Bioanalytik I – RNA/DNA Biochemie

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UV Absorption

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1

PCR I

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PCR II

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2

RT/PCR

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Nekrose/Apoptose

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3

Apoptose II

Fig. 12. Nuclei of apoptotic C6-cells (stained with Hoechst No. 33258). They appear shrunken and shriveled and are more luminous than non-apoptotic ones. Magnification: 400 fold

Fig. 13. Nuclei of C6-cells that show no sign of apoptosis (stained with Hoechst No. 33258). Magnification: 400 fold

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Trennung eines Testgemisches auf einer selbstbelegten Kapillare 11

10

Kapillare: 57 cm (L), 50 cm (l), 75 µm I. D., selbst belegt. Bedingungen: 10 kV, 30° C, 8 µA Puffer: 44 % TRIS, 56 % Borat + 7 M Harnstoff über 450.000 theoretische Böden

9

7

6

40 Nukleotide

20 Nukleotide

mAU

8

5

4

3

2 35

40

time(min)

45

50

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4

Anwendungen für Oligomerentrennungen 10

59

9

Primer (OL 210)

33 Nukleotide

8

49

7

33 Nukleotide

29

19

6

mAU

mAU

39

5

4

3

9 2

-1 30

40

time(min)

1

50

0 35

time(min)

40

33-Basen Oligomer nicht HPLC gereinigt

45

nach HPLC Reinigung

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CGE-Trennung 29,5 23130

60.00

R2 = 0.9053

24,5

50.00

Zeit [min]

40.00

19,5

30.00

RFU

20.00

9416

14,5

10.00

6557

0.00 0

5000

10000

15000

20000

25000

Basenpaare [bp]

9,5 4361 2322 564

125

2027

4,5

-0,5 0

10

20

30

40

50

60

Zeit [min]

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5

Kontrollversuch 39.5

34.5

29.5

RFU

24.5

19.5

14.5

9.5

4.5

-0.5 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Zeit [min]

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Apoptose 29.5

24.5

19.5

RFU

900 14.5

720 9.5

180

360

540

4.5

-0.5 0

10

20

30

40

50

60

70

80

Zeit [min]

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6

Gelelektrophorese (1)

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Gelelektrophorese (2)

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7

Gelelektrophorese (3)

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Blot-Techniken Übertragung 2D-Gel ⇒ Membran, die Nachweis- und Quantifizierungsreaktionen zuläßt Southern Blot (nach E.M.Southern): DNA Northern Blot: RNA Western Blot: Proteine

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8

Zielsetzung des Blottens PAGE

Blot-Membran

Identifizierung

Quantifizierung (?)

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Tank-Blotting 1980: Bittner et al. Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere + Schwämme gelegt Elektrophoretische Übertragung bei kleiner Spannung Effiziente Kühlung nötig!

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9

Semidry-Blotting 1984: Kyse-Andersen Horizontales „Blot-Sandwich“ Durch die elektrochemische Ra. an den Elektroden (Wasser) stellt sich ein pHGradient ein (Kathode: pH 12; Anode: pH 2) Beschwerung nötig, da die entstehenden Gase den Stapel auseinanderdrücken Keine Kühlung nötig!

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Blot-Membranen - Materialien früher: Nitrocellulose (löst sich in org.LM) Polyvinylidenfluorid (PVDF) Polypropylen (PP) Siliconisierte Glasfasern (SGF)

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10

Blot-Membranen - Eigenschaften Hydrophobizität: bestimmt Proteinbindung Porengröße Spezifische Oberfläche (zugängliche Oberfläche) Hohes Proteinbindungsvermögen bei geringem Porenvolumen und hoher spezifischer Oberfläche

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Antisense Oligonukleotide DNA Transkription

Hemmung der Transkription durch Tripelhelixbildung

Primäres RNA-Transcript Processing

Inhibierung des processing (5'-Capping, Splicing, Polyadenylierung)

mRNA Nucleus

Transport

Transporthemmung durch Doppelstrangbildung

Cytoplasma

mRNA Translation

Enzymatischer Abbau von Doppelsträngen (RNAse H) Hemmung der Translation durch Doppelstränge

