Die Institute

Institut für Molekulare Virologie Institute of Molecular Virology Neuherberg (Direktor / Director: Prof. Dr. Volker Erfle)

ie Bedeutung von Infektionen im allgemeinen, und besonders die von Virusinfektionen, für bestimmte wichtige Erkrankungen des Menschen nimmt zu als Folge der weit reichenden Veränderungen unserer Lebensumstände. Zum einen handelt es sich um Infektionen mit Erregern, die Krankheiten wie AIDS und BSE auslösen. Zum andern spielen veränderte Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtsorganismus unter neuen Umweltbelastungen oder bei der Anwendung neuer Therapien eine Rolle. Die Schwerpunkte der Arbeiten liegen daher in der Aufklärung von Mechanismen der Virus-Persistenz, der Virus-Vermehrung und der Krankheitsentstehung durch VirusInfektionen vor dem Hintergrund sich verändernder Belastungen des Wirtsorganismus. Auf der Grundlage der gewonnenen Erkenntnisse werden neue diagnostische und therapeutische Konzepte entwickelt. Das Wissen um die Strategien, mit denen Viren und Zellen interagieren und dabei den zellulären Stoffwechsel und das Immunsystem beeinflussen, bietet zudem einen Ausgangspunkt, Viren oder Virus-Bestandteile als Werkzeuge für die Immun- und Gentherapie zu verwenden.

D

Ziele der derzeitigen Arbeiten sind

• Beschreibung der Einflüsse retroviraler Kontrollgene und -elemente auf die Steuerung zellulärer Prozesse. • Aufklärung zellulärer Mechanismen, die die Replikation von Retroviren beeinflussen („antivirale Faktoren“). • Entwicklung und Anwendung viraler Vektoren für Immunprophylaxe und -therapie mit Schwerpunkt Vaccinia Virus Vektoren.

he importance of infections, particularly of viral infections, for the development of major human diseases is increasing as a result of the farreaching changes taking place in our way of life. On the one hand there are infections with pathogenic agents that trigger diseases like AIDS or BSE. On the other, changes in the interaction between viruses and host organisms as a result of environmental pollution or the application of new therapies in medicine also play a role. Therefore, research in the Institute of Molecular Virology is focused on mechanisms of viral persistence, viral replication, and the development of disease following virus infections, as they relate to the changing burden on the host organism. The results obtained will be used to develop new diagnostic and therapeutic concepts. The knowledge of the strategies with which viruses and cells interact and influence cellular pathways and the immune system will provide a basis for the use of viruses or parts of them as tools for immune and gene therapy. Current research focuses on the following. • Description of the effects of retroviral control genes and elements on cellular regulation processes • Elucidation of the cellular mechanisms that control retroviral replication (antiviral factors) • Development and application of viral vectors in immunoprophylaxis and therapy with a special emphasis on Vaccinia virus vectors • Evaluation of specific immune responses in viral infections and after vaccination and immune therapy (immunomonitoring)

T

GSF " 217

• Untersuchung der spezifischen Immunantworten bei Virus-Infektion und nach Vakzinierung und Immuntherapie (Immunmonitoring). Im Rahmen des Helmholtz (HGF) Forschungsbereichs „Gesundheit“ integriert sich das Institut in das Programm „Infektion & Immunität“ und kooperiert mit anderen HGF-Einrichtungen u.a. auf den Gebieten „Pathogenese“, „Mikroorganismen“ und „Prävention & Therapie“. Weitere Zusammenarbeiten bestehen im Rahmen der Programme „Vergleichende Genomforschung“, „Umweltbedingte Störungen der Gesundheit“ und „Krebsforschung“ des HGF-Forschungsbereichs „Gesundheit“. Die Arbeiten im Institut werden federführend von PD Dr. Ruth Brack-Werner, Dr. I. Drexler, Prof. Dr. C. Leib-Mösch und Prof. Dr. V. Erfle durchgeführt. Zum Jahresende waren im Institut 18 Wissenschaftler, 7 technische Mitarbeiter und 13 Doktoranden beschäftigt. 11 der MitarbeiterInnen wurden über Drittmittel finanziert.

