). Diese im Vergleich zu weiteren Arbeiten sehr restriktive Definition wurde aufgrund der auftretenden starken Schwankungen der Anfallsfrequenz einzelner Mäuse gewählt (BRANDT et al., 2006; BANKSTAHL et al., 2012). Eine zufällige Klassifizierung als Responder sollte so ausgeschlossen werden.

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Diskussion

In der hier untersuchten Tiergruppe konnten unter der akuten Behandlung mit den meisten verwendeten Antiepileptika sowohl Responder als auch Nonresponder nach der genannten Definition gefunden werden. Jedoch traten auch bei der Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung, die keine pharmakologischen Effekte hervorrufen sollte, bereits zwei Responder unter den 14 untersuchten FVB/N-wt-Mäusen auf. Eine dieser Mäuse zeigte in der halben Stunde nach der Behandlung einen generalisierten Anfall. Dieser kann durchaus die Einstufung als Responder verursacht haben, da, wie bereits erwähnt, mehrfach beobachtet wurde, dass generalisierte Anfälle die Frequenz fokaler Anfälle über einen variablen Zeitraum hinweg deutlich senken können. Die andere als Responder definierte Maus zeigte die Reduktion der Anfallsanzahl erst in der vierten halben Stunde nach der Behandlung. In den drei ersten halben Stunden nach der Behandlung war die Anfallsfrequenz tendenziell eher erhöht. Bei dieser Maus traten keine generalisierten Anfälle auf. Dass die Injektion und das Handling oder auch die isotonische Natriumchloridlösung einen solchen verzögerten Effekt hervorgerufen haben, erscheint unwahrscheinlich. Daher liegt nahe, dass auch andere, bisher nicht identifizierte Einflüsse starke Effekte auf die Anfallsfrequenz ausüben. Die Frage, ob bei der Selektion von Respondern und Nonrespondern ein Ausschluss aus der Auswertung von Tieren mit generalisierten Anfällen während und vor dem ausgewerteten Zeitraum zu einer verbesserten Aussage führen würde, kann hier ebenso wie bei der Gruppenauswertung aufgeworfen und entsprechend diskutiert werden. Folglich wurde auch in diesem Fall entschieden, alle Mäuse in die Auswertung einzubeziehen, um in dieser ersten Studie ein möglichst umfassendes Bild der auftretenden Effekte zu zeichnen. Für weitere Studien muss diskutiert werden, ob es sinnvoll ist, eine Behandlung zur Selektion von Respondern und Nonresponder wiederholt durchzuführen. Aufgrund des eher seltenen Auftretens generalisierter Anfälle erscheint es unwahrscheinlich, dass ein bestimmtes Tier innerhalb beider Untersuchungszeiträume einen generalisierten Anfall zeigt. Zusätzlich könnte durch dieses Vorgehen die basale Anfallsfrequenz abgesichert werden, wenn einzelne Mäuse starke Schwankungen erkennen lassen. Auch der Einfluss von Fehlinjektionen könnte so reduziert werden. Im Verlauf der Studie konnten bei der Applikation der meisten Substanzen nur wenige Responder beobachtet werden. Nur nach den Applikationen von Diazepam in ethanolhaltiger Lösung in beiden Dosierungen, Phenobarbital in einer Dosierung von 50 mg/kg und Levetiracetam in einer Dosierung von 800 mg/kg bei den FVB/N-wt-Mäusen konnten mindestens 50 %

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Diskussion

der Tiere als Responder eingestuft werden. Dies lässt auf einen deutlichen antikonvulsiven Effekt der genannten Substanzen schließen. Bei der Behandlung mit Diazepam in ethanolhaltiger Lösung in der Dosierung von 5 mg/kg traten unter den 10 ausgewerteten mdr1a/b(-/-)-Mäusen auch zwei Nonresponder auf, während in der Gruppe der zehn ausgewerteten FVB/N-wt-Mäuse alle Tiere als Responder eingestuft werden konnten. Es kann jedoch, wie bereits zuvor diskutiert, nicht ausgeschlossen werden, dass bei den genannten beiden Nonrespondern eine Fehlinjektion in den Darm erfolgt ist und demzufolge kein wirksamer Plasmaspiegel erreicht wurde. Auch aufgrund des Risikos von Fehlinjektionen erscheint im Hinblick auf die Selektion von Respondern und Nonrespondern eine mehrfache Applikation der einzelnen Substanzen sinnvoll. Dadurch könnten Nonresponder mit weitaus größerer Sicherheit identifiziert werden. In dieser Studie wurde auf mehrfache Applikationen verzichtet, da der Transporter-Hypothese zufolge erwartet wurde, dass Nonresponder auf keine der erfolgten Behandlungen mit Antiepileptika verschiedener Wirkmechanismen ansprechen, während Responder auf (fast) alle Wirkstoffe ansprechen, sodass eine eindeutige Unterscheidung nach mehreren Behandlungen mit verschiedenen Antiepileptika möglich wäre. Dies wurde erwartet, da Epilepsiepatienten, bei denen durch die Therapie mit dem ersten Antiepileptikum keine Anfallsfreiheit erreicht werden kann, nur noch eine 10- bis 15–prozentige Chance haben, durch weitere Antiepileptika anfallsfrei zu werden (LÖSCHER, 2006). Entsprechend konnte auch bereits im Tiermodell gezeigt werden, dass epileptische Ratten im BLA-Modell, welche nicht auf eine Behandlung mit Phenobarbital ansprechen, zu einem Anteil von 83 % ebenfalls nicht auf eine Behandlung mit Phenytoin ansprechen (BETHMANN et al., 2007). Daher wurde auch in der vorliegenden Studie bei Nonrespondern von einer Resistenz gegenüber verschiedenen Antiepileptika ausgegangen. Bei den Behandlungen mit 30-prozentigem Polyethylenglycol 400, dem Diazepam-Vehikel und beiden verwendeten Dosierungen von Carbamazepin konnten keine Responder gefunden werden. Da es sich bei den ersten beiden Substanzen um Lösungsmittel handelt, war zu erwarten, dass sie keine Effekte hervorrufen. Dies ist wichtig im Hinblick auf die korrekte Beurteilung der Antiepileptika. Wenn schon das Lösungsmittel einen Effekt auf die Anfallsfrequenz aufweist, lassen sich die Effekte der Substanz nicht von denen des Lösungsmittels trennen. Auch synergistisch verstärkte Wirkungen können dann nicht ausgeschlossen werden. Ein solches Beispiel liefert die Entdeckung von Valproat, welches zunächst nur als Lösungsmittel in Versuchen zur Untersuchung anderer Wirkstoffe verwendet wurde (BIALER, 2012).