Protein

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11

Spezifische Wirkungen abhängig von Sequenz: Hemmung der Genexpression des Zielproteins Ausschluss der Hemmung eines anderen Gens (BLAST Datenbank) ca. 4 Mrd. Basenpaare im menschlichen Genom 18mer kommt statistisch 1x in 68 Mrd. Basenpaaren vor nicht berücksichtigt: keine Zufallsverteilung der Basensequenz im Genom Paarung auch bei bis zu drei „mismatches“ möglich

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Unspezifische Wirkungen
bedingt durch polyanionisches Backbone: Hämostase Aktivierung des Komplementsystems erst deutlich über therapeutischem Bereich
bedingt durch spezielle Strukturen: Immunstimulation durch CpG Motiv und Phosphorthioat-Backbone

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12

Wahl der Antisense-Sequenz Ausschluss

der Hybridisierung an andere mRNA (Gendatenbank)

max.

2 CpG Motive, keine Hairpinstrukturen, nicht mehrere aufeinander folgende Guanosine

Wahl eines geeigneten Abschnitts der Ziel-mRNA: Zugang ev. durch Sekundär- und Tertiärstruktur gehindert bei Angriff an codierende Region meist keine Wirkung Vorhersage der mRNA-Sekundärstuktur noch unzuverlässig empirische

Testung („gene walk“) von vielen Oligonukleotiden nötig

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Modifikationen Verbesserung der Stabilität, Hybridisierungsaffinität und Pharmakokinetik: HO

Base O

chemische Modifikationen Phosphorthioat-Backbone 2‘-O-Alkyl- bzw. Oxyethylenketten

HO

O

Base

HO O

zwitterionische Oligonukleotide u.v.a.

HO O H

H

O

H

HO

O

O

Base O

H

O P SBase

O H

O

Base

O H

O

H

H

O

H

HO

O

NH2

H

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13

ASO in klinischer Prüfung (Auswahl) Antisense-Oligonukleotid Fomivirsen (Vitravene®) Oblimersen (Augmerosen, Genasense®, G3139) Alicaforsen (ISIS 2302) ISIS 3521 ISIS 5132 ISIS 2503 ISIS 104838 ISIS 14803 GEM 231 MG 98 Resten-NG GTI-2040 LE-AON

Zielprotein CMVIE2 BCL-2

Indikation Status (klinische Phase) Retinits durch CMV zugelassen Melanom, II/III Lymphom u.a. ICAM-1 Morbus Crohn III Lungenkarzinom II Protein Kinase C α RAF Kinase solide Tumore II HRAS Krebs II TNF-α Rheumatoide II Arthritis Polyprotein Initiationscodon Hepatitis C II Protein Kinase A1 solide Tumore II DNA Methyltransferase solide Tumore II c-MYC Restenosis II R2-Ribonukleotidreduktase Krebs II c-RAF Krebs I/II

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Schmelztemperatur Maß für Hybridisierungsaffinität Temperatur, bei der 50% der DNA als Duplex vorliegt Bestimmung durch UV-Absorption oder CD-Änderung

Rel. Absorption

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 80

70

60

50

-0,2 Temperatur

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14

Salzlösung

Oblimersen

Konjugat mit 3 Lysin

Fluorescein-Konjugat

reverse ASO

scrambled ASO

Oblimersen

3 Lys

2 Lys

1 Lys

Fluorescein

ohne Ligand

80 70 60 50 40 30 20 10 0 umgedreht

BCL-2 (%)

Western Blot

BCL-2

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Genetischer Fingerabdruck

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15

Sequenzierung

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Sequenzierung

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16

Sequenzierung II

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Transformation

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17

Selektionierung

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Definition

Als rekombinante Wirkstoffe werden solche Arzneistoffe bezeichnet, die von speziell zu diesem Zweck gentechnisch modifizierten Organismen produziert werden. (siehe auch Def.: DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte im EuAB)

