Die Optische Pinzette

Lehrstuhl f¨ ur Physikalisch-Medizinische Technik LPMT Friedrich Alexander Universit¨at Erlangen

Betreuer: Lena Lautscham Titelbild angelehnt an [Padgett and Bowman (2011)], [Ashkin (1978)]

Table of Contents

Inhaltsverzeichnis Table of Contents

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1 Einleitung 1.1 Vorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2 Theorie der optischen Falle 2.1 Fallenkr¨ afte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Rayleigh Regime d > λ . . . . . . . . .

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3 Kraftmessung und Kalibration 3.1 Positions- und Kraftbestimmung mittels CCD-Kamera . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Theorie der Kraftbestimmung mit Hilfe der Brown’schen Molekularbewegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ¨ 3.2.3 Uberf¨ uhren der gemessenen Spektren in physikalische Einheiten . . . . . .

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4 Aufbau

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5 Durchf¨ uhrung 5.1 Montage und Justage der Komponenten . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.1 Durchlichtstrahlengang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Fallenstrahlengang . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.3 Justieren der Quadrantenfotodiode . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Beadl¨ osung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1 Maximale Fallenkraft f¨ ur beide Beadgr¨oßen bestimmen . . . . . 5.3.2 Laser Intensit¨ at variieren und Fallenkraft bestimmen . . . . . . 5.3.3 Bestimmung der Minimalkraft, bei der ein Bead gefangen wird 6 Auswertung 6.1 Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1 Maximale Fallenkraft . . . . . . . . . . . . . 6.1.2 Fallenkraft in Abh¨ angigkeit der Laserleistung. 6.1.3 Minimale Fallenkraft um Bead zu halten . . . 6.2 Anwendung der optischen Pinzette . . . . . . . . . . Bibliography

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9 9 9 11

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22 22 22 22 22 22 23

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1 Einleitung Arthur Ashkin entdeckte 1970, dass kleine Partikel und Atome in einem stabilen optischen Potential, welche durch den Strahlungsdruck von Laser Licht geformt werden, gefangen werden k¨onnen [Ashkin (1970)]. Der erste Aufbau, der diesen Effekt nutzte (gebaut von Joe Dziedzic und Arthur Ashkin), bestand aus zwei sich gegen¨ uber stehenden fokussierten Laserstrahlen, die das Teilchen zwischen sich einfingen. Der h¨ohere Strahlendruck im Strahlfokus dr¨ uckte das Teilchen auf den zweiten Laser zu und fing es somit in der Gleichgewichtsposition. Von diesem Aufbau lernten Sie, dass das Teilchen nicht nur zwischen den Lasern, sondern auch senkrecht zu diesen gefangen war. Sie fanden heraus, dass es nicht nur die Steukraft gibt, die das Teilchen vom Laser weg beschleunigt, sondern auch noch eine senkrecht dazu wirkende Gradientenkraft, die aufgrund eines axialen Intensit¨ atsgradienten auftritt. Mit dieser Kenntnis konnten sie 1985 Laserfallen mit nur einem fokussierten Laserstrahl aufbauen [Ashkin et al. (1986)]. Die optische Pinzette ist heutzutage ein wichtiges Instrument in der Biologie und der Medizinischen Physik. Sie erlaubt ber¨ uhrungsloses Festhalten von Partikeln und erm¨oglicht Kraftund Materialmessungen an lebenden Zellen, Makromolek¨ ulen, Kraftmessungen im Vakuum und vieles mehr. Hier kommen h¨ aufig sogenannte Mikrosph¨aren oder Beads zum Einsatz. Dies sind kleine Kugeln aus unterschiedlichen Materialien, wie Glas, Latex oder Polystyrol. Diese Beads sind in unterschiedlichen Gr¨ oßen erh¨altlich, g¨angigerweise werden Gr¨oßen von einigen 100nm verwendet. Die Sph¨ aren sind teilweise mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen und k¨onnen, z.B. mit Proteinen, beschichtet werden. Diese Beschichtungen erlauben es, die Kugeln wiederum an andere Proteine oder auch an Zellen anhaften zu lassen. Anschließend kann durch die optische Falle eine Kraft auf die Sph¨ are und damit auf die Zelle bzw. das Protein ausge¨ ubt werden. Des Weiteren kann die Position des Beads u ¨ber spezielle Detektionsmethoden, z.B. Quadrantenphotodioden mit einer nm-Pr¨ azision und einer zeitlichen Aufl¨osung im µs-Bereich gemessen werden. Damit ist die Positionsgenauigkeit ca. um einen Faktor 100 h¨oher als die optische Aufl¨osung eines Lichtmikroskops. Die zeitliche Aufl¨osung ist sogar um einen Faktor 102 − 103 h¨oher als g¨angige Kameras dies erlauben. Gute Einf¨ uhrungen in das Thema der optischen Pinzette findet man in [Neuman and Block (2004), Svoboda and Block (1994)]