Neue Erkenntnisse zur Funktion des Nef-Proteins von HIV-1 R. Brack-Werner und S. Kramer-Hämmerle Das Nef-Protein des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) spielt eine wichtige Rolle bei der Infektion mit HIV-1. Nef kann schon sehr früh im Infektionsverlauf nachgewiesen werden und interagiert dann mit zahlreichen zellulären Prozessen. In CD4positiven T-Lymphozyten, den Haupt-Zielzellen von HIV-1, ist die Folge dieser Interaktionen in jedem Fall eine Steigerung der viralen Pathogenität durch Modulation der zellulären Eigenschaften. HIV-1 Nef aktiviert diese T-Zellen und induziert damit eine Steigerung der Virusproduktion. Im Verlauf unserer Untersuchungen zur HIV-Infektion des Gehirns haben wir bereits gezeigt, dass Astrozyten (Abb. 1) im Vergleich zu T-Zellen in anderer Weise auf die Infektion mit HIV-1 reagieren, dass aber auch hierbei der Interaktion von regulatorischen HIV-Proteinen mit den Astrozyten eine besondere Bedeutung zukommt. So ändern

218 " GSF

The Institute is integrated into the programme ‘Infection and Immunity’ within the Helmholtz (HGF) research area ‘Health’, and collaborates with other HFG institutions in the areas of ‘Pathogenesis’, ‘Microorganisms’, and ‘Prevention and Therapy’. There is further collaboration within the programmes on ‘Comparative Genomics’, ‘Environmental Health Disorders’, and ‘Cancer Research’ in the research area ‘Health’. The research is coordinated by PD Dr. Ruth Brack-Werner, Dr. I. Drexler, Professor C. Leib-Mösch, and Professor V. Erfle. At the end of the year, there were 18 scientists, 7 technicians, and 13 postgraduate students at the Institute, 11 of them supported by grant funds.

sich zum Beispiel die biologischen Eigenschaften von humanen Astrozyten durch die konstitutive Expression von HIV-1 Nef: Die Zellen verändern ihre Morphologie, zeigen eine erhöhte Expression von Aktivierungsmarkern und eine verstärkte Tendenz, in Nacktmäusen Tumoren zu erzeugen. Von besonderem Interesse war daher die Frage, welche Gene und Signalwege in

Abb.1: Humane Astrozyten, die ein grün-fluoreszierendes Protein exprimieren.

ten nachgewiesene Nef-Expression vermutlich eine lang andauernde Aktivierung der infizierten Astrozyten zur Folge.

Expression endogener Retroviren in Gehirn C. Leib-Mösch In menschlichem Gehirngewebe sind humane endogene Retroviren (HERVs) hochaktiv und werden mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Multipler Sklerose assoziiert. Die Rolle von HERVs in neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie wird in der Literatur kontrovers diskutiert. In einer von der Stanley Foundation initiierten Studie haben wir mehr als 200 Gehirnproben von Patienten mit Schizophrenie, bipolaren (z.B. manischdepressiven) Erkrankungen und von gesunden Kontrollpersonen auf die Expression humaner endogener Retroviren untersucht. Dazu wurde mit Hilfe eines Retrovirusspezifischen Microarrays, mit dem Transkripte der pol-Gene von über 50 repräsentativen Vertretern von 20 HERV-Familien gleichzeitig identifiziert werden können, ein gehirnspezifisches HERV-Expressionsprofil erstellt. Der Vergleich mit den Patientenproben ergab jedoch für die meisten HERVFamilien keine Unterschiede in der Expressionsaktivität und konnte damit frühere, positive Befunde anderer Arbeitsgruppen nicht bestätigen. Allerdings waren Transkripte einer Subgruppe der HML-2-Famile, HERV-K10, in beiden Patientengruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant überrepräsentiert. Mitglieder dieser Subgruppe sind die einzigen bekannten HERVs, die für alle retroviralen Gene kodieren und möglicherweise noch immer replizieren können. Bei der Maus dagegen sind neurotrope Varianten des murinen Leukämievirus MLV bekannt und sehr gut charakterisiert. Da diese neurotropen Retroviren ein sehr ähnliches Pathogenitätsspektrum aufweisen wie Prioneninfektionen, zum Beispiel spongiforme Veränderungen (Abb. 2), haben wir in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von H. Schätzl, Institut für Virologie der TU Mün-