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Diskussion

Dass beide Dosierungen von Carbamazepin nicht zum Auftreten von Respondern geführt haben, erscheint im Hinblick auf die Ergebnisse der Auswertung des Gruppeneffekts ebenfalls nicht verwunderlich. Carbamazepin zeigte in dieser Studie in beiden angewendeten Dosierungen einen signifikanten prokonvulsiven Effekt. Wenn jedoch prokonvulsive Effekte vorherrschen, ist nicht mit dem Auftreten einer Anfallsreduktion bei Einzeltieren zu rechnen. Die Ergebnisse der beiden Auswertungen stimmen somit überein. Auch Phenytoin zeigt in der Gruppenauswertung prokonvulsive Effekte. Dennoch konnte ein Responder in der Gruppe der FVB/N-wt-Mäuse identifiziert werden. Diese Maus zeigte jedoch sowohl in der halben Stunde vor als auch in der halben Stunde nach der Behandlung einen generalisierten Anfall. Wie bereits für isotonische Natriumchloridlösung diskutiert, kann dieser ebenfalls für die Senkung der Anfallsfrequenz verantwortlich sein. Abschließend muss erwähnt werden, dass nicht wie erwartet „generelle Responder“ identifiziert werden konnten, bei denen eine Reduktion der Anfallsfrequenz durch (fast) alle angewendeten Antiepileptika erzielt werden konnte. Eine solche Einteilung hätte einen großen wissenschaftlichen Nutzen, da dann Responder und Nonresponder systematisch verglichen werden könnten. Wenn eine Resistenz nur gegen einzelne Substanzen besteht, kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine Veränderung der Zielstrukturen, an welche das jeweilige Antiepileptikum bindet, allein für die Resistenz verantwortlich ist, wie es die Target-Hypothese besagt (SCHMIDT & LÖSCHER, 2005). Ein Vergleich, der Rückschlüsse auf zugrunde liegende Mechanismen der Pharmakoresistenz gegen eine Vielzahl an Arzneimitteln erlaubt, kann daher nicht gezogen werden. Für weitere Untersuchungen stellt sich die Frage, ob die Wahl des Mausstammes das Auftreten genereller Responder verhindert hat. Bei FVB/N-wt-Mäusen handelt es sich um einen Inzuchtstamm, d. h. die genetische Variabilität zwischen den einzelnen Mäusen ist nur sehr gering. Daher ist zu diskutieren, ob die Tiere genetisch zu ähnlich waren, um eine Subgruppen-Unterteilung zu erlauben. Eventuell treten die Mechanismen, die zu einer allgemeinen Pharmakoresistenz führen, gerade in diesem Stamm nicht auf. In anderen Arbeitsgruppen wurden im fokalen Kainat-Modell C57BL/6-, Swiss- und NMRI-Mäuse verwendet (RIBAN et al., 2002; GOUDER et al., 2003; ROUCARD et al., 2010). Da es sich bei den beiden letztgenannten um Auszuchtstämme handelt, besteht eine größere genetische Variabilität zwischen den einzelnen Tieren. Unter Umständen kommen dadurch andere Mechanismen zum Tragen, die zum Auftreten genereller Responder führen könnten. Untersuchungen zur Responder-

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Diskussion

Nonresponder-Selektion sind in diesen Stämmen jedoch bisher nicht vorgenommen worden. In der vorliegenden Studie wurden FVB/N-wt-Mäuse verwendet, weil ein Vergleich mit mdr1a/b(-/-)-Mäusen angestrebt wurde. Für einen solchen Vergleich mit genetisch veränderten Tieren muss immer der entsprechende Hintergrundstamm als Kontrollgruppe herangezogen werden, da nur dieser - abgesehen von der spezifischen Veränderung – den gleichen genetischen Hintergrund aufweist. Nur so können auftretende Unterschiede zuverlässig auf die Funktion des ausgeschalteten Gens bzw. des von ihm kodierten Proteins zurückgeführt werden. Studien zum Einfluss des Stammes auf das Auftreten von Respondern und Nonrespondern wurden beispielsweise in unserer Arbeitsgruppe an Ratten im Kindling-Modell durchgeführt (CRAMER et al., 1998; LÖSCHER et al., 1998). Darin konnte gezeigt werden, dass in Sprague Dawley-Ratten eine Selektion von Respondern und Nonrespondern nach einer Behandlung mit Phenytoin nicht möglich war, während diese in Wistar-Ratten gelang (LÖSCHER et al., 1993; EBERT et al., 1994; LÖSCHER et al., 1998). In Versuchen mit fünf verschiedenen Inzuchtstämmen zeigte sich außerdem ein Unterschied in der Häufigkeit des Auftretens von Respondern und Nonrespondern (CRAMER et al., 1998). Aufgrund dieser Studien erscheint es auch im fokalen Kainat-Modell in der Maus interessant, Unterschiede in der ResponderNonresponder-Selektion zwischen verschiedenen Mausstämmen zu untersuchen. Da generelle Responder und Nonresponder in der vorliegenden Studie nicht wie erhofft selektiert werden konnten, war es auch nicht möglich, weitere Vergleiche hinsichtlich Verhaltensveränderungen oder histologischen Unterschieden durchzuführen, die zunächst geplant waren.

6.5 Auswirkungen von P-Glykoprotein auf die Pharmakoresistenz Der Transporter-Hypothese zufolge kann eine Überexpression von Multidrug-Transportern wie Pgp an der Blut-Hirn-Schranke eine Pharmakoresistenz hervorrufen (LÖSCHER & POTSCHKA, 2002). In dieser Studie sollten dementsprechend die Effekte von Pgp auf die Wirksamkeit von Antiepileptika durch den Vergleich von FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen untersucht werden. Konkret wurde die Hypothese aufgestellt, dass auftretende Effekte der Antiepileptika, für die ein Transport durch Pgp bekannt ist, in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)Mäuse stärker ausgeprägt sind oder auch bei geringeren Dosierungen auftreten, da eine höhere Gehirnkonzentration des Wirkstoffs erreicht wird. So zeigten SCHINKEL et al. (1994), dass die Gehirnkonzentration von Ivermectin in mdr1a/b(-/-)-Mäusen gegenüber dem Hintergrund-

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stamm 90-fach erhöht war und demzufolge toxische Wirkungen hervorrief. Auch für das Antiepileptikum Phenytoin konnten RIZZI et al. (2002) in mdr1a/b(-/-)-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine deutlich erhöhte Konzentration in verschiedenen Hirnregionen nachweisen, obwohl sich die Plasmakonzentrationen nicht unterschieden. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Studie erwartet, dass bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen keine oder weniger Nonresponder auftreten, da ausreichende Wirkstoffspiegel im epileptischen Fokus bei allen Tieren erreicht werden. In dieser Studie konnten in der Gruppenauswertung jedoch für kein Antiepileptikum signifikante Unterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen gefunden werden. Eine signifikante Senkung der Anfallsanzahl nach der Behandlung mit Diazepam in einer Dosierung von 2 mg/kg konnte nur bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen nachgewiesen werden, zwischen den beiden Tiergruppen konnte hingegen kein signifikanter Unterschied gezeigt werden. Ein signifikanter Effekt von Diazepam in einer Dosierung von 5 mg/kg gegenüber dem Mittelwert vor der Applikation trat bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen nur in der ersten halben Stunde nach der Applikation auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich bei den FVB/N-wt-Mäusen die Anfallsfrequenz zu allen Zeitpunkten signifikant erniedrigt gegenüber dem Mittelwert vor der Applikation. Allerdings ist hierbei zu erwähnen, dass in der Gruppe der zehn mdr1a/b(-/-)-Mäuse zwei Nonresponder aufgetreten sind, bei denen eine Fehlinjektion nicht ausgeschlossen werden kann. Dies kann zu einem verminderten Effekt geführt haben. In beiden Gruppen war der Effekt gegenüber der Behandlung mit isotonischer Natriumchloridlösung zu allen Zeitpunkten signifikant. Im direkten Vergleich der FVB/N-wt- und der mdr1a/b(-/-)-Mäuse zeigte sich jedoch kein signifikanter Unterschied. Da Diazepam nicht als Substrat von Pgp gilt, konnte ein Unterschied der beiden Gruppen auch nicht erwartet werden (DORAN et al., 2005; CUCULLO et al., 2007; FENG et al., 2008). Auch bei Phenytoin und Phenobarbital, die nach ZHANG et al. (2012) definitive Substrate von Pgp sind, konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen ermittelt werden. Bei der Behandlung der mdr1a/b(-/-)-Mäuse mit Phenobarbital in einer Dosierung von 50 mg/kg konnte zwar im Gegensatz zu den FVB/N-wtMäusen eine signifikante Senkung der Anfallsanzahlen gezeigt werden, da aber auch bei den FVB/N-wt-Mäusen eine antikonvulsive Tendenz auftrat, bestand zwischen den Gruppen kein signifikanter Unterschied. Levetiracetam ist wahrscheinlich ebenfalls ein Substrat von Pgp (ZHANG et al., 2012). Aber auch bei dieser Substanz konnten keine signifikanten Unter-