1.1 Vorbereitung Zur Vorbereitung besch¨ aftigen Sie sich bitte mit den folgenden Fragen, die gr¨oßtenteils in dieser Versuchsanleitung behandelt werden, die Sie lesen sollten. • Welchen Impuls und Energie haben Photonen? • Wie und nach welchen Formeln erfolgt der Impuls¨ ubertrag bei St¨oßen mit verschiedenen Oberfl¨ achen? • Worin unterscheiden sich die Regime, mit denen die Fallenkraft erkl¨art wird. Warum unterscheidet man verschiedene Regime? • Mit Hilfe der Formel 2.4 berechnen Sie f¨ ur ein Experiment an einem Teilchen mit Durchmesser 4µm und einem Laser der Wellenl¨ange λ= 1064nm den G¨ utefaktor des Rayleigh λ Regimes Q, wobei ω0 = π·N ist. Wie kann es sein, dass man auch Teilchen fangen kann, A f¨ ur die der G¨ utefaktor kleiner als 1 ist? • Was ist wichtig um eine Laserfalle zu bauen?

1

1.1 Vorbereitung • Machen Sie sich mit den verschiedenen Bauteilen der Falle vertraut (zB. was ist und wie funktioniert ein Dichroid?) • Mit der Falle unterbindet man die Brown’sche Molekularbewegung. Berechnen Sie f¨ ur drei Medien mit Viskosit¨ aten η von 1mPa s, 10 mPa s und 40mPa s, wie weit sich ein Teilchen mit einem Radius von 1 bzw- 4 µm innerhalb 1 Sekunde, 1 Minute und 1 Stunde bei 22◦ C bewegt. Wie groß ist die mittlere Geschwindigkeit dieser Teilchen und somit ihre kinetische Energie? • Welche Methoden der Kraftkalibration gibt es f¨ ur Laserfallen? Und wie funktioniert eine Quadrantenfotodiode?

2

2 Theorie der optischen Falle 2.1 Fallenkr¨ afte Seit Kepler wird Licht ein Impuls zugeordnet. Maxwell postulierte 1873, dass elektromagnetische Wellen (EM-Wellen) einen Strahlungsdruck auf Materie aus¨ uben und von Einstein und Planck haben wir um 1900 gelernt, dass Licht Teilchen Eigenschaften besitzt. Diese Licht Quanten bezeichnet man als Photonen. Sie tragen den Impuls pabs = Ec = λh , wobei E die Energie, c die Lichtgeschwindigkeit, h die  Planckkonstante und λ die Wellenl¨ange ist. Da die Kraft (F )  d~ p ~ als Impuls¨ anderung definiert ist F = dt , u ¨bt die EM-Welle durch Absorption oder Reflektion eine Kraft aus (die Streukraft). Ausgedr¨ uckt als Kraft pro Fl¨ache nennt man diese auch Strahlungsdruck. F¨ ur Objekte mit makroskopischen Dimensionen ist der Strahlungsdruck von ’normalen’, nicht koherenten Lichtquellen zu gering, um einen messbaren Effekt zu zeigen, aber f¨ ur mikroskopische Objekte (< 100µm) zeigen sich zu ber¨ ucksichtigende Effekte. Diese Effekte werden durch den hohen Grad an r¨aumlicher Koh¨arenz und spektralen Reinheit von Laserlicht verst¨arkt und resultieren in starken optischen Kr¨aften [Ashkin (1980)]. Optische Streukr¨ afte werden allgemein definiert als Qnm P~ F~Streu = c