Die Institute

Astrozyten durch Nef beeinflusst werden und inwieweit sich diese Ergebnisse mit denen von HIV-infizierten T-Zellen decken. Mit Hilfe der Microarray-Technik wurden deshalb die Genexpressionsmuster von Astrozyten, die mit dem Nef-Gen (Wildtyp bzw. Mutanten) stabil transfiziert worden waren, untersucht. Parallel dazu wurden Datenbank-basierte Analysen der bereits aus früheren Untersuchungen von HIVinfizierten T-Zellen gewonnenen Ergebnisse durchgeführt. Im Fokus standen dabei Gene, die anhand der Literaturanalyse einem Nef-verbundenen Netzwerk zugeordnet werden konnten und deren Promotoren nun einer vergleichenden Sequenzanalyse (Genomatix Software GmbH) unterworfen wurden. Die statistische Auswertung der Microarrays zeigte kleine, spezifisch hochregulierte Gencluster in Wildtyp-Nef-Zellen im Vergleich zu Zellen, die eine nicht-myristylierte Nef-Variante exprimierten. Diese Nef-Mutante ist nicht funktionell, da ihr die für die Assoziation mit der Zellmembran essentielle Myristylierung fehlt. Mindestens drei signifikant überrepräsentierte Gen-Gruppen (kleiner GTPase Signalweg, Regulation der Apoptose und Lipidmetabolismus) wurden gefunden und der JAK/STAT Signalweg als das verbindene Element der drei Gengruppen identifiziert. Diese Ergebnisse wurden bestätigt durch den parallel durchgeführten theoretischen Ansatz zur Promotoranalyse. Die Organisation der entsprechenden Promotoren gab nach Abgleich mit den bisher beschriebenen experimentellen Daten Hinweise auf eine gemeinsame transkriptionelle Regulation und auf die direkte Verknüpfung mit HIV-1 Nef. Somit konnten wir durch die im Microarray-Ansatz gewonnenen Daten und ihre Bestätigung durch die Analysen der Promotoren von gemeinsam regulierten Genen neue Erkenntnisse zu den grundlegenden Mechanismen der komplexen Funktionen des Nef-Proteins in HIV-infizierten Zellen gewinnen. Die Resultate unserer Analysen sprechen dafür, dass HIV-1 Nef in Astrozyten ähnliche Signalwege wie in HIV-infizierten T-Zellen beeinflussen kann. So hat die schon früh im Verlauf der HIV-Infektion in Astrozy-

GSF " 219

nicht infiziert

Prion-infiziert

Abb. 2: Spongioforme Veränderungen (↑) im murinen Gehirn nach Prioninfektion.

