Aus der Klinik und Poliklinik für Urologie, Campus Charité Mitte der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Die diagnostische Validität des Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) im Serum von Patienten mit Prostatakarzinom (PCa)

Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Anja Michael aus Bernau bei Berlin

Gutachter: 1. Prof. Dr. K. Jung 2. Prof. Dr. K. Miller 3. Prof. Dr. R. Lichtinghagen

Datum der Promotion: 07.12.2007

Inhaltsverzeichnis

1

PUBLIKATIONSLISTE____________________________________________1

2

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS _____________________________________2

3

ZUSAMMENFASSUNG____________________________________________3

3.1

Abstract ________________________________________________________3

3.2

Einleitung und Zielstellung __________________________________________4

3.3

Material und Methoden ____________________________________________5

3.3.1

Probanden _____________________________________________________5

3.3.2

Methoden______________________________________________________6

3.4

Ergebnisse ______________________________________________________6

3.4.1

MIF im Serum von Patienten mit PCa, BPH und gesunden Probanden ___________6

3.4.2

Korrelation von Serum MIF, Alter, Prostatavolumen, tPSA, CRP ______________7

3.4.3

Diagnostische Validität von Serum-MIF ________________________________7

3.4.4

Serum-MIF im %fPSA-basierten ANN _________________________________8

3.4.5

Elimination von Serum MIF nach Prostatektomie__________________________8

3.5

Diskussion ______________________________________________________9

4

LITERATURVERZEICHNIS ______________________________________12

5

PUBLIKATIONEN ______________________________________________14

5.1

Publikation 1 ___________________________________________________14

5.2

Publikation 2 ___________________________________________________17

5.3

Publikation 3 ___________________________________________________24

6

ANTEILSERKLÄRUNG __________________________________________34 I

7

DANKSAGUNG _________________________________________________36

8

LEBENSLAUF__________________________________________________37

9

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG_________________________________39

II

1 Publikationsliste Diese Dissertationsschrift, die im Rahmen einer Publikationspromotion verfasst wurde, bezieht sich auf die folgend genannten Veröffentlichungen:

1

Michael A, Stephan C, Schnorr D, Loening SA, Jung K. Serum macrophage migration inhibitory factor is not elevated in patients with prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:328-9.

2

Michael A, Stephan C, Kristiansen G et al. Diagnostic validity of macrophage migration inhibitory factor in serum of patients with prostate cancer: a re-evaluation. Prostate 2005;62:34-9.

3

Stephan C, Xu C, Brown DA et al. Three new serum markers for prostate cancer detection within a percent free PSA-based artificial neural network. Prostate 2006;66:651-9.