(2.1)

mit dem dimensionslosen Faktor Q , der den Anteil der Energie beschreibt, die genutzt wird um Kraft zu erzeugen(Q=1 f¨ ur eine ebene Welle die auf ein perfekt absorbierendes Teilchen trifft), nm ist der Brechungsindex des Suspensionsmediums (f¨ ur biologische Proben in w¨assriger L¨osung nm ≈ 1, 33 @ 20◦ C), c die Lichtgeschwindigkeit und P~ die einfallende Laserleistung. Da P~ nur u ¨ber eine limitierten Bereich ver¨andert werden kann, bestimmt Q die Fallenkraft, welche von der numerischen Apertur (NA=nm sin α, α dem Halbenwinkel des maximalen Licht Kegels), der Wellenl¨ ange, dem Polarisierungszustand,der Laser-Moden-Struktur, dem relativen Brechungsindex und der Teilchengeometrie abh¨angt. Optische Kr¨afte reagieren sensibel auf kleine St¨orungen der Geometrie und k¨ onnen deshalb nicht durch eine exakte Beziehung beschrieben werden, sondern nur durch theoretische Modelle. In Abh¨angigkeit des Verh¨altnisses von der Laserwellenl¨ ange λ und dem Durchmesser d des gefangenen Objekts betrachtet man unterschiedliche Modell-Regime, um die Kr¨ afte zu beschreiben, die auf das gefangenen Teilchen wirken. W¨ahrend die Streukraft in allen Regimen gleich erkl¨art wird, wird die Gradientenkraft in den verschiedenen Regimen durch unterschiedliche physikalische Effekte und somit mit unterschiedlichen Konzepten erkl¨ art. Man unterscheidet die folgenden drei Regime: • Rayleigh-Regime (d > λ) Der Teilchendurchmesser ist sehr viel gr¨ oßer als die Wellenl¨ ange des Laser. In diesem Fall werden die wirkenden Kr¨afte durch Strahlenoptik beschrieben.

3

2.1 Fallenkr¨afte Im folgendem werden alle drei Regime kurz beschrieben.

2.1.1 Rayleigh Regime d 1 sein an der Stelle des maximalen Intensit¨atsgradientens, d.h. dieser muss hier gr¨oßer als die Streukraft sein. Die Gradientenkraft kann durch eine gr¨oßere Numerische Apertur (N A) vergr¨oßert werden, welche die Gr¨ oße des Laserfokusses verringert. Mit h¨oheren Streukr¨aften Fstreu verschiebt sich die Gleichgewichts-Fallenposition den Laserstrahl hinab. Da Q mit 1/r3 abf¨allt, ist die Falle stabiler f¨ ur kleinere Teilchen. Die Einzelstrahlgradientenlaserfallen, die als “optical tweezers” bezeichnet werden, wurden urspr¨ unglich f¨ ur Rayleighteilchen entwickelt [Ashkin et al. (1986)].

4

2.1.2 Geometrische-/Strahlenoptik oder Mie Regime d >> λ

2.1.2 Geometrische-/Strahlenoptik oder Mie Regime d >> λ Die optischen Kr¨ afte f¨ ur Teilchen mit Durchmesser gr¨oßer als die Laserwellenl¨ange werden durch geometrische Optik beschrieben. In der geometrischen Optik wird der Lichtstrahl in individuelle Strahlen mit passender Intensit¨ at, Richtung und Polarisation aufgeteilt. Die Strahlen propagieren in einem homogenen Medium linear und k¨onnen ihre Richtung durch Reflektion oder Brechung ¨ andern, sowie ihre Polarisation an dielektrischen Oberfl¨ache den Gesetzen der Fresnel Formel folgend ¨ andern (Fresnel Formel Seite 485ff in [Hecht (2002)]). Beugungseffekte werden in diesem Regime vernachl¨ assigt, da man annimmt, dass alle Strahlen eines Lichb¨ undels auf genau einen Punkt fokusiert werden. Beim Brechen und Reflektieren an einem Teilchen ¨andert sich der Impuls des Strahls und eine Kraft wirkt auf das Teilchen. Diese Kraft ist schematisch in 2.1 dargestellt.

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der Kr¨afte Fa und Fb , die sich durch Brechung von einem Strahlenpaar a und b an einer Sph¨are ergeben. Richtung und St¨arke der Kr¨ afte sowie ihre Summe h¨angen von der Position der Sph¨are im Laserstrahl ab. Eine axiale und transverse Verschiebungen des Teilchens aus dem Fallenfokus f gleichen sie somit aus, wie man in (a) Sph¨are unter dem Fokus, (b) Sph¨are u ¨ber dem Fokus und (c) Sph¨are rechts vom Fokus, sieht. [Ashkin (1992)].