chen, untersucht, ob endogene Retroviren und andere Retrotransposons der Maus bei Prionenerkrankungen als Kofaktoren involviert sein könnten. Dazu wurden die Expressionsprofile endogener Retroviren in mit Scrapie infizierten und nicht infizierten, neuronalen Zelllinien miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Infektion mit Maus-adaptierten Scrapie-Proteinen insbesondere die Transkriptionsaktivität von MLV und intrazisternalen A-Typ Partikeln (IAP) beeinflusst, dass dieser Effekt sowohl Zelltyp-spezifisch ist, als auch vom verwendeten Scrapiestamm abhängt und reversibel auf die „Heilung“ der Zellen mit Pentosanpolysulfat reagiert. Mit Hilfe eines DNAMicroarrays des GSF-Instituts für Experimentelle Genetik konnten außerdem potentielle zelluläre Kofaktoren in den Prion-infizierten Zellen ermittelt werden, die insbesondere Transportproteine, ATP- und Kalzium-bindende Proteine und Proteine des Zytoskeletts umfassen, sowie einige differentiell exprimierte Gene, die auch bei Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen eine Rolle spielen.

Dendritische Zellen und ihre Bedeutung für die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe I. Drexler und W. Kastenmüller Dendritische Zellen (DC) sind professionelle antigenpräsentierende Zellen, die komplexe Antigene prozessieren können, damit diese

220 " GSF

zusammen mit kostimulatorischen Molekülen auf der Zelloberfläche zur Erkennung für zytotoxische T-Zellen präsentiert werden. Orthopockenviren werden nicht nur zur Herstellung von Pockenimpfstoffen benutzt, sondern mittlerweile vornehmlich als Vektoren für die Entwicklung von Impfstoffen gegen andere Infektionskrankheiten und Krebserkrankungen herangezogen. Eines dieser Vektorsysteme ist das hoch attenuierte Modifizierte Vaccinia Virus Ankara (MVA), das auf Hühnerembryofibroblasten gezüchtet wird und in Säugetierzellen nicht mehr vermehrungsfähig ist. Trotz dieses Defekts erlaubt MVA in den meisten Säugetierzellen die Synthese aller viralen Proteine, was wiederum die Expression rekombinanter Gene unter der Kontrolle von Vacciniaspezifischen Promotoren und somit die Produktion heterologer Antigene erlaubt. Auf diese Weise ist es gelungen, rekombinante MVA-Impfstoffe gegen ein breites Spektrum von Infektionskrankheiten viraler, bakterieller und parasitärer Art sowie gegen Tumorerkrankungen zu entwickeln, die inzwischen auch in einer Reihe von klinischen Studien getestet wurden. Ein vielversprechender Ansatz im Rahmen solcher Impfstoffentwicklungen ist dabei die Kombination von MVA-Vakzinen mit dendritischen Zellen, um die entsprechenden Antigene dem Empfängerorganismus möglichst effektiv und immunogen präsentieren zu können. Am Beispiel des melanomassoziierten Antigens Tyrosinase konnte bisher in mehreren klinischen Studien gezeigt werden,

fanden und auch die lebensfähigen unreifen DC trotz Expression der kostimulatorischen Moleküle nicht mehr in der Lage waren, unter spezifischer Zytokinbehandlung zu reifen. DC können auch virale Antigene aus infizierten apoptotischen Zellen präsentieren. Dieser MVA-induzierte Prozess trägt möglicherweise zur effektiveren Stimulation der antigenspezifischen zytotoxischen TZellen bei. Im Gegensatz zu früheren Berichten über replikationsfähige Vacciniaviren waren in unserem Infektionsansatz mit replikationsdefizienten MVA-Konstrukten die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 nicht signifikant von der Zelloberfläche herunterreguliert. Unsere gewonnenen Erkenntnisse zur MVA-DC Interaktion liefern zum einen eine Möglichkeit, den Erfolg des DC-abhängigen MVA-Vektors in den klinischen Studien zu erklären. Zum anderen werden sie dazu beitragen, zukünftige MVA-basierte Impfstoffe und ihre immunologische Präsentation durch dendritische Zellen zu optimieren.