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Diskussion

schiede zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen nachgewiesen werden. Dabei sollte allerdings berücksichtigt werden, dass die Tiergruppen bei der niedrigen Dosierung nur klein waren. ZHANG et al. (2012) stufen Carbamazepin als mögliches Substrat von Pgp ein, da es Hinweise gibt, dass Carbamazepin bei humanen Patienten durch Pgp transportiert wird, in vitro jedoch kein Nachweis für einen Transport erbracht werden konnte und sich die Ergebnisse im Tierversuch wiedersprechen. Carbamazepin zeigte in der vorliegenden Studie in beiden verwendeten Dosierungen sowohl bei den FVB/N-wt- als auch bei den mdr1a/b(-/-)Mäusen prokonvulsive Effekte. Signifikante Unterschiede zwischen den FVB/N-wt- und den mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnten jedoch bei keiner der beiden Dosierungen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis spricht also eher gegen einen Transport durch Pgp. Valproat zählt nach ZHANG et al. (2012) unter Vorbehalt zu den Substraten von Pgp. Die vorhandenen in vitro Untersuchungen sind widersprüchlich. In der vorliegenden Studie konnten keinerlei signifikante Effekte des genetischen Hintergrundes festgestellt werden. Bei der Selektion von Respondern und Nonrespondern konnten ebenfalls keine auffallenden Unterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen identifiziert werden. Responder traten entweder in beiden Tiergruppen oder in keiner der beiden Gruppen auf. Ausnahmen davon bilden lediglich die Behandlungen mit isotonischer Natriumchloridlösung sowie mit Phenytoin. Das Auftreten der einzelnen Responder unter Behandlung mit diesen Substanzen nur bei den FVB/N-wt-Mäusen wurde bereits im letzten Abschnitt diskutiert. Eine mögliche Ursache für das Fehlen signifikanter Unterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen ist die kompensatorische Überexpression anderer Transportproteine. So gibt es Hinweise darauf, dass es zu einer erhöhten Expression anderer Transporter kommt, wenn ein Transporter genetisch ausgeschaltet wird. In mdr1a(-/-)-Mäusen wurde eine erhöhte Konzentration von mdr1b in der Leber und der Niere, nicht jedoch in anderen Geweben nachgewiesen (SCHINKEL et al., 1994). Auch eine etwa dreifach erhöhte Expression des Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) wurde in mdr1a(-/-)-Mäusen bereits gezeigt (CISTERNINO et al., 2004). Daher ist es wichtig, solche Anpassungsmechanismen bei der Interpretation von Untersuchungen an Transporter-knock-out-Tieren stets in Betracht zu ziehen. Zwar zeigten RIZZI et al. (2002) erhöhte Hirnkonzentrationen des Antiepileptikums Phenytoin in mdr1a/b(-/-)-Mäusen, jedoch wurden diese Untersuchungen an nicht-epileptischen Mäusen durchgeführt. Es wurde bereits gezeigt, dass die Expression von Pgp im Gehirn sowohl bei Labornagern als auch bei Hunden nach einem Status epilepticus vorübergehend und bei La-

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Diskussion

bornagern in der chronischen Phase der Epilepsie dauerhaft erhöht ist (RIZZI et al., 2002; SEEGERS et al., 2002; VAN VLIET et al., 2006; VAN VLIET et al., 2007; PEKCEC et al., 2009; BANKSTAHL et al., 2011). Es kann folglich nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Expression anderer Transporter von einer bestehenden Epilepsie erhöht wird. Dies könnte die Unterschiede zwischen der von RIZZI et al. (2002) an gesunden Mäusen durchgeführten und der hier vorliegenden Studie mit epileptischen Tieren erklären. Zusammenfassend konnte die Hypothese, dass die Abwesenheit von Pgp zu einem besseren Ansprechen auf Antiepileptika und zu einem verminderten Vorkommen von Nonrespondern führt, in dieser Studie nicht bestätigt werden.

6.6 Anhedonie Depressionen treten bei Epilepsiepatienten als häufigste psychiatrische Komorbidität auf (DEVINSKY, 2003; KANNER et al., 2012). Depressive Symptome schränken dabei die ohnehin geminderte Lebensqualität epileptischer Patienten weiter ein (KANNER, 2013). Dennoch werden Depressionen bei Epilepsiepatienten häufig nicht erkannt oder ausreichend therapiert (KANNER et al., 2012). Dieser Situation liegt sicher auch der Mangel an Informationen über die Verbindung der Erkrankungen und die gemeinsamen Mechanismen zugrunde. Daher ist es wichtig, den Zusammenhang zwischen Epilepsie und Depression eingehender zu untersuchen. Aus diesem Grund sollte der Sucrose-Preference-Test für Depressions-assoziiertes Verhalten in die Studie integriert werden, um festzustellen, ob das fokale Kainat-Modell für weitergehende Untersuchungen der Depression bei Epilepsie geeignet ist. Dieser Test wurde gewählt, da der Porsolt-Forced-Swimming-Test und der Tail-SuspensionTest, welche sehr häufig genutzt werden, in unserer Arbeitsgruppe nicht erfolgreich bei epileptischen Mäusen im fokalen Kainat-Modell und im Pilocarpin-Modell eingesetzt werden konnten, wie bereits zu Anfang erwähnt (GRÖTICKE et al., 2008; MÜLLER et al., 2009). Da zu befürchten war, dass die epileptischen Tiere ihre ausweglose Situation gar nicht erkennen können, war es für weitere Untersuchungen von entscheidender Bedeutung, einen für diese Tiere besser geeigneten Test zu finden. Depressionen können in ihrer gesamten Komplexität nicht in der Maus untersucht werden. Daher konzentriert sich der Sucrose-Preference-Test auf die Anhedonie bei Labornagern. Anhedonie, d. h. die Unfähigkeit an positiven Erlebnissen Freude zu empfinden, ist ein charakteristisches Symptom depressiver Patienten. MAZARATI et al. (2007; 2008) gelang be-

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reits der Nachweis anhedonischen Verhaltens in epileptischen Ratten mit Hilfe des SucrosePreference-Tests. Sie zeigten, dass die Präferenz für die süße Lösung sowohl im Kindling- als auch im Pilocarpin-Modell bei den epileptischen Ratten im Vergleich zu Kontrollratten deutlich vermindert war. In der hier vorliegenden Studie konnte ein deutlich verringerter Saccharosekonsum bei den epileptischen Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren sowohl in der Gruppe der FVB/Nwt- als auch in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse nachgewiesen werden. Die Präferenz für die Saccharoselösung blieb jedoch auch in den epileptischen Mäusen im Gegensatz zu den bereits erwähnten Studien von MAZARATI et al. (2007; 2008) erhalten. Dennoch kann auch die Verminderung des Saccharosekonsums als Anhedonie interpretiert werden, da die Freude am Konsum offensichtlich eingeschränkt ist. So wird in anderen Arbeiten, die Depressionsmodelle untersuchen, den Tieren von vorneherein nur eine Trinkflasche angeboten, sodass der Saccharosekonsum ohne einen Vergleich zum Wasserkonsum beurteilt wird (MUSCAT et al., 1992; MONLEON et al., 1995; PAPP et al., 1996; D'AQUILA et al., 1997). Auch in diesen Studien konnte eine Anhedonie nachgewiesen werden, welche durch Antidepressiva therapierbar war. Die in der vorliegenden Studie erhaltene Präferenz bei den epileptischen Tieren beweist zusätzlich, dass die Induktion des Status epilepticus und die Entwicklung spontaner Anfälle nicht zu Veränderungen des Gehirns geführt haben, die den Geschmackssinn negativ beeinflussen. Es ist also sichergestellt, dass die Tiere noch in der Lage sind, die Saccharoselösung zu erkennen. Im Gegensatz zu den Studien von MAZARATI et al. (2007; 2008) fiel in dieser Studie außerdem ein stark erhöhter Gesamtflüssigkeitskonsum insbesondere bei den Kontrolltieren auf. Dieser deutet auf einen sehr starken Anreiz zu trinken hin, da die Mäuse teilweise mehr als ihr eigenes Körpergewicht an Saccharoselösung innerhalb von 24 Stunden konsumiert haben. Da dieser Effekt bei MAZARATI et al. (2007; 2008) nicht auftrat, kann angenommen werden, dass der Trinkanreiz für die Ratten dort nicht so hoch war. Damit ist eventuell auch zu erklären, dass sie eine Abnahme der Präferenz beschreiben konnten, die in der hier durchgeführten Studie nicht auftrat. Um den Anreiz zu reduzieren, wurde die Konzentration der Saccharoselösung in der 23. bzw. 26. Woche nach der Induktion des Status epilepticus auf 1 % gesenkt. Doch auch in dieser Konzentration bevorzugten alle Mäuse die Saccharoselösung. Die Steigerung des Gesamtkonsums war jedoch geringer. Die Resultate unterschieden sich folglich nur in ihrer Ausprägung 106