1

2 Abkürzungsverzeichnis ANN

Artifizielles neuronales Netzwerk

AUC

Area under curve

BPH

Benigne Prostatahyperplasie

CRP

C-reaktives Protein

DRU

Digital-rektale Untersuchung

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

fPSA

Freies prostataspezifisches Antigen

HGPIN

High-grade intraepitheliale Neoplasie der Prostata

hK11

Humanes Kallikrein 11

LR

Logistische Regression

MIC-1

Macrophage Inhibitory Cytokine 1

MIF

Macrophage Migration Inhibitory Factor

PCa

Prostatakarzinom

PSA

Prostataspezifisches Antigen

tPSA

Totales prostataspezifisches Antigen

%PSA

Quotient aus freiem und totalem prostataspezifischen Antigen

2

3 Zusammenfassung 3.1

Abstract

Ziel der Dissertation war es zu prüfen, ob die Bestimmung des Zytokins Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) im Serum die Früherkennung des Prostatakarzinoms (PCa) verbessern kann. In einer initialen Studie konnten wir zeigen, dass sich die Serum-MIF-Konzentrationen von Patienten mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und Probanden ohne Erkrankung der Prostata nicht unterschieden. Die MIF-Konzentration im Serum von Patienten mit PCa dagegen war signifikant erniedrigt. Allerdings wiesen die Konzentrationsbereiche aller Gruppen starke Überschneidungen auf. Die Konzentrationen von MIF und des prostataspezifischen Antigens (tPSA), dem Leitparameter der Prostatakarzinomdiagnostik, korrelierten nicht miteinander. Die erhobenen Ergebnisse standen im Gegensatz zu einer Studie einer anderen Arbeitsgruppe, sodass wir in einer zweiten Studie weitere Untersuchungen durchführten. Die Ergebnisse der zweiten Publikation bestätigten unsere Beobachtungen. Auch in Untergruppen nach TNM-Staging und WHO-Grading zeigten sich erniedrigte Serum-MIFWerte. MIF erwies sich nicht nur unabhängig vom tPSA, sondern auch vom Patientenalter, Prostatavolumen und C-reaktiven Protein (CRP). Receiver-Operating-Characteristic (ROC)Analysen mit MIF und MIF-abhängigen Variablen erbrachten keine Verbesserung von Sensitivität oder Spezifität im Vergleich zum tPSA. Die Eliminationskinetik von MIF im Serum nach Prostatektomie korrespondierte nicht mit der des tPSA. Dies kann als ein eindeutiger Hinweis gewertet werden, dass die Höhe der MIF-Konzentrationen nur zu einem bestimmten Teil durch die Prostata beeinflusst werden In einer weiteren Studie wurde der Parameter Serum-MIF zusammen mit 2 weiteren potentiellen PCa-Biomarkern (Kallikrein 11, Makrophagen-Inhibitions-Cytokin 1) in ein artifizielles neuronales Netzwerk (ANN) integriert, das auf der Basis des diagnostischen Validität des freien PSA (fPSA) entwickelt wurde. Obwohl MIF als Einzelparameter die geringste diagnostische Validität aufwies, verbesserte der Einschluss dieses Markers in das ANN die Diskriminationsfähigkeit zwischen Karzinom- und Nichtkarzinompatienten und reduzierte die Anzahl unnötiger Prostatabiopsien. Das Potential des Serum-MIF’s im ANN ergab sich vor allem durch seine Unabhängigkeit gegenüber den anderen Markern.

3

3.2

Einleitung und Zielstellung

Das Prostatakarzinom (PCa) gehört zu den häufigsten bösartigen Tumoren des Mannes insgesamt und steht an erster Stelle bei den urologischen Malignomen [1]. Mit steigendem Alter nimmt seine Häufigkeit zu. Da das PCa bedingt durch sein meist dezentrales Wachstum im Frühstadium nur selten Beschwerden macht, eine dauerhafte Heilung jedoch nur bei Diagnose im frühen Stadium möglich ist, sind Vorsorgeuntersuchungen sinnvoll. Die digital-rektale Untersuchung

(DRU),

die

transrektale

Sonographie

und

die

Bestimmung

des

prostataspezifischen Antigens (PSA) sind die drei wesentlichen Säulen in der PCa-Diagnostik [24]. Diese Untersuchungen sind die Basis für die Entscheidung, eine Prostatastanzbiopsie durchzuführen. Das PSA sowie vor allem die diffenzierte Erfassung der molekularen Formen des PSA und der daraus resultierende Quotient von freiem PSA (fPSA) zu tPSA, in der Literatur als prozentuales PSA (%fPSA) bezeichnet, haben sich bisher als beste diagnostische Marker erwiesen [5-9]. Trotz der bereits erreichten Erfolge treten bei Anwendung der etablierten Methoden eine große Zahl falsch-positiver Biopsieergebnisse (65%) auf [10]. Einer der Gründe dafür ist sicherlich, dass PSA zwar weitgehend prostata-, aber nicht tumorspezifisch ist. So werden auch bei gutartigen Veränderungen der Prostata, wie benigner Prostatahyperplasie (BPH) oder chronischer Prostatitis, erhöhte PSA-Werte gemessen [10-12]. Die BPH ist wie das PCa eine häufige urologische Erkrankung, die mit steigendem Alter in ihrer Häufigkeit zunimmt. Insbesondere bei niedrig erhöhten PSA-Werten zwischen 4 und 10 µg/l, dem sogenannten GrauBereich des PSA, ist eine Unterscheidung zwischen BPH und PCa ohne Biopsie nicht möglich. Um die Anzahl von Biopsieuntersuchungen zu verringern, die für den Patienten unangenehm sind und sehr hohe Kosten verursachen, nimmt die Suche nach neuen Biomarkern und Methoden zur Evaluation der Daten einen großen Stellenwert in der Forschung ein. Ein neuer vielversprechender Biomarker schien das Zytokin Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) zu sein. MIF ist neben der Regulation der Immunantwort auch in Prozesse der Karzinogenese involviert, wie der Inhibition von Tumorsuppressorgenen, Proliferation und Angiogenese [13]. Erhöhte MIF-Expressionen auf mRNA- und Proteinebene wurden im Prostatakarzinomgewebe beschrieben [14,15]. Im Serum von Patienten mit PCa fanden sich erhöhte MIF-Konzentrationen [16]. Ausgehend von dieser Studie von Meyer-Siegler et al. [16] führten wir eine Fall-KontrollStudie durch. Unser Ziel war es zunächst, herauszufinden, ob sich Serum MIF für ein fPSAbasiertes artifizielles neuronales Netzwerk (ANN) eignet [Publikation 1]. Die erhobenen Daten standen im Gegensatz zur Arbeit von Meyer-Siegler et al., sodass wir weitere Untersuchungen 4