Die Institute

dass der Transfer von autologen, ex vivo mit MVA-Tyrosinase infizierten DC eine spezifische T-Zell-abhängige Immunantwort induziert, dass jedoch eine solche Immunreaktion bei der Wahl eines anderen Applikationsweges wie beispielsweise einer direkten Impfung mit diesem Vektor ausbleibt. Um den Mechanismus der effektiveren Antigenpräsentation durch DC zu charakterisieren, haben wir unreife und reife dendritische Zellen in vitro mit einem MVA Konstrukt, welches für das humane HER-2/neu-Antigen kodiert, infiziert und die Expression des rekombinanten als auch der viralen Antigene untersucht. Trotz Einschränkung der Genexpression auf die frühen Virusgene wurde das durch MVA produzierte Tumorantigen in beiden DC-Populationen sehr effizient produziert und präsentiert. Auch die unreifen DC waren in der Lage, das HER-2/neu Antigen zu prozessieren und entsprechende Peptide an T-Zellen zu präsentieren, obwohl wir in dieser nicht homogenen Population viele apoptotische Zellen

GSF " 221

"

Zusammenarbeit

"

Ausgewählte Veröffentlichungen

Der Leiter des Instituts ist o. Univ. Professor für Virologie und Leiter des Instituts für Virologie der Technischen Universität München. Mit der TU München bestehen außerdem Kooperationen innerhalb des DFG-Sonderforschungsbereiches 456 („Zielstrukturen für selektive Tumorinterventionen“). Mit der LMU München bestehen Kooperationen in den DFG-Sonderforschungsbereichen SFB Transregio 6007 („Chromatin: Aufbau und Vererbung von Struktur und Genaktivität“) und SFB 455 („Virale Funktionen und Immunmodulation“). Enge Kooperationen bestehen darüber hinaus mit dem Klinikum Mannheim der Universität Heidelberg, dem Paul-Ehrlich-Institut (PEI) in Langen, dem Institut für Virologie und Seuchenhygiene der Med. Hochschule Hannover, und den Universitäten Edinburgh und Jerusalem.

Frank, O., Giehl, M., Zheng, C., Hehlmann, R., LeibMösch, C., Seifarth, W.: Human endogenous retrovirus expression profiles in samples from brains of patients with Schizophrenia and bipolar disorders. J. Virol. 79, 10890-10901 (2005)

Kooperationen bestehen auch mit dem Verbund FORPRION („The role of activated retroviral genes as cofactors in prion-induced spongiform encephalopathy“) der bayerischen Forschungsstiftung, sowie in verschiedenen EU-Projekten (“New vaccinia virus MVA vaccines”, “New influenza virus vaccines”, “AIDS vaccine integrated project (AVIP)”). Außerdem besteht eine Kooperation mit Carl-Zeiss-Vision (“Anpassung und Optimierung von Imaging-Verfahren“) und eine enge Zusammenarbeit mit Genomatix Software GmbH auf dem Gebiet der Genomund Promotoranalysen.

Kramer-Hämmerle, S., Hahn, A., Brack-Werner, R., Werner, T.: Elucidating effects of long-term expression of HIV-1 Nef on astrocytes by microarray, promoter, and literature analysis. Gene 358, 31-38 (2005)

222 " GSF

Greenwood, A., Horsch, M., Stengel, A., Vorberg, I., Lutzny, G., Maas, E., Schädler, S., Erfle, V., Beckers, J., Schätzl, H., Leib-Mösch, C.: Cell line dependent RNA expression profiles of prion-infected mouse neuronal cells. J. Mol. Biol. 349, 487-500 (2005) Kramer-Hämmerle, S., Ceccherini-Silberstein, F., Bickel, C., Wolff, H., Vincendeau, M., Werner, T., Erfle, V., BrackWerner, R.: Identification of a novel Rev-interacting cellular protein. BMC Cell Biology 6:20 (2005)

Staib, C., Kisling, S., Erfle, V., Sutter, G.:Inactivation of the viral interleukin 1 receptor improves CD8+ T-cell memory responses elicited upon immunization with modified vaccinia virus Ankara. J. Gen. Virol. 86, 1997-2006 (2005)