Diskussion

von der höheren Konzentration. Daher wurde die höhere Konzentration für die folgenden Versuche beibehalten. Die Anhedonie, d. h. der geringere Saccharosekonsum der epileptischen Tiere blieb über den gesamten Verlauf der Studie erhalten. Bisher wurde dieser Test in epileptischen Tieren nie über einen so langen Zeitraum untersucht. Im Vergleich zu den beiden bei Nagern am häufigsten eingesetzten Tests für Depressionsassoziiertes Verhalten, dem Porsolt-Forced-Swimming-Test und dem Tail-Suspension-Test, bietet der Sucrose-Preference-Test einige Vorteile. Ein wichtiger Kritikpunkt der beiden erstgenannten Tests ist, dass sie die Wirkung von Antidepressiva nach einer akuten Behandlung beurteilen, während ein antidepressiver Effekt bei humanen Patienten meist erst nach einigen Wochen erreicht werden kann (CRYAN et al., 2005). Dies bringt eine gewisse Unsicherheit bezüglich der klinischen Voraussagekraft der beiden Tests mit sich. Im Sucrose-PreferenceTest können im Gegensatz dazu chronische Behandlungseffekte untersucht werden. Diese im Porsolt-Forced-Swimming-Test oder im Tail-Suspension-Test durch eine wiederholte Durchführung der Versuche zu beurteilen, muss ebenfalls kritisch diskutiert werden, da die Tiere unter Umständen lernen, dass sie nach einer gewissen Zeit in jedem Fall aus der Situation befreit werden und daher die eigenen Versuche zu entkommen einschränken. Ein weiterer Vorteil des Sucrose-Preference-Tests besteht darin, dass die Mäuse durch den Experimentator kaum beeinflusst werden. Die Tiere verbleiben während des Tests in ihren Heimatkäfigen und werden nur kurzfristig in ihrem normalen Verhalten gestört, wenn sie und die Trinkflaschen gewogen werden. Da jedoch der Konsum jeweils über 24 Stunden ermittelt wird, kann diese kurze Störung als unbedeutend angesehen werden. Gleichzeitig können so tageszeitliche Unterschiede der Versuchsergebnisse eingeschränkt werden, da jede Messung stets einen vollständigen Tag-Nacht-Zyklus umfasst. Ein Nachteil des Sucrose-Preference-Tests ist jedoch, dass er sehr zeitintensiv in der Durchführung ist. Auch der Arbeitsaufwand ist insbesondere aufgrund der mehrfachen Messungen des Konsums deutlich höher als bei den anderen genannten Tests einzuschätzen. Zusammenfassend kann man also folgern, dass der Sucrose-Preference-Test geeignet ist, eine Depressions-assoziierte Anhedonie in epileptischen Tieren nachzuweisen. Er bietet demnach einen vielversprechenden Ansatz, um Verhaltensunterschiede zu analysieren und dadurch zu einem besseren Verständnis der Beziehung zwischen Epilepsie und Depression beizutragen. Unter Umständen kann durch diesen Test auch ermittelt werden, ob bestimmte Subpopulatio-

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Diskussion

nen epileptischer Tiere besonders gefährdet oder besonders stark von Depressionsassoziiertem Verhalten betroffen sind. Die geplante Analyse von Unterschieden zwischen Respondern und Nonrespondern war aufgrund des Fehlens genereller Responder in der vorliegenden Studie nicht sinnvoll durchführbar.

6.7 Ausblick Zusammenfassend bietet das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus viele Vorteile für weitere Untersuchungen. Um es möglichst effektiv einzusetzen, sollten jedoch noch einige Punkte eingehender überprüft werden. So ist es wie erwähnt wichtig, den Einfluss generalisierter Anfälle genauer zu untersuchen. Auch ein Vergleich zwischen Tieren mit vielen bzw. wenigen generalisierten Anfällen wäre interessant, um herauszufinden, ob sie verschiedene Patientenpopulationen repräsentieren können. Aufgrund der Resistenz gegenüber bereits entwickelten Antiepileptika scheint es möglich, in diesem Modell neue Wirkstoffe zu finden, die auch bei humanen pharmakoresistenten Epilepsiepatienten eine deutlich verbesserte Anfallskontrolle ermöglichen. Auch die Responder-Nonresponder-Selektion zeigt bereits vielversprechende Ansätze. So konnte gezeigt werden, dass eine solche Selektion in diesem Modell prinzipiell möglich ist. Es wurden bereits verschiedene Ansätze, wie eine zweimalige Behandlung oder die Verwendung anderer Mausstämme, thematisiert, welche die Selektion weiter verbessern könnten, sodass das Modell letztendlich zu aussagekräftigen Untersuchungen im Vergleich zwischen Respondern und Nonrespondern führen kann. Wenn ein Auftreten genereller Responder erreicht wird, können Verhaltensunterschiede weiter charakterisiert werden. Dabei kann der Sucrose-Preference-Test ein gutes Werkzeug bieten, um das gemeinsame Auftreten von Pharmakoresistenz und Depression näher zu erforschen. Histologische Untersuchungen könnten außerdem Rückschlüsse auf strukturelle Veränderungen pharmakoresistenter Patienten ermöglichen. Das Modell liefert somit vielversprechende Möglichkeiten für weitergehende Studien.