Auch in diesem Regime ist die optische Kraft wieder aufgeteilt in Streu- und Gradientenkraft. Die Streukraft wirkt in Richtung des einfallenden Lichtes und entsteht haupts¨achlich durch Reflektion an den Oberfl¨ achen des Teilchens (¨außere Oberfl¨achen und innere Oberfl¨achen, wenn das Licht das Teilchen verl¨ asst), die eine Impuls¨anderung entgegen des einfallenden Lichtes, bewirkt. Die Gradientenkraft wirkt in Richtung des Intensit¨atsmaximums und somit mit oder entgegen der Streukraft. Die Gesamtkraft, die auf das Teilchen wirkt, ist die Vektorsumme der Impuls¨anderungen/ Kr¨ afte aller Lichtstrahlen. Reflektierte Strahlen tragen mit der Impuls¨anderung P R bei und die unendliche Anzahl gebrochener Strahlen mit abnehmenden Kr¨aften P T 2 , P T 2 R,... (siehe Bild 2.2). Das Verh¨ altnis zwischen Reflektion (R) und Transmission (T) ist f¨ ur nicht magnetische Materialien durch die Fresnel Formeln in Abh¨angigkeit von der Polarisation (parallel oder senkrecht zur Oberfl¨ ache) gegeben, als:

R⊥ :=

reflected power nm cos(Θi ) − nS cos(Θt ) nm − nS = = irradiation power nm cos(Θi ) + nS cos(Θt ) nm + nS nS cos(Θi ) − nm (Θt ) R|| : = nS cos(Θt ) + nm cos(Θi )

(2.5) (2.6)

5

2.1 Fallenkr¨afte

T⊥ :=

transmitted power 2nm cos(Θi ) nm = = irradiation power nm cos(Θt ) + nS cos(Θi ) nm + nS 2nm cos(Θi ) T|| : = nS cos(Θi ) + nm cos(Θt )

(2.7) (2.8)

wobei der Einfallswinkel Θi und Reflektionswinkel Θr gleich groß sind und nm sin(Θi ) = nS sin(Θt ) ¨ (Snellius’sches Brechungsgesetz), wobei Θt der Brechungswinkel zum Lot hin beim Ubergang von nm nach nS ist. Die Strahlenergie nimmt mit jeder Reflektion j ∈ N oder Transmission k mit einem Faktor der durch die Fresnel Koeffizienten Rk und T j gegeben ist, ab. F¨ ur die Strahlen mit Energien P R, P T 2 ,... erh¨alt man verschiedene Winkel (π +2Θi , α,...) zum einfallenden Strahl (siehe Abbildung 2.2).

Abbildung 2.2: Geometrien und Intensit¨ aten des gebrochenen und mehrfach reflektierten Strahls in einer Kugel [Ashkin (1992)].

Mit dem einfallenden Impuls pro Zeit F = und die Gradientenkraft in y-Richtung:

F|| = Fstreu

F⊥ = Fgrad

nm P c

ergeben sich f¨ ur die Streukraft in z-Richtung

  ∞ X nm P  = 1 + R cos(2Θi ) − T 2 Rj cos(α + jβ) , c j=0   ∞ X nm P  = R sin(2Θi ) − T 2 Rj sin(α + jβ) . c

(2.9)

(2.10)

j=0

dabei bezeichnet F|| den Kraftanteil in Richtung des einfallenden Strahls und F⊥ den senkrechten Anteil, wodurch sich die Cosinus- bzw. Sinusterme ergeben. Der Anfangsimpuls in z- Richtung wird durch den Term +1“in der Streukraft ausgedr¨ uckt. Addiert man die Kr¨afte im komplexen ” Raum (Fstreu + iFgrad ), kann man die Kr¨ afte weiterhin unterscheiden und die Formel mit Hilfe der geometrischen Reihe vereinfachen: T

2

∞ X j=0

Rj exp(i(α + jβ))

geometrische Reihe

=

T2

exp(iα) + Rexp(2iΘi ) exp(iα) = T2 , (2.11) 1 − R exp(iβ) 1 + cos(2Θt ) + R2

wobei die Relationen α = 2(Θi − Θt ) und β = π − 2Θt eingesetzt wurden, die man mit etwas