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18

Historische Entwicklung I am Beispiel des Insulins:

Entdeckung des Zusammenhanges zwischen Pankreas und Diabetes [Minkowski et al.]. 1889

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Historische Entwicklung I am Beispiel des Insulins:

Isolierung des Insulins aus tierischen Bauchspeicheldrüse [Banting und Best]. 1889 1921

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19

Historische Entwicklung I am Beispiel des Insulins:

Erste Behandlung des Diabetes mellitus. 1889 1921 1922

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Historische Entwicklung I am Beispiel des Insulins: Erste technische Produktion des Insulins aus Rinder- und Schweinepankreasgewebe (Eli Lilly / Hoechst). 1889 1921 1922 1923

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20

Schwachpunkte von tierischem Material



Standardisierung



Reinheit



Allergenität



Verfügbarkeit

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Historische Entwicklung II am Beispiel des Insulins:

Bestimmung der Aminosäuresequenz [Sanger et al.]. 1955

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21

Historische Entwicklung II am Beispiel des Insulins:

Vollsynthese des Insulins [Zahn et al. und chinesische Arbeitsgruppen]. 1955 1963

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Historische Entwicklung II am Beispiel des Insulins: Röntgenstruktur des Insulins [CrowfootHodgkin].

1955 19631967

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22

Historische Entwicklung II am Beispiel des Insulins: Aufklärung der DNA-Sequenz, erste Expression von Insulin cDNA in Bakterien [Goeddel et al.] 1955 1963 1967 1977/78

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Historische Entwicklung II am Beispiel des Insulins: Markteinführung des ersten gentechnisch hergestellten Insulins [Eli Lilly]. 1955 1963 1967 1977/78 1982

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23

Molkularbiologische “Werkzeuge” - geschichtliche Meilensteine 1953 1956 1959 1960 1961-68 1968 1970 1970 ff 1973 1981 1982 1985 1985 1988 1997 2000

DNA Doppelhelix Isolierung der DNA Polymerase Plasmide, bakterielle Vektoren zur Übertragung von Antibiotika-Resistenzen mRNA Entschlüsselung des genetischen Codes Restriktionsendonucleasen Reverse Transcriptase Sequenzierung von DNA Abschnitten Rekombination von Genen DNA Syntheseautomaten Transgene Maus mit zus. Wachstumshormon-Gen PCR Zulassung des zweiten rekombinanten Arzneistoffes rh-GH (Somatropin) Start des Human Genom Projektes Dolly Human Genom vollständig sequenziert

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Proteinbiosynthese Ribosom

m-RNA

T A C G Protein

AS DNA Insulin

Posttranslational e Modifikationen

Interferone Erythropoietin FSH / HCG Universität Wien Department für Medizinisch/Pharmazeutische Chemie

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24

Vom Protein zum Genabschnitt Aminosäuresequenz (ein-Buchstaben Code, 166AS) APPRLICDSR VLERYLLEAK EAENITTGCA EHCSLNENIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQAL LVNSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALRAQKEAIS PPDAASAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEA CRTGDR

Mögliche DNA C C C C C C C C C C GCU - CCU - CCU - CGU - CUU - AUU -UGU - GAU - AGU - CGU................... A A A A A A A G G G G G G

Synthese kurzer DNA Abschnitte die als Primer zur Durchmusterung von cDNA Datenbanken dienen

Selection des tatsächlichen humanen Genabschnitts Amplifikation mittels PCR, anschließend Sequenzierung GCA - CCU - CCG - CGU - CUA - AUC -UGU - GAU - AGC - CGU...................

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Rekombination des Genabschnittes mit der DNA des Expressionssystems Polyadenylierungssign al

Promotor

Origin

Selektionsmark er

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25

Plasmide

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Expressions Systeme • E. Coli • CHO (Chinese Hamster Ovarian) • BHK (Baby Hamster Kidney) • Hefe (Saccharomyces cerevisiae) • Pflanzen, Insektenzellen, Transgene Tiere Universität Wien Department für Medizinisch/Pharmazeutische Chemie

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26