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Zusammenfassung

7 Zusammenfassung Sabine Klein: Untersuchungen zur Wirkung von Antiepileptika und zum Auftreten Depressions-assoziierten Verhaltens im fokalen Kainat-Modell in der Maus Epilepsie ist eine der häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Mensch, Hund und Katze. Sie ist durch das Auftreten spontaner Anfälle zentralen Ursprungs gekennzeichnet. Die Therapie besteht in der Regel in der dauerhaften Verabreichung von Antiepileptika, welche die Anfälle symptomatisch unterdrücken. Eine pharmakotherapeutische Heilung ist bisher nicht möglich. Bei über 30 % der Epilepsiepatienten treten jedoch trotz einer adäquaten Behandlung weiter Anfälle auf, sodass sie als pharmakoresistent eingestuft werden. Die Mechanismen, die zur Resistenz führen, sind noch weitgehend unbekannt. Die meisten Patienten, die gegen ein Antiepileptikum resistent sind, sprechen auch nicht auf eine Behandlung mit Antiepileptika anderer Wirkmechanismen an. Dies spricht gegen die Möglichkeit, dass alleine eine Veränderung der Zielstrukturen, an welchen die Antiepileptika wirken, die Resistenz verursacht. Vielmehr müssen auch unspezifischere Mechanismen eine Rolle spielen, wie etwa die Überexpression von sogenannten „Multidrug-Transportern“ in der Blut-Hirn-Schranke, welche Substanzen aus dem Gehirn zurück in die Blutbahn transportieren und so zu verminderten Arzneimittelkonzentrationen im epileptischen Fokus führen. Ein sehr gut untersuchter Effluxtransporter ist das P-Glykoprotein (Pgp), das physiologisch eine entscheidende Rolle zum Schutz des Organismus vor toxischen Substanzen spielt, indem es die Akkumulation in besonders empfindlichen Geweben wie dem Gehirn verhindert. Antiepileptika, die von Pgp transportiert werden, sind beispielsweise Phenytoin, Phenobarbital, Lamotrigin und Oxcarbazepin. Eine erhöhte Expression von Pgp wurde bereits in reseziertem Gewebe menschlicher pharmakoresistenter Patienten sowie im Tiermodell bei pharmakoresistenten Ratten nachgewiesen. Das Ziel der vorliegenden Studie war die Etablierung eines Modells, welches einerseits geeignet ist, zugrundeliegende Resistenzmechanismen zu untersuchen, und in welchem andererseits neue Arzneimittel speziell zur Behandlung pharmakoresistenter Patienten entwickelt werden können. In der vorliegenden Studie wurde das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus gewählt. Zur Untersuchung der Auswirkungen von Pgp auf die Pharmakoresistenz wurden dabei FVB/N-Wildtyp- (FVB/N-wt-) und mdr1a/b(-/-)-Mäuse, welche kein Pgp exprimieren, in ihrem Ansprechen auf verschiedene Antiepileptika verglichen.

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Zusammenfassung

Es konnte gezeigt werden, dass die Frequenz fokaler Anfälle hoch genug war, dass anti- oder prokonvulsiver Effekte nach einer einmaligen Behandlung beurteilt werden konnten. Damit ist das intrahippocampale Kainat-Modell das einzige chronische Epilepsiemodell, welches diese Möglichkeit bietet. Es stellte sich dabei außerdem wie erwartet als sehr resistent dar. Die Frequenz fokaler Anfälle konnte nur durch die Behandlung mit Diazepam in ethanolhaltiger Lösung, in der Gruppe der FVB/N-wt-Mäuse durch Levetiracetam und in der Gruppe der mdr1a/b(-/-)-Mäuse durch Phenobarbital signifikant gesenkt werden. Carbamazepin und Phenytoin riefen hingegen prokonvulsive Effekte hervor. Durch die Behandlungen mit Phenobarbital bei den FVB/N-wt-Mäusen, Levetiracetam bei den mdr1a/b(-/-)-Mäusen sowie mit Diazepam in wässriger Lösung und Valproat bei allen Mäusen konnte keine signifikante Veränderung der Anfallsfrequenz hervorgerufen werden. Allerdings erscheint im Hinblick auf auftretende antikonvulsive Tendenzen eine Erhöhung der Anzahl untersuchter Tiere sinnvoll, um die statistische Validität der Versuche zu verbessern und so auch geringe Effekte nachweisen zu können. Nur ein Teil der menschlichen Epilepsiepatienten ist pharmakoresistent, während andere durch die gleiche Behandlung anfallsfrei werden. Eine entsprechende Einteilung der Tiere in Responder und Nonresponder konnte in dieser Studie erfolgreich durchgeführt werden. Es traten jedoch keine „generellen“ Responder auf, bei welchen die Anfallsfrequenz durch (fast) alle Antiepileptika gesenkt werden konnte. Eine solche Klassifikation könnte große Vorteile in der Entwicklung spezieller Therapiemöglichkeiten für humane pharmakoresistente Patienten bringen. Daher sollten zu dieser Thematik unbedingt weitere Studien angefertigt werden, die beispielsweise andere Mausstämme einsetzen könnten. Unterschiede zwischen FVB/N-wt- und mdr1a/b(-/-)-Mäusen konnten weder in der Auswertung der gesamten Tiergruppen noch in der Responder-Nonresponder-Selektion unter der Behandlung mit Pgp-Substraten gefunden werden. Die Hypothese, dass Pgp einen Einfluss auf die Pharmakoresistenz nimmt, konnte demnach in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Ein weiteres Ziel bestand darin herauszufinden, ob das fokale Kainat-Modell geeignet ist, Depressions-assoziiertes Verhalten in Mäusen näher zu untersuchen. Depressionen sind die häufigste psychiatrische Komorbidität und betreffen 20 – 40 % aller Epilepsiepatienten. Sie vermindern die Lebensqualität betroffener Patienten erheblich. In dieser Studie gelang es durch den Einsatz des Sucrose-Preference-Tests, eine Depressions-assoziierte Anhedonie der epileptischen Mäuse nachzuweisen, welche über einen Zeitraum von mindestens 40 Wochen 110

Zusammenfassung

erhalten blieb. Der Test und das Modell bieten sich folglich für weitere Untersuchungen des Zusammenspiels von Depression und Epilepsie an. Insgesamt charakterisiert die vorliegende Arbeit das intrahippocampale Kainat-Modell in der Maus als vielversprechenden Ansatz für weitergehende Untersuchungen sowohl der Entstehung und Behandlung der Pharmakoresistenz als auch depressiver Störungen bei Epilepsiepatienten.

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Zusammenfassung

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Summary

8 Summary Sabine Klein: Investigations on the effects of antiepileptic drugs and on the occurrence of depression-associated behaviour in the focal kainic acid mouse model Epilepsy is one of the most frequent neurological disorders in humans as well as in cats and dogs. It is characterized by a predisposition of the brain to develop spontaneous recurrent seizures. The therapy of choice to treat epilepsies is the chronic administration of antiepileptic drugs, which symptomatically suppress the epileptic seizures. It is, however, not possible to cure epilepsy yet. About 30 % of epilepsy patients are not seizure-free although they are treated in an adequate way, and so have to be classified as pharmacoresistant. The mechanisms, which lead to pharmacoresistance, are still only poorly understood. Most of the patients who are resistant to one antiepileptic drug do not get seizure free with another antiepileptic drug, even though it may act differently. This does not support the hypothesis that a specific change of the target regions of the antiepileptic drug is the only cause of pharmacoresistance. Contrary, an unspecific change like overexpression of multidrug transporters in the blood-brain barrier, which transport substances from the brain back to the blood and reduce the drug concentration in the epileptic focus, could explain this inefficiency. One of these multidrug transporters is P-glycoprotein (Pgp). Physiologically Pgp plays an important role in the protection of the organism against toxic substrates, because it avoids the accumulation in sensitive tissues like the brain. The following antiepileptic drugs, among others, are known to be transported by Pgp: phenytoin, phenobarbital, lamotrigine and oxcarbazepine. An increased expression of Pgp in the blood-brain-barrier could already be detected in resected human tissue of pharmacoresistant epileptic patients as well as in pharmacoresistant rats in several epilepsy models. The aim of this study was to establish an animal model that can be used to investigate mechanisms of pharmacoresistance and to develop new drugs especially useful in the treatment of pharmacoresistant patients. For this issue the focal kainic acid mouse model has been used. To analyse the effects of Pgp on pharmacoresistance FVB/N-wildtype (FVB/N-wt) and mdr1a/b(-/-) mice, which do not express Pgp, were compared in their response to different antiepileptic drugs. It could be shown that the frequency of focal seizures in this model was high enough to detect anti- or proconvulsive actions after just one acute treatment. Thus, it is the only chronic epi113