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2.1.3 Intermediate Regime d ≈ λ ¨ Uberlegung aus 2.2 konstruieren kann. Diese Formeln sind keine N¨ aherung, sondern exakt, da man mit der geometrischen Reihe alle Strahlen addiert hat. Teilt man die beiden Kraftkomponenten nun wieder auf erh¨alt man:   cos(2(Θi − Θt )) + R cos(2Θi ) nm P 1 + R cos(2Θi ) − T 2 , (2.12) Fstreu = c 1 + R2 + 2R cos(2Θt )   nm P 2 sin(2(Θi − Θt )) + R sin(2Θi ) Fgrad = R sin(2Θi ) − T . (2.13) c 1 + R2 + 2R cos(2Θt ) Da die Falle dreidimensional ist, treffen die Strahlen die Sph¨are unter verschiedenen Winkeln Θi . Damit ein Teilchen stabil gefangen wird, muss die Gradientenkraft gr¨oßer als die Streukraft sein. Aus Einfachheitsgr¨ unden werden diese Kr¨afte oft mit Hilfe eines Qualit¨atsfaktor analog zum Raleigh Regime beschrieben, c Q=F . (2.14) nm P Ashkin hat diesen f¨ ur eine Vielzahl von Strahlprofilen und Polarisationen berechnet (siehe Abbildung 2.1.2).

Abbildung 2.3: Werte des Qualit¨ atsfaktors f¨ ur die Streukraft QS , die Gradientenkraft Qg und die Gr¨ oße der Gesamtkraft Qmag : (a) f¨ ur einen einzelnen Strahl, der eine dielektrische Sph¨ are mit Brechungsindex n = 1.2 unter einem Winkel von Θ trifft [Ashkin (1992)]. Aus Abbildung 2.1.2 sehen wir, dass die Gradientenkraft bei circa 70 ◦ maximal ist. Um hohe Einfallswinkel zu erhalten, nutzt man Objektive mit hoher Numerischen Apertur, zum Bau von optischen Fallen. Die Fallenkraft kann weiter vergr¨oßert werden, indem man die hintere Objek¨ tiv¨offnung leicht u ullt, d.h. den Strahlradius weiter aufweitet als die Offnung groß ist. Dieses ¨berf¨ ¨ Uberf¨ ullen vergr¨ oßert das Verh¨ altnis von Gradienten zu Streukraft, da die ¨außeren/extremalen Strahlen u ¨berproportional zur axialen Gradientenkraft beitragen. Deshalb wird der Strahl so aufgeweitet, dass die 1/e2 Intensit¨ atspunkte des gaussverteilten Lasers zur Objektivapertur passen, wodurch mehr Intensit¨ at in den extremalen Strahlen ist und außerdem ungef¨ahr 87% des einfallenden Lasers in das Objektiv fallen l¨asst [Neuman and Block (2004)].

2.1.3 Intermediate Regime d ≈ λ Das Intermediate Regime ist das passenste und somit relevanteste Regime f¨ ur das Fangen von Beads mit einem ungef¨ ahren Durchmesser von 1µm, welche f¨ ur Cell-rheology und biologische Proben, die mit Infrarot Lasern ( 1064nm) untersucht werden, h¨aufig zum Einsatz kommen. F¨ ur Teilchen dieser Gr¨ oße muss man Beugungsph¨anomene ber¨ ucksichtigen und f¨ ur stark fokussierte Strahlen kann man den Vektorcharakter der Strahlen nicht vernachl¨assigen, was in paraxialen

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2.1 Fallenkr¨afte N¨aherungen gemacht wird. Deshalb muss man hier Berechnungen mit einem rigeroseren Ansatz f¨ ur die Randbedingungen benutzen. Das macht die Berechnung der Kr¨afte kompliziert. Einen L¨osungsansatz daf¨ ur kann man z.B. in [Svoboda and Block (1994)] finden.

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3 Kraftmessung und Kalibration Die F¨ahigkeit, Kr¨ afte ohne direkte Ber¨ uhrung auf eingefangene Objekte aus¨ uben zu k¨ onnen, macht eine optische Pinzette interessant f¨ ur unterschiedlichste biologische Versuche. Bei vielen Experimenten m¨ ochte man die auf die Objekte wirkenden Kr¨afte bzw. die Position der Objekte messen. Dazu ist es n¨ otig, die Auslenkung der Sph¨are aus der Ruhelage im Zentrum der Falle zu bestimmen. Es sind verschiedene Verfahren vorstellbar, wie diese Gr¨oßen gemessen werden k¨onnen. Die Position/Auslenkung des Objekts kann genutzt werden, um die Kraft der Falle und/oder Kr¨ afte, die auf das Teilchen ausge¨ ubt werden, zu ermitteln. Um eine effektive Kraft zu erhalten, ist es n¨ otig, dass man die gemessene Auslenkung mit einer bekannten Kraft kalibriert. Fallentheorien sind nicht in der Lage, die Fallenkraft akkurat f¨ ur ein bestimmtes Objekt und eine bestimmte Fallengeometrie auszurechnen, deshalb m¨ ussen wir diese empirisch mit Hilfe von Kalibrationsmessungen bestimmen.