durchführten. Darin wollten wir klären, ob Serum-MIF im Vergleich zu den bisherigen Leitparametern tPSA und %fPSA die Unterscheidung zwischen benignen und malignen Prostataerkrankungen verbessern kann [Publikation 2]. In der 3. Publikation wurde geprüft, ob in einem fPSA-basierten ANN durch Hinzunahme des Markers Serum-MIF zusammen mit zwei weiteren Biomarkern die diagnostische Aussagekraft des ANN verbessert werden kann.

3.3

Material und Methoden

3.3.1 Probanden Die Arbeit wurde an einer Population von 511 Männern vorgenommen, die zwischen 1999 und 2002 im Rahmen einer Studie über den diagnostischen Nutzen artifizieller neuronaler Netzwerke bei PCa ausgesucht wurden [17]. Die Studie umfasste 175 Patienten mit PCa (Alter: Mittelwert ± Standardabweichung, 64,0 ± 6,4 Jahre), 250 Patienten mit BPH (67,8 ± 7,6 Jahre) und 86 Männer ohne Erkrankungen der Prostata in der Vorgeschichte, frei von BPH-Symptomen und unauffälliger digital-rektaler Untersuchung (56,4 ± 12,9 Jahre). Ausschlusskriterien waren in allen Fällen Infektionszeichen, gastrointestinale, kardiale oder renale Erkrankungen, Tumoren oder immunologische Erkrankungen. Die Diagnose PCa bzw. "kein Anzeichen von Malignität in der Prostata" (im Folgenden vereinfacht als BPH aufgeführt) wurde jeweils histopathologisch bestätigt. Alle Serumproben wurden vor jeglicher diagnostischer bzw. therapeutischer Prozedur bzw. mindestens 4 Wochen nach diagnostischer Intervention gewonnen. Bei 5 PCa-Patienten, die sich einer radikalen laparoskopischen Prostatektomie unterzogen, wurden im postoperativen Verlauf die Eliminationskinetiken von MIF sowie zum Vergleich von PSA bestimmt. In den Veröffentlichungen wurden jeweils nur die Probanden mit vollständigen Datensätzen berücksichtigt, die u.a. aus der Anzahl der archivierten Proben resultierten. Daraus ergeben sich die Unterschiede in den Probandenzahlen in den drei Studien bzw. Veröffentlichungen. Es wurden bei -80°C archivierte, unaufgetaute Proben verwendet. Die Studie wurde entsprechend den ethischen Standards der Deklaration von Helsinki durchgeführt und durch die Ethikkommisssion der Charité genehmigt. Die Untersuchungen wurden von der Deutschen Krebshilfe (Kennzeichen 70-3295-ST1) sowie der Berliner Sparkassenstiftung Medizin unterstützt.

5

3.3.2 Methoden Die Bestimmung der Serum-MIF-Konzentration erfolgte mittels eines Sandwich-ELISA (DuoSet®, DY 289, R&DSystems, Minneapolis, USA) wie in Publikation 2 beschrieben [18]. Der interserielle Variationskoeffizient betrug 12.5 %. Totales und freies PSA wurden mit IMMULITE PSA Kits gemessen (Diagnostic Products Corp., Los Angeles, USA). CRP wurde am Modular-Analytik-System bestimmt (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland). Das Prostatavolumen wurde durch transrektalen Ultraschall mit der Formel (Höhe x Weite x Länge x 0.52) errechnet. Die Auswertung der Daten erfolgte mit SPSS, Version 11.5 für Windows (SPSS, Inc., Chicago, USA), GraphPadPrism, Version 4.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) und MedCalc 7.2.0.2 bzw. 8.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgien). P