Summary

lepsy model that offers this opportunity. As expected the model proved to be very resistant: The frequency of focal seizures could only be reduced significantly by the treatment with diazepam in an ethanol-containing solution. In the group of FVB/N-wt mice with levetiracetam and in the group of mdr1a/b(-/-) mice with phenobarbital. Carbamazepine and phenytoin produced proconvulsive effects. No effects could be seen after treatment with phenobarbital in the FVB/N-wt mice, with levetiracetam in mdr1a/b(-/-) mice and in all mice after treatment with diazepam in an aqueous solution and valproate. Because of occurring anticonvulsant tendencies it seems, however, useful to increase the number of analysed animals to improve the statistical power of the investigations and thus the sensitivity to smaller effects. Only a fraction of human epilepsy patients are pharmacoresistant while others become seizure-free although they get the same treatment. An equivalent division of the animals into responders, which react on treatment, and nonresponders, which still have seizures, could be successfully done. But no “general” responders which show a response to (almost) all antiepileptic drugs could be found. A classification like this could be of significant advantage in the development of new therapeutic strategies for pharmacoresistant patients. For this purpose further studies should investigate this topic using for example other mouse strains. Significant differences between FVB/N-wt and mdr1a/b(-/-) mice could not be found, neither in the analysis of treatment in groups nor in the responder-nonresponder selection. The hypothesis about Pgp playing an important role in pharmacoresistance could not be confirmed in this study. Another important aim of this study was to investigate whether the kainic acid mouse model is suitable to detect depression-associated behavior. Depression is the most frequent psychiatric comorbidity affecting 20 – 40 % of epilepsy patients. It substantially reduces the quality of life of these patients. In this study a depression-associated anhedonia could successfully be detected in epileptic mice using the sucrose preference test. This anhedonia lasted for at least 40 weeks. Therefore, this test and model are hopeful candidates for upcoming investigations about the interference of depression and epilepsy. Altogether, this study characterizes the intrahippocampale kainic acid mouse model as a promising approach for further investigations of both, causes of and therapies for pharmacoresistance as well as depression in epilepsy patients.

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Literaturverzeichnis

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130

Anhang

10 Anhang 10.1 Ansatz der applizierten Substanzen und Lösungen Substanz 30-prozentige Polyethylenglycol-400Lösung Carbamazepin

Lösungsmittel

Dosierung

30 % Polyethylenglycol 400 + 70 % Aqua ad injectabilia

Applikationsvolumen 10 ml/kg

30-prozentige Polyethylenglycol400-Lösung 30-prozentige Polyethylenglycol400-Lösung isotone Natriumchloridlösung

20 mg/kg

10 ml/kg

40 mg/kg

10 ml/kg

400 mg/kg

5 ml/kg

5 mg/kg

10 ml/kg

2 mg/kg

10 ml/kg

5 mg/kg

10 ml/kg

Kainat

0,4 % Salzsäure (1 M) + 99,6 % Aqua ad injectabilia verdünnt mit 5-prozentiger Glukosemonohydratlösung verdünnt mit 5-prozentiger Glukosemonohydratlösung 0,19 % Ethanol + 99,81 % 5-prozentige Glukosemonohydratlösung isotone Natriumchloridlösung

0,21 µg/Maus

50 nl/Maus

Levetiracetam

isotone Natriumchloridlösung

400 mg/kg

10 ml/kg

Levetiracetam

isotone Natriumchloridlösung

800 mg/kg

10 ml/kg

Marbofloxacin (Marbocyl®) Phenobarbital (als Phenobarbital-Natrium) Phenobarbital (als Phenobarbital-Natrium) Phenytoin

Aqua ad injectabilia

2 mg/kg

4 ml/kg

isotone Natriumchloridlösung

25 mg/kg

10 ml/kg

isotone Natriumchloridlösung

50 mg/kg

10 ml/kg

3 % Natriumhydroxid (1M) + 97 % Aqua ad injectabilia isotone Natriumchloridlösung

20 mg/kg

10 ml/kg

300 mg/kg

10 ml/kg

Carbamazepin Chloralhydrat Diazepam Diazepam (Faustan®) Diazepam (Faustan®) Diazepam-Vehikel

Valproat (als Natriumsalz)

131

10 ml/kg

Anhang

10.2 Verbrauchsmaterialien und Geräte Substanz/Verbrauchsmaterial Acht-Kanal-Analog-Digital-Wandler (PowerLab 8/30): 2 Stück Altromin 1324 Standardnagerdiät Aqua ad injectabilia Bepanthen Augen- und Nasensalbe Bohrer (Mod. 732 T1) Bupivacainhydrochloridlösung (Carbostesin® 0,25 %) Carbamazepin Chloralhydrat Computer zur EEG- und Videoüberwachung Deckel für Trinkflaschen Dentalbohrer 1,1 mm Dentalzement (Paladur®) Diazepam Diazepam Fertigarzneimittel (Faustan®) EEG-Ableitkabel Ein-Kanal-Verstärker (Animal BioAmp): 16 Stück Einmal-Latexhandschuhe Einmalspritzen Einstreu Einstreu für EEG- und VideoÜberwachung Elektroden

Bezugsquelle ADInstruments GmbH, Spechbach

Ethanol (vergällt) Ethanol 100 % Feinwaage

CG Chemikalien, Laatzen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Sartorius AG, Göttingen

Glukosemonohydrat

AppliChem GmbH, Darmstadt

Infrarotstrahler Injektionskanülen 27 G Kainat Kamera (Infrarot) Levetiracetam Lochzange Makrolonkäfige Marbofloxacin (Marbocyl® FD 1 %) Methanol Mikroliter-Spritze Nahtmaterial

Conrad Elektronik, Hannover TERUMO® Europe N.V., Leuven, Belgien Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim NyctoVision, Wunstorf UCB Pharma GmbH, Monheim Faust Medizintechnik, Berlin Ebeco, Castrop-Rauxel Vétoquinol GmbH, Ravensburg Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe SGE Europe Ltd, Milton Keynes, UK ETHICON GmbH, Norderstedt

Altromin GmbH, Lage, Deutschland B. Braun Melsungen AG, Melsungen Bayer Vital GmbH, Leverkusen Dremel, Leinfelden-Echterdingen AstraZeneca GmbH, Wedel Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim AppliChem GmbH, Darmstadt Dell GmbH, Frankfurt am Main Ebeco, Castrop-Rauxel Hager & Meisinger GmbH, Neuss Heraeus Kulzer, Hanau Hoffmann La Roche, Basel, Schweiz Temmler Pharma GmbH & Co. KG, Marburg Hopa Kabelkonfektion GmbH & Co. KG, Langenhagen ADInstruments GmbH, Spechbach NOBA Verbandmittel Danz GmbH u. Co KG, Wetter CODAN Medizinische Geräte GmbH & Co KG, Lensahn Rettenmaier & Söhne GmbH & Co. KG, Rosenberg Sheperd Speciality Papers, Watertown, USA Material von Conrad Elektronik, Hannover, zusammengebaut von Herrn R. Baum, Tierärztliche Hochschule Hannover

132

Anhang

Substanz/Verbrauchsmaterial Natriumchloridlösung (isotonisch, NaCl 0,9 %) Netzgerät

Bezugsquelle B. Braun Vet Care GmbH, Tuttlingen

Operationsbesteck Phenobarbital-Natrium Phenytoin pH-Papier Polyethylenglycol 400 rj10 Twist-Stop Saccharose Salzsäure Schrauben Skalpellklingen Stereotaktischer Apparat 1 Stereotaktischer Apparat 2 Sterofundin® VG-5 Trinkflaschen Überwachungskäfige

Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Melsungen Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Menzel-Electronic, Hannover Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG, Köln Merck, Darmstadt Hummer & Rieß, Nürnberg Rüttgers GmbH & Co. KG, Solingen David Kopf, Tujunga, CA, USA Stölting, Wood Dale, IL, USA B. Braun Melsungen AG, Melsungen Ebeco, Castrop-Rauxel Hergestellt durch Herrn R. Baum, Tierärztliche Hochschule Hannover Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Sartorius AG, Göttingen Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Hillesheim GmbH, Waghäusel AppliChem GmbH, Darmstadt

Valproat (Natriumsalz) Waage Wärmematte Wärmematte Wasserstoffperoxid (35 %)

Statron Gerätetechnik GmbH, Fürstenwalde

133

Anhang

10.3 Originaldaten der Antiepileptika-Behandlungen Ausrufezeichen symbolisieren in allen folgenden Tabellen einen generalisierten Anfall, welcher innerhalb der entsprechenden halben Stunde aufgezeichnet wurde.