3.1 Positions- und Kraftbestimmung mittels CCD-Kamera Es ist m¨ oglich, Bilder der gefangenen Sph¨are mit der Kamera aufzunehmen. Mit einem Algorithmus zur Bestimmung des Schwerpunktes der Sph¨are l¨asst sich deren Position mit einer hohen Genauigkeit bestimmen. Bei Kenntnis von Pixelgr¨oße und der optischen Vergr¨oßerung des abbildenden Systems ist eine Berechnung der Entfernung von Objektpositionen zu unterschiedlichen Zeitpunkten m¨ oglich. Diese Methode weist jedoch einige Schw¨achen auf. Die offensichtlichste ist die begrenzte zeitliche Aufl¨ osung der Kamera. Bewegungen, die hochfrequenter als die maximale Bildfrequenz der Kamera sind, lassen sich mit dieser Methode nicht detektieren. Des Weiteren besteht keine M¨ oglichkeit, den Ursprung der Falle direkt zu bestimmen. Es ist zwar m¨oglich, den Ursprung durch den Schwerpunkt aller Objektpositionen festzulegen, dies kann aber zu Fehlern f¨ uhren, da z.B. eine Str¨ omung innerhalb der L¨osung eine permanente Auslenkung des Objekts zur Folge h¨ atte. Dann w¨ urde der berechnete Ursprung f¨alschlicherweise in Richtung der Str¨omung verschoben. Der große Vorteil dieser Methode besteht darin, dass neben der Kamera, die in jedem Fall f¨ ur eine Kontrolle der Probenpositionierung n¨otig ist, keine weiteren Komponenten ben¨otigt werden.

3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD F¨ ur die beiden weiteren Methoden, die hier vorgestellt werden sollen, kommt eine sogenannte Quadrantenfotodiode(QPD) zum Einsatz. Bei dieser speziellen Art der Fotodiode wird die aktive Fl¨ache in Segmente geteilt, die jeweils separat unter Lichteinfall einen Fotostrom generieren. Diese Fotostr¨ ome sind idealerweise proportional zur auftreffenden Lichtleistung und werden durch Operationsverst¨ arker, die als Transimpedanzverst¨arker betrieben werden, in Spannungen umgewandelt. Auch bei der Umwandlung der Fotostr¨ome in Spannungen sollte idealerweise ein linearer Zusammenhang bestehen. Eine schematische Zeichnung einer solchen QPD ist in 3.1 zu sehen. Der in der Probe entstehende Laserfokus wird auf die Quadrantenfotodiode abgebildet. Die Kondensorlinse fungiert dabei als abbildendes System. Ein Objekt, das sich in der Falle befindet, wirkt als Streuzentrum. Kommt es nun zu einer Auslenkung des Objekts aus der Ruhelage, so wird das Licht beim Durchtritt durch die Sph¨are nicht symmetrisch gebrochen und verl¨ auft danach nicht mehr auf der optischen Achse des Systems. Beim Auftreffen auf die Kondensorlinse

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3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD

2

1 ~

3

4

Abbildung 3.1: Schematische Darstellung einer QPD mit Laserspot

f¨ uhrt dies zu einer lateralen Verschiebung des Spots in der Bildebene. Die beschriebene Situation ist in Abbildung 3.2 dargestellt.

``` ``` DD ``` D D D D D D D D D D D

        @ @ @ @

@l

Abbildung 3.2: Strahlengang zwischen Objekt und QPD

Durch Abweichung des Spots von der Mittellage wird die eingestrahlte Lichtleistung in den einzelnen Quadranten unterschiedlich. Es entstehen unterschiedliche Fotostr¨ome in den einzelnen Segmenten. Durch geeignete Summen- und Differenzenbildung lassen sich aus den resultierenden Spannungen die lateralen Abweichungen bestimmen: disp · x = (U 1 + U 4 − U 2 − U 3)

(3.1)

disp · y = (U 1 + U 2 − U 3 − U 4)

(3.2)

F¨ ur eine Kenntnis der Objektposition ist es demnach n¨otig, den Umrechnungsfaktor disp zwischen den Spannungsdifferenzen Ui und Auslenkungen x und y zu bestimmen, d.h. die Falle muss kalibriert werde. Wie man das macht wird im Folgendem erkl¨art. Die verschiedenen Spannungen die man von der Photodiode erh¨alt sind proportional zu der Auslenkung der Kugeln aus der Mitte des Strahls (bis zu einer Auslenkung von circa einem Kugeldurchmesser) [Svoboda and Block (1994)]. Diese Auslenkung kann genutzt werden, um die Kraft der Falle und/oder Kr¨ afte die auf das Teilchen ausge¨ ubt werden, zu ermitteln. Um eine effektive Kraft zu erhalten, ist es n¨ otig, dass man die gemessene Auslenkung mit einer bekannten Kraft kalibriert. Aus dieser Kalibration ergibt sich auch ein Positionskalibrationskoeffizient, der die gemessene Voltzahl der Photodiode in ein Auslenkung mit Einheit Meter u ¨bersetzt. Neben

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3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden aktiven Kalibrationsmethoden mit fixierten Beads, welche die Reibungskraft nutzen, um die Falle bzw. Photodiode zu kalibrieren, gibt es eine passive Methode mit Beads in L¨osung, bei der anhand der Brown’schen Bewegung der Beads schneller und genauer die Fallensteifheit (k) und der Positionskalibrationskoeffizient (disp) bestimmt wird.

3.2.1 Kalibration mit aktiven Methoden Es gibt verschiedene M¨ oglichkeiten der Kalibration mit aktiven Methoden. Eine Methode, den Umrechnungsfaktor disp zu bestimmen, besteht darin, ein Bead in das Zentrum der Falle einzubringen und dann um eine genau definierte Strecke zu verfahren. Dazu wird das Bead auf dem Glasboden des Probensch¨ alchens fixiert. Anschließend erfolgt die Translation des Objekttisches. Das dazugeh¨ orige Spannungssignal wird aufgezeichnet. Daraus ergibt sich direkt der Umrechnungsfaktor. An diesem Setup ist es m¨oglich mit Hilfe der automatischen Probenpositionierung und der Kamera ein fixiertes Bead um eine bestimmte Strecke aus dem Fokus auszulenken und diese Auslenkng dann einem bestimmten Photodiodensignal uQP D [V ] zuzuordnen. Auslenkung[m] = disp[

m ] · uQP D [V ] V

Das Problem dieser Methode ist, dass die Beads daf¨ ur fixiert sein m¨ ussen, d.h. man muss eine extra Probe herstellen. Eine andere M¨ oglichkeit w¨ are es, die Fallenposition so schnell zu ver¨andern, dass das gefangene Bead auf Grund von Reibung nicht folgen kann. Eine Bewegung der Fallenposition ist aber in unserem Setup nicht m¨ oglich.

3.2.2 Theorie der Kraftbestimmung mit Hilfe der Brown’schen Molekularbewegung Das zweite Verfahren zur Positionsbestimmung mittels Quadrantenfotodiode nutzt das zwangsl¨ aufige Auftreten von Diffusion im umgebenden Medium aus. Diese f¨ uhrt zu Schwankungen der Objektposition innerhalb der Falle und entsteht durch die Wechselwirkung der Mikrosph¨are mit den Molek¨ ulen des Mediums. Die daraus resultierenden Schwankungen in den Spannungssignalen werden mittels einer Fouriertransformation frequenzanalysiert.