10.3.1 Carbamazepin 20 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-127 SKL-131 SKL-132 SKL-133 SKL-137

67 45 55 107 41

51 68 33 78 58

79 62 11 16 46

42 36 60 100 36

77 78 56 80 31

61 57 72 87 65

90 66 70 78 61

81 53 62 88 53

SKL-140

61

53

35

43

58

60

28

44

SKL-141 SKL-145

68 52

74 59

49 61

33 53

49 61

71 61

49 80

62 51

SKL-148 SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-164 SKL-165 SKL-169 SKL-170

71 56 65 87 20 63 76 31

92 52 30 84 11 56 83 9

101 69 75 57 14 22 42 29

79 18 69 99 8 2 65 33

129 93 79 96 53 64 99 40

115 70 84 113 30 43 112 58

116 50 86 85 13 49 85 30

102 76 99 90 41 40 68 18

134

!!

Anhang

10.3.2 Carbamazepin 40 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-123 SKL-125 SKL-127 SKL-131 SKL-133

109 95 96 43 109

106 76 65 112 102

71 63 90 103 102

22 64 52 100 61

91 123 80 141 109

95 98 118 135 128

88 45 130 100 132

104 96 119 89 111

SKL-140

75

105

85

62

78

103

114

59

SKL-142 SKL-146

81 121

35 123

108 108

88 111

119 135

125 116

103 116

101 108

SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-164 SKL-167 SKL-168

94 88 50 90 90 87 104

141 !! 145 96 96 ! 57 29 90 62 61 67 91 106 107 102

179 136 44 111 87 147 41

185 157 53 142 127 96 171

175 165 35 122 161 122 168

176 171 54 97 148 116 164

172 124 85 152 128 99 152

!

10.3.3 Diazepam 2 mg/kg (Faustan®) # Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

FVB/N-wt

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-117 SKL-124 SKL-127 SKL-130 SKL-133 SKL-135 SKL-137 SKL-140 SKL-141 SKL-142

57 71 46 69 77 37 55 65 65 67

54 15 68 85 68 56 18 78 61 42

45 48 46 58 56 34 71 34 57 61

38 78 93 35 63 47 42 110 28 70

59 31 14 75 11 2 6 134 9 28

73 24 6 22 40 4 38 99 10 63

69 18 26 78 54 34 27 105 3 56

67 29 39 37 55 21 27 95 3 59

mdr1a/b(-/-)

TierMaus-Nr. gruppe

SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

71 53 68 40 80 53 81 63 45

21 101 54 19 91 17 ! 91 101 33

67 69 47 41 86 70 121 80 50

32 38 52 14 93 69 100 84 21

5 21 0 0 27 27 61 8 6

0 39 2 0 72 82 111 36 3

5 64 4 1 76 77 82 39 4

19 76 0 2 81 94 89 56 5

135

Anhang

10.3.4 Diazepam 5 mg/kg (Faustan®)

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-132 SKL-135 SKL-137 SKL-140

27 62 54 27 42 50 25

39 83 50 44 54 38 80

48 12 54 74 44 59 72

20 39 40 65 19 19 56

0 2 6 2 1 0 0

6 2 1 11 3 0 1

6 6 4 42 11 0 10

12 5 33 40 20 0 29

SKL-141

23

53

66

34

1

1

0

0

SKL-142 SKL-143

19 42

75 79

68 59

17 45

0 5

22 2

27 13

4 2

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-158 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

74 50 68 62 63 67 55 43 74 74

68 57 31 52 40 32 40 71 43 39

53 59 44 35 24 92 30 60 40 54

47 45 35 31 46 47 29 48 32 15

3 0 0 9 1 30 2 26 2 0

14 7 2 19 0 69 40 59 28 3

27 12 2 40 0 57 54 47 0 1

26 12 8 21 0 56 49 44 18 9

!

!

10.3.5 Diazepam 5 mg/kg in wässriger Lösung

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-123 SKL-124 SKL-132 SKL-135 SKL-141

107 101 30 ! 138 114

119 110 33 ! 91 71

90 116 ! ! 12 93 79

SKL-142

108

98

SKL-143 SKL-146

78 71

!

58 61

!

96 127 22 63 140

123 121 24 18 69

137 97 18 65 94

151 103 38 48 84

135 95 33 67 53

149

55

72

73

65

71

69 104

74 105

85 36

121 22

80 29

63 37

136

!

!

Anhang

10.3.6 Diazepam-Vehikel: enthält 0,19 % Ethanol

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-123 SKL-124 SKL-132 SKL-135 SKL-141

99 108 112 102 131

!

94 88 104 104 93

SKL-142

88

!

146

SKL-143 SKL-146

56 106

!

56 79

104 63 65 75 105

91 82 63 121 66

67 114 49 132 98

144

89

57

65 102

88 100

52 67

107 75 91 90 74 !! !

91 79 89

!

138 111 88 88 116

153 148 69 106 131

177

75

80 93

82 107

10.3.7 Levetiracetam 400 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-117 SKL-122 SKL-125 SKL-126 SKL-127 SKL-130 SKL-131 SKL-148 SKL-151

# Anfälle nach Behandlung

74 38 92 44 30 92 87 !

73 41

54 49 66 73 29 77 67 !

49 40

16 65 !! 49 55 48 105 ! 24

33 32 7 ! 40 13 55 52

21 62 2 41 0 55 67

91 67 0 40 22 72 55

62 48 48 58 34 85 56

63 66 69 31 29 31 54

66 65

98 17

90 44

96 49

43 58

56 51

!

SKL-153

47

17

43

18

13

16

23

20

SKL-154

58

45

46

51

23

57

64

54

SKL-157

86

79

76

80

22

16

77

62

137

Anhang

10.3.8 Levetiracetam 800 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe SKL-117 SKL-125 SKL-131 SKL-132 SKL-133 SKL-135 SKL-137 SKL-145 SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-164 SKL-167 SKL-168 SKL-169 SKL-170

# Anfälle vor Behandlung 2 - 1,5 h

1,5 - 1 h

56 52 27 73 108 42 50 43

38 45 38 71 79 1 61 44

97 81 34 4 93 75 17 46

94 51 34 5 91 71 53 33

!

!

# Anfälle nach Behandlung

1 - 0,5 h

0,5 - 0 h

0 - 0,5 h

0,5 - 1 h

1 - 1,5 h

1,5 - 2 h

70 51 61 76 88 10 36 26

71 8 18 61 66 4 43 37

3 53 18 34 92 1 0 39

41 1 37 34 62 10 2 33

39 18 45 50 62 18 28 43

49 27 51 42 55 27 40 44

44 13 14 9 116 81 63 50

82 38 30 8 83 48 62 42

76 6 26 24 38 73 99 50

49 84 25 13 67 67 80 20

80 66 31 18 72 61 13 51

!

!

50 81 18 15 65 73 86 14

138

!

Anhang

10.3.9 Isotonische Natriumchloridlösung

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe SKL-117 SKL-123 SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-132 SKL-133 SKL-135 SKL-137 SKL-140 SKL-141

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h 94 59 48 57 78 63 29 44 32 54 29

91 67 46 54 65 59 4 28 28 35 59

67 35 27 67 29 64 54 55 10 93 51

65 63 36 52 80 46 31 35 36 65 26

87 6 60 33 44 48 19 20 ! 30 128 55

106 17 73 75 97 58 14 ! 13 51 48 67

78 37 29 58 84 60 50 42 58 83 67

87 51 59 63 85 59 61 44 46 84 8

SKL-142

83

44

57

43

27

73

85

86

SKL-143 SKL-146

74 57

84 55

60 63

45 25

62 26

91 46

60 66

23 69

SKL-148 SKL-151 SKL-153 SKL-154 SKL-157 SKL-158 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168 SKL-169

89 5 49 56 50 41 25 79 21 66 56 50

67 39 53 43 45 78 66 75 69 79 62 31

40 78 44 59 55 56 50 92 40 72 41 39

79 2 30 57 33 42 9 52 29 54 64 21

73 8 12 48 74 53 15 100 22 87 48 45

90 45 22 53 63 64 39 ! 121 41 87 89 64

98 80 71 57 54 87 43 97 70 76 49 31

!

139

!

!

62 19 77 38 50 85 66 73 68 54 48 49

Anhang

10.3.10 Phenobarbital 25 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-124 SKL-125 SKL-127 SKL-135 SKL-137

41 56 71 47 58

62 8 42 48 63

54 29 71 25 73

39 7 41 12 13

21 12 10 75 53

27 54 71 11 63

35 40 62 36 60

12 36 67 42 52

SKL-140 SKL-141 SKL-143

59

53

71

45

69

61

56

64

78 38

64 84

80 71

29 32

39 39

91 81

78 50

81 34

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-168 SKL-169

43 74 69 36 68 64 61 57

57 65 60 44 60 55 66 64

40 77 64 41 29 25 48 40

4 57 53 6 17 39 49 31

10 21 53 26 42 39 62 69

55 72 57 68 62 74 80 43

41 85 50 21 47 65 43 30

3 51 45 66 47 30 56 35

!

!

10.3.11 Phenobarbital 50 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-124 SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-132

29 20 81 61 65

74 66 49 27 65

58 65 87 47 24

33 36 54 35 10

4 4 8 57 51

21 35 33 47 15

10 41 22 31 1

26 43 47 39 10

SKL-137

61

53

36

5

19

80

2

17

SKL-141 SKL-143

47 58

41 68

66 28

57 45

6 1

50 5

59 60

65 40

SKL-148 SKL-153 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-169

52 19 32 20 34 39 79 57

53 59 13 46 44 83 56 49

66 47 28 54 34 47 80 56

50 11 55 48 6 56 56 51

7 3 2 25 32 56 90 20

0 17 0 7 12 85 79 18

0 32 0 11 0 82 34 30

3 54 0 15 31 82 80 27

140

Anhang

10.3.12 Phenytoin 20 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-125 SKL-127 SKL-130 SKL-133 SKL-135

48 62 23 38 37

28 30 9 11 16

72 74 54 60 52

17 30 50 55 2 !

20 60 72 29 2 !

42 82 32 68 1

51 69 66 79 17

45 72 66 66 13

SKL-137 SKL-141 SKL-142

46

60

23

41

63

60

68

58

11 76

101 71

71 60

40 35

38 42

60 89

93 78

72 69

SKL-151 SKL-154 SKL-157 SKL-159 SKL-161 SKL-165 SKL-167 SKL-168

79 8 68 41 39 62 80 25

52 27 58 32 80 87 49 74

62 38 58 33 85 66 50 44

32 37 44 32 16 41 89 38

56 60 91 55 69 67 63 50

48 56 95 90 113 84 99 70

65 57 94 85 101 48 79 54

68 70 64 69 104 47 63 54

10.3.13 30-prozentiges Polyethylenglycol 400

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe SKL-132 SKL-133 SKL-135 SKL-137 SKL-141

# Anfälle vor Behandlung

# Anfälle nach Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h 86 86 73 51 88

!

74 62 49 98 63

73 77 115 81 54

64 95 82 42 66

38 98 36 45 37

109 101 69 56 85

116 83 89 68 107

88 80 73 67 99

SKL-142

77

110

103

106

75

89

114

93

SKL-146

128

129

122

126

158

112

136

143

SKL-164 SKL-167 SKL-168 SKL-169 SKL-170

94 123 105 81 74

77 114 98 64 75

71 111 101 84 10

76 122 111 99 35

52 155 115 109 ! 55

76 118 124 99 77

77 111 124 104 73

100 113 125 94 74

141

Anhang

10.3.14 Valproat 300 mg/kg

mdr1a/b(-/-)

FVB/N-wt

TierMaus-Nr. gruppe

# Anfälle vor Behandlung

2 - 1,5 h 1,5 - 1 h 1 - 0,5 h 0,5 - 0 h 0 - 0,5 h 0,5 - 1 h 1 - 1,5 h 1,5 - 2 h

SKL-117 SKL-125 SKL-127 SKL-131 SKL-133 SKL-137 SKL-140 SKL-142

13 74 74 32 96 64 49 72

65 52 57 32 83 69 45 60

SKL-148 SKL-151

77 79

SKL-153 SKL-154 SKL-157 SKL-164

# Anfälle nach Behandlung

!

54 57 78 47 90 23 43 99

20 72 53 29 31 44 33 66

43 77 7 21 23 17 60 57

90 80 60 35 82 54 39 88

59 77 76 47 77 84 33 81

33 92 73 36 72 73 57 78

82 82

76 61

54 49

12 53

6 65

38 64

62 69

32

35

42

21

11

47

37

17

57

38

61

30

40

26

42

68

85

92

89

18

51

84

66

59

34

20

45

31

8

35

46

47

46 39

81

79

107

78

88

61

16

52

68

67

SKL-168

87

SKL-170

71

!

81 31

!

!

142

Danksagung

11 Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Löscher für die Überlassung des interessanten Themas und die intensive fachliche Betreuung. Außerdem möchte ich meinen CoSupervisoren Herrn Prof. Dr. Alexandru Stan und Frau Prof. Dr. Kirsten Haastert-Talini für die freundliche Betreuung dieser Arbeit danken. Frau Jun.-Prof. Dr. Marion Bankstahl danke ich für die Anleitung zu experimentellen Arbeiten sowie für die Betreuung im Labor. Ihre stete Bereitschaft Ergebnisse und Probleme zu diskutieren ist hierbei ebenso wie die schnelle Korrektur verschiedener Manuskripte sowie der ersten Version dieser Arbeit besonders erwähnenswert. Auch bei allen weiteren Mitgliedern und Praktikanten des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie möchte ich mich herzlich für die gute Zusammenarbeit und die stete Hilfsbereitschaft bedanken. Ohne ihre Unterstützung bei der Versuchsdurchführung und EEG-Auswertung, hätte ich diese Arbeit nicht in der vorliegenden Form anfertigen können. Hierfür gebührt mein Dank insbesondere Frau Edith Kaczmarek, Frau Heike Breuer, Frau Friederike Twele, Herrn Steffen Langemeyer, Frau Daniela Deus, Frau Katharina Hohlbaum, Frau Ina Leiter und Herrn Marek Andrzejczak, Besonders meinen Mitdoktoranden möchte ich für die gute Arbeitsatmosphäre und die unterhaltsamen Stunden im und außerhalb des Instituts danken. Ebenfalls möchte ich meiner Familie und meinen Freunden für ihre fortwährende Unterstützung danken. Außerdem gilt mein Dank der Gesellschaft für Epilepsieforschung e.V. und der FAZITStiftung für die finanzielle Unterstützung durch Promotionsstipendien, die mir die Durchführung dieser Arbeit ermöglicht haben.

143