Brown’sche Bewegung eines freien Teilchens Die Brown’sche Bewegung eines Teilchens ist die thermisch verursachte Bewegung eines Teilchens. Wie im Equipartitions Theorem beschrieben tr¨agt jeder Freiheitsgrad f (der quadratisch zur Hamiltonfunktion beitr¨ agt) 21 kB T zur mittleren kinetischen Energie eines Teilchen in thermischen Equilibrium bei. Diese kinetische Energie f¨ uhrt dazu, dass das Teilchen sich mit Translations- und Rotationsbewegungen bewegt.pDiese Energie (E) ist unabh¨angig von der Masse (m) des Teilchens. Die Geschwindigkeit v¯ = 2 · E/m ist es nicht und deshalb bewegen sich leichte Teilchen schneller als schwere derselben Gr¨oße. Die mittlere Auslenkung in drei Dimensionen x ¯, durch die Bewegung mit Geschwindigkeit v eines freien Teilchens im thermischen Gleichgewicht, ist: r √ 3 1 kB T 2 v →x ¯ = v¯2 = 3 (3.3) x ¯ = kB T = m¯ 2 2 m

 Die mittlere quadratische Auslenkung x2 gibt die Varianz von x an, da die mittlere Auslenkung hxi sich zu 0 mittelt (Brown’sche Bewegung).



 V ar[x] = x2 − hxi2 = x2 . (3.4)

11

3.2 Positions- und Kraftbestimmung mittels QPD Die Diffusionskonstante f¨ ur ein sph¨ arisches Teilchen in Wasser ist durch die Einstein Relation gegeben als: D=

kB T kB T = , γ 6πηr

(3.5)

(detailiertere Rechnungen hierzu sind z.B.

2 auf Seite 409 in [Schwabl (2002)] zu finden). Die mittlere quadratische Auslenkung x in einer Dimension kann man schreiben als:

 2kB T x2 = 2Dt = t, γ

(3.6)

mit dem Reibungstherm γ = 6πηr, mit η der Viskosit¨at des Mediums und r dem Radius der Kugel.

Brown’sche Bewegung in einem harmonischen Potential (wie z.B. der Falle) Die Bewegung eines Teilchen in der Falle ist nicht frei, sondern auf ein harmonisches Potential (U = 1/2kx2 ), als das wir die Falle ansehen, beschr¨ankt. Die nachfolgenden Rechnungen sind u ¨bernommen von [Gittes and Schmidt (1998)]. Unter der Annahme, dass die Fallenkraft k linear von der Auslenkung xt abh¨angt, ist die Langevin Gleichung f¨ ur ein Teilchen in einem visk¨osen Medium mit Reibungskoeffizient γ und thermischer Kraft Ft : Ft = mx¨t + γ x˙t + kxt . (3.7) In einem rein viskosem Medium entsteht die Kraft aus unendlich kurzen Kollisionen und die Autokorrelation der Kraft Ft ist : hFt Ft+t0 it = C · δt0 , C ∈ < = const.

(3.8)

In thermischen Equilibrium gleicht Ft sich mit der Zeit zu 0 aus. Wir transformieren unsere Rechnungen in den Fourierraum und nutzen die Konvention: Z F[x](f ) = x ˆf = xt e(−2πif t) dt (3.9) Z und F ∗ [x](t) = xt = x ˆf e(2πif t) df. (3.10) Da wir im Bereich von kleinen Reynolds Nummern messen (µm Gr¨oße Teilchen), betrachten wir ein System, das einem u ampften Oszillator entspricht, und k¨onnen deshalb den ¨berd¨ Tr¨agheitsterm vernachl¨ assigen. Fˆf = 2πiγf x ˆf + kˆ xf → x ˆf =

Fˆf Fˆf 1 = · . 2πiγf + k γ 2πif + k/γ

(3.11)

Die Power spectral density (PSD) ist nach dem Wiener-Chintschin-Theorem eine Konstante: Fˆf Fˆf∗ = C · F[δt ] = C.

(3.12)

Die PSD ist definiert als das Energiespektrum |ˆ xf |2 . Diese wird normierte um unabh¨angig von der Gesamtdauer τ des Signals xt zu sein. Aus der PSD lernen wir, wie Fluktuationen u ¨ber verschiedenen Frequenzen verteilt sind. Mit den Formeln 3.11 und 3.12 bekommen wir: P SD(f ) =

12

1 C γ −2 1 A |ˆ xf |2 = · =: 2 2 , τ τ (2πf )2 + (k/γ)2 4π f + fc2

(3.13)

¨ 3.2.3 Uberf¨ uhren der gemessenen Spektren in physikalische Einheiten wobei wir die kritische Frequenz fc = Mit Parseval’s Theorem

+∞ R



|xt |2 dt =

k 2πγ



R∞

und die Amplitude A = !

C τ γ2

definieren.

|ˆ xf |2 df

[Dennery and Krzywicki (1995)] und dem


Gleichverteilungssatz f¨ ur das harmonische Potential 12 kB T = 12 k x2t k¨onnen wir die Amplitude u ucken: ¨ber die thermische Kraft ausdr¨ −∞

 kB T = x2t = k

−∞

+∞ Z −∞

+∞ Z dξ

f

ξ= f A 1 |ˆ xf |2 df = c τ 4π 2 fc

3.13

3.14

|Fˆf |2 = C = Aτ γ 2 =

−∞

1 A , = 2 1+ξ 4πfc

4πτ kB T fc 2 γ = 2kB T τ γ, k

(3.14)

(3.15)

mit der Einstein Relation (equation 3.5) folgt: A=

2kB T = 2D γ

(3.16)

Einsetzen in 3.13 ergibt die PSD, welche eine Lorentzfunktion ist: P SD(f ) =

kB T 2 2π γ(fc2 +

f 2)

(3.17)

Die PSD wird durch die kritische Frequenz in zwei Bereiche/Regime geteilt. F¨ ur Frequenzen f